KR100543977B1

KR100543977B1 - 키틴합성효소 ⅱ의 저해 활성을 지니는 홀아비꽃대추출물과 이로부터 분리된 신규 활성 화합물

Info

Publication number: KR100543977B1
Application number: KR1020030074362A
Authority: KR
Inventors: 김성욱; 임남희; 황의일; 노문철; 김영국; 강태훈; 김영태; 이상한; 성낙도
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-10-23
Filing date: 2003-10-23
Publication date: 2006-01-20
Also published as: KR20050039015A

Abstract

본 발명은 키틴 합성효소 Ⅱ의 저해 활성을 지니는 홀아비꽃대 추출물과 이로부터 분리된 활성 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 홀아비꽃대(Chloranthus japonicus)를 물 또는 적정 유기용매로 추출하여 얻어진 홀아비꽂대 추출물과, 상기한 홀아비꽃대 추출물을 크로마토그래피하여 얻어진 다음 화학식 1로 표시되는 신규의 활성 화합물과, 그리고 상기한 추출 및 분리방법으로 얻어진 홀아비꽃대 추출물과 이로부터 분리된 신규 화합물이 키틴합성효소 Ⅱ의 활성 저해 및 식물병원균에 대한 항진균 활성을 나타내므로 이를 유효성분으로 함유하는 살균제에 관한 것이다.

홀아비꽃대, 추출물, 키틴합성효소 Ⅱ, 살균제, CJ-01

Description

키틴합성효소 Ⅱ의 저해 활성을 지니는 홀아비꽃대 추출물과 이로부터 분리된 신규 활성 화합물{Extracts of Chloranthus japonicus having chitin synthase Ⅱ inhibitory activity and a novel compound isolated from same}

도 1은 화학식 1의 화합물에 대한 분자량 분석 스펙트럼이다.

도 2는 화학식 1의 화합물에 대한 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 3은 화학식 1의 화합물에 대한¹³C NMR 스펙트럼이다.

도 4는 화학식 1의 화합물에 대한 키틴합성효소 Ⅱ의 활성 저해 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 키틴합성효소 Ⅱ의 저해 활성을 지니는 홀아비꽃대 추출물과 이로부터 분리된 활성 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 홀아비꽃대(Chloranthus japonicus)를 물 또는 적정 유기용매로 추출하여 얻어진 홀아비꽃대 추출물과, 상기한 홀아비꽃대 추출물을 크로마토그래피하여 얻어진 다음 화학식 1로 표시되는 신규의 활성 화합물과, 그리고 상기한 추출 및 분리방법으로 얻어진 홀아비꽃대 추출물과 이로부터 분리된 신규 화합물이 키틴합성효소 Ⅱ의 활성 저해 및 식물병원균에 대한 항진균 활성을 나타내므로 이를 유효성분으로 함유하는 살균제에 관한 것이다.

[화학식 1]

농업용 살균제의 개발 연구는 1950년대 후반 일본에서 특정한 식물 병원균을 대상으로 한 광범위한 미생물 탐색으로, 블라스티시딘-에스(Blasticidin-S; S. Takeuchi, et al., J. Antibiotics., 11, 1-5, 1958), 카수가마이신(Kasugamycin; H, Umezawa, et al., Antimicrob. Agents & Chemother., 5, 753-757, 1965), 바리다마이신(Validamycin; T, Isawa, et al., J. Antibiotics, 24, 119-123, 1971) 등을 발견하여 그 당시 사용되고 있던 유기 수은제 농약을 대체하면서 활성화되기 시작하여 200여종의 각종 살균제들이 보고되었고 현재 135종이 이용되고 있으나 화학 합성품이 주종을 이루고 있다.

살균제 연구 동향을 살펴보면 ①생화학적인 대사 경로의 특정된 목표물을 대상으로 한 천연물 또는 화학 합성품의 탐색, ②분자 수준에서 식물체 발병과 병 저 항성 기작 연구를 통한 식물-미생물 상호작용의 규명, ③식물체의 발병을 억제하나 식물 병원성 진균류의 생육을 미치지 않는 화합물의 탐색, ④길항 미생물을 이용한 생물학적 방제에 관한 연구 등으로 나누어진다.

특히 특정 목표물을 이용한 연구에서는 진균류의 세포벽과 세포막 성분인 키틴(Chitin)과 에르고스테롤(ergosterol) 및 포스포리피드(phospholipid) 합성 저해제 탐색이 이루어지고 있다. 진균류는 동물세포와는 달리 세포벽이 존재하고, 식물세포와는 그 조성이 다르기 때문에 진균류의 세포벽은 선택적인 목표물로 오래 전부터 많은 주목을 받아 왔다.

진균류 세포벽의 주성분인 키틴(Chitin)은 N-아세틸-D-글루코사민이 β-1,4 결합으로 이루어진 호모폴리머로서 키틴합성효소 I, Ⅱ 및 Ⅲ에 의해 합성된다 (J. P. Gaughran, et al., J. Bacteriol., 176(18), 5857-5860, 1994; S, J. Silverman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 4735-4739, 1988; M, Debono, et al., Annu. Rev. Microbiol., 48, 471-497, 1994). 이러한 키틴합성효소들에 대한 각각의 특성과 기능이 알려지면서 선진국에서는 분자 생물학적 기법을 이용하여 각각의 효소만을 선택적으로 생산할 수 있는 재조합 Saccharomyces cerevisiae 균주를 개발하여 격막 형성에 관여하는 키틴합성효소 Ⅱ와 키틴 고리형성에 관여하는 키틴합성효소 Ⅲ에 대한 효소 저해제 탐색을 행하고 있다. 키틴합성 저해제로는 폴리옥신(polyoxin; K. Isono, et al., Agri. Biol. