KR100563143B1

KR100563143B1 - 에크디손 수용체 복합체를 통하여 외인성 유전자의 발현을 조절하기 위한 리간드

Info

Publication number: KR100563143B1
Application number: KR1019990022745A
Authority: KR
Inventors: 글렌리챠드 칼슨; 딘어빈 크레스; 탈로찬싱 다디알라; 로버트유진 홀만; 다트파트 르
Original assignee: 롬 앤드 하스 캄파니
Priority date: 1998-06-17
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2006-03-22
Also published as: US20010044151A1; DK0965644T3; BR9902283A; PT965644E; CN1296480C; KR20000006256A; DE69937519D1; ATE378414T1; AU765306B2; CY1107083T1; EP0965644A2; CN1251389A; EP0965644B1; AU3390099A; DE69937519T2; US6258603B1; EP0965644A3; JP2000037189A; TWI224109B; JP4537512B2

Abstract

본 발명은 DNA 결합 영역 ; 리간드 결합 영역 ; 전이활성화 영역 및 리간드를 포함하는 에크디손 수용체 복합체가 외인성 유전자와 반응성분을 포함하는데 외인성 유전자가 반응 성분 조절하에 있고 리간드의 존재하에서 반응 성분에 DNA결합 영역의 결합이 유전자의 활성화 또는 억제를 가져오는 DNA 구조물과 접촉되는, 외인성 유전자 발현을 조절하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 개선점은 알려진 리간드 보다 개선된 활성을 나타내는 선택된 비-스테로이드 리간드 그룹에 존재한다.

Description

에크디손 수용체 복합체를 통하여 외인성 유전자의 발현을 조절하기 위한 리간드{LIGANDS FOR MODULATING THE EXPRESSION OF EXOGENOUS GENES VIA AN ECDYSONE RECEPTOR COMPLEX}

본 출원은 1998년 12월 11일에 제출된 미국출원 09/210,010의 일부 계속출원이다.

본 발명은 동물과 식물세포에서 외인성 유전자의 발현을 유발하고 억제하는데 유용한 비스테로이드성 리간드에 관한 것이다.

유전자 공학 분야에서, 유전자 발현의 정밀한 일시적인 조절, 즉 유전자를 활성화시키거나 억제시키는 능력은 개발 및 다른 생리학적 과정을 연구, 처리 및 조절하는데 유용한 수단이다 (예를들면, 여기에 참고로 언급된 에반스(Evans)와 노(No), PCT 국제출원 제 PCT/US97/05330호 참조). 포유류계에서의 적용은 유발할 수 있는 유전자 표적화, 독성 및 기형을 발생하는 유전자의 과발현, 안티-센스(anti-sense) RNA 발현 및 유전자 치료를 포함한다. 식물계에서의 적용은 식물 특성 조절, 웅성식물 또는 자성식물 번식력 ; 식물 보호제의 과발현 ; 천연 및 비천연 물질을 포함하는 소정의 식물 제품의 제조 또는 변형을 포함한다. 동물과 식물 모두에서 유발능력은 외래 단백질 생성, 예를들면 치료 단백질, 산업용 효소, 폴리머등에 있어서 가치가 있을 수 있다.

종종 "유전자 스위치"로서 언급되는, 유전자 발현을 조절하기 위해 사용되는 제제는 조절되어야 할 유전자가 남아있는 유기체에 일반적으로 존재하지 않는 것이 중요하다. 이것은 유전자의 예기치않은 발현 또는 억제를 피하는 것이다. 예를들면, 유발가능한 테트라사이클린 조절된 시스템은 발명되어 트랜스제닉(transgenic) 쥐에 사용함으로서 유전자 활성이 항생물질 부재시 유발되고 존재시 억제된다. 불행하게도, 이 경우 테트라사이클린의 약물역학은 효과적인 "온-오프" 유전자 스위치로서 이의 사용을 방해할 수 있다.

국제특허출원 제 PCT/GB96/01195호는 스테로이드(예를들면, 20-하이드록시에크디손과 muristerone A)와 어떤 비-스테로이드성 유발인자에 대해 반응성인 유전자 스위치로서 작용할 수 있는 Heliothis virescens ("HEcR")로 부터 분리된 곤충 스테로이드 수용체를 기술하고 있다. 비-스테로이드성 유발인자는 스테로이드와 비스테로이드 유발인자에 모두 반응성인 이 시스템과 많은 다른 시스템에서 예를들면 보다 낮은 제조비용, 신진대사 안정성, 곤충, 식물 또는 포유류로부터의 부재 및 환경적 수용가능성을 포함하는 많은 이유때문에 스테로이드성 유발인자보다 뚜렷한 잇점을 갖는다. 이 PCT출원은 HEcR 시스템용 유전자 스위치로서 2개의 디벤조일하이드라진, 1,2-디벤조일-1-tert-부틸-하이드라진 및 테부페노지드 (N-(4-에틸벤조일)-N'- (3,5-디메틸벤조일)-N'-tert-부틸-하이드라진)을 사용하는 것을 기술하고 있으며 미국특허 제 5,117,057호에 기술된 것과 같은 다른 디벤조일하이드 라진이 이 시스템에서 유전자 스위치로서 작용할 수 있다는 것을 제시하고 있다. 이것이 사실일 수는 있지만 이들 디벤조일하이드라진의 활성은 명확하지 않다. 상세하게, 미국특허 제5,117,057호는 매우 광범위한 종류의 디벤조일하이드라진을 기술하고 있는데 이들 중 많은 것이 유전자 스위치로서 비효과적인 것으로 나타났다. GB96/01195는 20개의 이러한 디벤조일하이드라진을 시험했을 때 오직 7개만이 어떤 활성을 보였다고 기술하고 있다.

국제특허출원 제 PCT/EP96/00686호는 Drosophila melanogaster 로부터의 에크디손 수용체를 위한 화학적 리간드로서 테부페노지드(tebufenozide)의 사용을 기술하고 있다. 이 수용체는 농업적으로 중요한 다양한 특성을 조절하도록 트랜스제닉 식물에서 유전자 발현을 조절하기 위해 사용된다.

불행하게도, 상기한 참고문헌에 기술된 리간드가 분리된 세포에서 리포터(reporter)유전자 유발 활성을 나타냄에도 불구하고 손상되지 않은 식물, 동물과 같은 전체 유기체에 그들을 사용하려는 시도가 없었다.

따라서, 알려진 리간드와 비교하여 증가되거나 일치하는 활성을 가지며, 손상되지 않은 식물과 동물에서 활성을 나타내는 비-스테로이드성 리간드를 발전시키기 위한 계속되는 요구가 남아 있다. 본 발명자들은 손상되지 않은 식물과 동물에 사용될 때 개선된 이송 및 분포특성, 대사 안정성, 잔류 활성도, 수용체에 대한 친화력을 가지며 및 역효과가 없는 것 때문에 분리된 세포에서 리포터 유전자 유발 활성을 나타낼 뿐만 아니라 알려진 디아실하이드라진, 1,2-디벤조일-1-tert-부틸- 하이드라진 및 테부페노지드 보다 잇점을 갖는, 제한된 그룹의 디벤조일하이드라진 유도체를 발견했다.

본 발명은

a) DNA 결합 영역 ;

b) 리간드 결합 영역 ;

c) 전이활성화 영역 ; 및

d) 리간드를 포함하는 에크디손 수용체 복합체를

a) 외인성 유전자 ; 및

b) 반응 성분(response element)을 포함하는데,

여기에서,

a) 외인성 유전자는 반응성분의 조절하에 있고 ;

b) 리간드 존재하에서 반응 성분에 DNA 결합 영역의 결합이 유전자의 활성화또는 억제를 가져오는 DNA 구조물과 접촉시키는 것을 포함하는,외인성 유전자 발현을 조절하기 위한 방법에 있어서,

하기 식 Ⅰ의 화합물로부터 리간드를 선택하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다

여기에서 :

E는 3급 탄소를 함유하는 (C₄-C₆)알킬이거나 3급 탄소를 함유하는 시아노(C₃-C₅)알킬이고 ;

R¹은 H, Me, Et, i-Pr, F, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, OMe, OEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, SCN 또는 SCHF₂ 이고 ;

R²는 H, Me, Et, n-Pr, iPr, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH ₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃ OCF₂CF₂H, COEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe, NH-CN이거나 R³ 및, R²와 R³가 부착되어 에틸렌디옥시, 페닐탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴고리 또는 페닐탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로피릴고리를 형성하 는 페닐탄소와 결합되며,

R³는 H,Et 이거나 R³ 및 R²와 R³가 부착되어 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴고리 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로피릴 고리를 형성하는 페닐 탄소와 결합되며,

R⁴,R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, Me, Et, F, Cl, Br, 프로필, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe 또는 SEt이고 ;

이는

a) R¹이 Me이고 R²가 OMe일 때 ;

R³가 H ; R⁴,R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me, 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl 또는 3,5-디-F이고 ;

b) R¹이 Me이고 R²가 OEt일 때 ;

R³가 H ; R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me, 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl, 3,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-Cl이며 ;

c) R¹이 Et이고 R²가 OMe 또는 OEt일 때 ;

R³가 H ; R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은,

ⅰ) 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl, 3,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Cl, 2-Br 또는 3-Me 이거나

