KR100554560B1 - 비타민d유도체결정및그의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 I 로 나타낸 화합물의 결정 :

[화학식 I]

; 비타민 D 유도체의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 역상 크로마토그래피를 통해 정제한 다음 정제된 유도체를 유기 용매에서 결정화시킴으로써 제조된 비타민 D 유도체 결정; 비타민 D 유도체의 합성중에 형성된 부산물로써의 신규 화합물; 및 비타민 D 유도체 또는 그의 중간체의 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 고정제된 비타민 D 유도체, 특히 ED-71를 대량으로 및 지속적으로 공급하는 것을 가능케 한다.

Description

비타민 Ｄ 유도체 결정 및 그의 제조방법 {CRYSTALS OF VITAMIN D DERIVATIVES AND PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF}

본 발명은 신규한 비타민 D 유도체 결정 및 보다 구체적으로는 역상 크로마토그래피를 통해 비타민 D 유도체를 정제한 다음 유기 용매로부터 정제된 유도체를 결정화시킴으로써 수득되는 신규한 비타민 D 유도체 결정에 관한 것이다. 본 발명은 또한 결정화 단계를 포함하는 비타민 D 유도체의 정제 방법에 관한 것이다.

각종 비타민 D 유도체가 유용한 생리활성을 갖는 것으로 알려져있다. 예를 들면, JP 6-23185 B/1994 에는 하기 식으로 나타낸 1 α-히드록시비타민 D₃ 유도체가 칼슘 대사이상으로 인한 질병에 대한 치료제로서 또는 항-종양제로서 유용하다는 것이 개시되어있다 :

[식중, R₁ 은 아미노기 또는 식 OR' (R' 은 히드록실기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 아실아미노기로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 ∼ 7 의 저급 알킬기를 나타낸다)를 나타내고, R₂ 는 수소 원자 또는 히드록실기를 나타낸다].

상기 식으로 나타내는 화합물중 하나인 1α,25-디히드록시-2β-(3-히드록시프로폭시)비타민 D₃ (또한 ED-71 로도 불린다) 는 뼈 형성 작용을 갖는 비타민 D 유도체의 활성 형태이므로 골다공증에 대한 치료제로서 개발중에 있다.

상기 비타민 D 유도체가 치료제로서 확립되는 경우에, 고도로 정제되어야하고 지속적으로 대량 공급되어야한다. 그러므로, 가능한한 빨리 비타민 D 유도체를 제조하는 방법을 구축하는 것이 요구되고 있다.

특히, ED-71 은 비결정질 형태로만 수득되고 있으며 결정 형태의 ED-71 의 단리에 대해서는 보고된 바 없다.

도 1 은 ED-71 결정의 구조를 나타내는 분자 구조 투영도이다.

도 2 는 ED-71 결정의 구조를 나타내는 분자 구조 입체 투영도이다.

도 3 은 수소결합에 중점을 둔 ED-71 결정의 구조를 나타내는 분자 구조 투영도이다.

도 4 는 수소결합에 중점을 둔 ED-71 결정의 구조를 나타내는 분자 구조 입체 투영도이다.

본 발명의 바람직한 구현예

본 명세서에서 사용되는, 용어 "비타민 D 유도체" 는 하기 화학식 V를 부분적인 구조로 갖는 화합물을 의미한다 :

비타민 D 유도체는 바람직하게는 화학식 VIA, VIB 또는 VIC 로 나타낸 화합물이다 :

[식중, R₁ 은 (1) 아미노기;

(2) -OR₅ (식중, R₅ 는 히드록실기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 아실아미노기 또는 저급 알콕시기로 치환될 수 있는 저급 알킬기, 저급 알케닐기 또는 저급 알키닐기; 또는

(3) 히드록실기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 아실아미노기 또는 저급 알콕시기로 치환될 수 있는, 저급 알킬기, 저급 알케닐기 또는 저급 알키닐기이고;

R₂, R₃ 및 R₄ 은 각기 하나 이상의 히드록실기로 치환될 수 있는, 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 2 ∼ 10 의 알케닐기, 또는 탄소수 2 ∼ 10 의 알키닐기를 나타내고; 및

A 는 황원자 또는 산소원자를 나타낸다].

치환체에 대한 상기 정의에 있어서, 용어 "저급" 은 저급이라 나타낸 작용기내에 함유된 탄소원자의 수가 알킬기의 경우에는 1 내지 7 개, 알케닐기 및 알키닐기는 2 내지 7 개, 알콕시기는 1 내지 7 개인 것을 의미한다.

비타민 D 유도체는 보다 바람직하게는 1α-히드록시비타민 D₃, 1α,25-디히드록시비타민 D₃, 24,25-디히드록시비타민 D₃, 또는 하기 화학식 VIIA 또는 VIIB 로 나타낸 화합물 :

[식중, n 은 1 내지 7 의 정수를 나타낸다],

또는 하기 화학식 VIIIA 또는 VIIIB 로 나타낸 화합물이다 :

[식중, A 는 황원자 또는 산소원자를 나타낸다].

특히 바람직한 비타민 D 유도체는 하기 화학식 VIIA 로 나타낸 화합물이다:

[화학식 VIIA]

[식중, n 은 1 내지 7 의 정수이다].

가장 바람직한 비타민 D 유도체는 ED-71로 불리는 하기 화학식 IX 으로 나타낸 화합물이다:

본 명세서에서 사용되는, 용어 "결정 (crystal)" 는 가장 넓은 의미로 사용되므로 결정 형태, 결정계 등에 국한되지 않는다.

