KR100544374B1

KR100544374B1 - 올레아미드를 포함하는 방사선 치료 민감제

Info

Publication number: KR100544374B1
Application number: KR1020020080829A
Authority: KR
Inventors: 이윤실; 이윤진; 김대용; 김수관; 김경중; 전길자; 이수재; 조철구
Original assignee: 한국원자력연구소
Priority date: 2002-12-17
Filing date: 2002-12-17
Publication date: 2006-01-23
Also published as: KR20040053650A

Abstract

본 발명은 올레아미드(Oleamide) 또는 그의 무독성 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 방사선 치료 민감제를 제공한다.

올레아미드, 방사선 치료 민감제

Description

올레아미드를 포함하는 방사선 치료 민감제{A radiosensitizer comprising oleamide}

도 1은 인체 폐암 세포에 대한 콜로니 형성시험 결과를 나타낸 도면이고,

도 2는 인체 유방암 세포에 대한 콜로니 형성시험 결과를 나타낸 도면이고,

도 3은 DNA 단편화 시험결과를 나타낸 전기영동 사진이고,

도 4는 카스파제-3의 웨스턴 블럿팅 결과를 나타낸 사진이고,

도 5는 PARP의 웨스턴 블럿팅 결과를 나타낸 사진이고,

도 6은 유동세포계수 시험결과를 나타낸 도면이고,

도 7 은 SubG1의 세포사멸 효과를 나타낸 도면이고,

도 8 및 9는 생체내(in vivo) 동물시험 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 부작용이 최소화된 방사선 치료 민감제에 관한 것이다.

암의 치료법은 수술, 방사선치료법, 항암화학요법으로 크게 나눌 수 있는데, 현재 암 환자 중 국내의 경우 약 35 %, 미국의 경우 약 50 % 정도가 방사선 치료를 받고 있으며, 국내에서 방사선치료를 받는 암 환자의 수가 매년 증가하고 있는 추 세에 있으므로 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다. 그러나 암세포의 방사선내성 획득, 고선량 방사선치료 시 정상조직의 손상 등이 방사선치료의 효율을 저하시키는 문제점으로 지적되어 왔다.

따라서， 방사선 치료의 효율을　증진시키기　위한　방사선 치료 민감제에　대한　연구가　시도되고 있으나, 현재까지 보고된　방사선 치료 민감제는 주로 항암제들로서, 예를들어 탁솔(Taxol)과 시스플라틴(cisplatin)이 유방암, 자궁암. 폐암, 위암, 대장암 등의 고형암에서 방사선 치료 민감제로 사용될 수 있다고 개시된 바 있다 ("Enhancement of radiation effects by dombined decetaxel and carboplatin treatment in vitro", Amorino et al, Radiat Oncol Investig 1999;7(6):343-52; "Taxanes in combined-modality therapy for solid tumor", Choy H., Oncology 1999 Oct;13:22-38; "Paclitaxel, cisplatin, and concurrent radiation for esophageal cancer", Safran H et al., Cancer Invest 2001;19(1):1-7). 그러나, 이들 방사선 치료 민감제들은 그 자체가 항암제로서 사용되는 물질로서, 높은 부작용을 가지므로 그 사용이 제한적이라는 문제점이 있다.

따라서, 새로운 형태의 방사선 치료 민감제의 개발이 요구된다.

본 발명은 부작용을 최소화한 신규의 방사선 치료 민감제를 제공한다.

따라서, 본 발명은 신규의 방사선 치료 민감제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 올레아미드 또는 그의 무독성 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 방사선 치료 민감제를 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 명세서에서 사용하는 "방사선 치료 민감제"라는 용어는, 방사선 치료 시 병행처리되어 방사선에 대한 세포의 민감도를 증진시켜 방사선 치료효율을 상승시키는 물질로서, 예를들어 암치료시 병행처리되어 방사선에 대한 암세포의 민감도를 증진시켜 암세포 살상 효과 및 증식 억제 효과를 나타내는 물질을 말하며, 방사선 치료 증진제라고도 한다.

본 발명에 따른 방사선 치료 민감제의 유효성분으로 함유되는 올레아미드는 수면을 유도하고 체온을 낮추는 생리작용을 갖는 것으로 알려진 물질로서, 영지로부터 분리할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 기존의 방사선 치료 민감제로 공지된 바 있는 탁솔, 시스플라틴 등의 함암제에 비해 부작용의 발생을 훨씬 감소시킬 수 있다.

본 발명의 방사선 치료 민감제는 올레아미드 자체(free form) 또는 무독성 염의 형태로 사용할 수 있다. 상기 올레아미드의 무독성염으로는 약제학적으로 허 용되는 염이면 특별히 한정되지는 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산, 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 또는 나프탈렌술폰산염 등의 산 부가염의 형태일 수 있다.