ⅱ) R⁶은 H, R⁴는 Me이고 R⁵는 Et, F, Cl, Br, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe 또는 SEt이고 ;

d) R¹이 i-Pr일 때 ;

R²는 OMe 또는 OEt이고 ; R³는 H이며 R⁴,R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며; ;

e) R³가 Et일 때 ;

R²가 H이고 R¹ 이 F 또는 Cl이며 R⁴,R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me 이고 ;

f) R² 와 R³가 이들이 부착되는 페닐 탄소와 함께 에틸렌디옥시 고리를 형성할 때 ;

R¹은 Me이거나 Et이고 R⁴,R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며 ;

g) R²와 R³가 이들이 부착되는 페닐 탄소와 함께 디하이드로퓨릴 또는 디하이드로피릴 고리를 형성할 때 ;

R¹은 Et이고 R⁴,R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며 ;

h) R¹이 프로밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, SCN 또는 SCHF₂일 때 ;

R²는 OMe 이거나 OEt이고 R³는 H이며 R⁴,R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이고 ; 그리고,

i) R²는 Me, Et, n-Pr, i-Pr, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH ₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃, OCF₂CF₂H, COEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe 또는 NH-CN일 때 ;

R¹은 Et, R³는 H이고 R⁴,R⁵ 및 R⁶의 조합이 3,5-디-Me가 되는 경우이다.

본 발명은 또한

a) DNA 결합 영역 ;

b) 리간드 결합 영역 ;

c) 전이활성화 영역 ; 및

d) 식 Ⅰ의 화합물로 이루어진 리간드를 포함하는 에크디손 수용체 복합체 를,

a) 외인성 유전자 ; 및

b) 반응성분을 포함하는데,

여기에서,

a) 외인성 유전자는 반응 성분의 조절하에 있고 ;

b) 리간드 존재하에서 반응성분에 DNA 결합 영역의 결합이 유전자의 활성화 또는 억제를 가져오는 DNA 구조물과 접촉시키는 것을 포함하는, 외인성 유전자 발현을 조절하기 위한 방법에 관한 것이다.

a) 리간드 결합과 그 결과로 생긴 유전자 스위치 활성과 b) 손상되지 않은 식물과 동물에서 운반성, 계통성, 독성 및 대사 안정성 사이의 최적 균형을 달성하기 위해 식Ⅰ화합물 중 치환기 위치와 크기가 중요하다. 상기 특성들의 최적 균형은 E가 t-부틸, R¹이 에틸, R²가 에톡시, R³가 수소 및 R⁴,R ⁵ 및 R⁶의 조합이 3,5-디메틸일때 발생하는 것으로 나타났다. 각각의 이들 "R"기의 조성은 상당히 다양하다. 그러나, 식Ⅰ 화합물의 크기, 모양 및 전체 극성에 상당한 변화를 가져오는 변형은 최적 균형 및 결과적으로, 화합물의 개선된 성질을 감소시키는 경향이 있다. 이 이유때문에 어떤 하나의 특정 R기의 조성이 최적으로부터 변화될 때 남아 있는 R기의 조성의 변화가 제한되어야 한다.

바람직하게, E는 (C₄-C₅)알킬이다. 보다 바람직하게는 E가 t-부틸이다.

바람직하게, R¹은 Me, Et, i-Pr, F, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH 또는 CF₂CF₃이다. 보다 바람직하게는 R¹은 Me, Et, i-Pr, F, CF₃, CHF₂, CH₂F, CH₂OMe, OH₂CN, C≡CH 또는 CF₂CF₃이다. 보다 더 바람직하게는 R¹은 Me, Et, i-Pr 또는 F이다. 가장 바람직하게는 R¹은 Me 또는 Et이다.

바람직하게, R²는 Et, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, CF₂CF₃, 아지도, OCF₃ 이거나 R³ 및 R²및 R³가 부착되어 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴고리 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로피릴 고리를 형성하는 페닐 탄소와 결합된다. 보다 바람직하게는 R²는 Et, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, OH, OMe, OEt, CF₂CF₃이거나 R³ 및 R² 와 R³가 부착되어 에틸렌 디옥시 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴 고리를 형성하는 페닐탄소와 결합된다. 보다 더 바람직하게는 R²는 OH, OMe, OEt 이거나 R³ 및 R²와 R³가 부착되어 에틸렌디옥시 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴 고리를 형성하는 페닐탄소와 결합된다. 가장 바람직하게는 R²는 OMe이거나 OEt이다.

바람직하게 R³는 H, Et이거나 R² 및 R²및 R³가 부착되어 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴고리 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로피릴 고리를 형성하는 페닐 탄소와 결합된다. 보다 바람직하게는, R³는 H, Et이거나 R² 및 R² 와 R³가 부착되어 에틸렌디옥시 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴 고리를 형성하는 페닐탄소와 결합된다. 보다 더 바람직하게는, R³ 는 R²및 R²와 R³가 부착되어 에틸렌디옥시 또는 페닐탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴 고리를 형성하는 페닐탄소와 결합된다.

바람직하게, R⁴,R⁵ 및 R⁶는 독립적으로 Me, F, Cl, CH₂OH 또는 OMe이다. 보다 바람직하게, R⁴, R⁵ 및 R⁶는 독립적으로 Me, F, Cl, CH₂OH 또는 OMe이다. 보다 더 바람직하게는, R⁴, R⁵ 및 R⁶가 독립적으로 Me, F 또는 Cl이다. 훨씬 더 바람직하게는 R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me ; 3,5-디-Cl 또는 3,5-디-F이다. 가장 바람직하게는 R⁴,R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이다.

용어 "Me", "Et", " n-Pr", "i-Pr" 및 "Ac" 는 각각 메틸, 에틸, 노르말 프로필, 이소프로필 및 아세틸을 의미한다. R⁴, R⁵ 및 R⁶를 언급할때 용어 "2,4", "2,5", "3,5"등은 기가 부착되는 페닐 고리에서 상대적인 위치를 말한다.

용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도를 의미한다.

용어 "조절하다(modulate)"는 외인성 유전자의 전이활성화를 유발 또는 억제하기 위한 주어진 리간드/수용체 복합체의 능력을 의미한다.

용어 "외인성 유전자"는 피검자에 대한 외래 유전자, 즉 외인성 돌연변이된 유전자의 형질전환과정 또는 돌연변이되지 않은 형태를 거쳐 피검자내로 도입되는 유전자를 의미한다. 형질전환의 방법은 본 발명에서 중요하지 않고 선행기술 분야의 사람들에게 알려진, 피검자에게 적당한 방법일 수 있다. 예를들면, 트랜스제닉 식물은 형질전환된 세포로부터 재생에 의해 얻어진다. 수많은 형질전환과정이 Agrobacterium tumefaciens 또는 이의 T₁ 플라즈미드를 사용하는 토양감염, 일렉트로포레이션(electroporation), 식물세포와 원생동물의 미세주입 및 미세투사(microprojectile) 형질전환과 같이 문헌에 알려져 있다. 동물 세포의 형질전환과 트랜스제닉 동물에서 이러한 형질전화 세포의 재생을 위한 보완적인 기술도 알려져 있다. 외인성 유전자는 천연 또는 합성 유전자 및 DNA 또는 역전사 효소에 의해서와 같이 DNA 중간체를 통해 작용할 수 있는 RNA형태로 피검자에 도입되는 치료 유전자일 수 있다. 이러한 유전자는 표적 세포에 도입되거나, 직접적으로 피검자에 도입되거나 간접적으로 피검자내로 형질전환된 세포의 전이에 의해 도입될 수 있다. 용어 "치료 유전자"는 이러한 유전자가 발현되는 숙주세포에 이로운 기능을 제공하는 유전자를 의미한다. 치료 유전자는 천연적으로 숙주 세포에서 발견되지는 않는다.

용어 "에크디손 수용체 복합체"는 일반적으로 스테로이드 수용체과의 2개의 멤버, 에크디손 수용체 ("EcR") 및 초기공("USP";ultraspiracle) 단백질 (야오, 티.피.(Yao, T.P.) 등(1993) Nature 366, 476-479 ; 야오, 티.피. 등(1992) Cell 71.63-72 참조)로 이루어진 이종 2량체성 단백질 복합체를 의미한다. 관능성 에크디스테로이드 수용체 복합체로는 면역필린스(immunophilins)와 같은 추가적인 단백질을 또한 포함할 수 있다. 전사인자(DHR38, betaFTZ-1 또는 다른 곤충 동족체)로 알려진 단백질의 스테로이드 수용체과의 추가적인 멤버는 EcR 및/또는 USP에 대하여 리간드 의존적이거나 독립적인 파트너일 수 있다. 에크디손 수용체 복합체는 에크디손 수용체 단백질의 이종 2량체와 초기공 단백질의 척추동물 동족체, 레티노익산 X-수용체 ("RXR") 단백질일 수 있다. 에크디손 수용체 단백질 또는 USP의 동종 2량체는 어떤 환경하에서도 관능적일 수 있다.

에크디스테로이드 수용체 복합체는 활성 에크디스테로이드 또는 복합체의 다른 단백질을 배제하는 것은 아니지만 EcR을 포함하는 복합체 단백질 중 하나에 결합된 비스테로이드성 리간드에 의해 활성화될 수 있다.

