KR102114758B1

KR102114758B1 - 멤브레인 구조물을 이용한 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법

Info

Publication number: KR102114758B1
Application number: KR1020180142667A
Authority: KR
Inventors: 한형수; 이선덕; 이영미
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 경북대학교병원
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2020-05-26

Abstract

본 발명은 멤브레인 구조물을 이용한 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법에 관한 것으로서, 2장의 인접한 멤브레인 구조물을 이용하여 혈액에 존재하는 미생물의 핵산을 간단하게 추출하기 위한 혈액 시료 전처리 방법에 관한 것이다. 본 발명은 전혈 시료에서 미생물의 대부분이 혈액 세포가 아닌 혈장 성분에 존재한다는 사실에 근거하여 아주 간단한 막구조물을 이용하여 다른 기계의 도움 없이 빠르고 간편하게 혈액 세포와 혈장을 분리하는 방식을 개발하였다. 이에, 현재 시중에서는 현장에서 쉽게 핵산증폭법을 수행할 수 있는 제품들이 출시되고 있기 때문에 이런 제품과 연계하여 사용할 수 있는 혈액 시료를 간단하게 처리할 수 있는 방법이 개발된다면 현장 진단이 필요한 곳에서 유용하게 사용될 것으로 기대한다.

Description

멤브레인 구조물을 이용한 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법{Method for pretreating blood sample for nucleic acid extraction from blood borne infectious pathogens using membrane structures}

본 발명은 멤브레인 구조물을 이용한 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법에 대한 것으로, 2장의 인접한 멤브레인 구조물을 이용하여 혈액에 존재하는 미생물의 핵산을 간단하게 추출하기 위한 혈액 시료 전처리 방법에 관한 것이다.

사람에게 미생물이 침입하여 감염이 발생하였을 때에 많은 경우에 혈액에 미생물이 존재하게 된다. 따라서 미생물 감염을 진단하는 방법으로 여러 가지 진단법이 개발되어 있다. 그 중에서 혈액에 존재하는 미생물을 감지하기 위해서 핵산증폭기술을 이용하여 미생물에 특이적인 유전자를 확인하여 미생물의 존재와 종류를 감별하는 방법이 널리 사용되고 있다. 핵산증폭법을 이용할 경우 특정 미생물의 존재 유무를 확인할 수 있고 그 외에도 다양한 유전적인 특성 예를 들면, 항생제에 대한 내성 여부나 유전자 돌연변이 등을 확인할 수 있는 장점을 가지고 있다. 핵산증폭법을 수행하기 위해서는 혈액에 존재하는 미생물의 핵산을 추출하는 시료 처리 단계가 필수적으로 수반되어야 한다. 전통적으로 혈액에서 미생물 핵산을 추출하는 방법은 전혈을 원심분리하여 혈장을 분리하고 혈장에 존재하는 미생물을 파괴시킨 뒤에 핵산을 정제하는 여러 단계의 복잡한 절차를 수행하는 방식으로 구성된다. 실험 시설과 기자재가 잘 갖추어진 연구실에서는 이러한 핵산 추출 방법이 전혀 어려움 없이 수행이 가능하지만, 대다수의 임상 의료 현장 등에서는 핵산 추출과 핵산증폭이 효율적으로 이루어질 수 없기 때문에 최대한 빨리 시료를 연구시설로 운반하는 것이 중요하다. 하지만, 현장에서 혈액 시료를 바로 처리하고 핵산증폭을 실시할 수 있다면 결과를 확인할 수 있는 시간을 줄여서 즉각적인 치료가 가능하고 시료를 운송하는데 필요한 비용과 노력을 절감할 수 있을 것이다. 최근에 현장에서 분자진단을 구현하려는 많은 노력이 이루어지고 있고 진단검사키트 제품이 시장에 출시되고 있다. 하지만, 이런 제품이 가지는 결정적인 한계는 원심분리법이나 기타 기계를 사용하는 전처리법을 그대로 답습하고 있다는 점이다. 즉, 검사키트는 현장용이지만 검사에 사용되는 원료에 해당하는 핵산을 현장에서 획득할 수 없다는 문제점이 있다.