본 발명의 가장 바람직한 비타민 D 유도체인 ED-71 의 결정은 처음에 설명한 바와 같이 임의 물리적 성질에 의해 국한되지 않는다. 그러나, 하기 성질들을 갖는 것이 특히 바람직하다 :

(1) 외형: 육안 또는 형광-현미경 관찰시 백색 결정형 분말;

(2) 용해도: 에탄올중 1 mg/mL 의 농도에서 완전 용해;

(3) 확인 방법: IR 또는 NMR 방법;

(4) 융점: DSC 로 측정시 130 ℃ 이상;

(5) 흡광지수: 에탄올중 40 μg/mL 의 농도로 265 nm에서 측정시 ε= 16000 이상; 및

(6) HPLC 순도: 하기 조건하에서 HPLC 에 기록된 전체 피크의 면적에 대해 ED-71 에 대한 피크의 면적을 기준으로 97 % 이상 : DIACHROMA ODS N-20 5μm 4.6X250 mm, 45 % 아세토니트릴-물, 1 mL/분의 유속, 220 nm, 1 mg/mL 10 μL, 4-90 분.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 비타민 D 유도체의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 역상 크로마토그래피를 통해 정제한 다음 유기 용매로부터 정제된 유도체를 결정화시킴으로써 수득 가능한 비타민 D 유도체 결정을 제공할 뿐 아니라 비타민 D 유도체로 역상 크로마토그래피를 수행하고 및/또는 유기 용매로부터 정제된 비타민 D 유도체를 결정화시키는 것를 포함하는 비타민 D 유도체의 정제 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "조생성물 또는 예비 정제된 생성물" 이란 합성 반응 직후에 정제하지 않고 또는 통상적인 방법으로 정제하여 비타민 D 유도체의 합성으로부터 수득되는 비타민 D 유도체 생성물을 의미하는 것으로, 이는 대체적으로 비결정질 형태이다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "역상 크로마토그래피" 는 정지상이 이동상보다 더 낮은 극성을 갖는 크로마토그래피 시스템을 의미한다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 역상 크로마토그래피로서 바람직하다.

목적 물질을 효과적으로 분리하기 위해서는 용출액, 칼럼 충전물 및 칼럼으로의 부하량을 적절하게 선택하는 것이 필요할 것이다.

용출액의 예로는, 아세토니트릴/물 및 아세토니트릴/메탄올/물을 들 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 언급된 용출액으로 사용되는 용매의 혼합비는 정제되는 물질 및 사용되는 칼럼 충전물과 같은 요인에 따라 다양하고 특정 용도를 위한 용매의 적정비는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 아세토니트릴/메탄올/물의 비율은 일반적으로 20-60/0-40/0-80 중량부내이다.

칼럼 충전물은 정제되는 물질 및 사용되는 칼럼과 칼럼 충전물의 상용성을 고려하면서 그의 입자 직경 및 공도에 따라 선택될 수 있다.

칼럼으로의 부하량은 칼럼의 내부 직경 등에 따라 또한 다양하다. 그러나, 부하량은 예를 들어, 내부 직경이 50 mm 인 경우 약 25 μg 내지 10 g, 바람직하게는 약 25 μg 내지 3g 일 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 크로마토그래피를 수행하여 수득되는 분획을 결정화에 앞서 분획내에 함유되어있는 용질이 단리되도록 처리해야한다. 단리 공정으로는 증발법, 동결-건조법, 추출법 및 여과법이 포함된다. 단리를 위한 상기 공정들로부터, 정제되는 물질의 성질을 고려하여 물질에 적합한 하나 이상의 공정을 선택할 수 있다. 예를 들어, 증발법은 재생가능하고 ED-71가 분해되지 않기 때문에 ED-71의 정제에 조작상 유리하다.

비타민 D 유도체의 결정화에 사용될 수 있는 유기 용매로는 비양성자성 유기 용매가 바람직하다. 비양성자성 유기 용매의 예로는, 에틸 아세테이트와 같은 에스테르, 아세톤과 같은 케톤, 디에틸 에테르 및 디이소프로필 에테르와 같은 에테르, 아세토니트릴, 및 이들의 혼합액을 들 수 있으며, 바람직하게는 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 및 이의 혼합액을 들 수 있다.

결정화 조건은 정제되는 물질 및 사용되는 용매와 같은 요인에 따라 다양하므로, 특정 용도를 위해 적합한 조건은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 결정화는 30 ℃ 이하, 바람직하게는 -10 ℃이하의 온도에서 조 비타민 D 유도체보다 1-100 배, 바람직하게는 5-10 배 많은 양의 용매를 사용하여 일반적으로 수행된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기 화학식 II 로 나타낸 화합물의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 알콜로부터 재결정화하는 것를 포함하는 화학식 II 의 화합물을 정제하는 방법뿐만 아니라 이 방법으로 정제된 화학식 II 의 화합물을 제공한다:

[화학식 II]

상기 재결정화를 위해 사용된 알콜은 메탄올이다.