에크디손 수용체 복합체는 모든 구성원이 아미노-말단 전이활성화 영역, DNA 결합 영역("DBD") 및 힌지 부위에 의해 분리되는 리간드 결합 영역 ("LBD")의 존재에 의해 특징되는 스테로이드 수용체 초과(superfamily)의 구성원인 단백질을 포함한다. 이 과의 어떤 구성원은 LBD의 카르복시-말단 측상에 또 다른 전이 활성화 영역을 가질 수 있다. DBD는 2개의 아미노산 모티프인 P-박스와 D-박스 사이의 2개의 시스테인 아연 핑거의 존재에 의해 특징되는데 이는 에크디손 반응 성분에 대한 특이성을 제공한다. 이들 영역은 천연, 변성될 수 있거나 이종 수용체 단백질 의 다른 영역의 키메라 일 수 있다.

용어 "반응성분"("RE")은 에크디손 수용체 복합체의 DNA 결합 영역과의 상호작용을 통해 조절된 프로모터에 반응성을 주는 하나 이상의 시스-작용 DNA 성분을 의미한다. 이 DNA 성분은 그 서열에서 팔린드롬성(palindromic) (완전 또는 불완전)이거나 다양한 수의 뉴클레오티드로 분리된 서열 모티프 또는 절반 부위로 이루어질 수 있다. 절반 부위들은 유사하거나 동일할 수 있고 직접 또는 전환된 반복으로 배열될 수 있다. 에크디손 수용체 복합체는 리간드 존재 또는 부재시 이 반응 성분의 조절하에서 하류 유전자의 전사를 개시 또는 억제하기 위해 RE의 DNA 서열에 결합한다. 천연 에크디손 수용체의 RE에 대한 DNA 서열의 예로는 RRGG/TTCANTGAC/ACYY (케르바스 엘. (Cherbas L.)등 (1991), Genes Dev. 5, 120-131 참조) ; AGGTCAN_(n)AGGTCA, 여기에서, N_(n) 은 하나이상의 스페이서(spacer) 뉴클레오티드 이다.(디아비노 피피(D'Avino PP.)등(1995), Mol. Cell. Endocrinol, 113, 1-9 참조) ; 및 GGGTTGAATGAATTT (안토니스키 씨 (Antoniewski C.)등 (1994). Mol. Cell. Biol. 14, 4465-4474 참조)를 포함한다.

외인성 유전자, 반응성분 및 에크디손 수용체 복합체를 구성하는 DNA 서열은 Escherichia coli, Bacillus subtilis 또는 다른 장내세균과 같은 원핵 생물 세포내로 도입될 수 있다. 그러나, 유전자에 의해 발현된 많은 단백질이 박테리아에서 부정확하게 처리되기 때문에 진핵 생물 세포가 바람직하다. 외인성 유전자, 반응성분 및 수용체 복합체에 대한 뉴클레오티드 서열은 RNA 분자, 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스와 같은 관능성 바이러스 RNAs 형태로서도 도입될 수 있다. 진핵생물 세포들 중 척추동물문 세포는 자연적으로 에크디손 수용체용 리간드에 반응을 주는 분자가 없기 때문에 바람직하다. 그 결과 그들은 본 발명의 리간드에 대해 민감하지 않다. 따라서, 본 발명의 리간드는 형질전환 세포 또는 전체 유기체에 무시할만한 생리학적 또는 다른 효과를 가질 것이다. 따라서, 세포가 성장하여 소정의 생성물을 리간드 그 자체의 존재에 의해서 거의 영향받지 않은 발현시킬 수 있다.

용어 "피검자"는 손상되지 않은 식물 또는 동물 또는 식물 또는 동물의 세포를 의미한다. 피검자가 진균류 또는 이스트일 때 리간드는 동일하게 잘 작동할 것으로 기대된다. 피검자가 손상되지 않은 동물일 때, 바람직하게는 이 동물은 척추동물, 가장 바람직하게는 포유동물이다.

외인성 유전자에 연결된 반응성분에 결합된 에크디손 수용체 복합체와 사용될때 본 발명의 리간드는 외인성 유전자의 발현의 외부의 일시적인 조절을 위한 수단을 제공한다. 다양한 성분이 서로 결합하는, 즉 리간드가 수용체 복합체에 그리고 수용체 복합체가 반응성분에 결합하는 순서는 중요하지 않다. 전형적으로, 외인성 유전자 발현의 조절은 특이적 조절 또는 조절하는 DNA 성분에 에크디손 수용체 복합체의 결합에 대한 반응에 있다. 스테로이드 수용체 과의 다른 구성원과 같이 에크디손 수용체 단백질은 최소한 3개의 영역, 전이활성화 영역, DNA 결합 영역 및 리간드 결합 영역을 소유한다. 스테로이드 수용체 과의 작은 조직과 같이 이 수용체는 이종 이량화 성질에 대해 반응성인 덜 정의된 부위를 소유한다. USP 또는 RXR 단백질과 이종 이량화 후 에크디손 수용체 단백질의 리간드 결합 영역에 리간드의 결합은 이종 이량화 단백질의 DNA결합영역이 활성화된 형태로 반응성분에 결합할 수 있게 하고 따라서 외인성 유전자의 발현 또는 억제를 가져온다. 이 메카니즘은 EcR 또는 USP에 대한 리간드의 결합 잠재성을 배제하지 않고 활성 동종 이량체 복합체(예를들면 EcR+EcR 또는 USP+USP)의 형성을 가져온다. 바람직하게, 하나 이상의 수용체 영역은 키메라성 유전자 스위치를 생성하도록 다양해질 수 있다. 전형적으로, 3개 영역 중 하나 이상은 키메라성 수용체가 활성도, 리간드의 상보적인 결합 및 특이적 반응 성분의 인식을 전이활성화시키기 위해, 선택된 숙주세포 또는 유기체에서 최적화되도록 다른 영역의 근원과는 다른 근원으로부터 선택될 수 있다. 또는, 반응성분 그자체는 키메라성 에크디손 수용체 복합체를 수용하도록 이스트로부터 GAL-4 단백질(사도우스키(Sadowski)등 (1988) Nature, 335, 563-564 참조) 또는 E. coli로부터 LexA 단백질(브렌트(Brent)와 프타쉰(Ptashne) (1985), Cell, 43, 729-736 참조)과 같은 다른 DNA 결합 단백질 영역에 대한 반응 성분으로 변성되거나 치환될 수 있다. 키메라성 시스템의 또 다른 잇점은 이 시스템이 소정의 최종 결과에 따라 외인성 유전자를 작용시키도록 사용된 프로모터를 선택할 수 있도록 하는 것이다. 이러한 이중 조절은 유전자 치료 분야, 특히 세포독소 단백질이 생성될때 특히 중요할 수 있는데 이는 발현시점뿐만 아니라 발현이 발생하는 세포도 조절될 수 있기 때문이다. 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 특이적 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 서열은 전사가 적당한 조건하에서 특이적으로 개시될 수 있는 부위이다. 적당한 프로모터에 효과적으로 결합된 외인성 유전자가 피검자의 세포내로 도입될 때 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 리간드 존재에 의해 조절될 수 있다. 프로모터는 구성성분적으로 또는 유발적으로 조절될 수 있거나 조직-특이적(즉, 세포의 특정 형태에서만 발현됨) 또는 유기체의 특정 진전 단계에 특이적일 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은 유기체에 식 Ⅰ의 화합물을 포함하는 리간드의 효과적인 양, 즉 소정의 유전자 발현 또는 억제를 유도하는데 요구되는 양을 투여하는 것을 포함하는, 유기체에서 하나 이상의 외인성 유전자의 발현을 조절하기 위한 방법으로서 여기에서 유기체의 세포는

a) 1) DNA 결합 영역 ;

2) 리간드용 결합 영역 ; 및

3) 전이 활성화 영역을 포함하는 에크디손 수용체 복합체와

b) 1) 외인성 유전자 ; 및

2) 반응성분을 포함하는데,

여기에서,

a) 외인성 유전자는 반응 성분의 조절하에 있고 ;

b) 리간드의 존재하에서 반응 성분에 DNA 결합 영역의 결합이 유전자의 활성화와 억제를 가져오는, DNA 구조물을 함유한다.

본 발명의 관련된 태양은 유기체의 세포내에서 에크디손 수용체와 식 Ⅰ의 화합물을 포함하는 리간드를 접촉시키는 것을 포함하는, 트랜스제닉 유기체에서 외인성 또는 이종 구조 유전자 발현을 조절하기 위한 방법으로 여기에서 세포는 에크 디손 수용체용 DNA 결합 서열을 함유하고 에크디손 수용체-리간드-DNA 결합 서열 복합체의 형성은 유전자의 발현을 유발한다.

본 발명의 네번째 태양은

a) 식 Ⅰ의 화합물을 포함하는 리간드에 대한 노출에 거의 민감하지 않은 세포를 선택하고 ;

b) 세포내로

1) a) 폴리펩티드를 엔코딩하는 외인성 유전자 ; 및

b) 반응성분을 포함하는데,

여기에서, 외인성 유전자가 반응성분의 조절하에 있는 DNA 구조물과 ;

2) a) DNA 결합 영역 ;

b) 리간드용 결합 영역 ;

c) 전이활성화 영역을 포함하는 에크디손 수용체 복합체를 도입하며 ;

c) 리간드에 세포를 노출시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법이다.