한국공개특허 US 2010-0240023 (2010.09.23 공개)

본 발명의 목적은 2장의 인접한 멤브레인 구조물을 이용하여 혈액에 존재하는 미생물의 핵산을 간단하게 추출하기 위한 혈액 시료 전처리 방법 및 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리용 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 분리된 미생물 감염 혈액을 1차 멤브레인(membrane) 상에 떨어뜨리는 단계; (2) 상기 1차 멤브레인을 통과한 혈장을 2차 멤브레인에 흡수시키는 단계; 및 (3) 상기 혈장이 흡수된 2차 멤브레인으로부터 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 혈액에서 혈구세포 및 혈장을 분리하기 위한 혈장 분리용 1차 멤브레인 및 상기 1차 멤브레인을 통과한 혈장 흡수용 2차 멤브레인을 포함하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리용 키트를 제공한다.

도 1은 멤브레인 구조물의 외형과 크기를 나타낸다.
도 2는 PCR 실험을 이용하여 대장균 특이 유전자를 증폭한 결과를 나타낸다. 원심분리법과 멤브레인 분리법의 성능을 비교한 실험으로 실험 조건에 대한 설명은 다음과 같다. 1 ~ 5: 혈액에 대장균을 섞은 다음 원심분리를 한 뒤에 분리된 혈장에서 핵산을 추출하여 PCR을 실시한 결과. 6: 혈액에 대장균을 섞지 않고 원심분리 한 뒤에 분리된 혈장에서 핵산을 추출하여 PCR을 실시한 결과. 7 ~ 12: 혈액에 대장균을 섞은 다음 멤브레인 구조물을 이용하여 분리된 혈장에서 핵산을 추출하여 PCR을 실시한 결과. 13: 음성대조군(negative control). 14: 양성대조군(positive control).
도 3은 PCR 실험을 이용하여 인간 세포 특이 유전자인 GAPDH를 증폭한 결과를 나타낸다. 원심분리법과 멤브레인 분리법의 성능을 비교한 실험으로 실험 조건에 대한 설명은 다음과 같다. 1 ~ 5: 혈액에 대장균을 섞은 다음 원심분리를 한 뒤에 분리된 혈장에서 핵산을 추출하여 PCR을 실시한 결과. 6: 혈액에 대장균을 섞지 않고 원심분리 한 뒤에 분리된 혈장에서 핵산을 추출하여 PCR을 실시한 결과. 7 ~ 12: 혈액에 대장균을 섞은 다음 멤브레인 구조물을 이용하여 분리된 혈장에서 핵산을 추출하여 PCR을 실시한 결과. 13: 음성대조군(negative control).
도 4는 GAPDH 유전자를 타겟으로 하는 PCR 실험 결과를 나타낸다. 실험 조건에 대한 설명은 다음과 같다. 1 ~ 5: 순수한 대장균에서 추출한 핵산을 이용한 핵산증폭반응 결과를 나타낸다. 6 ~ 11: 인간 혈액에서 추출한 핵산을 이용한 핵산증폭반응 결과를 나타낸다.

이에, 본 발명자들은 전혈 시료에서 미생물의 대부분이 혈액 세포가 아닌 혈장 성분에 존재한다는 사실에 근거하여 아주 간단한 막구조물을 이용하여 다른 기계의 도움 없이 빠르고 간편하게 혈액 세포와 혈장을 분리하는 방식을 개발하는데 중점을 두었다. 핵산 증폭에 적합한 수준의 핵산을 획득하는 것이 최종적인 목적이므로 이를 구현할 수 있도록 1차적으로 혈장을 분리하는 막구조물과 분리된 혈장을 저장하면서 핵산 추출에 사용할 수 있는 막구조물의 2개 구성품으로 구성하였다. 각각의 막구조물은 원하는 목적을 충실하게 달성할 수 있도록 여러 가지 막의 특성을 조절하여 기능을 최적화하는 방향으로 기술이 개발하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 (1) 분리된 미생물 감염 혈액을 1차 멤브레인(membrane) 상에 떨어뜨리는 단계; (2) 상기 1차 멤브레인을 통과한 혈장을 2차 멤브레인에 흡수시키는 단계; 및 (3) 상기 혈장이 흡수된 2차 멤브레인으로부터 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 분리된 미생물 감염 혈액은 20 내지 40 ㎕ 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 1차 멤브레인은 혈액에서 혈구세포 및 혈장을 분리하기 위한 혈장 분리용 멤브레인으로서, 상기 1차 멤브레인은 천연 섬유로 이루어진 종이일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 천연 섬유로 이루어진 종이는 한지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 1차 멤브레인은 기공 크기(pore size) 1 내지 10 ㎛, 두께 200 내지 1200 ㎛, 무게 60 내지 300 gram/m² 및 마이크론 등급(micron rating) 2 내지 4 ㎛ 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 2차 멤브레인은 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 2차 멤브레인은 기공 크기(pore size) 0.01 내지 1 ㎛, 두께는 100 내지 800 ㎛일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 (3) 단계의 혈장이 흡수된 2차 멤브레인으로부터 핵산 추출 시료를 얻는 단계는 상기 혈장이 흡수된 2차 멤브레인을 60 내지 70℃에서 5 내지 10분 동안 반응시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 1차 멤브레인은 기공 크기(pore size) 1 내지 10 ㎛, 두께 200 내지 1200 ㎛, 무게 60 내지 300 gram/m² 및 마이크론 등급(micron rating) 2 내지 4 ㎛이고, 한지로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 2차 멤브레인은 기공 크기(pore size) 0.01 내지 1 ㎛, 두께는 100 내지 800 ㎛이고, 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 상기 키트에는 효과적인 혈액 내 미생물의 핵산 추출에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있으며, 시료 내 핵산을 방출시키기 위한, 용해 완충액(lysis buffer) 등이 추가로 포함될 수 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 시료 전처리

채취한 전혈은 즉시 EDTA 처리된 bottle에 넣어 응고가 되지 않도록 처리하였다. 전혈은 기존의 방법대로 처리한 경우와 본 발명을 통해 개발된 방법으로 처리한 경우로 나누어 그 차이를 비교하였다.

1) 전혈에서 혈장을 원심분리하고 혈장에 존재하는 미생물의 핵산을 추출하여 핵산증폭에 사용하는 전통적인 방법:

EDTA bottle에서 전혈을 실험용 튜브로 옮기고 실험에 사용할 목적으로 배양한 일정량의 미생물을 추가하여 spiking test를 준비하였다. 미생물이 포함된 전혈을 일반적으로 혈장을 분리하기 위해 사용되는 조건(3000 g, 5분)으로 원심분리 시켰다. 상층에 분리되어 있는 혈장 층을 새로운 튜브로 옮겼다. 혈장에 존재하는 핵산을 추출하기 위해 Qiagen DNA extraction kit (QIAamp DNA Mini Kit, Cat No 51304)를 이용하였다. 핵산을 추출하는 방법은 제품에서 제공하는 방법을 그대로 사용하였고 분리된 핵산을 이용하여 핵산증폭반응을 실시하였다.

2) 전혈에서 원심분리 없이 멤브레인 구조물을 이용하여 혈장을 분리하고 혈장에 존재하는 미생물의 핵산을 추출하여 핵산증폭에 사용하는 새로운 방법:

