KR100582751B1 - 아미노기 보호기, 이 보호기의 제조방법 및 이 보호기를이용한 펩티드 합성방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 온화한 조건에서 아미노기에 부착과 제거가 용이하여 아미노기를 효율적으로 보호 할 수 있으며, 보호된 유도체의 열적, 화학적 안정성이 높고, 유기용매에 대한 용해도가 좋아 펩티드를 효율적으로 합성할 수 있게 하는 새로운 아미노기 보호기, 그 제조 방법 및 응용에 관한 것이다.
본 발명에 의한 새로운 아미노기 보호기는 화학식 (1)로 표시되는 카본산 에스테르 화합물이다
본 발명에 의한 보호기는 화학적, 열적 안정성이 우수하고 유기용매에서 화합물의 용해도를 증가시켜 주므로 aliphatic 아미노산 뿐만 아니라 방향족 및 헤테로고리 아미노산의 아미노기 보호기로도 사용할 수 있다.
또한 본 발명에 의하면 저렴한 메틸 또는 에틸 에스터 형태의 아미노산을 시작물질로 사용할 수 있게 되어 경제적으로 펩티드를 합성할 수 있게 된다.
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Description
본 발명은 새로운 아미노기 보호기, 아미노기 보호기의 제조방법 및 아미노기 보호기를 이용한 펩티드 합성방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 온화한 조건에서 아미노기에 부착(capping, protection; 이하 "캡핑"이라 함)과 제거(decapping, deprotection;이하 "디캡핑"이라 함)가 용이하여 아미노기를 효율적으로 보호 할 수 있으며, 보호된 유도체의 열적, 화학적 안정성이 높고, 유기용매에 대한 용해도가 좋아 펩티드 합성의 경제성 및 수율을 증대 시켜 효율적으로 펩티드를 합성할 수 있게 하는 화학식 (1)의 카본산 에스테르 화합물, 그 제조 방법 및 응용에 관한 것이다.
[X는 파라나이트로페닐옥시, 이미다조일, Cl, Br, Y는 S, Ar은 불소기가 포함된 아릴기]
펩티드 화합물 제조시 아미노산의 아미노기 작용기를 보호하는 대표적인 보호기로는 tert-butoxycarbonyl(tBoc), 9-fluoroenylmethoxycarbonyl(Fmoc), 2-(4-nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl(Nsc) 등이 알려져 있다.
tBoc은 산으로 제거해야 하므로 산에 민감한 작용기를 지닌 아미노산의 경우 사용할 수 없다는 치명적인 단점이 있다.
Fmoc은 약한 염기조건에서 아미노기로부터 쉽게 디캡핑할 수 있으므로 tBoc보다 훨씬 순조로운 조건에서의 펩티드 합성을 가능하게 한다.
그러나 Fmoc 유도체는 몇 가지 치명적인 단점이 있다. 첫째, 화학적, 열적 안정성이 좋지 않고, 특히 방향족의 아미노기 보호기로서는 화학적, 열적 안정성이 더욱 떨어진다. 따라서 Fmoc 보호기를 지닌 방향족 아미노산의 펩티드 합성 수율을 높이기 위해서는 짧은 반응 시간과 과량의 아미노산 당량을 사용해야 한다. 둘째, 헤테로고리 화합물들의 아미노기 보호기로 사용되는 경우, 이 화합물들의 유기용매에서의 낮은 용해도를 개선시키는데 한계가 있다. 셋째, tBoc과는 달리 아미노산의 메틸 또는 에틸 에스터를 시작물질로 사용하지 못하고 t-뷰틸 에스터 또는 카르복실산을 시작물질로 사용해야 한다. 특히 헤테로고리 화합물의 경우에는 탈카르복실 현상이 잘 일어나기 때문에 카르복실산을 사용하지 못하고 t-뷰틸 에스터를 사용해야 한다. 그런데 이 t-뷰틸기는 강산 조건하에서 제거되어야 하므로 산에 민감한 작용기를 지닌 헤테로고리 아미노산에 Fmoc 보호기를 사용하는 것이 원천적 으로 불가능하게 된다. 넷째, Fmoc을 디캡핑할 때 사용하는 염기인 피페리딘은 생성된 dibenzofulvene(DBF)과의 반응성이 약하므로 반응을 통해 이들을 제거하여 DBF에 의한 부반응을 줄이는데 한계가 있다.
Nsc를 사용하는 방법은 Fmoc에 비교하여 안정성이 크기 때문에 펩티드 제조에 유용하지만, 보호된 화합물에 따라서 유기용매에 대한 용해도가 낮아 고체상 합성시 적당하지 못하다는 단점이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 약한 염기조건에서 펩티드 합성을 가능하게 하는 Fmoc이나 Nsc의 장점을 그대로 유지하면서 위에서 언급한 단점을 보완하여 1) 화학적, 열적 안정성이 우수하고 2) 유기용매에 대한 용해도가 높으며 3) 출발물질로서 값싼 아미노산의 메틸, 또는 에틸에스터를 사용할 수 있고 4) 보호기의 제거 반응시 생성물에 의한 부반응이 없는, 새로운 아미노기의 보호기를 개발하고, 이를 이용하여 펩티드를 효과적으로 합성하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 새로운 아미노기 보호기, 아미노기 보호기의 제조방법, 아미노기 보호기에 의해 아미노기가 보호된 화합물 및 아미노기 보호기를 이용한 펩티드 합성방법에 관한 것이다.