세포에 의해 폴리펩티드 생성을 일시적으로 조절하는 잇점뿐만 아니라 본 발명의 특징은 이러한 폴리펩티드의 축적이 세포를 손상시킬때의 경우에 폴리펩티드의 발현이 단기간으로 제한될 수 있다는 점에서 또다른 잇점을 더 제공한다. 이러한 조절은 외인성 유전자가 치료 유전자일 때 특히 중요하다. 치료 유전자는 당뇨병 환자에게서 인슐린 생성과 같은, 요구되는 기능을 조절하는 폴리펩티드를 생성하도록 할 때 요구될 수 있다. 그들은 암세포에 대해 치사적인 것과 같은, 손상 또는 심지어 치사 단백질을 생성하기 위해서도 사용될 수 있다. 이러한 조절은 생성된 단백질 수준이 트랜스제닉 식물과 같이 성장 또는 재생산시에 대사의 고갈을 이룰때도 중요하다.

다양한 폴리펩티드를 코딩하는 수 많은 게놈 및 cDNA 핵산 서열이 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 리간드에서 유용한 외인성 유전학적 물질로는 예를들면 세포로부터 방출될 수 있는 분비 단백질 ; 기질을 독성 물질로부터 비-독성 물질로 또는 불활성 물질로부터 활성물질로 대사시킬 수 있는 효소 ; 조절단백질 ; 세포표면 수용체등과 같은 생물학적으로 흥미로운 활성 단백질을 엔코드하는 유전자를 포함한다. 유용한 유전자는 혈액 응고 인자, 인슐린, 부갑상선 호르몬, 루테인화 호르몬 방출 인자, 알파와 베타 정액 인히빈 및 인간 성장 호르몬과 같은 호르몬을 엔코드하는 유전자 ; 부재가 비정상적인 상태의 발생을 야기하는 효소와 같은 단백질을 엔코드하는 유전자 ; 인터페론, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 콜로니 자극 인자-1, 종양 회저 인자 및 에리트로포이에틴과 같은 시토킨 또는 림포카인을 엔코딩하는 유전자 ; 알파₁-안티트립신과 같은 억제물질을 엔코딩하는 유전자, 디프테리아와 콜레라 독소와 같이 약물로서 작용하는 물질을 엔코딩하는 유전자등을 포함한다. 유용한 유전자는 암치료와 유전적 장해를 치료하는데 유용한 것들을 포함한다. 본 기술분야에 통상의 지식을 가진자들은 모든 알려진 유전자에 대한 핵산 서열 정보에 접근가능하고 공공 기탁기관, 서열 공개 기관으로부터 직접적으로 핵산 분자를 얻거나 그 분자를 제조하기 위한 간단한 방법을 사용할 수 있 다.

유전자 치료용으로서, 여기에 기술된 리간드는 예를들면 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 연고, 연금약액(elixirs) 및 주사가능한 조성물과 같은 제약학적으로 수용가능한 캐리어에 포함될 수 있다. 제약학적 제제는 0.01-99중량%의 리간드를 함유할 수 있다. 제제는 단일 또는 복합 복용량 형태일 수 있다. 특정 제약학적 제제에서 리간드의 양은 효과적인 용량, 즉 소정의 유전자 발현 또는 억제를 이루는데 요구되는 용량에 좌우된다.

제약학적 제제를 투여하는 적당한 경로는 경구, 직장, 국부(피부, 구강 및 혀밑을 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 피내, 포막내 및 경막밖을 포함) 및 코-위 튜브에 의한 것을 포함한다. 투여의 바람직한 경로는 치료되는 상태에 좌우되고 투여받는자의 상태와 같은 요인에따라 다양할 수 있다는 것이 본 기술분야에 통상의 지식을 가진자에게 이해될 것이다.

여기에 기술된 리간드는 다른 제약학적으로 활성적인 화합물과 조합하여 투여될 수 있다. 여기에 기술된 리간드와 조합하여 사용된 제약학적으로 활성적인 화합물은 투여받는자에 대한 역 효과 또는 화합물 사이의 바람직하지 않은 상호작용을 피하도록 선택된다는 것이 본 기술분야에 통상의 지식을 가진 자들에게 이해될 것이다. 리간드와 조합하여 사용될 수 있는 다른 제약학적으로 활성적인 화합물의 예로는 예를들면 AIDS 화학요법제, 아미노산 유도체, 진통제, 마취제, 식욕감퇴생성물, 제산제와 고창억제제, 항생물질, 응고방해물질, 해독제, 항섬유소 용해제, 항히스타민제, 항염증제, 항종양약, 구충제, 항원충제, 해열제, 방부제, 진경 제와 콜린억제제, 항바이러스, 성욕 억제제, 관절염약물, 생물학적 반응 변성제, 뼈 신진대사 조절제, 장 배설 촉진제, 심장혈관제, 중앙 신경계 자극제, 대뇌 신진대사 강화제, 세륨에놀리틱스(cerumenolytics), 콜린에스트라제 억제제, 감기와 기침 조제약, 콜로니 자극 인자, 피임약, 세포보호제, 치과용 조제약, 방취제, 피부약, 해독제, 당뇨병제, 특수증상, 설사약물, 도파민 수용체 작용물질, 전해질, 효소와 소화제, 에르고친 중독 조제약, 수정제, 섬유 보충제, 항진균제, 유루증 억제제, 위산분비억제제, 위장 프로키네틱제, 성선자극 호르몬 억제제, 모발 성장 촉진제, 헤마틴제, 헤모르헤오로지제(hemorrheologic agents), 히스타민 H₂ 수용체 길항제, 호르몬, 고혈당제, 하이포리피더믹스(hypolipidemics), 면역억제제, 완하제, 리프로스타틱스 (leprostatics), 레우카페레시스(leukapheresis) 부가물, 폐 계면활성제, 편두통 조제약, 점액용해제, 근육완화길항제, 근육완화제, 마취 길항제, 코 스프레이, 배멀미 약물, 뉴클레오시드 동족체, 영양 보충제, 골다공증 제제, 분만 촉진제, 부교감신경작용 차단제, 부교감신경자극 흥분제, 파킨슨 증후군 약물, 페니실린 보조약, 포스포리피드, 혈소판 억제제, 포르피린증제, 프로스타글라딘 동족체, 프로스타글라딘, 프로톤 펌프 억제제, 소양증 약물 항정신제, 퀴놀론, 호흡기 자극제, 타액 자극제, 염 치환제, 경화제, 피부상처 조제약, 금연 보조제, 설폰아미드, 교감신경 차단제, 혈전붕괴제, 토레트 증후군제, 진전 조제약, 결핵 조제약, 요산뇨증제, 비뇨기계제, 자궁수축제, 자궁완화제, 질 조제약, 현기증제, 비타민 D 동족체, 비타민 및 의학적 영상 대비 매체를 포함한다. 어떤 경우, 리간드는 예를들면 특정약물을 대사하는 효소를 생성하는 유전자를 "턴-오프(turn-off)"하기 위한 약물치료의 보조제로서 유용하다.

농경적 적용에 있어서, 상기에 기술된 적용이외에 본 발명의 리간드는 Bacillus thuringiensis (Bt) 독소와 같은 살충성 단백질의 발현을 조절하는데도 사용될 수 있다. 이러한 발현은 조직 또는 식물 특이적일 수 있다. 또한 특히 식물 해충의 방제가 요구될 때 하나 이상의 살충제가 여기에 기술된 리간드와 조합될 수 있고 그러므로써 살충제가 개별적으로 살포되는 경우보다 적은 총 살포를 포함하는, 추가적인 잇점과 효과를 제공한다. 살충제와의 혼합물이 사용될 때 조성물에서 각각의 성분의 상대적인 비율은 상대적인 효과와 처리되어야 할 농작물, 해충 및/또는 잡초에 대한 각 살충제의 소정의 살포비율에 좌우된다. 본 발명에 통상의 지식을 가진자는 살충제의 혼합물이 단독으로 사용된 살충제보다 보다 넓은 활성 스펙트럼과 같은 잇점을 제공할 수 있다는 것을 알 것이다. 여기에 기술된 리간드를 갖는 조성물에 조합될 수 있는 살충제의 예는 살진균제, 제초제, 살충제, 살진드기제 및 살생물제를 포함한다.

