KR100571822B1

KR100571822B1 - 마이크로 ｐｃｒ 장치, 그를 이용한 핵산의 증폭방법 및ｐｃｒ 증폭 산물의 농도를 측정하는 방법

Info

Publication number: KR100571822B1
Application number: KR1020030076216A
Authority: KR
Inventors: 김상효; 한정임; 박진성; 김진태
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2003-10-30
Filing date: 2003-10-30
Publication date: 2006-04-17
Also published as: KR20050041159A; US20050095624A1; US7452669B2

Abstract

본 발명은 내부 면이 폴리양이온성 또는 폴리음이온성 중합체로 코팅되어 있고, 전극을 포함하는 증폭반응 챔버를 포함하는 마이크로 PCR 장치를 제공한다.

폴리양이온, 폴리음이온, 전기적 신호, PCR

Description

마이크로 ＰＣＲ 장치, 그를 이용한 핵산의 증폭방법 및 ＰＣＲ 증폭 산물의 농도를 측정하는 방법{Micro PCR device, method for amplifying a nucleic acid and method for measuring concentration of PCR product using the same}

도 1은 본 발명의 실시예에서 사용된 마이크로 PCR 칩을 모식적으로 나타낸 도면이고,

도 2는 1,000∼100,000Hz sweep, 교류 전압 10 mV, HBV DNA 10⁶ 카피, 40 회에서 측정된 결과를 Bode plot으로 나타낸 결과이고,

도 3은 도 2의 결과를 Nyquist plot으로 나타낸 결과이고,

도 4는 100,000Hz sweep, 교류 전압 10 mV, HBV DNA 10⁶ 카피, 40 회에서 증폭산물의 임피던스 크기 값을 PCR 회수에 따라 측정한 결과이고,

도 5는 10,000Hz sweep, 교류 전압 10 mV, HBV DNA 10⁶ 카피, 40 회에서 증폭산물의 임피던스 크기 값을 PCR 회수에 따라 측정한 결과이고,

도 6은 1,000Hz sweep, 교류 전압 10 mV, HBV DNA 10⁶ 카피, 40 회에서 증폭산물의 임피던스 크기 값을 PCR 회수에 따라 측정한 결과이다.

본 발명은 마이크로 PCR 장치, 그를 이용하는 핵산의 증폭 방법 및 전기적 신호를 측정하는 PCR 증폭산물의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

기존의 PCR은 단지 반응 종결점에서 전기영동을 이용하여 증폭된 DNA의 정성적인 결과만을 보여주는 것으로서 DNA의 정량적 검출에서 정확성 등 많은 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 광학적 검출시스템을 이용하여 증폭된 DNA의 농도에 비례하는 형광의 세기를 검출함으로써 DNA의 정량분석을 가능케 해주는 리얼타임 PCR 장치가 개발되었다.

DNA의 정량분석은 질병의 치료와 DNA 발현의 연구에 필수적이다. 예를 들면, B 형 간염 바이러스 (HBV)에 감염된 간염 환자의 성공적인 약물치료를 위해서 정기적으로 혈장의 HBV의 농도를 리얼타임 RT-PCR을 이용하여 정량 측정함으로써, 투여되는 약물에 대한 바이러스의 내성을 검사해야만 하는 경우를 들 수 있다.

종래의 리얼타임 PCR은 레이저 소스와 미세거울, 현미경 이외에 필터 등의 여러 광학장치가 필요함과 동시에 고가의 형광 염료가 사용되어지고 있었다. 또한, DNA 정량 분석을 위한 많은 PCR 칩이 개발되었으나, 종래의 리얼타임 PCR 칩은 형광 검출의 원리에 의한 방법이기에 소형화 (칩화)와 경제성에서 많은 단점을 가지고 있었다.

이 문제를 극복하고자 모세관 전기영동(CE: capillary electrophoresis)을 이용하여 전기적으로 DNA를 검출하고자하는 노력이 있었다 (Christa L. Colyer 등, Journal of Chromatography A, Volume 781, Issues 1-2, 26 September 1997, pp. 271-276; F. Laugere 등, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 83, Issues 1-3, 15 March 2002, pp. 104-108; Pumera 등, Anal. Chem., 2002, 74(9), pp.1968-1971). 이 방법은 정성분석이 가능하고 정량분석을 하기엔 많은 문제가 있을 뿐더러 PCR이 끝난 뒤 산물을 미세채널을 이용하여 모세관 전기영동 검출 시스템까지 옮겨야 하는 번거로움과 높은 전압이 필요하다는 점에서 경제성과 또 그에 따른 기기의 소형화에 문제가 있다.

밀스(Miles) 등은 PCR 과정 중에서 DNA의 농도가 증가함에 따라 저항값이 작아지고, 전도성은 증가한다는 개념에 근거하여 특허 출원하였다 (미국 특허공개 2002/0072054 A1). 상기 출원은 리얼타임 PCR 칩이 아닌 반응 종결시점 검출 PCR 칩이라는 점에서, 리얼타임 PCR 칩과는 다르다. 또한, 상기 출원은 증폭된 PCR 산물을 검출하기 위하여 이온적으로 표지된 프로브를 사용해야 한다는 문제점이 있었다.

한편, 상기와 같은 종래의 전기적 또는 화학적 신호를 이용한 검출 방법에 의하면, 재현성 있는 신호를 검출할 수 없었다. 이는 PCR 반응액에 존재하는 단백질, 이온, 및 안정제와 같은 성분이 전극 표면 또는 증폭반응 챔버의 내부 면에 흡착하기 때문인 것으로 여겨진다. 이러한 흡착 현상은 열역학적으로 매우 불안정할 뿐만 아니라, 동역학적인 요인도 함께 존재한다. 따라서, 온도 및 전자기력과 같은 외부의 미세한 자극에 의하여도 흡착 정도가 달라진다고 알려져 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자, 집중적으로 연구를 수행하여오던 중 증폭반응 챔버 내부 면을 폴리양이온 중합체 또는 폴이음이온 중합체 코팅층을 형성시킴으로써, PCR이 수행되는 고온 (약 100)에서도 전기적 신호를 이용하여 PCR 증폭산물을 재현성 있게 측정할 수 있는 방법을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 전기적 신호를 이용하여 PCR 증폭 산물을 재현성 있게 증폭할 수 있는 마이크로 PCR 장치를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 마이크로 PCR 장치를 이용한 핵산의 증폭 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 마이크로 PCR 장치를 이용하여 PCR 증폭 산물의 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리양이온성 중합체의 예에는, 폴리라이신, PDADMAC (폴리(디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드)) (poly(diallyl dimethyl ammonium chloride)), PAH (폴리(알릴아민 히드로클로라이드)) (poly(allylamine hydrochloride)), 및 PEI (폴리(에틸렌 이민) (poly(ethylene imine))로 구성되는 군으로부터 선택되는 중합체가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 폴리음이온성 중합체의 예에는 PSS (폴리(소듐 스티렌술포네이트)) (poly(sodium stryrenesulfonate))가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 폴리양이온성 중합체 또는 폴리음이온성 중합체를 증폭반응 챔버 내부 면에 코팅함으로써, PCR 반응액 중의 특정한 성분이 상기 코팅층에 균일하고 신속하게 흡착되게 한다. 그렇게 함으로써, 전기적으로 발생하는 신호를 측정하여 PCR 반응산물을 검출 또는 정량하는 경우, 그 결과가 재현성이 있도록 한다.

PDADMAC PAH PSS

PEI

본 발명에 있어서, 상기 폴리양이온성 중합체 또는 폴리음이온성 중합체는 중합반응 챔버의 내부 면에 임의의 순서대로 번갈아 코팅되어질 수 있다. 예를 들 면, 상기 중합반응 챔버의 내부 면에 폴리양이온성 중합체를 먼저 코팅하고, 다음으로 폴리음이온성 중합체를 코팅하여 제조되는 표면이 폴리음이온성 중합체로 이루어지는 내부 면 또는 여기에 다시 폴리양이온성 중합체를 코팅하여 제조되는 표면이 폴리양이온성 중합체로 이루어지는 내부 면을 갖는 중합반응 챔버가 사용될 수 있다. 반대로, 상기 중합반응 챔버의 내부 면에 폴리음이온성 중합체를 먼저 코팅하고, 다음으로 폴리양이온성 중합체를 코팅하여 제조되는 표면이 폴리양이온성 중합체로 이루어지는 내부 면 또는 여기에 다시 폴리음이온성 중합체를 코팅하여 제조되는 표면이 폴리음이온성 중합체로 이루어지는 내부 면을 갖는 중합반응 챔버가 사용될 수 있다. 상기에서 폴리양이온성 중합체와 폴리음이온성 중합체가 번갈아 코팅되는 회수는 특별하게 제한되는 것은 아니다. 상기 코팅은 바람직하게는, 20회 이하, 더욱 바람직하게는 10이하로 행하여지는 것이다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 마이크로 PCR 장치는 임피던스 분석기를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 마이크로 PCR 장치는 PCR 장치에 통상적으로 요구되는 요소들, 예를 들면, 가열기(heater), 냉각기(cooler) 및 온도 조절기를 포함할 수 있다. 또한, 랩온어 칩의 경우에는, 시료 준비 및 PCR 산물의 측정에 필요한 장치를 더 포함할 수 있다. 이러한 통상적인 마이크로 PCR 장치는 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 증폭반응 챔버의 재질은 석영(quartz), 유리, 및 실리콘과 같은 PCR 과정 동안의 열 순환에 견딜 수 있는 재질이면, 어느 것이나 사용할 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한, (a) 본 발명에 따른 상기 마이크로 PCR 장치의 증폭반응 챔버에 PCR 반응액을 첨가하여 상기 증폭반응 챔버와 PCR 반응액 사이에 흡착이 이루어지도록 하는 단계; 및 (b) PCR 반응을 수행하는 단계를 포함하는 핵산의 증폭방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, "PCR 반응액(PCR reaction mixture)"이란 핵산 증폭을 위하여 열순환 반응(thermal cycling reaction)을 수행하기 위한 반응용액으로서, dNTP, Mg²⁺와 같은 이온, 프라이머와 같은 핵산, 폴리머라제와 같은 단백질 등의 성분을 포함하는 반응 용액을 의미한다.

본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는 PCR 증폭 산물을 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 본 발명에 따른 상기 마이크로 PCR 장치의 증폭반응 챔버에 PCR 반응액을 첨가하여 상기 증폭반응 챔버와 PCR 반응액 사이에 흡착이 이루어지도록 하는 단계;

(b) PCR 반응을 수행하는 단계;

(c) 상기 전극 사이에 전기장을 발생시키는 단계 및

(d) 상기 PCR 반응액의 전기적 신호를 측정하는 단계.

본 발명의 (a) 단계에서, PCR 반응액을 증폭반응 챔버에 첨가하여, 폴리양이온 또는 폴이음이온을 띠고 있는 증폭반응 챔버에 PCR 반응액의 성분이 신속하고 균일하게 흡착되도록 한다.

본 발명의 (b) 단계에서, "PCR 반응"이란 변성, 어닐링 및 연장 반응을 반복 하여 핵산을 증폭시키는 중합효소연쇄 반응을 의미하는 것으로 당업자라면 용이하게 알 수 있으며, 각 단계의 온도 및 시간은 사용되는 중합효소, 증폭하고자 하는 표적 핵산 서열 및 사용한 프라이머의 서열 등을 고려하여 적당하게 조절하여 용이하게 사용할 수 있다.

본 발명의 (c) 단계에서, 상기 증폭반응 챔버 중의 전극사이에 전기장을 가하여 전기적 신호를 발생시킨다. 이렇게 발생되는 전기적 신호는 증폭되는 핵산의 농도에 따라 재현성 있게 변화하기 때문에, 상기 전기적 신호를 측정함으로써 PCR 증폭산물을 측정할 수 있다. 이는 폴리양이온성 중합체 또는 폴리음이온성 중합체의 코팅층에 의하여, PCR 반응액이 신속하고 균질하게 흡착되도록 함으로써, 재현성이 높은 결과를 얻을 수 있다. 상기와 같은 중합체 코팅층이 없는 경우, 얻어지는 전기적 신호는 변화가 심하여 재현성이 낮은 단점이 있었다.

본 발명의 (c) 단계에서, 상기 전기장은 주파수 1 Hz 내지 100 Hz의 교류를 사용함으로써 발생될 수 있다. 또한, 상기 전기장은 평균 전압 (Vrms) 1 mV 내지 10 V의 교류 전압을 사용함으로써 발생될 수 있다. 그러나, 이들 범위에 한정되는 것은 아니며, 임의의 형태의 전압의 인가될 수 있다.

본 발명의 (d) 단계에서, 상기 PCR 반응액의 전기적 신호를 측정하여, PCR 반응산물의 농도를 측정한다. 상기 전기적 신호에는 예를 들면, 인피던스, 유전손실, 유전상수 또는 어드미턴스와 같은 PCR 반응액의 유전적 특성이 포함될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실 시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 폴리양이온성 중합체의 코팅

본 실시예에서는 마이크로 PCR 칩 중에 포함되어 있는 각 증폭반응 챔버 (재질 : 유리, 용량 1 ㎕)의 내부 면을 0.5 M NaCl 중의 PDADMAC 3g/ml를 첨가하고, 20분 동안 방치하여, 코팅하였다. 다음으로, 증류수를 이용하여 세척하고, 실온에서 30 분 이상 방치하여 건조하였다.

이렇게 폴리양이온 중합체로 코팅된 증폭반응 챔버의 내부 면의 접촉각을 접촉각 측정기(FACE 사, 일본)를 이용하여 측정하여 코팅층이 형성되었는지를 확인하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

표 1. 폴리양이온 중합체로 코팅된 증폭반응 챔버의 접촉각 (단위: 도)

코팅 대상면	코팅 전	코팅 후
유리 (SiO₂)면	45±0.5	19±0.5
백금 전극	91±0.5	70±0.5

표 1에 나타낸 바와 같이, 코팅 후의 접촉각은 코팅 전에 비하여 현저하게 감소하였다. 이는 증폭반응 챔버의 내부 면에 폴리양이온 중합체 코팅층이 형성되었다는 것을 의미한다. 즉, 친수성 고분자 코팅에 의해 유리 표면의 접촉각이 감소하였으므로 코팅층이 형성되었다는 사실을 뒷받침할 수 있다.

실시예 2 : 실시간 PCR 반응의 전기적 신호의 측정

실시예 1에 나타낸 바와 같이, 폴리양이온 중합체 코팅층이 형성된 증폭반응 챔버를 갖는 마이크로 PCR 장치를 포함하는 마이크로 PCR 칩을 이용하여 PCR을 수행하고, 전기적 신호, 즉 인피던스를 측정함으로써 실시간으로 PCR 증폭산물의 농도를 측정하였다. 본 발명에 사용된 마이크로 PCR 칩은 자체 제작된 모델로서, 백금 전극이 설치된 유리 재질로 되어 있고, 용량 약 1㎕인 증폭반응 챔버를 포함한다. 사용된 마이크로 PCR 칩은 모식도는 도 1에 나타내었다. 도 1은 상기 PCR 칩의 측면 단면도로서, 입구(13), 출구(15), 상부 전극(21), 하부 전극(19), 중합 반응 챔버(17) 및 유리 웨이퍼(11)가 도시되어 있다.

먼저, PCR 반응액 (각각 200 nM 의 dNTP, DNA polymerase (0.1 U/㎕), 프라이머 (서열번호 1과 서열번호 2)를 증폭반응 챔버에 첨가하였다. 그 후, 주형 DNA 0.1 ㎍을 첨가하고, PCR을 수행하였다. PCR 반응은 변성 단계는 94 ℃에서 30초간, 어닐링 단계는 60 ℃에서 30초간 및 연장 단계는 72 ℃에서 1분 30초간 실시하였고, 30 회를 수행하였다.

상기와 같은 실험을 통하여 얻어진 결과를 도 2 내지 6에 나타내었다. 상기 도 2는 1,000∼100,000Hz sweep, 교류 전압 10 mV, HBV DNA 10⁶ 카피 (주형 DNA), 40 회에서 측정된 결과를 Bode plot으로 나타낸 결과이다. 도 3은 도 2의 결과를 Nyquist plot로 타나낸 결과이다. 도 4 내지 6은 각각 1,000 Hz∼100,000Hz sweep, 교류 전압 10 mV, HBV DNA 10⁶ 카피, 40 회에서 증폭산물의 임피던스 크기 값을 PCR 회수에 따라 측정한 것으로서, 도 4 내지 6은 각각 100,00 Hz, 10,000 Hz 및 1,000 Hz에서 측정한 결과를 나타내는 것이다.

도 4 내지 도 6의 실험 결과에 의하면, PCR 반응이 진행됨에 따라 증폭된 DNA의 함량이 증가하고, 그에 따른 이중나선 구조의 전기적인 작용으로 인해 용액의 저항치가 낮아지는 것을 알 수 있다.

실시예 3 : 폴리음이온성 중합체의 코팅 및 실시간 PCR 반응의 전기적 신호의 측정

본 실시예에서는 마이크로 PCR 칩 중에 포함되어 있는 각 증폭반응 챔버 (재질 : 유리, 용량 1 ㎕)의 내부 면을 0.5 M NaCl 중의 PSS 3g/ml를 첨가하고, 20분 동안 방치하여, 코팅하였다. 다음으로, 증류수를 이용하여 세척하고, 실온에서 30 분 이상 방치하여 건조하였다.

이렇게 폴리음이온 중합체로 코팅된 증폭반응 챔버의 내부 면의 접촉각을 접촉각 측정기 (FACE 사, 일본)를 이용하여 측정하여 코팅층이 형성되었는지를 확인한 다음, 실시예 2와 같이 PCR을 수행하고 실시간으로 PCR 증폭산물의 농도를 측정하였다.