상기와 같이 알콜로부터 재결정화하여 정제된 화학식 II 로 나타낸 화합물의 물리적 성질은 임의의 수치에 국한되지는 않는다. 그러나, 하기와 같은 성질들을 갖는 것이 특히 바람직하다 :

(1) 외형: 육안 또는 형광-현미경 관찰시 백색 내지 황색 결정형 분말;

(2) 용해도: 에탄올중 2 mg/mL 의 농도에서 완전 용해 (용액은 수-백색 내지 황색일 수 있다);

(3) 확인 방법: IR 및 NMR 방법;

(4) 수함량: 시료 100 mg을 사용하여 칼-피셔 방법으로 측정시 3.0 % 이하;

(5) 흡광지수: 에탄올중 100 μg/mL 의 농도로 282 nm에서 측정시 ε= 10000 이상; 및

(6) HPLC 순도: 하기 조건하의 HPLC에서 프로형태와 unP₄ 의 피크 사이에 관찰가능한 피크는 없으며, HPLC 에 기록된 전체 피크의 면적에 대해 화학식 II 의 화합물에 대한 피크의 면적을 기준으로 85 % 이상 : DIACHROMA ODS N-20 5μm 4.6x250 mm, 55 % 아세토니트릴-물, 1 mL/분의 유속, 220 nm, 1 mg/mL 10 μL, 4-70 분; 및

(7) 함량; 하기 조건하에서 내부표준물질을 이용하여 수행된 HPLC에서 85 % 이상 : YMC Pack ODS A-303 5μm 4.6x250 mm, 55 % 아세토니트릴-물, 1 mL/분의 유속, 220 nm.

하기 실시예는 본 발명을 보다 더 설명하기위해 제공된 것이나 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 목적은 매우 정제된 비타민 D 유도체, 특히 ED-71의 제조 방법을 확립하여, 생성물을 지속적으로 대량 공급할 수 있도록 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비타민 D 유도체의 조생성물 또는 예비 정제 생성물을 정제하여 수득할 수 있는 비타민 D 유도체 결정을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 결정화 단계를 포함하는 비타민 D 유도체의 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 결정화 단계를 포함하는 ED-71 의 선구형태 화합물을 정제하는 방법, 및 이 방법으로 수득되는 정제된 선구형태 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비타민 D 유도체의 합성 및 정제중에 이차적으로 형성되는 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 프로비타민 D 유도체 (프로형태) 로부터 ED-71 의 합성 및 정제중에 나타나는 하기와 같은 점들에 관하여 폭넓게 연구를 수행하였다 : (1) ED-71 의 HPLC 예비 정제에 대한 프로형태중의 불순물의 영향; (2) 열, 빛 및 산소에 대한 ED-71 및 그의 선구비타민 D 유도체 (선구형태) 의 안정성; (3) 극소량으로도 높은 생리적 작용을 나타내는 ED-71 의 조작; (4) 결정화에 의해 ED-71 의 정제의 가능성. 연구의 결과로써, 메탄올로부터 프로형태를 재결정화하고, 재결정화된 프로형태를 저온에서 광-반응 및 열적 이성질화 반응을 수행하고, 역상 HPLC 로 이성질화된 생성물을 정제하고, 용출액을 농축한 다음 에틸 아세테이트로부터 잔류물을 결정하는 순으로 ED-71 결정이 그램 단위로 수득될 수 있다는 것을 알아냄으로써 본 발명이 완성되었다. 더욱이, 프로 형태중에 본래부터 함유되어있거나 또는 광-반응중에 형성되는 부산물의 구조를 밝히고 그들중 일부 화합물이 신규하다는 것을 알았다.

본 발명의 한 양태에 따라, 화학식 I 로 나타낸 화합물 결정이 제공된다 :

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 역상 크로마토그래피를 통해 비타민 D 유도체의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 정제한 다음 유기 용매로부터 정제된 유도체를 결정화시킴으로써 수득되는 비타민 D 유도체 결정이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 비타민 D 유도체를 역상 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 비타민 D 유도체의 정제 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 유기 용매로부터 비타민 D 유도체를 결정화시키는 것을 포함하는 비타민 D 유도체의 정제방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 역상 크로마토그래피를 통해 비타민 D 유도체의 조생성물 또는 예비 정제 생성물을 정제한 다음 유기 용매로부터 정제된 유도체를 결정화시키는 것을 포함하는 비타민 D 유도체의 정제방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 화학식 II 로 나타낸 화합물의 조생성물 또는 예비 정제 생성물을 알콜로부터 재결정화시키는 것을 포함하는 화학식 II 로 나타낸 화합물의 정제 방법이 제공된다 :

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 화학식 II 로 나타낸 화합물의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 알콜로부터 재결정화하여 수득된 화학식 II 로 나타낸 화합물의 정제 생성물이 제공된다.

[화학식 II]

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 화학식 II :

[화학식 II]

로 나타낸 화합물의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 알콜로부터 재결정화하고, 화학식 II 의 재결정화된 화합물에 자외선 조사 및 열 이성질화 반응을 수행하여 화학식 I 로 나타낸 비타민 D 유도체를 생성하고, 역상 크로마토그래피를 통해 화학식 I 의 초기 또는 예비 정제된 비타민 D 유도체를 정제하고, 유기 용매로부터 화학식 I 의 비타민 D 유도체를 결정화하는 것을 포함하는 화학식 I :

[화학식 I]

로 나타낸 비타민 D 유도체의 정제 생성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 화학식 III 으로 나타낸 화합물 및 화학식 IV 로 나타낸 화합물이 제공된다 :

상기 화합물들은 ED-71 의 프로 형태의 자외선 조사 및 뒤이은 열 이성질화 반응에 의해 수득되는 반응 혼합물중에 함유되어있다.

실시예 1 : 2β-(3'-히드록시프로폭시)-5,7-콜레스타디엔-1α,3β-트리올(프로형태)의 합성 및 정제

에폭시 화합물 (1) (1.00 g, 2.41 mmol), tert-부톡시화칼륨 (0.75 g, 6.68 mmol) 및 1,3-프로판디올 (20 ml) 의 혼합물을 실온에서 10 분간 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 95 ℃의 내부온도로 가열하고 이 온도로 5 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 암모니아 포화 수용액 (40 ml)에 교반하에 붓는다. 실온 (25-35 ℃)에서 10 분간 교반한 후, 형성된 결정을 필터상에서 수합하여 증류수 (20 ml) 로 3 회 세척한다. 물을 함유하는 조결정 (6.3 g)을 아세토니트릴 (20 ml) 중에 실온 (27-32 ℃) 에서 1 시간동안 교반시킨다. 결정을 필터상에서 수합하고 아세토니트릴 (5 ml) 로 2 회 세척한 다음 건조시켜 프로형태의 화합물 (2)을 수득한다 (0.96 g, 81% 수율).