여기에 기술된 리간드는 통상적인 고-리터 수압 스프레이, 저-리터 스프레이, 공기발진 및 공기 스프레이와 같이 보통 사용되는 방법으로 수성 스프레이로서 식물 잎에 살포될 수 있다. 살포의 희석율과 속도는 사용된 장치, 소정의 살포방법과 주기 및 리간드 살포비율에 좌우된다. 스프레이 탱크에 추가적인 보조제를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 보조제로는 계면활성제, 분산제, 살포제, 스티커, 항폼제, 에멀젼화제 및 MC Publishing Company의 McCutcheon's Division (New Jersey)에 의해 매년 발간되는 McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, McCutcheon's Emulsifiers and Detergents/Functional Materials 및 McCutcheon's Functional Materials에 기술된 다른 유사한 물질을 포함한다. 리간드는 그들의 살포전에 비료 또는 비료화물질과 혼합될 수 있다. 리간드와 고형 비료화물질은 혼합 장치 또는 블렌딩 장치에서 혼합될 수 있거나 그래뉼 제형으로 비료와 함께 도입될 수 있다. 비료의 상대적인 비율은 처리될 농작물과 잡초에 적당하게 사용될 수 있다. 여기에 기술된 리간드는 보통 5-50%의 비료화 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 소정 식물의 빠른 성장을 촉진시키고 동시에 유전자 발현을 억제하는 비료화 물질을 제공한다.

본 발명의 리간드는 알려진 화합물이거나 미국 특허 제 5,117,057호, 제 5,530,028호 및 제 5,378,726호에 기술된 과정을 이용하여 본 기술분야에 통상의 지식을 가진자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 일반적으로 두단계의 공정이 사용된다. 제 1단계에서, 식 Ⅱ의 치환된 벤조산 클로라이드를 식 Ⅲ의 치환된 하이드라진과 조합하여 식 Ⅳ의 모노아실하이드라진을 제조한다. 식 Ⅳ의 모노아크릴하이드라진을 제 2단계에서 식 Ⅴ의 또다른 벤조산 클로라이드와 조합하여 식 Ⅰ의 화합물을 형성한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명 리간드의 활성을 입증하는 것이다.

하기 리간드와 비교 리간드를 평가했다 :

리간드	R1	R2	R3	3- R4	5- R5	4- R6
CE-1	H	H	Et	Me	Me
CE-2	H	H	H	H	H
CE-3
1	Et	OMe	H	OMe	H
2	Me	-OCH₂CH₂O-		Me	Me
3	Me	OMe	H	Me	Me
4	Et	OMe	H	F	F
5	Et	OMe	H	Me	Me
6	Me	OEt	H	Me	Me
7	Et	-OCH₂CH₂O-		Me	Me
8	Et	-CH₂CH₂O-		Me	Me
9	Me	OMe	H	Cl	Cl
10	Et	OMe	H	Cl	Me
11	i-Pr	OMe	H	Me	Me
12	Et	OEt	H	Me	Me
13	Et	OMe	H	Cl	Cl
14	Me	OH	H	Me	Me
15	Me	OH	H	Me	CH₂OH
17	F	H	Et	Me	Me
18	Me	OMe	H	OMe	OMe	Me

CE-1 = 테부페노지드

CE-2 = 1,2-디벤조일-1-tert-부틸-하이드라진

CE-3 = muristerone A

유전자 구축

pVgRXR (Invitrogen Corp., Carlsbad, 캘리포니아)은 변성된 이종 이량체 핵 수용체를 형성하기 위해 VgEcR과 RXR을 모두 발현하는 8728kb 플라즈미드이다 (노,디.(No, D.)등, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3346-3351 참조). 에크디손 수용체(VgEcR)를 천연 Drosophila 에크디손 수용체로부터 유도하여 VPI6 전이활성화 영역을 함유하도록 변성시켰다 (크레스, 더블유. 디.(Cress, W.D.)와 트리젠베르그, 에이. 제이(Triezenberg, S.J.)(1991), Science 251, 87-90 ; 사도스키, 아이.(Sadowski, I.)등 (1988) Nature 335, 563-564 ; 트리젠베르그, 에스. 제이. 등 (1988) Genes Dev 2, 718-729 ; 트리젠베르그, 에스. 제이. 등(1988), Genes Dev 2, 730-742 참조). RXR은 Drosophila 에크디손 수용체에 대한 천연 파트너인 USP(ultraspiracle)의 포유동물 동족체이다. (야오, 티.피. (Yao,T.P.) 등 (1993), Nature 366, 476-479 ; 야오, 티.피. 등(1992), Cell 71, 63-72 참조). VgEcR DNA 결합 영역의 P-박스 부위를 글루코르티코이드 반응 성분로부터의 절반 부위(우메소노, 케이. (Umesono, K.)와 이반스, 알. 엠. (Evans, R.M.) (1989), Cell 57, 1139-1146)와 천연 에크디손 반응 성분으로 부터의 절반 부위로 이루어진 하이브리드 에크디손 반응성분을 인식하기 위해 변성시켰다. 하이브리드 반응성분은 천연 에크디손 반응성분(EcRE)과 결합할 수 있는 파르세노이드 X 수용체와의 상호작용 가능성을 감소시킨다. 세포확대 바이러스 강화-프로모터는 VgEcR의 발현을 유발하고 Rous sarcoma 바이러스 프로모터는 RXR의 발현을 유발한다. 벡터 pIND(Invitrogen Corp.)는 pcDNA3.1에 기초한 5024 bp 벡터이다. 이것은 pVgRXR과 최소 열 충격 프로모터로부터 발현된 변성 에크디손 수용체에 의해 인식된 5개의 하이브리드 E/GREs를 함유한다 (야오, 티.피 등(1993) Nature, 366, 476-479 참조). pIND/lacZ (Invitrogen Corp.)는 수용체 효소로서 β-갈락토시다아제 유전자를 함유하는 8170bp 플라즈미드이다. pIND/lacZ와 pVgRXR의 코트랜스펙션 (cotransfection)은 muristerone A와 같은 에크디손 작용물질의 첨가시 β-갈락토시다아제의 유발을 가져온다. 수용체 플라즈미드 pIND/luc를 Nhe I-BamHI 입자와 같은 pGL3(Promega/E1741)로 부터 pIND로 개똥벌레 발광효소 유전자를 서브클로닝 (subcloning)하므로서 구축하고 Nhe I 와 BamHI로 소화시켰다.

포유동물 세포주의 유지와 트랜스펙션

CHO 세포 (ATCC # CCL-61)를 10% 태아송아지 혈청(FBS, 완전 배지 ; Gibco/BRL, 16000-036)이 보충된 F-12 Nutrient 혼합물(Ham's 배지) (Gibco/BRL, 11765-054)에 유지시켰다. 이들 세포를 95% 대기 공기와 5% CO₂ 내에서 37℃로 유지시켰다.

CHO 세포를 웰당 ㎖당 0.5×10⁵ 세포의 농도로 12-웰 조직 배양판에 살포했다. 지질 Pfx-8 (Invitrogen, T930-18)을 일시적으로 에크디손 유도 발현 시스템(Invitrogen catalog number K1000-01)을 감염시키기 위해 사용했다. 에크디손 유도 발현 시스템은 수용체 서브유니트(subunit)를 엔코딩하는 pVgRXR과 각각 β-갈락토시다아제 또는 발광효소를 엔코딩하는 리포터 유전자와 반응성분을 함유하는 pIND/lacZ 또는 pIND/luc 로 이루어진다. 세포 살포 24시간 후, 지질/DNA 용액을 무균수에서 0.5mg/㎖의 VgRXR과 0.5mg/㎖의 pIND/lacZ 또는 pIND/luc DNAs로 제조했다. 36㎕의 Pfx-8을 1.5㎖ Opti/-MEM 배지(Gibco/BRL, 31985)를 함유하는 무균 17×100mm 폴리스티렌 튜브에서 희석시켰다. 6㎕의 플라즈미드 DNA 원료를 또 다른 폴리스티렌 튜브에서 1.5㎖의 Opti-MEM 배지와 혼합했다. DNA와 지질 용액을 3㎖의 트랜스펙션 용액 (3중 샘플의 한 세트에 충분한)을 만들기 위해 조합했다. 세포로부터 배지를 내므로써 세포를 포스페이트 완충용액(PBS;Gibco/BRL, 14190-144)으로 3번 세척했다. 세포를 4시간 동안 배양하고 트랜스펙션 배지를 같은 부피의 손상되지 않은 배지로 대체했다. 세포를 추가 20시간 동안 배양했다.

안정하게 형질전환된 포유동물 세포주

pVgRXR과 pIND/LacZ(SPI) (Invitrogen Corp.)로 안정하게 형질전환된 CHO 세포를 10% FBS, 2mM 글루타민, 300㎍/㎖ Zeocin(Invitrogen Corp.) 및 300㎍/㎖ Hygromycin B를 함유하는 Hams F-12 배지에 유지시켰다. pIND벡타에 대해 선택적인 pIND(SPI)를 3 시스-작용 SPI 성분의 존재로 인하여 pIND의 절대 발현 수준보다 5배 큰 절대 발현 수준을 유발시킬 수 있다. 기본적인 발현 수준도 상응하게 커진다.

리간드로 처리

원료 용액(10^-2M)을 각각 에탄올과 아세톤에서 muristerone A와 본 발명의 비스테로이드 리간드에 대해 제조하고 -20℃에서 저장했다. 트랜스펙션 24시간 후에 시험 화합물을 각각의 1㎖ 세포배양 웰당 10μM(10^-5M)의 최종농도로 첨가했다. 10μM농도의 Muristerone A (Sigma, M7888)를 양성적인 대조군으로서 사용했다. 아세톤을 음성적인 대조군으로서 첨가했다.