(1) 본 발명에 의한 새로운 아미노기 보호기는 화학식 (1)로 표시되는 카본산 에스테르 화합물이다
여기서 X는 파라나이트로페닐옥시, 이미다조일, Cl 또는 Br을, Y는 S를, Ar은 불소기가 포함된 아릴기로서
본 발명에 의한 아미노기 보호기인 화학식 (1)의 카본산 에스테르는 ① 강한 염기 조건에서 펩티드 합성을 가능하게 하며 ② 화학적, 열적 안정성이 우수하고 ③ 유기용매에 대한 용해도가 높으며 ④ 출발물질로서 값싼 아미노산의 메틸, 또는 에틸에스터를 사용할 수 있고 ⑤ 보호기의 용이한 디캡핑을 위해 염기 조건에서 불안정한 유도체로 변환이 용이하며 ⑥ 디캐핑 반응시 생성물에 의한 부반응이 없다는 특징을 가진다.
(2) 본 발명에 의한 화학식 (1)로 표시되는 카본산 에스테르 화합물은 ① arylhalide의 불화유도체와 mercaptoethanol을 반응시켜 2-(phenylsulfanyl)- ethanol의 불화 유도체를 얻는 단계 및 ② 2-(phenylsulfanyl)-ethanol 불화 유도체를 파라나이트로페닐옥시, 이미다조일, Cl 또는 Br과 반응시키는 단계를 통해 제조될 수 있다.
예를들면, 반응식-1과 같이 Arylchloride의 불화유도체를 유기용매에 용해하고 mercaptoethanol을 가하여 20 ~ 160℃에서 10 ~ 30시간 반응시켜 화학식 (5)와 같은 알콜[2-(phenylsulfanyl)-ethanol]을 얻는다(단계 1). 이어서 상기 화학식 (5) 화합물을 유기용매에 용해하고 파라나이트로페닐옥시, 이미다조일, Cl 또는 Br을 가하여 0 ~ 100℃에서 1 ~ 5시간 반응시켜 본 발명에 의한 화학식 (1)의 화합물을 얻는다(단계 2). 예를들면, 4- nitrophenyl cholroformate을 가하여 화학식 (1)의 일종인 화학식 (6)의 화합물을 얻을 수 있다.
반응식-1
(3) 본 발명은 또한 상기 카본산 에스테르 화합물로 아미노기가 보호된 화학식 (2)로 표시되는 화합물을 제공한다.
여기서 Y는 S 또는 SO2이고, Ar 및 R은 상기와 같다.
화학식 (2) 화합물은 하기 (4-1)에 설명되는 바와 같이, 화학식 (1)의 화합물과 아미노산 유도체의 아미노기를 반응시켜 아미노산 유도체 카바메이트를 만드는 캡핑단계를 거쳐 생성되는 화합물이다(이때 Y는 S).
경우에 따라서는 S가 산화된 SO2 형의 화합물일 수도 있다. S의 산화는 하기 (4-4)에서 설명되는 바와 같이 적절한 산화제로 Y가 S인 화학식 (2)의 화합물을 산화시키는 것으로 이루어진다.
(4) 또한 본 발명은 상기 아미노기 보호기를 이용한 펩티드 합성방법에 관한 것이다. 펩티드 합성방법은 크게 캡핑단계, 펩티드결합단계 및 디캡핑단계로 구분된다.
(4-1) 캡핑단계
화학식 (1)의 화합물과 아미노산 유도체의 아미노기를 반응시켜 화학식 (2)로 표시되는 아미노산 유도체 카바메이트를 제조하여 아미노기를 보호하는 단계이다.
여기서 R은 카르복시산 및 에스테르를 포함하는 아미노산 유도체와, 카르복시산 및 에스테르를 포함한 헤테로 고리 화합물이며, Y는 S이며, Ar은 불소기가 포함된 아릴기이다.
이 단계는 예를들면, 반응식 2와 같은 과정이 된다. 즉, 화학식 (6)의 화합물(본 발명에 의한 카본산 에스테르의 일종)과 화학식 (7)과 같은 아미노산 유도체를 반응시켜 카바메이트 화합물인 화학식 (8)의 화합물을 얻는 것이다.
반응식-2
(4-2) 카르복시산 형성단계
캡핑된 아미노산 유도체 카바메이트 화학식 (2)의 우측말단이 카르복시산이 아닌 경우, 염기를 가하여 카르복시산으로 변환시킨다. 이 단계는 예를들면, 반응식 3과 같이, 화학식 (8)의 화합물을 염기와 반응시켜 화학식 (9)와 같은 카르복시산 화합물을 얻는 것이다. 예시된 화학식 (8) 또는 (9)에서 캡핑기는 염기에 안정한 기로서 2-(4- trifluoromethylphenyl-thio)ethoxycarbonyl(이하 "Ttc"라 함)기이다.
반응식-3
(4-3) 펩티드결합단계
이어서, 화학식 (2)의 우측말단의 카르복시산과 다른 아미노산 유도체의 아미노기를 반응시켜 펩티드결합을 형성함으로써 화학식 (3)과 같은 아미노산 다이머(dimer) 유도체를 얻는다. 펩티드 결합에 사용되는 시약으로 tetramethylfluoroformamidinium hexafluorophosphate(TFFH), bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium- hexafluorophosphate(PyBroP) 등이 유용하다.