상기 수득된 프로형태 화합물 (2) (29.0 g)을 가열하여 아르곤 가스를 통과시켜 미리 예비처리한 메탄올 (290 ml) 중에 용해시킨 다음 생성된 용액을 고온상태로 키리야마(Kiriyama) 필터 페이퍼 (No.4)를 통해 여과한다. 실온으로 냉각시킨 후, 종자 결정을 용액에 첨가하여 결정화를 유도한다. -10 ℃ 미만으로 더 냉각시킨 후, 형성된 결정을 필터상에서 수합하고 29 ml 의 냉 메탄올로 2 회 세척한다. 이어서, 결정을 실온에서 진공 건조시켜 22.9 g 의 정제된 프로형태를 수득한다 (79.1 % 회수, 92.1 % 순회수). 정제된 프로형태의 물리적 데이터는 하기와 같다 :

NMR (CD₃OD) 및 IR (KBr): 표제 화합물을 나타낸다;

TLC (CH₂Cl₂:EtOH=9:1): 단지 한 점이 전개된다 (Rf 0.5);

HPLC 순도 (220 nm): 98.7 %;

함량 : 97.1 % (내부 표준 방법); 및

DSC: 최저 피크 95.6 ℃ 및 163.2 ℃, 최고 피크 120.2 ℃.

실시예 2 : (1R,2R)-1,25-디히드록시-2-(3'-히드록시프로폭시)-콜레칼시페롤; 2β-(3'-히드록시프로폭시)-(1α,3β,5Z,7E)-9,10-세코콜레스타-5,7,10(19)-트리엔-1,3,25-트리올 (ED-71) 의 합성 및 정제

실시예 1에서 수득된 정제된 프로형태 (2) (6.02 g)을 1 리터 용기내에서 THF (1L) 중에 용해시키고, 용액을 냉각 조건 (내부 온도 -13 ℃ 미만)에서 아르곤 대기하에 150 분간 비코르(Vycor) 필터를 통한 고압 수은 증기를 함유한 400 W 램프를 가지고 UV광선을 조사시킨다. 실온으로 가온한 후, 반응 용액을 용기로부터 2 리터 에그플랜트 타입 플라스크에 부으면서 용기를 새로운 THF (100 mL) 로 세척한다. 합해진 용액을 180 분간 환류하에 가열한다. 반응 혼합물을 농축한 후, 생성된 잔류물을 메탄올 (80 mL) 중에 용해시켜 분리 시료를 형성한다. 펌프를 이용하여, 프로형태로 표현하여 계산된 1.5 g 의 용질을 함유하는 시료 20 mL을 내부 직경이 50 mm 이고 길이가 300 mm 이며 시판되는 5μm 의 입자직경을 갖는 DIACHROMA ODS N-20 (Mitsubishi kakouki Co. 사제) 으로 충전된 정제 크로마토그래피 칼럼에 적하시킨다. 수중 45 % 아세토니트릴을 60 ml/분의 유속으로 칼럼을 통과시켜 용출물을 220 및 305 nm 의 UV-광선으로 확인한다. 약 2.4 L ED-71-함유 분획을 크로마토그래피 시작후 약 130 내지 170 분 사이의 시간 동안 수합한다. 이러한 일련의 공정들을 3 회 더 반복하고, ED-71의 분획들은 총 약 9 리터이다. 합해진 분획들을 이어서 10 L 회전식 증발기로 농축시킨다. 잔류물을 에탄올중에 용해시키고 용액을 다시 증발 건조시킨다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 (20 mL)를 이용하여 수합하고 용액을 실온에서 교반하여 결정을 침전시킨다. 현탁액을 -10 ℃ 미만으로 더 냉각시키고 이 온도로 15 분간 교반시킨다. 결정성 물질을 여과 제거하고, 냉 에틸 아세테이트 (6 ml) 로 3 회 세척하고, 실온에서 하룻밤동안 진공 건조시켜 ED-71를 수득한다 (2.17 g, 36.1% 수율).

HPLC 순도 : 99.8% (220 nm), 99.9% (265 nm)

UV (EtOH) : λmax 265.4 nm (ε 17100)

DSC : 135.3℃ (최소 피크), 122 mJ/mg

잔류 용매 (GC 법) : 1.24% (EtOAc), 0.24% (EtOH)

IR (cm^-1) : 3533, 3417, 3336, 2943, 2918, 2862, 1649, 1470, 1444, 1416, 1381, 1377, 1342, 1232, 1113, 1078, 1072, 1045, 999, 974, 957, 955, 924, 910, 895, 868, 833, 796, 764, 663, 634, 594, 472

실시예 3 : 관련 화합물들의 물리적 데이터

광- 및 열 이성질화 반응중에 형성된 일부 유사체를 단리하여 구조를 판명한 다음 특성화한다. 실시예 1 및 2에서 수득된 ED-71 및 그의 프로형태를 또한 상세하게 특성화한다. 하기 보고된 물리적 데이터는 유사체의 재결정화 등에 의해 더 정제된 시료에 대한 것이라는 것을 주목한다.