표 2. 폴리음이온 중합체로 코팅된 증폭반응 챔버의 접촉각 (단위: 도)

코팅 대상면	코팅 전	코팅 후
유리 (SiO₂)면	45±0.5	22±0.5
백금 전극	91±0.5	72±0.5

상기 접촉각의 측정 결과를 표 2에 나타내었다. 폴리음이온성 중합체의 코팅한 후, 접촉각이 표 1에 나타낸 정도와 유사하게 감소하여, 코팅층이 형성되었음을 알 수 있었다. 또한, PCR 수행 중에 임피던스 측정을 통하여 PCR 산물을 실시간으로 측정한 결과, PCR 회수가 증가함에 따라 증폭반응 용액의 저항이 감소함을 알 수 있었다.

실시예 4 : 폴리양이온성 중합체 및 폴리음이온성 중합체의 코팅 및 실시간 PCR 반응의 전기적 신호의 측정

본 실시예에서는 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 폴리양이온성 중합체 PDADMAC로 중합반응 챔버를 코팅한 다음, 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 폴리음이온성 중합체 PSS로 중합반응 챔버를 코팅한 다음, 실시예 2에 나타낸 바와 같이 PCR을 수행하고, PCR 산물의 농도를 전기적으로 측정하였다.

그 결과, 접촉각의 측정 결과는 실시예 3의 결과와 거의 유사하였으며, PCR이 진행됨에 따라 PCR 증폭 산물이 포함되어 있는 반응용액의 임피던스 값은 재현성 있게 감소하는 것을 알 수 있었다.

상기한 바와 같이, 폴리음이온성 중합체 또는 폴리양이온성 중합체를 증폭반응 챔버의 내면에 코팅함으로써, 증폭 산물의 농도를 전기적 신호를 이용하여 측정할 수 있었다. 또한, 증폭반응 챔버의 내면을 전하를 띤 물질로 코팅함으로써, 시료의 미세유동에 있어서 버블이 발생하는 것을 방지할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로 PCR 장치에 의하면, 전기적 신호를 이용하여 재현성 높게 PCR 증폭산물의 농도를 측정하면서, PCR을 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산의 증폭방법에 의하면, 전기적 신호를 이용하여 재현성 높게 PCR 증폭산물의 농도를 측정하면서, 핵산을 증폭할 수 있다.

본 발명에 따른 PCR 증폭 산물의 농도를 측정하는 방법에 의하면, PCR 반응과 동시에 전기적 신호를 이용하여 재현성 높게 PCR 증폭산물의 농도를 측정할 수 있다.

<110> Samsung Electronics Co. Ltd. <120> Micro PCR device, method for amplifying a nucleic acid and method for measuring concentration of PCR product using the same <130> PN051209 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtggctttgg ggcatggaca tt 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctctaaggcc tcccgataca g 21

Claims

내부 면이 폴리양이온성 또는 폴리음이온성 중합체로 코팅되어 있고, 전극을 포함하는 증폭반응 챔버를 포함하는 마이크로 PCR 장치.
제1항에 있어서, 상기 폴리양이온성 중합체는 폴리라이신, 폴리(디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드), 폴리(알릴아민 히드로클로라이드) 및 폴리(에틸렌 이민)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 중합체임을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
제1항에 있어서, 상기 폴리음이온성 중합체는 폴리(소듐 스티렌술포네이트)임을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
제1항에 있어서, 내부 면이 폴리양이온성 중합체와 폴리음이온성 중합체가 번갈아 코팅되어 있고, 내부 면의 표면은 폴리양이온성 중합체 또는 폴리음이온성 중합체로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
제1항에 있어서, 상기 증폭반응 챔버에 구비된 임피던스 분석기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 마이크로 PCR 장치의 증폭반응 챔버에 PCR 반응액을 첨가하여 상기 증폭반응 챔버와 PCR 반응액 사이에 흡착이 이루어지도록 하는 단계; 및

PCR 반응을 수행하는 단계를 포함하는 핵산의 증폭방법.
(a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 마이크로 PCR 장치의 증폭반응 챔버에 PCR 반응액을 첨가하여 상기 증폭반응 챔버와 PCR 반응액 사이에 흡착이 이루어지도록 하는 단계;

(b) PCR 반응을 수행하는 단계;

(c) 상기 전극 사이에 전기장을 발생시키는 단계 및

(d) 상기 PCR 반응액의 전기적 신호를 측정하는 단계를 포함하는 PCR 증폭 산물의 농도를 측정하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 전기적 신호는 인피던스, 유전손실, 유전상수 또는 어드미턴스인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 전기장을 발생시키는 단계는 주파수 1 Hz 내지 100 Hz 의 교류를 사용하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 전기장을 발생시키는 단계는 평균 전압(Vrms) 1 mV 내지 10 V의 교류 전압을 사용하는 방법.