원하는 아미노산 결합체(펩티디)를 얻을 때 까지 전기 두 가지 과정(카르복시산 형성단계+펩티드결합단계)을 반복한 후 최종적으로 펩티드 유도체의 우측말단을 카르복시산으로 변환시킨다(예, 화학식 (3)).
R1, R2는 수소, 알킬, 아릴 또는 헤테로 고리 화합물이고, Ar은 불소기가 포함된 아릴기이다.
(4-4) 산화단계 : Tsc기의 형성
일단 전기 (4-1) 캡핑단계 이후 어느 단계 전후에라도 캡(카본산 에스테르 화합물)의 염기에 대한 민감도를 증가시키기 위해 화학식 (3)의 Y 즉 S를 SO2로 산화시킨다. 즉, Ttc기를 산화시켜 하기의 Tsc기로 변환시키는 것이다.
이 과정은 예를들면, 반응식 4와 같이 화학식 (9)의 화합물을 유기용매 하에서 과산화수소 또는 과산화수소와 다른 산화제의 혼합액을 사용하여 -10 ~ 100℃의 반응온도로 처리하여 화학식 (10)과 같은 산화물을 얻는 것이다. 예로 든 화학식 (10)은 2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxycarbonyl(이하 "Tsc"라 함)기로서 이 기의 카바메이트 결합이 염기에 대하여 매우 약하게 된다.
이러한 산화단계는 캡핑단계 이후의 어느 단계에서 이루어지더라도 상관이 없다. 경우에 따라서는 산화단계와 하기 디캡핑단계가 동시에 이루어질 수도 있다.
반응식-4
(4-5) 디캡핑단계
이어서 상기 산화된 화학식 (3), 예를들면 화학식(10)을 유기용매 하에서 피페리딘(piperidine) 등과 같은 2차 염기, 3차 염기 또는 방향족 염기를 가하여 카바메이트 결합을 해체하여 디캡핑하고 화학식 (4)와 같이 원하는 펩티드를 수득한다. 즉, 상기 펩티드결합단계를 거친 화합물을 염기조건에서 카본산 에스테르 부위(moiety)를 제거하는 단계이다.
R1, R2는 수소, 알킬, 아릴 또는 헤테로 고리 화합물이다.
보다 구체적으로는, 산화된 화학식 (3)에서의 Tsc기는 Nsc기, Fmoc기 등과 마찬가지로 염기로 제거한다. 예를들면, β-수소제거반응에 의해 화학식 (9)의 화합물을 DMF 하에서 20 %(v/v) piperidine과 반응시켜 Tsc기를 제거하는 것이다.
참고로, piperidine의 사용으로 보호기를 디캡핑한 후, NMR과 액체상 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석한 결과, 반응식 5에서처럼, 디캡핑 결과물로 화학식 (12)가 관찰되었을 뿐, β수소제거반응의 부산물인 화학식 (11) 화합물은 발견되지 않았다.
반응식-5
따라서 본 발명의 방법에 의하면 부반응을 유발할 수 있는 화학식 (11)과 같은 유형의 화합물이 발생하지 않기 때문에 종래 Fmoc 기를 활용하는 것에 비해 매우 효율적으로 원하는 펩티드를 획득할 수 있게 된다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 명확히 설명하기 위한 예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 합리적인 범위 내에서 하기 실시예의 각종 반응화합물 및 반응조건을 변경하여 적용하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식인에게는 용이할 것이며, 이러한 변형 역시 본 발명의 기술적 사상 범위에 포함될 것이다.
특히 펩티드의 인공합성에서는 반응(중간)물질들의 용매에 대한 용해도 저하가 문제가 되고 있다. 따라서 본 실시예에서의 반응(중간)물질들의 용매에 대한 용해도가 저하되지 않음을 확인하기 위하여, 특히 용해도가 낮은 피롤(pyrrole) 또는 이미다졸(imidasole)과 같이 N을 포함하는 헤테로사이클형 아미노산 유도체를 적용하였다.
실시예 1 : 본 발명에 의한 카본산 에스테르 화합물의 제조
2 단계를 통하여 본 발명에 의한 카본산 에스테르 화합물을 제조하였다.
(1) 단계 1 : 2-(4-Trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethanol의 제조
무수 DMF (200 mL)에 4-chlorobenzotrifluoride (31.36 mL, 235.26 mmol)을 녹인 후, 여기에 mercaptoethanol (15.00 mL, 213.87 mmol), K2CO3 (38.43 g, 278.06 mmol)을 가한 후, 상온에서 30 min 간 교반한 뒤, 환류하였다. 15시간 경과 후 반응물의 온도를 상온으로 내리고 증류수를 가하여 반응을 종결시켰다.
반응물을 Diethyl ether로 추출하여 유기층을 NH4Cl 수용액으로 세척한 뒤, 무수 MgSO4로 수분을 제거하고, 용매를 농축하였다. 농축된 반응액을 Silica gel column chromatography (EtOAc : n-hexane = 1:3)로 정제하여 무색의 오일 2-(4-Trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethanol (32.11 g, 67.56 %) 을 얻었다.
화학식 (5)에 해당하는 상기 화합물의 화학적 특성은 다음과 같았다 : TLC (EtOAc : n-hexane = 1:1) R
f = 0.45; 1H NMR (CDCl3) 7.53 (d, J =8.4 Hz, 2H), 7.42 (d, J =8.4 Hz, 2H), 3.82 (t, 2H), 3.20 (t, 2H), 2.15 (brs, 1H) ; 13C NMR (CDCl3) 140.60, 129.38, 128.48, 128.04, 127.62, 127.18, 125.74, 125.69, 125.64, 125.59, 122.18, 118.58, 60.36, 35.84.