EDTA bottle에서 전혈을 실험용 튜브로 옮기고 실험에 사용할 목적으로 배양한 일정량의 미생물을 추가하여 spiking test를 준비하였다. 미생물이 포함된 전혈 중에 일부(40㎕)를 분리용 멤브레인 구조물 위에 떨어뜨렸다. 1분 동안 멤브레인 위에 두어서 전혈이 분리용 멤브레인을 통과하면서 혈구세포와 혈장이 분리되도록 하였다. 분리용 멤브레인을 통과한 혈장이 시료용 멤브레인에 잘 흡수될 수 있도록 엄지손가락을 이용하여 최대한 일정한 압력을 가하였다. 혈장이 흡수된 시료용 멤브레인을 잘라서 작은 조각으로 만든 뒤에 1.5ml tube에 넣는다. 핵산추출제품인 Qiagen DNA extraction kit (QIAamp DNA Mini Kit, Cat No 51304)에서 제공하는 lysis 버퍼 200ul를 1.5ml tube에 넣고 5분 동안 vortex를 실시하여 lysis 버퍼용액과 멤브레인을 잘 섞어 주고 멤브레인은 제거한다. 1.5ml tube에 남아 있는 용액을 이용하여 핵산을 추출하였으며 핵산을 추출하는 방법은 제품에서 제공하는 방법을 그대로 사용하였다. 분리된 핵산을 이용하여 핵산증폭반응을 실시하였다.

2. 혈액 전처리에 사용하는 멤브레인 구조물

실험에 사용한 멤브레인 구조물은 두가지 종류로 전혈에서 혈구세포와 혈장을 분리하는 분리용 멤브레인과 분리된 혈장을 핵산 추출 반응까지 보관하는 시료용 멤브레인으로 구성된다. 전처리라는 목적에 적합하게 사용되기 위해서는 2개의 멤브레인 sheet들은 분리된 상태이지만 아주 가까운 거리에 밀착된 상태로 유지되어야 한다. 각 멤브레인 sheet의 크기는 가로 50mm, 세로 20mm이고 두께는 아래에 제시된 각 멤브레인의 기능을 최적화시킬 수 있는 아주 얇은 수준으로 결정된다(도 1).

분리용 멤브레인은 다양한 조건의 재질과 필터의 특성을 검토하여 혈장 분리에 가장 적합한 특성을 가진 멤브레인을 선정하였다. 천연 섬유로 된 종이(한지)와 유사한 재질로 구성된 멤브레인을 활용하였는데 pore size 1 ~ 10 ㎛, 두께 200 ~ 1200 ㎛, 무게 60 ~ 300 gram/m², micron rating 2 ~ 4 ㎛ 범위에 해당하는 것이 원하는 목적과 기능을 달성하는데 적합하였고 이 중에서 가장 효과적인 분리용 멤브레인의 조건은 pore size 10 ㎛, 두께 1000 ㎛, 무게 250 gram/m², micron rating 3 ㎛ 이었다.

시료용 멤브레인은 분리용 멤브레인을 통과한 혈장을 보관하면서 혈장에 포함된 미생물에서 핵산을 추출하기에 가장 편리한 특성을 가진 멤브레인을 선정하였다. 시료용 멤브레인은 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 재질의 것으로 pore size는 0.01 ~ 1 ㎛, 두께는 100 ~ 800 ㎛ 범위에 해당하는 것이 원하는 목적과 기능을 달성하는데 적합하였고 이 중에서 가장 효과적인 시료용 멤브레인의 조건은 pore size 0.1 ㎛, 두께 400 ㎛ 이었다.

3. 핵산증폭반응

혈액에 존재하는 미생물의 예로는 대장균(E. coli)을 사용하였고 미생물의 존재를 확인하는 방법으로서는 대장균 특이 유전자를 핵산증폭 하는 PCR 방법을 이용하였다.

본 발명에 사용한 대장균 유전자에 특이적인 PCR 반응용 primer sequence는 다음과 같다. forward primer 5'-CGATTTACCGCAGCCAGA-3', reverse primer 5'-AAGCCATCTCCTGATGAC-3'.

본 발명에 사용한 사람 세포에 특이적인 유전자인 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase; GAPDH)에 적용되는 PCR 실험용 primer sequence는 다음과 같다. forward primer 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3', reverse primer 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'.

본 발명에 사용한 PCR 조건은 다음과 같다.

Initial denaturation 95도, 5분, 증폭 35 사이클 (denaturation 95도 30초; annealing 55도 30초; extension 72도 30초). Final elongation 72도 5분.

< 실시예 1> 분리 방법에 따른 핵산 추출 수준 비교

원심분리를 통한 분리와 멤브레인 구조물을 이용한 분리 방법에서 균이 분리되는 효과를 비교하기 위해 분리된 시료를 이용하여 핵산 추출을 실시한 뒤에 최종 산물의 핵산 농도를 측정하였다(표 1).

실험 조건	첨가된 균의 수 (용액 조성)	분리 방법	DNA 농도(ng/ul)
1	10⁶　(균 10ul)	분리 안함	8.4
2	10⁶　(균 10ul + PBS 30ul)	원심분리	8
3	10⁶　(균 10ul + PBS 30ul)	멤브레인	6.2
4	10⁶ (균 10ul + blood 30ul)	원심분리	37.6
5	10⁶　(균 10ul + blood 30ul)	멤브레인	3.3

표 1의 실험 결과를 보면 실험의 기준이 되는 분리 절차를 거치지 않은 순수한 균 용액을 이용한 핵산 추출시 DNA 농도는 8.4로 나타났다 (실험 조건 1). 균을 혈액 세포가 존재하지 않는 phosphate buffered saline (PBS) 용액에 섞어서 원심분리한 경우(실험 조건 2)에 DNA 농도는 8ng/ul 이었고 멤브레인 구조물을 이용하여 분리한 경우(실험 조건 3)에는 6.2ng/ul으로 나와서 멤브레인 구조물에서 약간 낮은 회수율을 보였다. 균을 실제 사람의 혈액에 섞어서 원심분리한 경우(실험 조건 4)에는 37.6ng/ul 이었고 멤브레인 구조물을 이용하여 분리한 경우(실험 조건 5)에는 3.3ng/ul 으로 나왔다. 실험 조건 4에서 기준이 되는 실험 조건 1 보다 휠씬 더 높은 농도의 DNA가 측정된 것은 원심분리가 완전하게 혈액세포와 혈장을 분리하지 못하였기 때문에 혈구세포에 포함된 사람 핵산이 포함되었기 때문으로 예상 된다. 실험 조건 4에서의 결과만으로는 혈액에 포함된 미생물 중에서 어느 정도가 원심분리를 통해서 분리가 가능한지 여부를 확인할 수는 없었다.

실험 조건 5에서는 실험 조건 3에 비하여 낮은 수치가 나온 것은 혈액에 존재하는 미생물이 실제 혈액과는 다른 조성인 PBS에 섞여 있을 경우 더 잘 분리된다는 것으로 해석할 수 있다. 결과적으로 혈액에 존재하는 미생물 중에서 멤브레인 구조물을 통한 분리법으로 40% 정도는 분리가 가능하다는 결과를 보여 준다.

< 실시예 2> 분리 방법과 균 수에 따른 핵산 추출 수준 비교

표 1의 실험 조건 중에서 혈액에 미생물이 섞여 있을 경우에 한정하여 동일한 실험 조건에서 첨가하는 균의 수만 희석한 상태로 반복 실험을 실시하여 그 결과를 표 2에 제시하였다.

분리방법	첨가된 균의 수	DNA 농도 (ng/ul)	분리방법	첨가된 균의 수	DNA 농도 (ng/ul)
멤브레인	10⁶	7.8	원심분리	10⁶	32
멤브레인	10⁵	2.4	원심분리	10⁵	11.6
멤브레인	10⁴	1.5	원심분리	10⁴	8.1
멤브레인	10³	2	원심분리	10³	8.3

표 2의 실험 결과에 따르면 혈액에 존재하는 미생물의 양이 감소하면 그에 비례하여 추출되는 DNA의 양이 감소하는 양상이 분리 조건에 상관 없이 비슷한 경향으로 나타남을 알 수 있다. 이 실험에서도 원심분리에서 멤브레인으로 분리한 경우보다 더 높은 농도의 DNA가 측정되었고, 그 이유는 혈장에 포함된 분리되지 않은 혈구세포로 인한 것으로 예상이 된다.

< 실시예 3> PCR 실험을 통한 분리 방법의 비교

2가지 방법으로 분리한 핵산을 이용하여 PCR 실험을 실시하였고, 그에 따른 실험 결과는 도 2 및 도 3에 제시하였다.

대장균에 대한 원심분리법과 멤브레인 분리법의 분리 능력의 차이를 비교한 실험은 도 2에 표시하였다.

2가지의 다른 방법으로 분리한 대장균의 핵산을 PCR 실험을 통해 확인한 도 2의 결과를 보면 원심분리 방법과 멤브레인 구조물 방법 모두에서 대장균 핵산이 분리되어 핵산증폭반응이 일어남을 알 수 있다. PCR 결과물이 나타내는 band density를 육안으로 확인해 보면 전반적으로 멤브레인 구조물을 이용한 경우가 원심분리 방법을 이용한 경우에 비해서 상대적으로 낮은 band density를 보이고 있지만 통계적으로 유의한 차이는 없었기 때문에 실험 결과에 큰 영향을 주지는 않는다고 판단된다.

2가지 다른 방법을 이용하여 분리할 경우에 인간 혈구세포가 제대로 분리되었는지에 대한 비교 확인 실험 결과는 도 3에 표시하였다.

2가지의 다른 방법으로 분리한 인간 세포의 핵산을 PCR 실험을 통해 확인한 도 3의 결과를 보면 원심분리 방법에 의한 1 ~ 6번 lane 중에서 2번을 제외한 모든 lane에서 GAPDH band가 나타남을 알 수 있다. 멤브레인 구조물을 이용한 분리 방법을 사용한 7 ~ 12번의 경우에는 9와 10번을 제외한 모든 lane에서 GAPDH band가 나타남을 알 수 있다. 사람 혈구 세포를 분리하는 성능은 원심분리 방법보다 멤브레인 구조물을 이용한 분리 방법이 더 우수함을 알 수 있다.

도 4는 인간에만 존재하는 특이 유전자인 GAPDH를 타겟으로 PCR 실험을 실시한 결과를 통해 대장균에서는 핵산증폭반응이 일어나지 않음을 보여주고 있다. 이는 앞에서 제시한 도 2 및 도 3에서의 PCR 실험 결과가 세포의 종에 따라 특이적으로 나타난다는 것을 보여주는 증거이다. 즉, GADPH는 인간 세포가 존재할 경우(실험 조건 6 ~ 11)에만 나타나고 대장균 세포(실험 조건 1 ~ 5)에서는 나타나지 않음을 보여주고 있다.

한편, 핵산의 분리 과정에서 필수적인 세포막과 핵막 등을 제거하는 방식으로는 계면활성제(detergent)를 비롯한 각종 시약을 사용하는 대신 온도를 높여서 반응시키는 방식을 활용하였다. 하지만, 온도가 과다하게 높아지면 핵산 특히, RNA는 자연 분해되는 경향이 있으므로 이를 방지하여 핵산 증폭에 적합한 수준을 유지할 수 있는 조건을 최적화시키기 위하여 가열 온도와 시간을 조절하였다.

상기에서 언급한 바와 같이, 멤브레인 구조물을 이용하여 혈액 시료를 전처리하고, 혈장이 흡수된 시료용 멤브레인을 잘라서 작은 조각으로 만든 뒤에 1.5ml tube에 넣는다. Bio-Rad thermal Cycler를 이용하여, 상기 1.5ml tube를 60℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 5uL의 희석 용액을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.

즉, 1) 원심분리 후 Qiagen kit 사용, 2) 멤브레인 분리 후 Qiagen kit 사용 및 3) 멤브레인 분리 후 가열의 3가지 방법을 통해 혈액 내 미생물의 DNA를 분리하여 비교하였다. 3가지 방법 모두 10⁵ 균수의 박테리아가 섞인 40㎕의 혈액을 사용하였다. 상기 3가지 방법을 통해 분리한 DNA의 농도 및 순도 결과는 표 3과 같다.

3가지 방법 모두, 분리된 DNA 농도 및 순도에는 큰 차이가 없었다.

