KR100571847B1

KR100571847B1 - 이온성 첨가물을 이용한 마이크로웨이브에 의한 세포 용해방법

Info

Publication number: KR100571847B1
Application number: KR1020040113689A
Authority: KR
Inventors: 정성영; 백상현; 박종면; 한기웅; 정종석; 이정남
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2004-12-28
Filing date: 2004-12-28
Publication date: 2006-04-17
Also published as: US20060141556A1

Abstract

본 발명은 이온성 첨가물을 이용한 마이크로웨이브에 의한 세포 용해 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은, 용해시키고자 하는 세포 샘플을 준비하는 단계; 상기 샘플에 이온성 첨가물을 첨가하는 단계; 및 상기 이온성 첨가물이 첨가된 샘플에, 일반 전자레인지를 이용하여, 원하는 정도의 세포 용해를 일으킬 수 있는 시간 동안 마이크로웨이브를 조사하여, 샘플 내 세포를 용해시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법에 의하면, 고가의 마이크로웨이브 장비가 아닌 통상의 마이크로웨이브를 사용하면서도, 샘플의 양에 구애받지 않고, 샘플의 온도가 신속하게 상승하여 빠른 시간 내에 세포 용해가 일어나도록 하며, 후속하는 PCR 과정에서 저해작용을 일으키지 않는 세포 용해를 수행할 수 있다.

Description

이온성 첨가물을 이용한 마이크로웨이브에 의한 세포 용해 방법 {Method for microwave cell lysis using ionic additives}

도 1 은 CHAPS를 첨가하여 마이크로웨이브 처리한 것과, 아무것도 첨가하지 않고 마이크로웨이브 처리한 것에 대한 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 여러가지 쌍성이온 화합물을 첨가하여 마이크로웨이브로 처리한 결과물에 대한 검출 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 마이크로웨이브를 이용한 세포 용해 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마이크로웨이브의 조사에 의한 열을 이용하여 세포를 용해하는 방법에 있어서 이온성 첨가물을 이용함으로써 보다 효율이 높고 시간과 비용을 낮출 수 있는 방법에 관한 것이다.

세포 용해는 세포막을 파괴하여 세포 내 물질을 방출시키기 위한 과정을 말하는데, 주로 PCR과 같은 증폭 과정의 전단계에서, DNA 또는 RNA를 분리하기 위하여 세포로부터 방출시키는 과정을 말한다.

세포 용해는 통상적으로 기계적, 화학적, 열적, 전기적, 초음파 및 마이크로 웨이브 방법으로 수행된다.

화학적인 방법은, 일반적으로 세제, 용매, 또는 효소 등을 사용한다. 세제는 지질 이중층을 파괴하여 세포의 내용물을 방출시키며, 막 단백질을 용해하는데, 이는 동물 세포를 용해하기 위해 가장 일반적으로 사용되며, 많은 세제는 단백질을 변성시킨다. 그러나, 세포 용해를 위해 따로 시약을 첨가해야 하고, 그에 대한 후속 제거공정이 필요하며, PCR 저해 작용이 일어나기도 하며, 시간이 오래 걸린다는 문제점이 있다.

열에 의한 방법에 의해서도 세포 용해가 수행된다. 예를 들면, 핫 플레이트와 같은 고온의 물체에 세포를 열적으로 접촉시킴으로써 세포 용해를 수행하는데, 이러한 열적인 방법은 통상 시간이 오래 걸리고, 샘플 내 수분을 증발시킴으로써 샘플이 건조해져 버린다는 문제점이 있다. 또한 단백질을 변성시킴으로써 PCR 저해 작용을 하기도 한다.

초음파 처리를 이용해 세포 용해를 수행하기도 한다. 이 방법은, 세포 용액 또는 현탁액을 초음파 수조에 위치한 챔버 내에 놓고 초음파 처리를 한다. 그러나 이러한 초음파 파괴는 세포 용해에서 많은 단점을 가진다. 우선, 초음파의 에너지 분포가 균일하지 않음으로써, 일관성 없는 결과를 초래하고, 두 번째로, 초음파 수조는 용기에 에너지를 집중시키지 못하므로, 세포의 파괴를 완성하는데 더 많은 시간이 소비된다는 문제점이 있다.

또한 마이크로웨이브를 조사하여 세포 용해를 수행하기도 한다. 마이크로웨이브에 의한 세포 용해는 열에 의한 세포 용해의 일종으로서, 마이크로웨이브를 조 사하여 세포 용해에 필요한 정도로 세포를 가열하는 방법에 의한다. 세포 용해 방법으로서 마이크로웨이브에 의한 가열은 통상의 가열 방법에 비하여 훨씬 빠르고 효율적으로 가열할 수 있으며, 스위치의 온 오프에 의하여 조절이 용이하고, 시간이 짧음으로써 샘플의 과도한 증발을 감소시킬 수 있다.

이와 같이, 마이크로웨이브 조사에 의한 세포 용해 방법은, 진단 등의 신속성을 위해 핵산의 추출이 신속하고 간단하게 이루어져야 한다는 요구에는 잘 부응하지만, 이 방법은 샘플을 담은 용기 내에서 증기압의 증가로 인해 폭발이 일어나기도 하고, 통상의 2.45 GHz라는 주파수에서 샘플의 양이 적을 때, 즉 이 주파수의 마이크로웨이브의 파장에 대응될 정도로 작은 크기의 샘플에 있어서는 세포 용해에 오랜 시간이 소요되어 효율적이지 못하다는 단점이 있었다. 또한 샘플의 양이 적은 경우 쉽게 건조되어 용기 벽에 붙어버림으로써 추출된 핵산을 다음 단계에 이용하는 것이 어려운 경우도 종종 있었다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 여러 가지 시도가 있었는데, 미국 특허 제6,623,945호는, 마이크로웨이브의 주파수를 20 GHz 이상으로 높여서 파장을 짧게 함으로써 크기가 작은 샘플에 대해서도 세포 용해 효율을 높이고자 하였다. 그러나, 이 방법은 주파수를 높이기 위해 고가의 마이크로웨이브 장비를 이용하므로, 장비가 없는 경우에는 이 방법을 적용할 수 없으며, 상기와 같이 높은 주파수를 이용하기 위하여는 반드시 고가의 장비를 구입해야만 하므로 실용화에 어려움이 있었다.

따라서, 본 발명의 발명자들은, 상기 마이크로웨이브에 의한 세포 용해 방법 의 단점을 보완하기 위하여, 고가의 마이크로웨이브 장비가 아닌 통상의 마이크로웨이브를 사용하면서도 작은 양의 샘플에 대하여 적용이 가능하며, 증기압이 증가되지 않아서 폭발의 위험이 없고, 샘플의 온도가 신속하게 상승하여 빠른 시간 내에 세포 용해가 일어나도록 하며, 동시에 후속하는 PCR 과정의 저해작용이 없는 세포 용해 방법을 개발하던 중, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은, 마이크로웨이브를 이용하여 세포를 용해시켜 핵산을 추출할 때, 적절한 이온성 첨가물을 넣어줌으로써, 마이크로웨이브 조사시 증기압의 상승을 억제하고, 낮은 주파수에서도 샘플의 온도를 신속하게 효율적으로 상승시킬 수 있는 세포 용해 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

용해시키고자 하는 세포 샘플을 준비하는 단계;

상기 샘플에 이온성 첨가물을 첨가하는 단계; 및

상기 이온성 첨가물이 첨가된 샘플에, 일반 전자레인지를 이용하여, 원하는 정도의 세포 용해를 일으킬 수 있는 시간 동안 마이크로웨이브를 조사하여, 샘플 내 세포를 용해시키는 단계를 포함하는 세포의 용해 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 이온성 첨가물은, 쌍성이온(zwitterions) 화합물일 수 있으며, 상기 쌍성이온 화합물은, 동량의 양전하와 음전하를 포함하는 화합물이라면 모두 가능하며, 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 CHAPS(3[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonio]-propanesulfonic acid), CAPS(3-(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid), CAPSO((3-[cyclohexylamino]-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid), 및 CHES(2(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid )로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.본 발명의 상기 세포 용해 방법에 있어서, 첨가하는 상기 이온성 첨가물은, 이온성 액체(ionic liquid)일 수 있으며, 상기 이온성 액체는, 공지된 이온성 액체를 모두 사용할 수 있으며, 그 예는 Merck 사에 의해 공지된 Ionic Liquids 에 기재된 화합물들로부터 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 방법을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 세포 용해 방법은, 용해시키고자 하는 세포 샘플을 준비하는 단계; 상기 샘플에 이온성 첨가물을 첨가하는 단계; 및 상기 이온성 첨가물이 첨가된 샘플에, 일반 전자레인지를 이용하여, 원하는 정도의 세포 용해를 일으킬 수 있는 시간 동안 마이크로웨이브를 조사하여, 샘플 내 세포를 용해시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 용해시킬 수 있는 세포는 특별히 제한되지 않으며, 세포 샘플 역시 세포를 포함하는 것이라면, 그 양과 종류에 구애를 받지 않고 어떠한 시료라도 사용이 가능하다. 세포 샘플의 종류는, 미생물 균주를 포함하는 세포 현탁액 뿐만 아니라, 인간의 타액, 혈액, 기타의 모든 세포를 포함하는 샘플이 사용 가능하다. 또한 샘플의 양은, 특별히 제한되지 않으며 모두 적용이 가능하다.

상기 샘플에 첨가하는 이온성 첨가물은, 쌍성이온(zwitterion) 화합물, 이온성 액체, 기타 전하(양전하, 또는 음전하 또는 양전하와 음전하를 동시에)를 띠는 화합물이 사용 가능하다.

첨가물로서 사용 가능한 쌍성 이온 화합물은, 분자 내에 양전하와 음전하를 모두 포함하는 화합물로서, 이러한 형태에서는 분자간 전기적 인력과 수소결합 상호작용이 가장 크게 된다. 이러한 쌍성 이온 화합물과 혼합된 샘플에 마이크로웨이브를 조사하면, 이온 교차로 인한 마찰이 극대화되고, 온도 상승 효과가 비약적으로 빨라진다.

본 발명의 방법에 있어서는, 상기와 같은 특징을 갖는 쌍성 이온 화합물이라면 어떠한 것이라도 샘플에 첨가하여 사용할 수 있다. 바람직하게 사용할 수 있는 쌍성 화합물은, 특별히 제한되지는 않지만, CHAPS, CAPS, CAPSO, 및 CHES로 구성된 군으로부터 선택할 수 있다.

이와 같이, 사용가능한 쌍성 이온 화합물은 특별히 제한되지는 않지만, 단, 이러한 쌍성 이온 화합물과 샘플의 혼합물에 마이크로웨이브를 조사하여 세포 용해를 수행했을 때, 추출된 DNA에 흡착되거나 또는 기타의 이유로 PCR 증폭을 불가능하게 하는 등의 PCR 저해를 나타내는 화합물들은 사용이 불가능하다. 예를 들면, 하기 실시예에서도 설명하는 바와 같이, Merquat 2001, Merquat 3331, Merquat 281 등은 비등점 도달 시간이 매우 짧아서 온도 상승 효율이 비교적 높은 쌍성 이온 화합물들이지만, 이러한 화합물들의 사용은 바람직하지 않다. 왜냐하면, 예를 들어 Merquat 281 등의 화합물의 경우, 일렬로 양이온과 음이온이 50 개 정도 씩 나열된 구조를 갖기 때문에, DNA에 쉽게 흡착되어 후속하는 PCR 과정을 원하는 대로 수행할 수가 없다는 문제점이 있기 때문이다. 또한, 첨가물로서 사용가능한 이온성 액 체는 이온 결정의 용융상태와 같은 액체를 말하는 것으로서, 완전한 이온으로만 구성되며, 마이크로웨이브를 고효율로 흡수하는 특징을 지닌다. 특히, 이온성 액체는 일반적으로 200 C의 온도까지도 비교적 불활성이고 안정하기 때문에, 샘플에 마이크로웨이브 조사시 갑작스런 증기압의 상승으로 인한 폭발을 막을 수 있으며, 따라서 보다 안정적으로 온도 상승에 의한 세포 용해를 수행할 수 있다.

상기 이온성 액체는, 특별히 제한되지 않으며, 사용가능한 이온성 액체에 관하여는 Ioinic Liquids (Mercks), Organic Synthesis Using Microwaves and Supported Reagents, R.S. Varma in "Microwaves in Organic Synthesis," A. Loupy (Ed.), Wiley-VCH, Weinheim, Chapter 6, pp 181-218 (2002), Microwave Organic Synthesis, R.S. Varma in "McGraw -Hill Yearbook of Science and Technology 2002", pp 223-225, McGraw-Hill, New York, NY (2001), 및

An Expeditious Solvent-Free Route to Ionic Liquids Using Microwaves, R.S. Varma and V.V. Namboodiri: Chem . Commun., 643 (2001) 를 참조한다. 특히, 본 발명에 사용하기에 바람직한 이온성 액체의 구체적인 예로는, 알킬피리디늄 양이온류, 및 디알킬이미다졸륨 양이온류가 있다.

또한 본 발명의 방법에 있어서, 상기 쌍성 이온 화합물 및 이온성 액체 외에도, 마이크로웨이브의 효과를 극대화시키고 샘플의 온도 상승을 안정화시킬 수 있는, 전하를 갖는 기타의 첨가물이라면 어떠한 화합물도 사용가능하다. 양전하, 음전하, 또는 양전하와 음전하를 동시에 띠는 화합물을 사용할 수 있는데, 사용가능한 전하를 띠는 화합물들은 특별히 제한되지는 않지만, 단, 이러한 전하를 띠는 화 합물과 샘플의 혼합물에 마이크로웨이브를 조사하여 세포 용해를 수행했을 때, 추출된 DNA에 흡착되거나 또는 기타의 이유로 PCR 증폭을 불가능하게 하는 등의 PCR 저해를 나타내는 화합물들은 사용이 불가능하다. 예를 들면, 하기 실시예에서도 설명하는 바와 같이, SDS는 비등점 도달 시간이 현격하게 짧아서 온도 상승 효율이 비교적 높고 세포 용해도 잘 일어나지만, 이러한 화합물들의 사용은 바람직하지 않다. 왜냐하면, SDS를 첨가한 경우, SDS의 세제 특성으로 인하여, 세포 단백질의 변성이 일어나며, 또한 추출된 핵산으로 PCR을 수행한 결과 PCR 밴드가 형성되지 않는 등의 PCR 저해 작용이 일어난다는 문제점이 있었기 때문이다.

상기와 같은 이온성 첨가물의 첨가량은, 본 발명을 한정하는 데 있어서 특히 중요한 것은 아니며, 당업자가 원하는 세포 용해를 수행함에 있어서, 세포의 종류와 샘플의 농도, 그리고 사용하는 이온성 첨가물의 종류에 따라서, 실험을 통하여 적절한 양으로 조절하여 첨가가 가능하다. 단, 각 첨가물에 따라서, PCR 저해를 일으키지 않는 함량으로 선택하는 것이 중요하며, 이것에 대하여는 당업자라면 누구나 알 수 있을 것이다. 예를 들면, 혈액 시료나 타액 시료를 사용하고, 이온성 첨가물로서 CHAPS 등의 쌍성 이온 물질을 사용하는 경우에는, 샘플 양에 대하여 이온성 첨가물의 첨가량은, 세포 샘플의 종류에 따라서, 원하는 세포 용해의 정도에 따라서 당업자가 적절히 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 상기와 같이 이온성 첨가물이 첨가된 샘플에, 일반 전자레인지를 이용하여, 원하는 정도의 세포 용해를 일으킬 수 있는 시간 동안 마이크로웨이브를 조사하여, 샘플 내 세포를 용해시킨다.

본 발명의 상기 방법에 있어서, 이온성 첨가물이 첨가된 샘플에 마이크로웨이브를 조사하는 방법은 일반 전자레인지를 이용한다. 모든 일반 전자레인지는 현재 약 2.45 GHz의 주파수로 표준화된 주파수를 사용하고 있는데, 별도의 고가의 마이크로웨이브 장비 없이, 일반 전자레인지를 손쉽게 사용하면서도 모든 종류와 양의 세포 샘플에 대하여 고효율로 세포 용해를 수행할 수 있다는 것은 본 발명의 큰 효과 중 하나이다.

즉, 일반 전자레인지의 주파수는 약 2.45 GHz로 모두 표준화되어 있는데, 상기 주파수 대의 마이크로웨이브의 파장을 이용할 경우에는, 시료가 소량일 경우 온도 상승에 너무 긴 시간이 소요된다는 문제점이 있었다. 예를 들면, 혈액 샘플의 경우 등에 있어서 핵산의 분리에 사용되는 시료가 소량인 점을 감안 할 때, 신속하고 효율적인 세포 용해가 수행될 수 없다는 단점이 생긴다. 상기 문제점을 해결하기 위하여, 상기에서 살펴본 바와 같이, 미국 특허 제 6,623,945 호는 주파수 대가 18 내지 26 GHz인 마이크로웨이브 장비를 이용하는 것을 제안하고 있지만, 본 발명에서는 이러한 고가의 장비를 이용하지 않고, 일반 전자레인지의 주파수를 그대로 이용하면서, 대신 이온성 첨가물에 의하여 효율적인 온도 상승을 가능하게 한다.

이와 같이 본 발명의 방법에 의하면, 세포 샘플의 양에 관계없이 낮은 주파수에서도 빠른 시간 내에 온도 상승을 가능하게 함으로써 세포 용해의 효율이 증가된다. 또한 원하는 세포 용해 온도에 도달하는 시간을 단축시킴으로써 증기압의 과도 상승을 억제하여, 고온에서도 샘플을 안정화시킨다.

상기와 같이, 본 발명에 의하면 이온성 첨가물을 샘플에 첨가하여 마이크로 웨이브를 조사함으로써 세포 용해를 현저하게 촉진할 수 있었다. 본 발명자들은, 이러한 효과에 대하여, 세제의 성질을 띠는 이온성 첨가물 자체의 화학적 세포 용해 효과와 마이크로웨이브의 열적 세포 용해 효과가 단순히 합쳐진 효과인지 아니면 그보다 더한 상승 효과가 있는지에 대하여 시험해 보았다(하기 실시예 2). 시험한 결과, 본 발명의 세포 용해 효과를 나타내는 1분 이하의 짧은 시간에서는 세제 자체만으로는 화학적 세포 용해 효과를 거의 일으킬 수 없다는 사실이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명에서 이온성 첨가물은 그 자체의 세포 용해 효과를 나타내는 것이 아니라, 마이크로웨이브의 효과를 극대화시키는 상승 효과에 큰 역할을 하는 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

첨가물의 종류에 따른 비등점 도달 시간 측정

E. coli 세포 샘플에 대하여 여러가지 종류의 첨가물을 첨가한 후, 마이크로웨이브를 조사하여 비등점에 도달하는 시간을 측정하였다. 상세한 방법은 다음과 같이 하였다.

먼저, E. coli 현탁액 (3 ml)를 37℃에서 대수기까지 LB 배지에서 호기 조건 하에 24 시간 배양하였다. 박테리아 세포를 원심분리로 수합하고, 5 ml의 인산염 완충액(PBS)으로 2회 세정하였다. 세포를 PBS에서 재현탁하였다.

상기와 같이 제조한 세포 현탁액 2 ml에 0.2g의 이온성 첨가물을 첨가한 후, 일반 전자레인지에 놓고 마이크로웨이브를 가동시켜서, 육안 관찰에 의해 비등하는 시점까지의 시간을 측정하였다.

비등점에 도달한 세포 샘플에 대하여 원심분리를 행하고 관찰한 결과, 세포 펠렛이 형성되지 않고, 세포가 상당 부분 파괴되었음을 육안으로 확인할 수 있었다.

첨가물을 다양한 종류로 첨가한 샘플에 대하여 비등점 도달 시간을 측정한 결과 하기 표 1과 같았다.

첨가물	비등점 도달시간
증류수 (Gibco)	5:20
Triton X-100(비이온성) (Sigma)	6:00
Merquat 2001(쌍성이온성) (ONDEO Nalco)	1:00
Merquat 3331(쌍성이온성) (ONDEO Nalco)	1:16
Merquat 281(쌍성이온성) (ONDEO Nalco)	0:20
SDS(음이온성) (Sigma)	0:09
스몰 비드 (Sigma)	2:30
라지 비드 (Ssigma)	2:30
모래 (Sigma)	2:30
CHAPS(쌍성이온성) (Aldrich )	0:26
CAPS(쌍성이온성) (Aldrich)	0:26
CAPSO(쌍성이온성) (Aldrich)	0:30
CHES(쌍성이온성)(Aldrich)	0:30

상기 표 1에 나타난 결과를 설명하면 다음과 같다.

먼저, 샘플에 첨가물로서 증류수를 사용하여 일반 전자레인지로 가열하였을 경우에는 온도 상승 시간이 매우 느린 것으로 나타났다. 또한 비이온성 세제인 Triton X-100을 첨가하여 마이크로웨이브를 조사한 결과 역시 온도 상승 시간이 매우 느리게 나타났다. 이와 같은 결과로부터, 물이나 비이온성 세제는 마이크로웨이브의 효과에 아무런 영향을 주지 못하고, 따라서 물이나 비이온성 세제를 첨가한 샘플은 일반 전자레인지를 사용하여서는 효과적인 세포 용해를 수행할 수 없다는 것을 알 수 있었다.

또한, 상기 표 1을 보면, 샘플에 첨가물로서 Merquat 2001, Merquat 3331, Merquat 281, CHAPS, CAPS, CAPSO, CHES의 쌍성이온성 화합물을 사용하여 일반전자레인지로 가열하였을 경우, 온도 상승 시간이 매우 단축되는 것으로 나타났다. 즉, 열효과를 매우 크게 할 수 있는 비드(스몰 비드, 라지 비드, 모래)를 사용하는 경우보다도 온도 상승 시간이 매우 단축되었다. 그러나, Merquat 2001, Merquat 3331, Merquat 281은, 분리된 DNA를 흡착하는 성질을 가지고 있으므로, 후속하는 PCR 공정에서 이용할 수 없다는 문제점이 있었다. 이와 같이, 쌍성이온성 화합물로서 마이크로웨이브 효과를 증대시킨다 하더라도, PCR 저해 효과를 나타낸다면, 본 발명의 이온성 첨가물로서 사용할 수 없다. 이것은 당업자라면 쉽게 판단할 수 있을 것이다.

상기의 쌍성 이온성 화합물 중에, CHAPS, CAPS, CAPSO, CHES는 비등점 도달 시간을 현저하게 줄였으며, 후속하는 PCR 공정의 수행도 전혀 방해하지 않았다. 따라서 상기 화합물들을 따로 제거하는 과정도 필요가 없었다.

또한 표 1에서와 같이, 전하를 갖는 화합물로서, SDS를 첨가물로 이용하였을 때, 샘플의 온도 상승 효과는 매우 큰 것으로 나타났다. 그렇지만, 이렇게 SDS를 첨가한 샘플 역시 후속하는 PCR 공정에서 테스트해 본 결과, PCR 밴드가 형성되지 않는 것으로 나타났다. 이와 같이 전하를 갖는 화합물 중에서도 PCR 저해가 없는 것을 선택하여 사용하는 것이 바람직하며, 이것은 당업자라면 쉽게 이해할 것이다.

비교예 1

상기 실시예 1에서 현저한 세포 용해 효과를 나타낸 CHAPS, CAPS, CAPSO, CHES에 대하여, 마이크로웨이브를 조사하지 않은 비교 실험을 다음과 같이 행하였다.

즉, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 준비한 세포 현탁액에, 동일한 양과 조건으로 상기 첨가물을 각각 첨가하고, 마이크로웨이브를 조사하지 않고 30 초간 둔 후, 세포 용해 여부를 관찰하였다.

세포 용해 여부는 상기 실시예 1과 같이, 원심분리 한 후, 육안으로 관찰하였는데, 마이크로웨이브를 조사하지 않은 본 비교예에서는, 세포 펠렛이 뚜렷하게 형성됨으로써, 세포가 거의 용해되지 않았음을 알 수 있었다.

상기 결과로부터, 상기 실시예 1의 세포 용해 효과는, CHAPS, CAPS, CAPSO, CHES과 같은 쌍성 이온 화합물들의 화학적 용해 효과로 인한 것이 아님을 명확히 알 수 있었다.

실시예 2

인간의 타액에 대하여 세포 용해 효과를 다음과 같이 시험하였다.

침 2ml에 CHAPS, CAPS, CHES를 각각 10% 농도로 넣고 전자레인지에서 끊는 시점까지 가열하여 세포 용해를 행하였다. 대조구로 화합물을 넣지 않은 침을 사용 하여 동일한 방법으로 세포 용해를 행하였다.

세포 용해 결과를 확인하기 위하여, 상기와 같이 세포 용해를 행한 샘플 1ul를 취해 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같다.

각각 cy3가 표지된 프라이머(프라이머 0.68uM, 0.2mM dNTP, 2X PCR 버퍼(Solgent, korea), 그리고 2.5u Taq DNA 폴리머라아제(Solgent, korea)를 50ul에서 반응시켰다. 초기 변성은 95℃, 1분, 그 후 변성은 95℃, 5초, 어닐링은 60℃, 13초, 신장반응은 72℃, 15초로 25 사이클을 수행하고 마지막 신장반응은 72℃, 1분을 수행하였다. PCR 산물는 3.5% 아가로스 겔 상에서 확인하였다. 그러나 아가로스 겔 상의 결과로는 세포 용해 결과가 잘 확인되지 않았다. 따라서, 다음과 같은 박테리아 칩을 제작하여 세포 용해 결과를 확인하였다.

-박테리아 칩의 제작

인간의 침 내에 존재할 수 있는 미생물인, 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus peumoniae), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 에루지노사( Pseudomonas aeruginosa), 레지오넬라 뉴모니아(Legionella pneumoniae), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae) , 마이코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis)의 총 10종의 박테리아를 호흡기성 감염질환 대상으로 선정하여. 각 종을 동정할 수 있는 프로브 및 프라이머를 선별하여 칩을 제작하였다. 프라이머 및 프로브는, 각 박테리 아의 16S rRNA을 다중 정렬(multiple alignment)을 통하여 불변 부위 중에서 상동성을 가지는 부분을 검색한 후, 이 부분에 대해 유니버설 프라이머를 디자인하여 200-300bp를 가지는 앰플리콘을 제조하였다. 이 앰플리콘 내의 가변 부위에 대해 종 특이적인 프로브를 디자인하였다.상기와 같은 특성을 갖는 박테리아 칩을 이용하여 타액에 대해 세포 용해 결과의 검출을 행하였다. 하이브리다이제이션 조건은, 6X SSPET 버퍼, 40℃ 온도, 3X-1X SSPET의 세척 버퍼를 이용하여, 30 분간 하이브리다이제이션 행하였다. 그 결과는 Axon Scanner를 이용하여 행하였으며, 도 1 및 도 2에 각각의 결과를 나타내었다.

도 1은, CHAPS를 첨가하여 마이크로웨이브 처리한 것과, 아무것도 첨가하지 않고 마이크로웨이브 처리한 것에 대한 검출 결과를 나타낸 것이다. 도 1의 검출 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

	CHAPS (20초)	대조군 (20초)	대조군 (40초)	미처리
HI_F	9806	240	885	90
HI_R	2762	190	527	96
SP_F	7334	230	640	96
SP_R	5130	290	1422	131

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 화합물을 첨가하지 마이크로웨이브로 세포용해를 행한 결과에 비하여, CHAPS를 첨가하여 마이크로웨이브를 행한 결과는, 40 배 정도의 세포 용해 효율이 증가하였음을 알 수 있었다. 더욱이, CHAPS를 첨가하여 마이크로웨이브를 행한 경우, 20초 만에 비등점에 도달하였으며, 침의 점도를 현저히 낮추는 효과까지도 나타내었다.

도 2는 여러가지 쌍성이온 화합물을 첨가하여 마이크로웨이브로 처리한 세포 용해 결과물에 대한 검출 결과를 나타낸 것이다. 도 2의 검출 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

	CHAPS	CAPS	CHES	대조구	미처리
HI_F2	1971	2980	3236	395	99
HI_R2	315	396	591	227	98
SP_F2	4079	9840	8460	1785	93
SP_R2	4147	6302	7229	2483	100

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 여러가지 쌍성 이온 화합물을 첨가하여 마이크로웨이브로 세포 용해를 행한 결과, 20초 만에 비등점에 도달했으며, 침의 점도를 현저히 낮추어 주는 효과도 있었다. 또한 표에서도 알 수 있는 바와 같이, 대조구에 비하여 10배 정도 세포 용해 효율이 증가하였다.

본 발명의 첨가물을 이용한 세포 용해 방법에 따르면, 고가의 마이크로웨이브 장비가 아닌 통상의 마이크로웨이브를 사용하면서도, 샘플의 양에 구애 받지 않고, 온도 상승 과정 동안 증기압이 증가되지 않아서 폭발의 위험이 없고, 샘플의 온도가 신속하게 상승하여 빠른 시간 내에 세포 용해가 일어나도록 하며, 동시에 화학물질의 제거가 필요없으므로 후속하는 PCR 과정에서 저해작용을 일으키지 않는 세포 용해를 수행할 수 있다.

Claims

용해시키고자 하는 세포 샘플을 준비하는 단계;

상기 샘플에 이온성 첨가물을 첨가하는 단계; 및

상기 이온성 첨가물이 첨가된 샘플에 마이크로웨이브를 조사하여, 샘플 내 세포를 용해시키는 단계를 포함하는 세포의 용해 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 이온성 첨가물은, 쌍성이온(zwitterions) 화합물인 것을 특징으로 하는 세포의 용해 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 쌍성이온 화합물은, CHAPS(3[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-propanesulfonic acid), CAPS(3-(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid), CAPSO((3-[cyclohexylamino]-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid), 및 CHES(2(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid )로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포의 용해 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 쌍성이온 화합물은 알킬피리디늄 양이온류, 디알킬이미다졸륨 양이온류로 구성된 군으로부터 선택되는 한 가지 이상임을 특징으로 하는 하는 세포의 용해 방법.
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