(2) 단계 2 : Carbonic acid 4-nitro-phenyl ester 2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethyl ester의 제조
무수 Dichloromethane (DCM) (100 mL) 에 전기 실시예 1에서 수득한 2-(4-Trifluoromethyl-phenylsulfanyl)ethanol (15.00 g, 67.50 mmol)을 용해하고 0℃ 에서 pyridine (7.59 mL, 93.81 mmol), 4-nitrophenyl cholroformate (13.61 g, 67.50 mmol)를 차례로 가한 뒤, 상온에서 2시간 동안 교반하였다.
증류수을 가하여 반응을 종결시키고, DCM을 이용하여 반응물을 추출하였다. 추출된 유기층을 NH4Cl 수용액으로 세척한 뒤, anhydrous MgSO4 로 수분을 제거한 후, 용매를 농축하였다. 농축액을 Silica gel column chromatography (DCM : n-hexane = 5:1)로 분리하여 연노란 오일의 carbonic acid 4-nitro-phenyl ester 2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethyl ester (22.54 g, 86.21%)를 얻었다.
본 발명에 의한 카본산 에스테르 화합물인 화학식 (1)에 해당하는 상기 화합물은 다음과 같은 화학적 특성을 나타내었다 : TLC(EtOAc : n-hexane = 1:3) R
f
: 0.37; 1H NMR (CDCl3) 8.27 (d, J =9.3 Hz, 2H), 7.56 (d, J =8.7 Hz, 2H), 7.47 (d, J =8.1, 2H), 7.36 (d, J =8.7, 2H), 4.47 (t, 2H), 3.35 (t, 2H) ; 13C NMR (CDCl3
) 155.05, 152.08, 145.24, 139.89, 129.29, 128.75, 128.32, 128.17, 127.89, 127.45, 125.87, 125.82, 125.77, 125.72, 125.69, 125.15, 122.09, 121.55, 118.48, 66.78, 30.95.
실시예 2 : 본 발명의 방법에 의한 펩티드의 제조예 I
피롤형 아미노산 유도체를 적용하여 펩타이드를 제조하였다.
(1) 캡핑단계
<Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-pyrrole-2-carboxylic acid methyl ester의 제조>
EA (20 mL)에 1-methyl-4-nitropyrrole-2-methyl ester (1.17 g, 6.35 mmol)를 녹인 후, 10 % Pd/C (50 mg, catalytic weight)을 가하고 수소 분위기하의 상온에서 1시간 동안 교반하여 니트로기(NO2)를 아미노기(NH2)로 환원시켜 피롤형 아미노산 유도체를 얻었다. 10 % Pd/C은 celite 545 로 필터하여 제거하고, EA와 MeOH로 세척한 후 진공하에서 용매를 농축하였다. 여기에 무수 DCM (30 mL)에 용해한 화학식 (1)인 화합물 carbonic acid 4-nitro-phenyl ester 2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethyl ester (2.23 g, 5.76 mmol), DIEA (2.01 mL, 11.56 mmol), DMAP (1.41 g, 11.56 mmol), HOBt (1.77 g, 11.56 mmol)을 가한 뒤, 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 물을 가하여 반응을 종결시키고, DCM으로 반응물을 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4로 수분을 제거하고, 용매를 농축하였다. Silica gel column chromatography (EA : n-hexane = 1:3)를 하여 methyl 1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-pyrrole-2-carboxylate(1.98 g, 85.42%)(연노란색 고체)를 얻었는다.
본 발명에 의한 방법에서 화학식 (2)인 카바메이트에 해당하는 상기 화합물의 화학적 특성은 다음과 같았다 : TLC(EA : n-hexane = 1:3) R
f : 0.13; 1
H NMR ( CDCl3) 7.54 (d, J =8.4 Hz, 2H), 7.54 (d, J =8.1 Hz, 2H), 7.05 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 6.39 (brs, 1H), 4.33 (t, 2H), 3.88(s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.26 (t, 2H); 13C NMR (CDCl3) 161.35, 153.24, 140.79, 129.37, 128.40, 127.97, 127.65, 127.53, 127.10, 125.77, 125.73, 125.67, 125.62, 122.16, 121.33, 119.97, 118.56, 108.26, 63.00, 51.01, 36.61, 31.22.
(2) 펩티드결합단계 1 : 카르복시기의 형성
<Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H- pyrrole-2-carboxylic acid의 제조>
캡핑단계에서 얻어진 methyl 1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-pyrrole-2-carboxylate (5.0 g, 12.43 mmol)를 THF / H2O (200 mL/ 100 mL)에 용해한 다음 1N LiOH (30 mL)을 가하고 상온에서 4일간 교반하였다. 반응액을 1N HCl로 pH 2.0까지 산성화시킨 뒤, EA와 물을 가하여 추출하였다.
유기층은 NaCl 수용액으로 세척한 뒤, 무수 MgSO4 로 수분을 건조시키고, 용매를 제거하여 하얀색의 고체를 얻었다. 이를 EA와 n-hexane으로 재결정하여 1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-pyrrole-2-carboxylic acid(3.20 g, 66.29 %)(연 노란색의 고체인 카르복시산)를 얻었다.
