CN114058686A - 一种基于阻抗检测的数字pcr芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于阻抗检测的数字PCR芯片及其检测方法，该芯片包括基底、微孔阵列和电极。检测过程中，芯片的每个微孔内最多有一个微球，微球表面固定有扩增引物，DNA模板分子掉入微孔中，保证平均每个微孔中不足一个DNA分子。然后在每个微孔内进行PCR反应，通过PCR反应前后的微孔内的阻抗变化获得判断微孔内的阳性和阴性反应，通过计数阳性和阴性反应的微孔数目，根据泊松分布原理计算DNA模板分子的浓度。本发明采用芯片和电信号获取反应结果，与光学检测方法相比，减小了检测设备体积，降低了成本，提高了检测效率，在体外诊断等领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及芯片及其检测方法，具体为一种基于阻抗检测的数字PCR芯片及其检测方法。
背景技术
在DNA分析领域PCR检测应用广泛，通过将DNA的特殊片段放大再经过凝胶成像可以检查PCR过程是否生成了预期的DNA片段，根据凝胶成像的结果可以得出结论。但是凝胶成像耗时过长，同时也只能定性的测量是否有无，没有办法精确的测量DNA的原始的浓度。后面又发展出荧光定量PCR，荧光定量PCR可以通过检测PCR扩增期的荧光增量可以确定靶点的起始量，精度颇高，但是荧光定量PCR耗时长，试剂昂贵，因此有必要对PCR检测技术进行改进。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种能够设置不同频率不同幅值检测电压的基于阻抗检测的数字PCR芯片，本发明的另一目的是提供一种检测迅速、减少不必要溶液转移的基于阻抗检测的数字PCR芯片的检测方法。
技术方案：本发明所述的一种基于阻抗检测的数字PCR芯片，包括基底，基底上设置若干微孔壁，基底或微孔壁的一侧设置微孔和电极，微孔形成阵列排布的微孔阵列，每个微孔内最多有一个微球，微球内设置DNA探针。
进一步地，电极与阻抗测量器相连，阻抗检测器可以使用直流源或交流源进行检测，通过电极对进行微孔内反应液的阻抗检测。通过电极施加交流或直流电场，检测PCR扩增前后的电信号变化，判断微球上是否结合有DNA靶序列，并进而通过数字PCR计算出DNA靶序列的绝对长度。
进一步地，微孔的直径为在1～100μm。直径小于1μm，制作工艺存在困难；直径大于100μm，在检测时存在较大误差。同时，微孔的直径与微球的大小存在关系，常用的微球直径为0.5μm～40μm，有较好的均一性，所以微孔直径选择为1～100μm。每个微孔内设置至少一对电极。
进一步地，电极为方形或圆形，电极材料为铝、铜、金、铂中的任意一种。电极的高0.05～0.6μm，宽为0.1～1.5μm，间距为0.1～2μm。
基于阻抗检测的数字PCR芯片还包括温度传感器，可以作为一个温度触发，设置为同一温度下检测阻抗。温度传感器与热循环器相连，用于使数字PCR芯片在0～100℃内自由转换。
上述基于阻抗检测的数字PCR芯片的检测方法，包括以下步骤：
(a)利用有DNA探针的微球捕获待测DNA靶序列，保证微球数目远远多于DNA靶序列；
(b)将微球和PCR反应液装配到微孔阵列中，保证一个微孔中最多只有一个微球，检测当前状态下的阻抗值；
(c)反应结束后，等待温度回归室温之后进行阻抗检测，通过比较微孔中微球表面PCR反应前后的阻抗变化，测量微球表面是否结合有DNA靶序列；
(d)通过数字PCR计算对DNA靶序列进行绝对定量检测。
进一步地，DNA探针为羧基探针，能够与待测DNA靶序列结合，进行核酸提取与检测。
进一步地，微孔内加入脱氧核苷酸、DNA聚合酶和引物，用于放大样品的DNA。
工作原理：通过微电极施加交流或直流电场，检测PCR扩增前后的电信号变化，判断微球上是否结合有DNA靶序列，进而通过数字PCR计算出DNA靶序列的绝对长度。若微球上结合有DNA靶序列，则反应过程中，脱氧核苷酸依次连接在DNA探针上形成DNA靶序列的互补序列。DNA合成过程中，微孔中的阻抗就会发生变化，在合成全部完成之后，检测微孔中的整体阻抗，若与反应前的阻抗有明显变化，则该微球上结合有DNA靶序列。