본 발명의 방사선 치료 민감제는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 즉, 본 발명에서 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 기타 첨가제, 예컨대 안정제, 완화제, 유화제 등을 선택하여 사용할 수 있다. 예를들어, 부형제로서 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈 등이 사용될 수 있고, 붕해제로서 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등이 사용될 수 있다. 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈 등이 사용될 수 있고, 활택제로서는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등으로부터 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 방사선 치료 민감제는 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 또는 건조시럽제 등의 경구용 제형 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으며, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 에탄올에 용해시킨 액제 형태로 제제화하여 경구투여할 수 있다.

본 발명의 방사선 치료 민감제 중 올레아미드 또는 그의 무독성 염의 치료학적으로 유효한 양은 50∼2000 mg/kg/day의 범위일 수 있다. 그러나, 상기 치료학적으로 유효한 양 및 단위 투여량 형태는 조사되는 방사선량, 환자의 나이, 성별, 조 건 등에 따라 변경될 수 있다.

본 발명의 방사선 치료 민감제는 하기 실시예로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 암세포를 방사선과 병행 처리하였을 때 방사선 단독 처리군에 비해 방사선에 의한 암세포 살상능을 현저히 증가시킬 수 있고(약 30% 이상), 암세포 증식능을 월등히 감소시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 콜로니 형성 시험

인체 폐암세포(NCI-H640, 한국세포주은행) 및 인체 유방암 세포(MCF-7, 한국세포주은행) 각각 약 600개를 10%의 FBS(fetal bovine serum)와 페니실린 및 스트렙토마이신이 함유된 RPMI 1640 배지(GIBCO BRL)를 사용하여 배양하였다. 배양은 5개의 60mm 디쉬(dish)에 나누어 37℃의 CO₂ 배양기에서 하루동안 실시하였다.

올레아미드를 에탄올에 용해시켜 서로 다른 농도의 올레아미드 시료(인체 폐암 세포의 경우에는 0, 20, 40, 50, 60 μM, 인체 유방암 세포의 경우에는 0, 20, 40, 50 μM)를 준비한 다음, 이를 상기 5개의 디쉬에 각각 3ml씩 처리한 다음, 방사선 선량을 증가시키면서 방사선을 조사하였으며, 콜로니가 형성될 때까지 계속 배양했다. 적당한 콜로니가 형성되면, 고정액 (메탄올 : 아세트산 = 3 : 1)으로 고정시킨 후, 트리판 블루 (trypan blue)로 염색하여 콜로니 수를 세어 도 1 및 도 2 에 도시하였다.

도 1 및 도2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 방사선과 함께 올레아미드를 병용 처리한 경우 올레아미드를 처리하지 않은 경우와 비교시 암세포의 성장을 약 30% 이상 억제하는 것을 알 수 있으며, 올레아미드의 농도가 높아질수록 암세포의 생존율이 감소하므로 암세포의 생존률은 올레아미드에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있다.

실시예 2: DNA 단편화 시험, 웨스턴 블럿팅, 및 유동세포계수시험

6개의 디쉬를 사용하여, 인체 폐암세포(NCI-H640)를 실시예 1과 동일한 조건으로 배양하였으며, 하기 표1과 같이 올레아미드를 투여하고 방사선을 조사한 다음, DNA 단편화, 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 및 유동세포계수(Flow cytometry) 시험을 하였다.

처리군 번호	올레아미드 농도 (μM)	방사선량 (Gy)
1	0	0
2	40	0
3	0	5
4	0	10
5	40	5
6	40	10

(2-1) DNA 단편화 시험

상기 표1과 같이 올레아미드와 방사선을 처리한 인체 폐암세포를 세포용해용 완충액(lysis buffer: 20mM Tris/HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1% SDS 및 0.5 mg/ml 프로티나아제 K)으로 용해시킨 후, 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알콜 혼합액 (페놀:클로로포름:이소아밀알콜=25:24:1)을 처리하여 염색체 DNA를 추출하였다. 추출 된 각각의 염색체 DNA를 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하고 UV하에서 측정하여 DNA의 단편화 정도를 확인하였으며, 그 결과는 도3과 같다.

도3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 방사선만을 처리한 군(처리군 3 및 4)과 올레아미드만을 처리한 군(처리군 2) 보다 병용처리 군(처리군 5 및 6)에서 DNA 단편화가 현저히 증가되었음을 알 수 있다.