리포터 유전자 평가

유전자 발현을 일시적으로 형질감염된 세포처리 24-48시간 후 또는 시험 리간드로 안전하게 형질 전환된 세포주의 처리후 24시간 후에 평가했다. β-갈락토시다아제를 고정된 세포를 점적하거나 세포성 용해질에서 효소 활성도를 평가하므로서 평가했다. β-갈락토시다아제는 현미경하에서 시각화될 수 있는 고정된 세포 (Invitrogen, KI 1465-01)에서 푸른색을 생성하는 β-갈락토사이드, X-겔 (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토피라노사이드)의 가수분해를 촉매화한다. 선택적 으로, 리포터 용해 완충제 (RLB;Promega/E397A)를 화학발광물질, Galacto-Star(Tropix/BM 1000S)를 사용하는 β-갈락토시다아제 활성도의 검출을 위한 세포를 용해시키는데 사용했다. 각각의 12-웰 판에서 세포를 250㎕의 RLB로 용해시켰다. 20㎕의 각각의 추출물을 100㎕의 기질로 평가했다.

발광효소 활성도의 검사를 위해 세포를 PBS로 2번 세척하고 웰당 250㎕ RLB로 용해시켰다. 10분 후, 판을 10분동안 -80℃에서 냉동시키고 실온으로 회복시켰다. 20㎕ 샘플의 용해질을 100㎕의 발광효소 평가 시약(Promega, E1500)과 혼합했다. β-갈락토시다아제와 발광효소 평가를 위해 발광을 기질의 운반을 위해 자동주입기가 장치된 DYNEX MLX 미세적정 판 발광측정기를 사용하여 실온에서 검사했다.

Drosophila Kc 세포로부터 시토졸성 에크디손 수용체 추출물 제조

기본적으로 Drosophila 태아로부터 유발된 쌍시류 세포주 Kc 167(에카리어, 지(Echalier, G.)와 오하네시안, 에이(Ohanessian, A.) (1969) C.R. Acad, Sci.,268, 1771 참조)을 피터 케르바스(Peter Cherbas) 박사 (인디아나 대학교)로부터 얻었고 기술된 바와같이 유지했다(케르바스, 엘. (Cherbas, L.) 등, (1994), Methods in Cell Biology, 44, 161-179). Kc 세포의 400㎖ 배양물 (㎖당 3×10⁷ 세포)을 실온에서 10분동안 700×g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화했다. 상청액을 흡입시키고 펠릿을 70㎖의 차거운 TM 완충제(10mM Tris, 5mM MgCl₂, 1mM DTT, pH 7.2)에서 재현탁시켰다. 얼음에서 10분간 배양후 세포를 2,300×g으로 원심분리했다. 상청액을 버렸다. 세포펠릿을 -20℃에서 1시간동안 냉각했다. 냉각된 세포 펠릿을 얼음위에서 천천히 녹이고 4℃에서 10번 위,아래 왕복운동으로 500회 세팅하여 Caframo 균질기 모터에서 테프론 막자를 사용하는 냉각 Potter-Elvehjem 균질기에서 균질화시켰다. 이 슬러리를 60분동안 회전버킷 로터에서 100,000×g로 원심분리했다. 시토졸성 단백질 추출물을 함유하는 상청액을 T 완충제 (10mM Tris, 1mM DTT, pH7.2)로 희석시켜 5mg/㎖의 단백질 농도로 만들었다. 이 추출물을 즉시 리간드 결합 평가용으로 사용했다.

Plodia interpunctella 세포로부터 핵 에크디손 수용체 제조

인시목 Plodia interpunctella 의 성충 날개 디스크로부터 유도된 세포주 IAL-PID2를 에이치 오버랜더(H. Oberlander)로부터 얻어서 기술된 바와같이 유지했다(린.이.이.(Lynn, E.E.)와 오버랜더, 에이치. (Oberlander, H.)(1983), J. Insect Physiology, 29, 591-96). P. interpunctella 세포의 300㎖ 고정상 배양물을 실온에서 10분동안 700×g로 원심분리하여 세포를 펠릿화했다. 상청액을 흡입시키고 세포성 펠릿을 35㎖ TMT (0.1% Triton X-100로 TM 완충제)에서 재현탁시켰다. 현탁액을 얼음위에서 Dounce 균질기의 20번 위,아래 왕복운동으로 균질화시켰다. 균질물을 10분동안 얼음위에서 배양한 후 15분동안 900×g에서 원심분리했다. 펠릿을 15㎖ TM 완충제에서 재현탁시키고 2,300×g에서 원심분리했다. 젤라틴성 슬러리가 형성될 때까지 펠릿을 분쇄하기 위해 유리 로드를 사용하여 TMK 완충제 (800mM KCl을 갖는 TM 완충제)에서 펠릿을 추출하고 얼음위에서 15분간 배양했다. 추출물을 회전 버킷 로터에서 60분동안 100,000×g로 원심분리했다. 핵 추출물을 구성하는 상청액을 T-완충제로 평형화된 10DG 탈염 칼럼(Bio-Rad, 732-2010)에서 탈염시켰다. 핵 추출물에서의 총 단백질 농도를 1mM DTT를 함유하는 T-완충제로 ㎖당 5mg으로 조절했다.

박테리아 글루타디온-S-전이효소 융합 단백질 제조

CDEF 영역만을 함유하는 가문비 모충(cheristoneura fumiferana) EcR(CfEcR)의 박테리아 글루타티온-S-전이효소(GST) 융합 단백질과 초기공 단백질(CfUSP)을 방사리간드 치환 평가에 사용했다. CfEcR의 cDEF 영역을 엔코딩하는 cDNA를 BamH1 와 EcoRI 부위를 함유하는 프라이머(Perera SC, M Sundaram, Krell PJ, Petnakaran A, Dhadialla TS, SR Palli, 1999 Arch. Insect Biochem. Physiol. 41, InPress)를 사용하여 PCR 증폭으로 구축했다. PCR생성물을 BamHI 와 EcoRI로 소화시키고 Pharmacia Biotech 로 부터 얻어진 pGEX-3X 벡터로 클론했다. CfUSP코딩 영역을 BamHI과 EcoRI 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 증폭시키고 Pharmacia Biotech로 부터 얻은 pGEX-2T로 클론했다. 2개의 벡터 각각으로 형질전환된 E-Coli를 성장시켜 Pharmacia Biotech GST-기술공보에 상세히 기술된 바와같이 융합 단백질의 생성을 유발시켰다.

에크디손 수용체 경쟁 결합 평가

³H ponasterone A, 효능있는 파이토에크디스테로이드 (66,000dpm ; 특이적 활성도 170 Ci/mmole ; NEW Life Science Products, 보스톤, 메사츄세츠)를 각각 총 또는 비-특이적 3중 수소화된 ponasterone A의 개략을 얻기 위해 10μM 라벨링되지 않은 20-하이드록시에크디손(20E)의 부재 또는 존재하에서 0.8×50mm 유리 시 험관에서 100㎕ Kc 시토졸성 또는 Plodia 핵 에크디손 수용체 추출물과 혼합했다. 튜브를 선회시키고 평형에 도달하도록 반응을 구속하기 위해 Kc 시토졸성 추출물에 대해 4℃에서 밤새 배양하거나 Plodia 핵 추출물에 대해 1.5시간 배양했다. 평형 결합 시간의 끝부분에서 결합된 3중 수소화된 ponasterone A를 각각 Kc 또는 Plodia 추출물에 얼음 냉각된 600㎕ 또는 300㎕ 덱스트란 코팅된 숯 용액 (500㎖의 Sigma HCL-세척된 활성탄, 50mg Pharmacia Dextran T70, 50㎖의 T-완충제)의 첨가하므로서 결합되지 않는 것으로부터 분리했다. 튜브를 짧게 선회시키고 7,000×g에서 원심분리하여 숯을 펠릿화했다. 단백질에 결합된 3중 수소화된 ponasterone A를 함유하는, Kc 또는 Plodia 추출 반응을 위한 각각 600㎕ 또는 300㎕ 상청액을각각 5㎖의 신틸레이션 칵테일(ReadySafe

, 버크만)을 함유하는 액체 신틸레이션 바이알내로 흡입시켰다. 혼합물을 와동시키고 총 또는 비-특이적으로 결합된 방사능의 양을 3중 수소에 대해 60% 카운팅 효능을 갖는 버크만 LS500 액체 신틸레이션 카운터로 측정했다.

Kc 또는 Plodia 세포추출물 및 박테리아 용해 단백질에서 에크디스테로이드 수용체 복합체에 결합하는 ³ H-ponasterone A의 경쟁 억제제에 대한 Kd값 측정

3중 수소화된 ponasterone A결합 (IC₅₀)이 50% 억제된 경쟁자의 농도를 시험 화합물의 농도범위(0.1nM-10μM) 존재하에서 ³H-ponasterone A (반응당 66,000dpm)와 Kc 또는 Plodia 핵 추출물 또는 박테리아생성 CfEcR(CDEF)-GST 및 CfUSP-GST 융합 단백질을 배양하여 측정했다. 박테리아 융합 단백질을 사용하는 결합반응의 경 우 각각 박테리아 생성 CfEcR(CDEF)-GST 또는 CfUSP-GST 융합 단백질의 20 또는 1㎕ 추출물을 결합반응 당 포함시켰다. 평가조건과 총 및 비-특이적 결합의 측정 은 상기에 기술된 바와같다. 20E 또는 용매 단독에서와 같이 용매에서 경쟁자의 양을 100배 농축된 원료용액 (즉 원료용액의 100배 희석)을 사용하므로서 총 반응량의 1%로 유지시켰다. 평가의 나머지는 상기에 기술된 바와같다. 각각의 반응을 시험 화합물 당 농도에 대해 중복하여 수행했다. ³H-ponasterone A의 특이적 결합을 총(경쟁자 없음) 또는 결합된 경쟁방사능으로 부터 비-특이적 결합 (10μM 20E의 존재하에서 얻어짐)을 빼므로서 측정했다. 각각 시험 화합물의 데이타를 IGOR Pro 소프트웨어 (WaveMetrics, Lake Oswego, OR)를 사용하여 분석하고 IC₅₀ 값을 계산했다. 시험 화합물에 대한 결합상수 (μM에서의 Kd)를 IGOR Pro 소프트웨어에서 Cheng-Prusoff 방정식 (문손 피제이.(Munson PJ.)와 로드버드 디.(Rodbard D.)(1980) Anal Biochem. 107, 220-239 참조)을 도입하여 계산했다.

표 1-3은 얻어진 데이타를 요약한 것이다.

리간드	Kc log (1/EC50)	Plodia log (1/IC50)	박테리아 CfECR log (1/IC50)
CE-1	6.55	8.7
CE-2	5.52	6.48
CE-3	7.96
1	7.36	8.52
2	7.16	9.14
3	6.73	9.04	8.76
4	7.41	8.51
5	7.70	9.49
6		8.82
7		8.78
8		8.85
9		9.00
10		8.80
11		8.93
12	8.10	9.63
13	7.44	9.06
14			8.61
15			8.49
17		9.24
18		8.82

일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 발광효소 유전자 활성화
리간드 10μM	발광효소 활성도¹	유발 비율²	Kc세포에 대한 Kd (nM)
없음	42
CE-1	89	2	110
CE-2	36	1	2000
CE-3	316	8	2.3
CE-4	418	10	0.7
1	275	7	39.5
2	204	5	60
3	324	8	124
4	251	6	47
5	313	8	13.3
12	305	7	5.3
13	226	5	65

CE-4 = ponasterone A

¹상대적인 광 유니트(RLU)에서 -2회 반복 샘플의 평균

² 리간드 존재 및 부재하에서 RLU의 비율

안정하게 형질전환된 CHO 세포에서 β-갈락토시다아제 유전자 활성화
리간드 10mM	β-갈락토시다아제 활성도¹	유발 비율²	Kc 세포에 대한 Kd (nM)
없음	200
CE-1	323	2	192
CE-2	145	1	2000
CE-3	9830	49	2
CE-4	10386	52	0.7

¹상대적인 광 유니트(RLU)에서 -3회 반복 샘플의 평균

²리간드 존재 및 부재하에서 RLU의 비율

이들 데이타는 본 발명의 리간드가 알려진 화합물 CE-1과 CE-2와 유사하거나 더 낮은 농도에서 유전자 발현을 유발시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

개선된 유전자 발현 조절 능력 이외에 리간드는 그들의 우수한 운반과 신대사 특성때문에 손상되지 않은 식물과 동물에서 보다 큰 유용성을 가질 것으로 기대된다. 하기 실시예는 식물에서 알려진 리간드(CE-1)와 비교할 때 본 발명 리간드 (리간드 3)의 개선된 식물 운반 특성을 설명하고 있다.

전이층 이동

연구를 모델 시스템과 같이 신생 사탕무우 행렬구더기 유층, Spodoptera exigua를 사용하여 면화 잎내로 2개 화합물의 전이층 이동을 평가하기 위해 수행했다.

2개의 처리물을 평가했다 : 스프레이 탱크 농도를 자극하기 위해 100㎍/㎖의 농도에서 CE-1과 리간드 3 (각각 5% 와 19%)의 유화가능한 농축물을 평가했다. 이들 처리물을 우수한 전이층 이동(에마멕틴 벤조에이트, 0.16% EC [20㎍/㎖], Merck & Co.)을 갖는 것으로 알려진 표준화학물질로 처리된 식물 및 비처리된 식물과 비교했다.

4주된 면화식물, Gossypium hirsutum L. cv. Stoneville을 해당처리에 따라 단일 복제 잎/식물의 위쪽 표면을 페인팅하므로서 각각의 처리물로 처리했다. 식물을 필요할 때까지 27℃에서 유지되는 조절된 환경 유리집에 유지시켰다. 나머지 효과를 처리(DAT), 1,7 및 14일 후의 3일에 신생 사탕무우 행렬구더기 유충, Spodoptera exigua로 처리 및 처리하지 않은 잎을 시험하므로서 평가했다. 각각의 샘플 데이타에서, 단일 처리된 잎/식물을 처리당 각각 5개 복제 식물로부터 절제했다. 잎을 플라스틱 페트리디쉬(100×20mm)의 위쪽 뚜껑에 묶은 후 10개의 제 1령 유충으로 만연시켰다. 제 1 령 사탕무 행렬구더기 유충은 보통 잎의 아래 표면을 먹고 일반적으로 위쪽 표면으로 통하게 않는다. 따라서, 물질의 전이층 이동은 화합물이 단지 잎 윗표면에 살포되기 때문에 유충에 영향을 주는 것이 필요하다. 유충의 사망율을 만연 4일 후에 기록했다. 또한, 어떤 살아있는 유충을 탈피가속 화합물의 특징적인 징후(새로운 표피 및/또는 미끄러지는 헤드 캡슐의 형성)를 관찰했다. 각각의 처리를 5번 반복했다.

사망율 퍼센트 데이타를 제곱근의 아크사인(arcsine)으로 변형시킨 후 JMP(Ver. 3.2.1)를 사용하여 ANOVA에 의해 분석했다. 평균을 Tukey-Kramer 시험 (P=0.05)에 의해 분리했다.

결과는 리간드 3이 전이층 이동으로부터 S. exigua 유충을 죽이는데 있어서 CE-1보다 상당히 효과적이고 따라서 식물에서 보다 높은 계통성을 갖는 것으로 나 타났다.

사망율 퍼센트
처리	농도 (㎍/㎖)	살포 후 일자
처리	농도 (㎍/㎖)	1	7	14
CE-1, 5% EC	100	2.5	0.0	22.7
3, 19% EC	100	100.0	93.8	100.0
에마메틴 벤조에이트 0.16EC+AG-98	20	100.0	100.0	100.0
비처리된 체크		11.6	6.5	8.1

AG-98=0.12% 비이온성 계면활성제 Latron AG-98 계면활성제 (롬 앤드 하스 컴패니)

본 발명에서 변화와 변경은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와같이 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고 행해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

삭제
a) DNA 결합 영역;

b) 리간드 결합 영역;

c) 전이활성화 영역; 및

d) 하기식의 리간드를 포함하는 에크디손 수용체 복합체를,

a) 외인성 유전자; 및

b) 반응 성분을 포함하는 DNA 구조물과 접촉시키는 것을 포함하는 외인성 유전자 발현을 조절하기 위한 방법으로서,

a) 외인성 유전자는 반응성분의 조절하에 있고;

b) 리간드 존재하에서 반응 성분에 DNA 결합 영역의 결합이 유전자의 활성화또는 억제를 가져오는 방법:

상기 식에서,

E는 3급 탄소를 함유하는 (C₄-C₆)알킬이거나 3급 탄소를 함유하는 시아노(C₃-C₅)알킬이고,

R¹은 H, Me, Et, i-Pr, F, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, OMe, OEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, SCN 또는 SCHF₂ 이며,

R²는 H, Me, Et, n-Pr, iPr, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃ OCF₂CF₂H, COEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe 또는 NH-CN이고,

R³는 H 또는 Et 이거나,

R² 및 R³은 함께 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴고리 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로피릴 고리를 형성하며,

R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, Me, Et, F, Cl, Br, 프로필, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe 또는 SEt이고,

단,

a) R¹이 Me이고, R²가 OMe 일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me, 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl 또는 3,5-디-F 이며;

b) R¹이 Me이고, R²가 OEt일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me, 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl, 3,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-Cl 이며;

c) R¹이 Et이고, R²가 OMe 또는 OEt 일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은,

ⅰ) 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl, 3,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Cl, 2-Br 또는 3-Me 이거나,

ⅱ) R⁶은 H이고, R⁴는 Me이며, R⁵는 Et, F, Cl, Br, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe 또는 SEt이고;

d) R¹이 i-Pr일때,

R²는 OMe 또는 OEt이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

e) R³가 Et일때,

R²가 H이고, R¹ 이 F 또는 Cl이며, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me 이고;

f) R² 및 R³가 함께 에틸렌디옥시 고리를 형성할 때,

R¹은 Me 또는 Et이고, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

g) R² 및 R³가 함께 디하이드로퓨릴 또는 디하이드로피릴 고리를 형성할때,

R¹은 Et이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

h) R¹이 프로밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, SCN 또는 SCHF₂ 일때,