상기 카르복시화된 카바메이트 화합물의 화학적 특성은 다음과 같이 나타났다 : TLC (EA : n-hexane = 1:1) R
f :0.23; 1H NMR (DMSO-d
6 ) 12.17 (brs, 1H), 9.46 (brs, 1H), 7.65 (d, J = 8.4, 2H), 7.56 (d, J = 8.4, 2H), 7.03 (s, 1H), 6.62 (d, J = 1.5, 1H), 4.24 (t, J = 6.5, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.37 (t, J = 6.6, 2H); 13C NMR (DMSO-d
6 ) 161.92, 153.18, 141.95, 129.71, 127.09, 126.43, 126.11, 126.00, 125.79, 125.75, 125.57, 125.15, 122.51, 121.35, 120.01, 118.91, 107.72, 61.97, 36.13, 30.35.
(3) 산화단계 : Tsc기의 형성
<Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-pyrrole-2-carboxylic acid의 제조>
전단계에서 얻어진 1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (3.00 g, 7.7 mmol)를 Acetone (90 mL) 에 용해한 다음, Na2MoO4 (2.40 mL of 0.3 M solution), H2O
2 (4.50 mL of 30% solution)를 차례로 가하고 상온에서 교반하였다. 72 시간 경과 후 하얀 침전물을 필터하여 acetone 과 EtOAc 로 세척하여 하얀색 고체 Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (2.10 g, 64.81 %)를 얻었다.
Tsc기를 가지는 상기 화합물의 각종 화학적 특성은 다음과 같았다 : TLC (EA : n-hexane = 4:1) R
f = 0.38; 1H NMR(DMSO-d
6 ) 12.15 (brs, 1H), 9.21 (brs, 1H), 8.14 (d, J = 8.1, 2H), 8.00 (d, J = 8.1, 2H), 6.95 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 4.34 (t, J = 5.6, 2H), 3.84 (t, J = 5.4, 2H), 3.77 (s, 3H); 13C NMR (DMSO-
d
6 ) 161.82, 152.46, 143.27, 134.09, 133.66, 133.23, 132.80, 128.78, 126.64, 126.60, 125.16, 122.00, 121.54, 119.86, 118.84, 117.94, 107.67, 57.47, 54.23, 36.08; HRMS (FAB) for C16H15F3N2O6S (M+
), calcd 420.0603, found 420.0609.
(4-1) 펩티드결합단계 2 : 펩티드결합의 형성 예 1
<1-Methyl-4-({1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxy-carbonylamino]-1H-pyrrole-2-carbonyl}-amino)-1H-pyrrole-2-carboxylic acid methyl ester의 제조>
1-Methyl-4-nitropyrrole-2-methyl ester (65.68mg, 0.3567mmol)를 EA (10mL)에 녹인 용액에 10 % Pd/C (10 mg)를 첨가후, 반응액을 수소대기하, 실온에서 10시간 교반하여 니트로기(NO2)를 아미노기(NH2)로 환원시켜 피롤형 아미노산 유도체를 얻었다. 10% Pd/C는 celite 545를 사용하여 여과한 후, EA 와 methanol로 세척한다. 무수 DMF (6 mL) 및 DCM (2 mL)의 용액에 1-Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxycarbonyl-amino]-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (49.98 mg, 0.1189 mmol), TFFH ( 94.21 mg, 0.3567 mmol), HOAt (64.73 mg, 0.4756 mmol) 및 DIEA (82.84 L, 0.4756 mmol)를 첨가한후, 반응액을 실온에서 8시간 교반한다. 반응액에 증류수를 넣고 diethyl ether로 추출한다. 유기층은 무수 MgSO4로 건조 후, 농축한다. 농축액을 silica gel column chromatography(EA : n-hexane = 3:1)로 분리하여 1-methyl-4-({1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxy-carbonylamino]-1H-pyrrole-2-carbonyl}-amino)-1H-pyrrole-2-carboxylic acid methyl ester ( 41.70 g, 62.99%)를 연노란 고체로 얻는다.
상기 얻어진 화합물의 화학적 특성은 다음과 같다 : TLC (EA : n-hexane = 3:1) R
f = 0.43; 1H NMR (DMSO-d6 + CDCl3) 9.87 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 4.36 (bt, 2H), 3.84 (m, 8H), 3.73 (s, 3H).
(4-2) 펩티드결합단계 2 : 펩티드결합의 형성 예 2
<1-Methyl-4-({1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)ethoxy- carbonylamino]-1H-imidazole-2-carbonyl}-amino)-1H-pyrrole-2-carboxylic acid methyl ester의 제조>
1-Methyl-4-nitropyrrole-2-methyl ester (65.68mg, 0.3567mmol)를 EA (10mL)에 녹인 용액에 10 % Pd/C (10 mg)를 첨가후, 반응액을 수소대기하, 실온에서 10시간 교반하여 니트로기(NO2)를 아미노기(NH2)로 환원시켜 피롤형 아미노산 유도체를 얻었다. 10% Pd/C는 celite 545를 사용하여 여과한 후, EA 와 methanol로 세척한다. 무수 DMF (6 mL) 및 DCM (2 mL)의 용액에 1-Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-1-Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxycarbonyl-amino]-1H-imidazole-2-carboxylic acid (50.10 mg, 0.1187 mmol), TFFH (83.37 mg, 0.3567mmol), HOAt (64.73 mg, 0.4748 mmol) 및 DIEA (82.84 L, 0.4748 mmol)가하고 전기 (4-1)과 같은 방법으로 반응시켜 1-Methyl-4-({1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)ethoxy-carbonylamino]-1H-imidazole-2-carbonyl}-amino)-1H-pyrrole-2-carboxylic acid methyl ester(연노란색 고체)( 41.7 mg, 63.01 %)를 얻었다.