Method	농도(ng/uL)	260/280 ratio
원심분리 + Qiagen	1.7	1.85
멤브레인 + Qiagen	1.5	1.91
멤브레인 + 가열	1.4	1.76

결론적으로, 현장에서 원심분리기를 사용하지 않고 간단하게 혈액 내에 존재하는 미생물의 핵산을 전처리하는 방법을 개발하기 위해 멤브레인 구조물을 이용한 간단한 방법을 개발하였다. 기존에 전통적으로 널리 사용되고 있는 원심분리를 이용한 혈장 분리법과 멤브레인 구조물을 이용한 분리법을 추출한 뒤에 확보한 DNA의 양적인 측면과 핵산증폭반응 결과의 2가지 지표를 이용하여 비교한 결과 대장균의 핵산을 분리하는 성능에서는 원심분리 방법이 약간의 우위를 보였으나 핵산증폭반응 결과에는 큰 영향을 미치지 않았다. 인간 혈구세포를 분리하는 기능이라는 지표로 비교하였을 때에는 멤브레인 구조물을 이용한 방법이 약간 더 우위가 나타나는 경향을 보였다. 결론적으로, 본 발명에서 개발된 멤브레인 구조물을 이용한 간단한 방법은 기존에 사용되던 원심분리를 이용한 방법을 충분히 대체할 수 있다. 또 전기가 제대로 공급되지 않는 지역이나 재난 상태에서도 실험을 할 수 있는 여건을 제공하기 때문에 현장용 분자진단 기술을 활용하는데 유리한 조건을 제공해 줄 것으로 기대가 된다.

Claims

(1) 분리된 미생물 감염 혈액을 천연 섬유로 이루어진 종이 재질의 1차 멤브레인(membrane) 상에 떨어뜨리는 단계;
(2) 상기 1차 멤브레인을 통과한 혈장을 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 재질의 2차 멤브레인에 흡수시키는 단계; 및
(3) 상기 혈장이 흡수된 2차 멤브레인으로부터 핵산 추출 시료를 얻는 단계를 포함하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법.
제1항에 있어서, 상기 분리된 미생물 감염 혈액은 20 내지 40 ㎕인 것을 특징으로 하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법.
제1항에 있어서, 상기 1차 멤브레인은 혈액에서 혈구세포 및 혈장을 분리하기 위한 혈장 분리용 멤브레인인 것을 특징으로 하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법.
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제1항에 있어서, 상기 천연 섬유로 이루어진 종이는 한지인 것을 특징으로 하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법.
제1항에 있어서, 상기 1차 멤브레인은 기공 크기(pore size) 1 내지 10 ㎛, 두께 200 내지 1200 ㎛, 무게 60 내지 300 gram/m² 및 마이크론 등급(micron rating) 2 내지 4 ㎛인 것을 특징으로 하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법.
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제1항에 있어서, 상기 2차 멤브레인은 기공 크기(pore size) 0.01 내지 1 ㎛, 두께는 100 내지 800 ㎛인 것을 특징으로 하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 혈장이 흡수된 2차 멤브레인으로부터 핵산 추출 시료를 얻는 단계는 상기 혈장이 흡수된 2차 멤브레인을 60 내지 70℃에서 5 내지 10분 동안 반응시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법.
혈액에서 혈구세포 및 혈장을 분리하기 위한 혈장 분리용 천연 섬유로 이루어진 종이 재질의 1차 멤브레인 및 상기 1차 멤브레인을 통과한 혈장 흡수용 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 재질의 2차 멤브레인을 포함하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리용 키트.
제10항에 있어서, 상기 1차 멤브레인은 기공 크기(pore size) 1 내지 10 ㎛, 두께 200 내지 1200 ㎛, 무게 60 내지 300 gram/m² 및 마이크론 등급(micron rating) 2 내지 4 ㎛이고, 한지로 이루어진 것을 특징으로 하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리용 키트.
제10항에 있어서, 상기 2차 멤브레인은 기공 크기(pore size) 0.01 내지 1 ㎛, 두께는 100 내지 800 ㎛이고, 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인인 것을 특징으로 하는 혈액 내 미생물의 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리용 키트.