R²는 OMe 또는 OEt이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이고; 및

i) R²가 Me, Et, n-Pr, i-Pr, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃, OCF₂CF₂H, COEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe 또는 NH-CN일때,

R¹은 Et이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합이 3,5-디-Me이다.
하기식의 리간드를 효과적인 양으로 인간을 제외한 피검자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간을 제외한 피검자에서 하나 이상의 외인성 유전자의 발현을 조절하는 방법:

상기 식에서,

E는 3급 탄소를 함유하는 (C₄-C₆)알킬이거나 3급 탄소를 함유하는 시아노(C₃-C₅)알킬이고,

R¹은 H, Me, Et, i-Pr, F, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, OMe, OEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, SCN 또는 SCHF₂ 이며,

R²는 H, Me, Et, n-Pr, iPr, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃ OCF₂CF₂H, COEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe 또는 NH-CN이고,

R³는 H 또는 Et 이거나,

R² 및 R³은 함께 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴고리 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로피릴 고리를 형성하며,

R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, Me, Et, F, Cl, Br, 프로필, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe 또는 SEt이고,

단,

a) R¹이 Me이고, R²가 OMe 일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me, 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl 또는 3,5-디-F 이며;

b) R¹이 Me이고, R²가 OEt일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me, 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl, 3,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-Cl 이며;

c) R¹이 Et이고, R²가 OMe 또는 OEt 일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은,

ⅰ) 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl, 3,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Cl, 2-Br 또는 3-Me 이거나,

ⅱ) R⁶은 H이고, R⁴는 Me이며, R⁵는 Et, F, Cl, Br, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe 또는 SEt이고;

d) R¹이 i-Pr일때,

R²는 OMe 또는 OEt이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

e) R³가 Et일때,

R²가 H이고, R¹ 이 F 또는 Cl이며, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me 이고;

f) R² 및 R³가 함께 에틸렌디옥시 고리를 형성할 때,

R¹은 Me 또는 Et이고, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

g) R² 및 R³가 함께 디하이드로퓨릴 또는 디하이드로피릴 고리를 형성할때,

R¹은 Et이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

h) R¹이 프로밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, SCN 또는 SCHF₂ 일때,

R²는 OMe 또는 OEt이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이고; 및

i) R²가 Me, Et, n-Pr, i-Pr, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃, OCF₂CF₂H, COEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe 또는 NH-CN일때,

R¹은 Et이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합이 3,5-디-Me이며;

상기 인간을 제외한 피검자의 세포가

a) 1) DNA 결합 영역;

2) 리간드 결합 영역; 및

3) 전이활성화 영역을 포함하는 에크디손 수용체 복합체, 및

b) 1) 외인성 유전자; 및

2) 반응성분을 포함하는 DNA 구조물을 포함하고,

a) 외인성 유전자는 반응 성분의 조절하에 있고 ;

b) 리간드 존재하에서 반응성분에 DNA 결합 영역의 결합이 유전자의 활성화 또는 억제를 가져온다.
a) 하기식의 리간드의 노출에 거의 민감하지 않은 세포를 선택하고;

상기 식에서,

E는 3급 탄소를 함유하는 (C₄-C₆)알킬이거나 3급 탄소를 함유하는 시아노(C₃-C₅)알킬이고,

R¹은 H, Me, Et, i-Pr, F, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, OMe, OEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, SCN 또는 SCHF₂ 이며,

R²는 H, Me, Et, n-Pr, iPr, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃ OCF₂CF₂H, COEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe 또는 NH-CN이고,

R³는 H 또는 Et 이거나,

R² 및 R³은 함께 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴고리 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로피릴 고리를 형성하며,

R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, Me, Et, F, Cl, Br, 프로필, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe 또는 SEt이고,

단,

a) R¹이 Me이고, R²가 OMe 일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me, 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl 또는 3,5-디-F 이며;

b) R¹이 Me이고, R²가 OEt일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me, 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl, 3,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-Cl 이며;

c) R¹이 Et이고, R²가 OMe 또는 OEt 일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은,

ⅰ) 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl, 3,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Cl, 2-Br 또는 3-Me 이거나,

ⅱ) R⁶은 H이고, R⁴는 Me이며, R⁵는 Et, F, Cl, Br, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe 또는 SEt이고;

d) R¹이 i-Pr일때,

R²는 OMe 또는 OEt이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

e) R³가 Et일때,

R²가 H이고, R¹ 이 F 또는 Cl이며, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me 이고;

f) R² 및 R³가 함께 에틸렌디옥시 고리를 형성할 때,

R¹은 Me 또는 Et이고, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

g) R² 및 R³가 함께 디하이드로퓨릴 또는 디하이드로피릴 고리를 형성할때,

R¹은 Et이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

h) R¹이 프로밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, SCN 또는 SCHF₂ 일때,

R²는 OMe 또는 OEt이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이고; 및

i) R²가 Me, Et, n-Pr, i-Pr, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃, OCF₂CF₂H, COEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe 또는 NH-CN일때,

R¹은 Et이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합이 3,5-디-Me이며,

b)1) a) 폴리펩티드를 엔코딩하는 외인성 유전자; 및

b) 반응성분을 포함하는 DNA 구조물로서, 상기 유전자가 반응성분의 조절하에 있는 DNA 구조물; 및

2) a) DNA 결합 영역;

b) 리간드 결합 영역; 및

c) 전이활성화 영역을 포함하는 에크디손 수용체 복합체를 세포내로 도입시키며; 및

c) 리간드에 세포를 노출시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드 제조방법.
하기식의 리간드를 인간을 제외한 유기체의 세포내에 있는 에크디손 수용체 복합체와 접촉시키는 것을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 유기체에서 외인성 또는 이종 유전자 발현을 조절하는 방법으로서,

상기 세포는 리간드와 조합시 에크디손 수용체 복합체에 대한 DNA 결합 서열을 더 함유하고 에크디손 수용체 복합체-리간드-DNA 결합 서열 복합체의 형성이 유전자의 발현을 유발시키는 방법:

상기 식에서,

E는 3급 탄소를 함유하는 (C₄-C₆)알킬이거나 3급 탄소를 함유하는 시아노(C₃-C₅)알킬이고,

R¹은 H, Me, Et, i-Pr, F, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, OMe, OEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, SCN 또는 SCHF₂ 이며,

R²는 H, Me, Et, n-Pr, iPr, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃ OCF₂CF₂H, COEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe 또는 NH-CN이고,

R³는 H 또는 Et 이거나,

R² 및 R³은 함께 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴고리 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로피릴 고리를 형성하며,

R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, Me, Et, F, Cl, Br, 프로필, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe 또는 SEt이고,

단,

a) R¹이 Me이고, R²가 OMe 일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me, 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl 또는 3,5-디-F 이며;

b) R¹이 Me이고, R²가 OEt일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me, 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl, 3,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-Cl 이며;

c) R¹이 Et이고, R²가 OMe 또는 OEt 일때,

R³가 H이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은,

ⅰ) 3,5-디-OMe-4-Me, 3,5-디-Cl, 3,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-F, 2,4- 또는 2,5-디-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Cl, 2-Br 또는 3-Me 이거나,

ⅱ) R⁶은 H이고, R⁴는 Me이며, R⁵는 Et, F, Cl, Br, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe 또는 SEt이고;

d) R¹이 i-Pr일때,

R²는 OMe 또는 OEt이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

e) R³가 Et일때,

R²가 H이고, R¹ 이 F 또는 Cl이며, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me 이고;

f) R² 및 R³가 함께 에틸렌디옥시 고리를 형성할 때,

R¹은 Me 또는 Et이고, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

g) R² 및 R³가 함께 디하이드로퓨릴 또는 디하이드로피릴 고리를 형성할때,

R¹은 Et이고, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이며;

h) R¹이 프로밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, SCN 또는 SCHF₂ 일때,

R²는 OMe 또는 OEt이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me이고; 및

i) R²가 Me, Et, n-Pr, i-Pr, 포르밀, CF₃, CHF₂, CHCl₂, CH₂F, CH₂Cl, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C≡CH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, O-n-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃, OCF₂CF₂H, COEt, 사이클로프로필, CF₂CF₃, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF₃, OCHF₂, O-i-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe 또는 NH-CN일때,

R¹은 Et이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합이 3,5-디-Me이다.
제 2,3,4 또는 5항에 있어서, 리간드가 하기식으로 이루어지고,

E는 t-부틸이고; R¹은 Me, Et, i-Pr 또는 F이며; R²는 OH, OMe 또는 OEt이고, R³는 H 또는 Et이거나, R² 및 R³은 함께 에틸렌디옥시 또는 페닐탄소에 인접한 산소를 갖는 디하이드로퓨릴을 형성하며; R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 Me, F, Cl, CH₂OH 또는 OMe인 방법.
제 2,3,4 또는 5항에 있어서, 리간드가 하기식으로 이루어지고,

E는 t-부틸이고, R¹은 Et이며, R²는 OEt이고, R³는 H이며, R⁴, R⁵ 및 R⁶의 조합은 3,5-디-Me인 방법.
제 2,3 또는 4항에 있어서, 에크디손 수용체 복합체가 키메라성 에크디손 수용체 복합체이고 DNA 구조물이 프로모터를 더 포함하는 방법.
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