상기 화합물의 화학적 특성은 다음과 같이 나타났다 : TLC (EA : n -hexane = 3:1) R
f = 0.48; 1H NMR (CDCl3) 8.86 (s, 1H), 8.09 ( d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.85 ( d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.81 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.52 (bt, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.56 (bt, 2H).
실시예 3 : 본 발명의 방법에 의한 펩티드의 제조예 II
전기 실시예 2와는 다른 이미다졸형 아미노산 유도체를 적용하여 펩티드를 제조하였다.
(1) 캡핑단계
<1-Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-imidazole-2-carboxylic acid ethyl ester의 제조>
EtOAc (20 mL)에 1-methyl-4-nitroimidazole-2-ethyl ester( 2.56 g, 12.85 mmol)를 용해한 후, 10 % Pd/C (100 mg, catalytic weight)을 가하고 수소 분위기의 상온에서 10시간 동안 교반하여 니트로기(NO2)를 아미노기(NH2)로 환원시켜 이미 다졸형 아미노산 유도체를 얻었다. 10 % Pd/C를 celite 545 로 필터하여 제거하고, EA 와 MeOH로 반응물을 세척한 후 농축하였다. 여기에 무수의 DCM(40 mL)를 가하여 녹인 용매에 화학식 (1)인 화합물 carbonic acid 4-nitro-phenyl ester 2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethyl ester( 4.52 g, 11.67 mmol), DIEA( 4.06 mL, 23.32 mmol), DMAP( 2.85 g, 23.32 mmol), HOBt( 3.57 g, 23.32 mmol) 를 가하여 상온에서 교반하였다. 12시간 경과 후 물을 가하여 반응을 종결하고, DCM으로 반응물을 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4 로 수분을 건조한 뒤, 용매를 농축하였다. Silica gel column chromatography (EtA : n-hexane = 1:2)로 분리하여 1-Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-imidazole-2-carboxylic acid ethyl ester( 3.77 g, 77.40 %) 하얀색 고체를 얻었다.
본 발명에 의한 방법에서 화학식 (2)인 카바메이트에 해당하는 상기 화합물의 화학적 특성은 다음과 같았다 : TLC (EA : n-hexane =1:2) R
f : 0.14; 1
H NMR (CDCl3) 7.54 (d, J = 8.4, 2H), 7.45 (d, J = 8.1, 2H), 7.31 (brs, 1H), 7.23 (s, 1H), 4.40 (q, J = 6.9, 3H), 4.33 (t, J = 7.2, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.26 (t, J = 6.9, 2H), 1.41 (t, J = 7.1, 2H); 13C NMR (CDCl3) 158.50, 152.57, 140.52, 136.92, 131.58, 129.27, 128.33, 127.89, 127.67, 127.46, 127.03, 125.79, 125.75, 125.70, 125.65, 122.07, 118.47, 113.15, 63.33, 61.48, 36.05, 31.10, 14.39.
(2) 펩티드결합단계 1 : 카르복시기의 형성
<Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-imidazole-2-carboxylic acid의 제조>
전기 캡핑단계에서 수득한 ethyl 1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-imidazole-2-carboxylate( 0.69 g, 1.65 mmol)을 THF / H2O (27.40 mL / 13.70 mL)에 용해하고 1N LiOH (4.57 mL)를 가한 뒤 상온에서 교반하였다. 15시간 경과 후 반응액을 1N HCl로 pH 2.0까지 산성화시킨 뒤, EA와 물을 가하여 추출하였다.
유기층은 NaCl 수용액으로 세척한 뒤, 무수 MgSO4 로 수분을 건조시키고, 용매를 농축하여 제거하고 EA와 n-hexane으로 재결정하여 하얀색 고체인 카르복시산 methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-imidazole-2-carboxylic acid(0.52 g, 80.94 %)를 얻었다.
상기 카르복시화된 카바메이트 화합물의 화학적 특성은 다음과 같이 나타났다 : TLC (EA : MeOH : H2O = 24:5:4) R f :0.33; 1H NMR (DMSO-d
6 ) 10.15 (brs, 1H), 7.65 (d, J = 8.4, 2H), 7.57 (d, J = 8.1, 2H), 7.28 (s, 1H), 4.25 (t, J = 6.6, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.36 (t, J = 6.5, 2H);
13C NMR (DMSO-d 6) 160.02, 153.24, 141.94, 137.34, 132.06, 129.70, 127.14, 126.39, 126.10, 125.96, 125.78, 125.73, 125.54, 125.11, 122.50, 118.90, 113.61, 62.33, 35.51, 30.19.
(3) 산화단계 : Tsc기의 형성
<1-Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-imidazole-2-carboxylic acid의 제조>
전단계에서 얻어진 1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-phenylsulfanyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-imidazole-2-carboxic acid(1.00 g, 2.57 mmol)를 Acetone(30 mL)에 용해하고 Na2MoO4(0.80 mL of 0.3 M solution), H2O2
(1.50 mL of 30% solution)를 가하여 상온에서 교반하였다. 72시간 경과 후 침전물을 여과한 다음 Acetone과 EA로 세척하여 1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl- benzenesulfonyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-imidazole-2-carboxylic acid(0.73 g, 67.59 %)(하얀색의 고체)를 얻었다.