(2-2) 웨스턴 블러팅 시험

상기 표1과 같이 올레아미드와 방사선을 처리한 인체 폐암세포를 (2-1)과 동일한 방법으로 세포용해용 완충액으로 용해시켜, 원심분리하여 단백질을 추출하고, SDS PAGE에서 단백질을 분리하여 니트로셀룰로오스막으로 전이시켰다. 카스파제-3 (caspase-3), PARP (poly(ADP-ribose)polymerase) 항체를 막에 부착시키고 HRP (horseradish peroxide)가 연결된 2차 항체(secondary antibody)를 결합시킨 후 ECL시약(PerkinElmer Life Sciencec, Inc.)을 사용하여 세포사멸을 조절하는 카스파제-3(casepase-3) 및 PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)의 발현을 확인하여, 그 결과를 도 4 및 도 5에 도시하였다.

도4 및 도5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 방사선 또는 올레아미드 단독 처리 군보다 병용 처리 군에서 세포사멸(apoptosis)을 조절하는 주요 단백질들인 카스파제-3 및 PARP의 단편화가 현저히 증가하였음 알 수 있다.

(2-3) 유동세포계수(Flow cytometry) 시험

상기 표1과 같이 올레아미드와 방사선을 처리한 인체 폐암세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고 프로피디움 요오드 (Propidium iodide) 형광시약으로 DNA를 염색한 후 유동세포계수기(Becton DICKINSON)를 사용하여 Sub G1(세포사멸로 죽은 세포분획)의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도6 및 도7과 같다.

도6 및 도7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인체 폐암세포에 방사선 또는 올레아미드를 단독 처리한 군보다 병용 처리 군에서 SubG1의 양이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있다.

상기의 2-1 내지 2-3의 결과는 올레아미드의 방사선 치료 민감제로서의 효과가 세포사멸과정(apoptosis)을 통하여 일어난다는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 생체내(in vivo) 동물실험

20 g의 누드 마우스를 6개의 군으로 나누어, 각각 인체 폐암세포(NCI-H460세포)를 누드 마우스의 대퇴부에 이식하여 종양크기가 약 120-150 cm³에 이르게 하였다. 제1군은 대조군으로 하고, 제2군은 올레아미드를 50 mg/kg의 용량으로 에탄올에 용해시켜 매일 경구투여하고, 제3군은 20Gy의 방사선을 1회 조사하고, 제4군은 올레아미드를 제2군과 동일하게 투여한 후 20Gy의 방사선을 1회 조사하고, 제5군은 탁솔을 에탄올에 용해시켜 24 mg/kg의 용량으로 매일 투여하였다. 제6군은 탁솔을 제5군과 동일하게 투여한 후 20Gy의 방사선을 1회 조사하였다. 각각의 처리군을 3일 간격으로 종양의 부피를 측정하였으며, 그 결과는 도8과 같다. 또한, 방사선 조사 40일째 각 군의 누드마우스 사진은 도9와 같다.

도8 및 도9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 올레아미드를 투여하고 방사선을 조사한 처리군에서 암세포의 크기가 유의성 있게 감소함을 알 수 있다. 또한, 누드 마우스의 배양 일수가 증가함에 따라 폐암세포만 이식한 군은 배양일수에 의존적으로 폐암세포의 크기가 빠르게 증가하였고, 폐암세포를 이식한 누드 마우스에 올레아미드를 처리한 군은 폐암세포의 크기가 느리게 증가하였고, 폐암세포를 이식한 누드 마우스에 방사선 단독을 처리한 군의 경우, 배양일수 의존적으로 느린 속도로 폐암세포의 크기가 증가하였지만, 폐암세포를 이식한 누드 마우스에 방사선과 올레아미드를 병행 처리한 군의 경우에는 폐암세포의 크기가 처음 배양을 시작했을 시기의 크기를 지속적으로 유지하다가 현저히 감소시키는 것을 알 수 있다. 따라서 올레아미드는 배양세포 수준에서뿐만 아니라 인체 암세포 이식생쥐를 이용한 동물시험에서도 방사선 치료 증진작용을 나타내는 것으로 관찰되었다.

따라서, 올레아미드를 방사선과 병행하여 처리할 경우, 방사선 치료의 선량을 낮추면서도 치료 효율적인 측면에서는 고 선량 처리 효과를 얻을 수가 있으므로 고 선량 방사선 치료 시 나타나는 부작용인 정상세포의 손상을 현저히 줄일 수 있으므로 치료의 효율을 극대화시킬 수 있다.

본 발명의 방사선 치료 민감제는 항암제를 사용한 종래의 방사선 치료 민감제에 비해 부작용을 최소화할 수 있으며, 또한 방사선 치료의 선량을 낮추면서도 고 선량 처리 효과를 얻을 수가 있어 고 선량 방사선 치료 시 나타나는 부작용, 즉 고 선량 방사선 조사에 의한 정상세포의 손상을 현저히 줄일 수 있으므로 방사선 치료의 효율을 극대화시킬 수 있다.

Claims

올레아미드(Oleamide) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 방사선 치료 민감제.