융점은 정확하지는 않다. IR 스펙트럼에 대한 것은 KBr 타블렛(tablet) 방법에 의해 JEOL JIR-6000 으로 결정한다. ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼은 JEOL JNM-270EX 를 이용하여 결정된다. TMS 는 ¹H-NMR을 위한 내부표준물질로 사용되고, CHCl₃ 의 피크는 ¹³C-NMR 의 내부표준물질로 사용된다. UV 는 실온에서 에탄올중 HITACHI U-3210을 이용하여 결정된다.

실시예 1에서 수득된 ED-71의 프로형태의 물리적 데이터:

¹H-NMR (ppm) : 0.63(3H,s), 0.96(3H, d, J^20-21 = 6.3Hz), 1.07(3H, s),

1.22 (6H, s), 3.6-4.0(7H, m), 5.36-5.40(lH, m), 5.70-5.73(lH, m)

¹³C-NMR (ppm) : 141.1, 136.6, 120.8, 115.1, 82.2, 71.0, 70.9, 68.3, 66.7,

59.8, 55.7, 54.4, 44.1, 42.9, 41.3, 39.0, 38.3, 36.3, 36.0, 34.6,

32.0, 28.8, 28.7, 27.9, 22.9, 20.7, 20.5, 18.6, 15.8, 11.7

UV; λmax(ε) : 294. 2 nm (6550), 282.2 nm (11300),

271.9 nm (10500), 204.7 nm (2420)

IR (cm^-1) : 3385, 2941, 2872, 1471, 1468, 1381, 1379,

1327, 1138, 1082, 1080, 1053

ED-71 의 물리적 데이터:

¹H-NMR (ppm): 6.37(lH, d; 11.4Hz), 6.05(lH, d; 11.4Hz), 5.50(lH, t; 2.lHz),

5.08(lH, t; 2.lHz), 4.32(lH, d; 8.9Hz), 4.26(lH, m), 3.88-

3.96(lH, m), 3.85(2H, t; 5.7Hz), 3.69-3.77(lH, m), 3.27(lH, dd;

9.OHz, 2.8Hz), 2.78-2.83(lH, m), 2.55(lH, dd; 10.6Hz, 4.OHz),

2.42(lH, bd; 13.6Hz), 1.8-2.1(5H, m), 1.22(6H, s), 1.2-1.7(11H,

m), 0.94(3H, d; 6.3Hz), 0.9-1.1(lH, m), 0.55(3H, s)

¹³C-NMR (ppm) : 144.2, 143.0, 132.2, 124.9, 117.2, 111.8, 85.4, 71.6, 71.1,

68.3, 66.6, 61.1, 56.6, 56.4, 45.9, 44.4, 40.5, 36.4, 36.1,

31.9, 29.3, 29.2, 29.1, 27.7, 23.7, 22.4, 20.8, 18.8, 11.9

UV; λmax : 265. 4 nm (ε 17900)

융점 : 134.8 - 135.8 max (1 ℃/분),

DSC : 137℃ (최소 피크, 115 mJ/mg),

TG/DTA : 138 ℃ (최소 피크, 용융시 손실 건조중량: 약 1 %, 시험 시료 1.96 mg)

IR (cm^-1) : 3533, 3417, 3336, 2943, 2918, 2862, 1649, 1470, 1444, 1416, 1381,

1377, 1342, 1232, 1113, 1078, 1072, 1045, 999, 974, 957, 955, 924,

910, 895, 868, 833, 796, 764, 663, 634, 594, 472

하기 화학식 IV 로 나타낸 ED-71 의 루미 형태 :

[화학식 IV]

HPLC 순도 : 97.5 % (220 nm)

¹H-NMR (ppm): 5.75(lH, d, J=5.3Hz), 5.42-5.44(lH, m), 4.19(lH, q, J=2.9Hz),

3.8-4.0(4H, m), 3.6-3.7(lH, m), 3.25(lH, dd, J=2.6Hz, 9.6Hz),

1.21(6H, s), 0.90(3H, d, J=5.6Hz), 0.82(3H, s), 0.58(3H, s)

¹³C-NMR (ppm): 141.9, 136.2, 123.3, 115.5, 82.8, 77.9, 71.1, 67.4, 64.9, 61.1,

57.2, 49.5, 46.7, 44.4, 43.8, 41.4, 37.5, 36.2, 35.9, 32.0,

29.4, 29.2, 28.8, 22.6, 21.4, 20.9, 18.5, 18.3, 8.5

UV; λmax: 273.5 nm (ε 9010)

IR (cm^-1) : 3437, 3383, 3309, 3041, 2960, 2935, 2872, 2787, 1657, 1641, 1470,

1441, 1375, 1257, 1205, 1203, 1167, 1128, 1097, 1074, 1039, 1011,

980, 935, 908, 885, 820, 781, 779, 723, 671, 613

하기 화학식 III 으로 나타낸 ED-71 의 타키 형태 :

[화학식 III]

HPLC 순도 : 97.6 % (220 nm)

¹H-NMR (ppm): 6.65(lH, d, J=16.lHz), 6.10(lH, d, J=16.lHz), 5.73(lH, d, J=2.8

Hz), 4.21-4.25(2H, m), 3.70-3.90(4H, m), 3.45(lH, dd, J=2.4Hz, 6.OHz),

1.91(3H, s), 1.22(6H, s), 0.98(3H, d, J=6.5Hz), 0.69(3H, s)

¹³C-NMR (ppm): 138.1, 130.9, 129.5, 127.8, 126.0, 124.5, 83.1, 72.4, 71.1,

68.5, 65.3, 61.1, 54.0, 50.0, 44.4, 42.8, 36.4, 36.0, 35.9,

31.9, 31.4, 29.4, 29.2, 28.7, 25.1, 24.3, 20.8, 18.7, 15.1, 11.2

UV; λmax: 281.4 nm (ε 26100)

IR (cm^-1) : 3375, 2945, 2875, 1664, 1632, 1612, 1468, 1429, 1377, 1215, 1157,

1095,1068, 957, 908, 879, 764, 710, 646

하기 식으로 나타낸 ED-71 의 선구형태 :

HPLC 순도 : 97.2% (220 nm)

¹H-NMR (ppm): 5.91, 5.78 (1Hx 2, d, J=12Hz), 5.52 (1H, d, J=3.3Hz), 4.0-4.2

(2H, m), 3.7-4.0(4H, m), 3.43(lH, dd), 1.76(3H, s), 1.22(6H, s),

0.96(3H, d, J=6.6Hz), 0.70(3H, s)

UV; λmax : 206 nm (ε 10300)

IR (cm^-1) : 3377, 2949, 2947, 2872, 1643, 1470, 1435, 1406, 1379, 1377, 1263,

1215, 1140, 1119, 1088, 1063, 1047, 1032, 1030, 962, 937, 935,

756, 735, 542

실시예 4 : ED-71의 X-선 결정 구조 분석

ED-71 의 X-선 회절 실험을 시료 분말로부터 선택된 결정성 분말을 사용하여 수행하고, 그중 일부는 또한 실시예 3에서 사용되었다. 결과로서, 결정은 롬빅 (rhombic) 시스템인 것으로 P2₁2₁2₁ 의 공간군을 가지며 격자상수가 a = 10.352 (2), b = 34.058 (2) 및 c = 8.231 (1) Å 이고, Z = 4 인 것으로 밝혀졌다. 상기 실험들로부터, 2520 개의 반사 데이터를 수득하였다.

구조 분석은 하기와 같다. SHELXS86을 이용한 직접적인 방법을 결정기에 사용한 다음 비-수소 원자의 각각의 위치를 푸리에 매핑법 (mapping) 으로 확인한다. 탄소-결합된 수소원자에 대해서, 그들 각각의 위치를 탄소원자의 위치를 이용하여 계산함으로써 결정한다. 산소-결합된 수소원자에 대해서, 그들 각각의 위치를 다른 원자들의 각 위치를 결정한 후에 D 매핑에 의해 결정한다.

비-수소 및 산소-결합된 수소원자의 위치 및 최소 스퀘어 방법으로 비-수소 원자에 대한 이방성의 온도 인자의 정확도를 향상시킨 후, 분석 결과의 신뢰도 인자 (R 값)는 3.9 % 로 수렴한다. 그러나, 결정의 절대 구조는 그 결과로부터 직접 결정되는 것이 아니라 ED-71 의 위치 13, 14, 17 및 20 의 배위가 콜레스테롤의 상응하는 배위와 동일하다는 조건에서의 결과를 계산함으로써 결정된다.

도 1 내지 도 4 는 ED-71의 구조 및 그 안에서의 수소결합을 각각 나타내는데, 이는 분석 결과를 토대로 하여 결정된다.

참고예 1 : ED-71 결정 화합물의 안정성

비결정질 및 결정성 ED-71 화합물을 10 ℃, 25 ℃ 및 40 ℃ 에서의 안정성에 대해 시험한다. 안정성을 측정하기 위하여, HPLC 정량 검정 및 흡광도 및 순도 계측을 이용한다. 순도는 HPLC 에서의 피크 면적비를 퍼센트 (peak area ratio in percentage: % P.A.R.) 로 나타낸다. 시험을 하기 절차를 이용하여 수행한다 :

(1) 안정성 시험의 절차

각각의 비결정질 및 결정성 시료 약 2 mg 분량을 정확하게 측량하여 스크류 캡을 갖는 투명한 10 ml 시험관에 각각 담는다.

시험관을 진공 데시케이터 및 글로브 박스를 이용하여 아르곤으로 퍼지한다. 상기 퍼지 절차는 하기 표에서 "1M (공기)" 로 나타낸 시험관에는 적용되지 않는다.

시험관들을 한 군으로 하여 각기 상기 온도로 조절된 항온조에 고정시켜 어두운 상태로 방치시킨다. 1 주 (1W) 또는 2 주 (2W) 또는 1 개월 (1M) 후, 시험관을 항온조로부터 제거하여 하기 검정 및 측정을 수행한다 :

(2) HPLC 정량 검정

5 ml 의 무수 에탄올을 정확하게 시험관에 첨가하여 시료 용액을 제조한다. 1 ml 의 시료 용액 및 1 ml 의 내부 표준 용액 모두를 또 다른 시험관에 정확하게 첨가하여 생성된 혼합액을 메틸렌 클로라이드로 희석하여 총 부피 20 ml을 수득한다. 상기 희석된 용액을 용액 1 로 칭한다. 내부 표준 용액은 2-아미노피리미딘을 0.6 mg/ml 의 농도로 메탄올중에 용해시켜 형성된다.

다음으로, 결정성 ED-71을 무수 에탄올중에 0.4 mg/ml 의 농도로 용해시켜 형성된 정량 검정을 위한 또다른 표준 용액 1 ml 및 내부 표준 용액 1 ml 모두를 정확하게 다른 시험관에 첨가하고, 생성된 혼합액을 메틸렌 클로라이드로 희석시켜 총 부피가 20 ml을 수득한다. 상기 희석된 용액을 용액 2 로 칭한다.

HPLC를 용액 1 및 2 각각의 20 μl를 이용하여 수행한다. 각 용액에 대해서, 내부 표준 물질의 피크에 대한 ED-71의 피크의 면적비를 HPLC 데이터로부터 결정한다. 시료중 ED-71의 함량을 용액 2 의 면적비에 대한 용액 1 의 면적비의 비율로 결정한다.