Tsc기를 가지는 상기 화합물의 각종 화학적 특성은 다음과 같았다 : TLC (EA : MeOH : H2O = 24:5:4) R
f = 0.17; 1H NMR (DMSO-d
6 ) 9.82 (brs, 1H), 8.14 (d, J = 7.8, 2H), 8.00 (d, J = 7.8, 2H), 7.94 (brs, 1H), 7.06 (s, 1H), 4.36 (brs, 2H), 3.87 (brs, 3H); 13C NMR (DMSO-d
6 ) 160.04, 152.50, 143.22, 136.96, 134.04, 133.61, 133.18, 132.75, 132.32, 128.86, 126.60, 125.14, 121.52, 117.93, 113.22, 56.97, 54.15, 35.43; HRMS (FAB) for C15H14F3N3
O6S (M + Na+), calcd 444.0375, found 444.0464.
(4-1) 펩티드결합단계 2 : 펩티드결합의 형성 예 1
<1-Methyl-4-({1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)ethoxy-carbonylamino]-1H-pyrrole-2-carbonyl}-amino)-1H-imidazole-2-carboxylic acid ethyl ester의 제조>
EtOAc (20 mL)에 1-methyl-4-nitroimidazole-2-ethyl ester( 2.56 g, 12.85 mmol)를 용해한 후, 10 % Pd/C (100 mg, catalytic weight)을 가하고 수소 분위기의 상온에서 10시간 동안 교반하여 니트로기(NO2)를 아미노기(NH2)로 환원시켜 이미다졸형 아미노산 유도체를 얻었다. 10% Pd/C는 celite 545를 사용하여 여과한 후, EA 와 methanol로 세척한다. 무수 DMF (6 mL) 및 DCM (2 mL)의 용액에 1-Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (49.98 mg, 0.1189 mmol), PyBroP (166.29 mg, 0.3567 mmol) 및 DIEA (62.13 L, 0.3567 mmol)을 가하고 전기 실시예 2의 (4-1)과 같은 방법으로 반응시켜 연한 노란색의 고체인 1-Methyl-4-({1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)ethoxy-carbonylamino]-1H-pyrrole-2-carbonyl}-amino)-1H-imidazole-2-carboxylic acid ethyl ester(51.05 g, 75.12 %)를 얻었다.
상기 얻어진 화합물의 화학적 특성은 다음과 같다 : TLC (EA : n-hexane = 3:1) R
f = 0.23; 1H NMR (CDCl3) 8.33 (s, 1H), 8.10 (d, J
= 8.1Hz, 2H), 7.86 (d, J
= 8.1 Hz, 2H), 7.54 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.51 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 4.40 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 3.56 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 1.41 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
(4-2) 펩티드결합단계 2 : 펩티드결합의 형성 예 2
<1-Methyl-4-({1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxy-carbonylamino]-1H-imidazole-2-carbonyl}-amino)-1H-imidazole-2-carboxylic acid ethyl ester의 제조>
EtOAc (20 mL)에 1-methyl-4-nitroimidazole-2-ethyl ester( 2.56 g, 12.85 mmol)를 용해한 후, 10 % Pd/C (100 mg, catalytic weight)을 가하고 수소 분위기의 상온에서 10시간 동안 교반하여 니트로기(NO2)를 아미노기(NH2)로 환원시켜 이미다졸형 아미노산 유도체를 얻었다. 10% Pd/C는 celite 545를 사용하여 여과한 후, EA 와 methanol로 세척한다. 무수 DMF (6 mL) 및 DCM (2 mL)의 용액에 1-Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxycarbonyl-amino]-1H- imidazole-2-carboxylic acid (50.10 mg, 0.1187 mmol), TFFH ( 94.21 mg, 0.3567mmol), HOAt (64.74 mg, 0.4748 mmol) 및 DIEA (82.85 L, 0.4748 mmol)을 가하고 전기 실시예 2의 (4-1)과 같은 방법으로 반응시켜 연한 노란색의 고체 1-Methyl-4-({1-methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxy-carbonylamino]-1H-imidazole-2-carbonyl}-amino)-1H-imidazole-2-carboxylic acid ethyl ester(37.00 g, 54.45%)를 수득하였다.
상기 얻어진 화합물의 화학적 특징은 다음과 같이 나타났다 : TLC (EtOAc : n-hexane = 3:1) R
f = 0.26; 1H NMR (CDCl3) 9.42 (s, 1H), 8.09 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 4.52 (bt, 2H), 4.42 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.03 (s, 3H), 4.02 (s, 3H), 3.57 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.44 (t, J =7.1 Hz, 3H).
실시예 4 : 본 발명의 방법에서 디캡핑 시에 부반응 발생여부 확인
본 발명에 의한 방법에 따라 펩티드를 합성하는 과정 중에서 디캡핑시에 부반응이 발생되는지 여부를 간접적으로 확인하였다.
즉, 염기 예를들면 피페리딘을 가하여 반응시키는 디캡핑단계에서 β수소제거반응의 부산물인 화학식 (11) 화합물이 만들어지는지, 아니면 피페리딘 유도체인 화학식 (12) 화합물이 만들어지는지를 확인하였다(반응식 5).