有益效果：本发明和现有技术相比，具有如下显著性特点：采用电流信号代替传统的荧光探针，用阻抗检测代替传统的光学检测，从而降低了PCR过程的成本，有利于提高检测效率，减少了检测过程中不必要的溶液转移；利用微孔阵列中的电极检测微孔在PCR过程中的阻抗变化情况，当微孔中有PCR过程产生时，随着DNA浓度的增加，带电粒子迁移被阻碍，导致阻抗增加，可以通过比较阻抗的变化情况，进而确定该微孔内是否含有该引物，最后统计有引物的微孔和无引物的微孔，根据泊松分布就可以确定引物的原始浓度。
附图说明
图1是本发明数字PCR芯片的第一种结构示意图；
图2是本发明电极4的第一种连接示意图；
图3是本发明电极4的第一种结构示意图；
图4是本发明PCR反应前后阻抗频率关系图；
图5是本发明数字PCR芯片的第二种结构示意图；
图6是本发明电极4的第二种连接示意图；
图7是本发明电极4的第二种结构示意图；
图8是本发明阻抗测量器5的电路图。
具体实施方式
实施例1
如图1，基底1上垂直设有四个微孔壁2，微孔壁2的侧面设置微孔3和电极4，微孔3形成阵列排布的微孔阵列，每个微孔3内最多有一个微球，微球内设置DNA探针。
如图2，阻抗检测的微孔阵列中，PCR混合液置于电极4制成的微孔阵列中，与下方的阻抗检测电路分隔开来。微孔3的外侧有至少一对平行的电极4，电极4与阻抗测量器5相连，阻抗检测器可以使用直流源或交流源进行检测，通过电极4对进行微孔3内反应液的阻抗检测。
如图3，电极4为方形的交指电极，两端有一对检测电极，由铝、铜、金、铂中的任意一种制成。电极4的高0.05～0.6μm，宽为0.1～1.5μm，间距为0.1～2μm。数字PCR芯片还包括温度传感器，可以作为一个温度触发，设置为同一温度下检测阻抗。温度传感器与热循环器相连，用于使数字PCR芯片在0～100℃内自由转换。PCR程序用于放大样品中的DNA。为了放大样品中的DNA，将样品、至少两个引物、核苷酸和Taq DNA聚合酶加入PCR管。
加入形成反应混合物的底剂会根据人们希望放大的DNA序列而变化。例如，如果对样品进行测试以确定从中提取样本的人是否患有特定疾病，则添加与该疾病相关的DNA序列对应的底剂以制备反应混合物。如果希望测试样本以确定患者是否具有一种或多种疾病，可以添加多组与多种疾病对应的底剂。构成混合物的PCR管被放置在热循环器中。热循环器在执行达到PCR扩增所需的高温变性、低温退火、适温延升的温度。热循环器配置了用于测量混合物的电阻的系统。随着PCR循环的进行，可以通过测量混合物的pH值来测量混合物的电导率，因为混合物受PCR循环的影响。通过用PCR管配置电极4来测量混合物的电导率。让电极4接触反应混合物，电极4是电路的一部分，有助于测量反应混合物的电导率。
本实施例的数字PCR芯片的检测方法，包括以下步骤：
(1)利用有DNA探针的微球捕获待测DNA靶序列，保证微球数目远远多于DNA靶序列。
(2)将微球和PCR反应液装配到微孔阵列中，保证一个微孔3中最多只有一个微球，当混合物在每个PCR循环中处于特定温度下时，测量反应混合物的阻抗值。在PCR循环期间，可将硅油加入反应混合物，以限制混合物中液体的汽化。同时，蒸发也可以通过PCR管的盖子进行限制蒸发，泄漏受到限制。
众所周知，在PCR周期期间，混合物的温度升高到变性温度97℃，使双绞合DNA分离成单绞合。此后，混合物的温度降低到退火温度，使底剂与模板结合序列。随后，温度升高，通常为72～74℃，从而使DNA聚合酶产生一个互补的DNA链。当混合物的温度在72℃时，对混合物的电阻抗进行测量。理想情况下，当混合物的温度为72℃时，可以测量混合物的电阻抗。为确保在混合物中温度为72℃时测量电导率，在热循环器将温度提高到72～74℃后30～40秒后测量电导率。
(3)反应结束后，等待温度回归室温之后进行阻抗检测，通过比较微孔3中微球表面PCR反应前后的阻抗变化，如图4，测量微球表面是否结合有DNA靶序列；