생존율 (%)을 상기 처리전에 동일한 시료중 ED-71 함량으로 상기 수득된 ED-71 함량을 나눔으로써 결정된다.

HPLC 사용 조건:

칼럼; YMC A-004SIL (4.6x300 mm)

이동상; 메틸렌 클로라이드/메탄올 혼합물 (95/5)

유속; 1 ml/분

검출; UV 265 nm.

(3) 흡광도 측정

상기 "HPLC 정량 검정"에서 제조된 시료 용액 1 ml을 무수 에탄올로 희석하여 총 부피 10 ml을 수득하고, 이러한 희석된 용액을 자외선 분광광도계를 이용하여 265 nm에서의 흡광도를 측정한다. 흡광도를 램버트-비어 법칙 (Lambert-Beer Law) 으로부터 유도된 E 1% 값으로 전환시키는데, 전환은 하기 식에 따른다:

E 1% = A/cd

[식 중, A 는 흡광도이고, c 는 농도 (g/100ml) 이고, b 는 시험 용액을 통과하는 광도의 길이 (cm) 로, 통상 1 이다].

(4) 순도 측정

(4-1) 정상상 HPLC

상기 "HPLC 정량 검정"에서 제조된 시료 용액 1 ml을 진공건조시켜 용매 (무수 에탄올)을 제거한다. 잔류물을 1 ml 의 메틸렌 클로라이드중에 용해시킨다. HPLC 검정을 상기 용액 25 μl를 이용하여 수행한다.

HPLC 사용 조건:

칼럼; YMC A-004SIL (4.6x300 mm)

이동상; 메틸렌 클로라이드/메탄올 혼합물 (96/4)

유속; 1.8 ml/분

검출; UV 265 nm.

(4-2) 역상 HPLC

상기 "HPLC 정량 검정"에서 제조된 시료 용액 25 μl를 사용하여 HPLC를 수행한다.

HPLC 사용 조건:

칼럼; Inertsil ODS-2 (5x250 mm)

이동상; 아세토니트릴/물 혼합물 (55/45)

유속; 1 ml/분

검출; UV 265 및 220 nm.

HPLC 정량 검정 및 순도 측정의 수치를 2 회 시행에 대해 평균한다. 수득된 결과를 하기 표 1 내지 5 에 나타낸다.

HPLC 정량 검정의 결과 (% 생존율)

	10℃	25℃	40℃
	비결정질 결정형	비결정질 결정형	비결정질 결정형
01 W2 W1 M1 M (공기)	100 100 98.5 96.8 94.8 97.0 97.4 95.0	100 100 99.5 99.4 94.7 98.8	100 100 94.4 99.5 88.8 102.9
주: 모든 시료는 1 M (공기)를 제외하고 아르곤으로 퍼지한다.

E 1%

	10℃	25℃	40℃
	비결정질 결정형	비결정질 결정형	비결정질 결정형
01 W2 W1 M1 M (공기)	327.5 350.2 324.9 343.8 320.5 342.7 316.3 341.7	327.5 350.2 323.0 349.5 316.9 341.6	327.5 350.2 313.2 349.8 304.0 348.7
주: 모든 시료는 1 M (공기)를 제외하고 아르곤으로 퍼지한다.

정상상 HPLC를 이용한 순도 측정 (265 nm 에서의 % P.A.R)

	10℃	25℃	40℃
	비결정질 결정형	비결정질 결정형	비결정질 결정형
0ED-71선구 형태다른 피크	96.06 99.15 1.67 0.21 2.27 0.63	96.06 99.15 1.67 0.21 2.27 0.63	96.06 99.15 1.67 0.21 2.27 0.63
1WED-71선구 형태다른 피크		95.97 99.56 1.88 0.14 2.14 0.30	94.47 99.55 2.53 0.14 3.00 0.31
2WED-71선구 형태다른 피크	95.46 99.06 2.27 0.66 2.28 0.27	94.74 98.95 2.25 0.67 3.01 0.38	92.12 98.92 2.99 0.67 4.89 0.41
1MED-71선구 형태다른 피크	94.58 98.91 2.33 0.65 3.09 0.44
1M (공기)ED-71선구 형태다른 피크	95.26 98.88 2.31 0.66 2.42 0.46
주: 모든 시료는 1 M (공기)를 제외하고 아르곤으로 퍼지한다.

역상 HPLC를 이용한 순도 측정 (265 nm 에서의 % P.A.R)

	10℃	25℃	40℃
	비결정질 결정형	비결정질 결정형	비결정질 결정형
0ED-71선구 형태다른 피크	95.38 99.04 1.16 0.36 3.47 0.60	95.38 99.04 1.16 0.36 3.47 0.60	95.38 99.04 1.16 0.36 3.47 0.60
1WED-71선구 형태다른 피크		94.78 99.35 1.27 0.28 3.95 0.38	92.47 99.40 1.98 0.29 5.55 0.31
2WED-71선구 형태다른 피크	94.48 98.84 1.75 0.83 3.77 0.32	94.20 98.78 1.72 0.85 4.08 0.37	90.68 98.75 2.53 0.85 6.78 0.40
1MED-71선구 형태다른 피크	93.05 98.77 1.88 0.86 5.07 0.37
1M (공기)ED-71선구 형태다른 피크	94.11 98.72 1.82 0.86 4.07 0.42
주: 모든 시료는 1 M (공기)를 제외하고 아르곤으로 퍼지한다.

220 nm (%)

	10℃	25℃	40℃
	비결정질 결정형	비결정질 결정형	비결정질 결정형
0ED-71선구 형태다른 피크	93.95 97.44 1.35 0.52 4.70 2.04	93.95 97.44 1.35 0.52 4.70 2.04	93.95 97.44 1.35 0.52 4.70 2.04
1WED-71선구 형태다른 피크		93.37 98.17 1.50 0.44 5.13 1.40	90.00 98.18 2.29 0.47 7.71 1.35
2WED-71선구 형태다른 피크	92.85 97.91 2.02 1.01 5.13 1.09	92.39 97.56 1.93 1.01 5.68 1.43	87.40 97.65 2.88 1.02 9.72 1.33
1MED-71선구 형태다른 피크	92.85 97.44 2.02 1.05 5.13 1.51
1M (공기)ED-71선구 형태다른 피크	92.07 97.09 2.04 1.09 5.88 1.82
주: 모든 시료는 1 M (공기)를 제외하고 아르곤으로 퍼지한다.

표에서 알 수 있는 바와 같이, 결정형태가 비결정질 보다 25 ℃ 및 40 ℃에서 2 주 이상 더 안정하였다.

본 발명의 비타민 D 유도체 결정은 비타민 D 유도체의 개선된 순도 및 안정성 및 지속적인 성질을 가지므로, 이는 비타민 D 유도체를 함유하는 약제 제조 등에 유용한다. 더욱이, 본 발명의 비타민 D 유도체를 정제하는 방법은 고순도의 비타민 D 유도체를 대량 (그램 단위) 으로 및 지속적으로 공급하는 것을 가능케한다.

더욱이, ED-71 의 유사체인 타키 및 루미 형태 및 ED-71 의 프로형태는 각기 신규한 화합물이고, 비타민 D 유도체의 합성에 있어서 수행될 수 있는 시험 또는 분석에 유용하다.

Claims (27)

1. 화학식 I 로 나타낸 화합물 결정 :

   [화학식 I]
2. 화학식 I 로 나타낸 비타민 D 유도체의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 역상 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후, 유기용매로부터 정제된 유도체를 결정화시킴으로써 수득되는 비타민 D 유도체 결정.

   [화학식 I]
3. 제 2 항에 있어서, 유기 용매가 비양성자성 유기 용매인 결정.
4. 제 3 항에 있어서, 비양성자성 유기 용매가 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 또는 이들의 혼합물인 결정.
5. 제 2 항에 있어서, 유기 용매가 비양성자성 유기 용매인 결정.
6. 제 5 항에 있어서, 비양성자성 유기 용매가 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴 또는 이들의 혼합물인 결정.
7. 화학식 I 으로 나타낸 비타민 D 유도체를 역상 크로마토그래피 하는 것을 포함하는 비타민 D 유도체의 정제 방법.

   [화학식 I]
8. 화학식 I 으로 나타낸 비타민 D 유도체를 유기 용매로부터 결정화시키는 것을 포함하는 비타민 D 유도체의 정제 방법.

   [화학식 I]
9. 제 8 항에 있어서, 유기 용매가 비양성자성 유기 용매인 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 비양성자성 유기 용매가 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 또는 이들의 혼합물인 방법.
11. 제 8 항에 있어서, 유기 용매가 비양성자성 유기 용매인 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 비양성자성 유기 용매가 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 또는 이들의 혼합물인 방법.
13. 화학식 I로 나타낸 비타민 D 유도체의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 역상 크로마토그래피를 통해 정제한 후, 정제된 유도체를 유기 용매로부터 결정화시키는 것을 포함하는 비타민 D 유도체의 정제 방법.

    [화학식 I]
14. 제 13 항에 있어서, 유기 용매가 비양성자성 유기 용매인 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 비양성자성 유기 용매가 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 또는 이들의 혼합물인 방법.
16. 제 13 항에 있어서, 유기 용매가 비양성자성 유기 용매인 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 비양성자성 유기 용매가 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 또는 이들의 혼합물인 방법.
18. 화학식 II 로 나타낸 화합물의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 알콜로부터 재결정화시키는 것을 포함하는 화학식 II 로 나타낸 화합물의 정제 방법:

    [화학식 II]
19. 제 18 항에 있어서, 알콜이 메탄올인 방법.
20. 화학식 II 로 나타낸 화합물의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 알콜로부터 재결정화시켜 수득된 화학식 II 로 나타낸 화합물의 정제된 생성물 :

    [화학식 II]
21. 제 20 항에 있어서, 알콜이 메탄올인 방법.
22. 하기 단계를 포함하는 화학식 I 로 나타낸 비타민 D 유도체의 정제된 생성물의 제조 방법 :

    [화학식 I]

    화학식 II 로 나타낸 화합물의 조생성물 또는 예비 정제된 생성물을 알콜로부터 재결정화하는 단계;

    [화학식 II]

    화학식 II 의 재결정화된 화합물에 자외선 조사 및 열 이성질화 반응을 수행하여 화학식 I 로 나타낸 비타민 D 유도체를 수득하는 단계;

    역상 크로마토그래피를 통해 화학식 I 의 초기 또는 예비 정제된 비타민 D 유도체를 정제하는 단계; 및

    유기 용매로부터 화학식 I 의 비타민 D 유도체를 결정화하는 단계.
23. 제 22 항에 있어서, 유기 용매가 비양성자성 유기 용매인 방법.
24. 제 23 항에 있어서, 비양성자성 유기 용매가 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 또는 이들의 혼합물인 방법.
25. 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 알콜이 메탄올인 방법.
26. 화학식 III 으로 나타낸 화합물 :

    [화학식 III]
27. 화학식 IV 로 나타낸 화합물:

    [화학식 IV]