반응식-5
1-Methyl-4-[2-(4-trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethoxycarbonylamino]-1H-imidazole-2-carboxylic acid (30 mg, 0.07 mmol)에 20 % piperidine (DMF (2mL))을 가하여 상온에서 0.5시간 동안 교반한다. 반응물에 물과 diethyl ether를 넣고 추출하여 유기층은 무수 MgSO4로 수분을 건조시킨 뒤, 용매를 농축한다. 결과물을 chromatography (EA:n-hexane = 1:1)로 분리하여 하얀색 고체(22.6 mg, 99 %)를 수득하였다.
얻어진 화합물을 NMR과 액체상 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석한 결과, 1-[2-(4-Trifluoromethyl-benzenesulfonyl)-ethyl]-piperidine로 확인되었다.
즉, 디캡핑 반응과정에서 다음 반응식에서처럼 부산물이 피페리딘 유도체인 것을 알 수 있었다.
얻어진 분산물의 화학적 특성은 다음과 같았다 : TLC (EA:n-hexane = 1:1) R
f = 0.38; 1H NMR (CDCl3) 8.07 (d, J = 8.4, 2H), 7.83 (d, J = 8.4, 2H), 3.34 (t, 2H), 2.74 (t, 2H), 2.27 (s, 4H), 1.35 (s, 6H); 13C NMR (CDCl3) 128.65, 126.12, 126.07, 126.02, 125.97, 54.08, 53.62, 51.95, 25.66, 23.97.
따라서 본 발명의 방법에 의하면 부반응을 유발하는 화학식 (11)과 같은 유형의 화합물이 발생하지 않기 때문에 종래 Fmoc 기를 활용하는 것에 비해 매우 효율적으로 원하는 펩티드를 획득할 수 있게 된다.
본 발명에 의한 보호기에 의해 펩티드 합성을 효율적으로 할 수 있게 된다.
본 발명에 의한 보호기인 Ttc 또는 Tsc기는 염기 조건 하에서 용이하게 디캡핑되므로 종래 Fmoc을 이용한 펩티드 합성 방법을 그대로 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 보호기는 화학적, 열적 안정성이 우수하고 유기용매에서 화합물의 용해도를 증가시켜 주므로 aliphatic 아미노산 뿐만 아니라 방향족 및 헤테로고 리 아미노산의 아미노기 보호기로도 사용할 수 있다.
또한 본 발명에 의하면 저렴한 메틸 또는 에틸 에스터 형태의 아미노산을 시작물질로 사용할 수 있게 되어 경제적으로 펩티드를 합성할 수 있게 된다.
Claims (10)
- 하기 화학식 (1)로 표시되는 카본산 에스테르 화합물.화학식 (1)
[여기서 X는 파라나이트로페닐옥시, 이미다조일, Cl 또는 BrY는 S,Ar은 불소기가 포함된 아릴기] - 제 1 항에 있어서, 상기 Ar기는중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 카본산 에스테르 화합물.
- arylhalide의 불화유도체와 mercaptoethanol을 반응시켜 2-(phenylsulfanyl)- ethanol의 불화 유도체를 얻는 단계; 및상기 2-(phenylsulfanyl)-ethanol 불화 유도체를 파라나이트로페닐옥시, 이미다조일, Cl 또는 Br과 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 의한 카본산 에스테르 화합물의 제조방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 arylhalide는 arylchloride인 것을 특징으로 하는 제 1 항에 의한 카본산 에스테르 화합물의 제조방법.
- 제 1 항에 의한 카본산 에스테르 화합물로 아미노기를 보호하는 방법.
- 제 1 항에 의한 카본산 에스테르 화합물로 아미노기가 보호된 화학식 (2)로 표시되는 화합물.화학식 (2)
[여기서 Y는 S 또는 SO2Ar은 불소기가 포함된 아릴기R은 카르복시산 또는 에스테를 포함한 아미노산 및 그 유도체, 카르복시산 또는 에스테르를 포함한 헤테로 고리 화합물] - 제 6 항에 있어서, 상기 Ar기는중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 카본산 에스테르 화합물.
- 펩티드 합성방법에 있어서,(A) 제 1 항에 의한 카본산 에스테르로 카르복시산 또는 에스테를 포함한 아미노산 및 그 유도체, 카르복시산 또는 에스테르를 포함한 헤테로 고리 화합물의 아미노기를 보호하는 캡핑단계;(B) 상기 화합물의 에스테르를 산화시켜 가르복시산으로 변환하는 카르복시산 형성단계;(C) 상기 카르복시산이 형성된 화합물의 카르복시기와 카르복시산 또는 에스테를 포함한 아미노산 및 그 유도체, 카르복시산 또는 에스테르를 포함한 헤테로 고리 화합물의 아미노기 사이를 결합시키는 펩티드결합단계;(D) 상기 카본산 에스테르 부위의 S를 산화시켜 SO2로 변환하는 산화단계; 및(E) 상기 펩티드결합단계를 거친 화합물을 염기조건에서 상기 카본산 에스테르 부위(moiety)를 제거하는 디캡핑단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드 합성방법.
- 제 8 항에서, 상기 (D) 산화단계는 상기 (A) 캡핑단계와 상기 (E) 디캡핑단계 사이의 어느 단계 전후에 위치하는 것을 특징으로 하는 펩티드 합성방법.
- 제 8 항에서, 상기 (D) 산화단계는 (E) 디캡핑단계와 동시에 이루어지는 것을 특징으로 하는 펩티드 합성방법.
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