(4)通过数字PCR计算对DNA靶序列进行绝对定量检测。
实施例2
如图5，基底1上垂直设有四个微孔壁2，基底1的上表面有微孔3和电极4，微孔3形成阵列排布的微孔阵列，每个微孔3内最多有一个微球，微球内设置DNA探针。
如图6，阻抗检测的微孔阵列中，PCR混合液置于电极4制成的微孔阵列中，与下方的阻抗检测电路分隔开来。微孔3的内有至少一对平行的电极4，电极4与阻抗测量器5相连，阻抗检测器可以使用直流源或交流源进行检测，通过电极4对进行微孔3内反应液的阻抗检测。
如图7，电极4为圆形的交指电极，两端有一对检测电极，由铝、铜、金、铂中的任意一种制成。电极4的高0.05～0.6μm，宽为0.1～1.5μm，间距为0.1～2μm。数字PCR芯片还包括温度传感器，可以作为一个温度触发，设置为同一温度下检测阻抗。温度传感器与热循环器相连，用于使数字PCR芯片在0～100℃内自由转换。
本实施例的数字PCR芯片的检测方法，其余步骤与实施例1相同，区别仅仅在于：在测量过程中，不仅测量混合物在72℃时的阻抗，也对放大过程中各种温度/周期中的阻抗进行测量。阻抗用于确定核酸被放大的性质。随着PCR循环的进展，混合物的电导率不仅取决于所创造的DNA链的数量，而且可能取决于其他因素。因此，为了中和这些因素对混合物的电导率测量的影响，使用了一种控制。控制一种没有DNA样品的混合物，而反应混合物中存在的所有其他成分也存在于控制中。当热循环器中反应混合物时，该控制也发生温度变化。控制电导率的测量方式与测量反应混合物的电导率相同。从反应混合物的电导率测量中否定了对照的电导率测量，从而能够识别脱氧核糖核酸放大后混合物中电导率的变化。测量控制阻抗，用于分析。
如图8，电极4的一端接直流或交流激励电源，另一端接阻抗测量器5的负输入端。阻抗测量器5的正输入端通过电阻接地，同时负输入端与输出端通过电阻形成反馈。
Claims (9)
1.一种基于阻抗检测的数字PCR芯片，其特征在于：包括基底(1)，所述基底(1)上设置微孔(3)阵列，所述微孔(3)由微孔壁(2)隔离分开，所述微孔壁(2)内设有电极(4)和微球，所述微球表面设有DNA探针。
2.根据权利要求1所述的一种基于阻抗检测的数字PCR芯片，其特征在于：所述电极(4)与阻抗测量器(5)相连。
3.根据权利要求1所述的一种基于阻抗检测的数字PCR芯片，其特征在于：所述微孔(3)的直径为在1～100μm。
4.根据权利要求1所述的一种基于阻抗检测的数字PCR芯片，其特征在于：所述电极(4)为方形或圆形。
5.根据权利要求4所述的一种基于阻抗检测的数字PCR芯片，其特征在于：所述电极(4)的高为0.05～0.6μm，宽为0.1～1.5μm，间距为0.1～2μm。
6.根据权利要求6所述的一种基于阻抗检测的数字PCR芯片，其特征在于，所述微孔壁内可以不存在微球，DNA探针可直接设置在微孔壁上。
7.根据权利要求1～6任一所述的一种基于阻抗检测的数字PCR芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)利用有DNA探针的微球捕获待测DNA靶序列，保证微球数目远远多于DNA靶序列；
(b)将微球和PCR反应液装配到微孔阵列中，保证一个微孔(3)中最多只有一个微球，检测当前状态下的阻抗值；
(c)反应结束后，等待温度回归室温之后进行阻抗检测，通过比较微孔(3)中微球表面PCR反应前后的阻抗变化，测量微球表面是否结合有DNA靶序列；
(d)通过数字PCR计算对DNA靶序列进行绝对定量检测。
8.根据权利要求7所述的一种基于阻抗检测的数字PCR芯片的检测方法，其特征在于：所述DNA探针为羧基探针，能够与待测DNA靶序列结合，进行核酸提取与检测。
9.根据权利要求7所述的一种基于阻抗检测的数字PCR芯片的检测方法，其特征在于：所述微孔(3)内加入脱氧核苷酸、DNA聚合酶和引物。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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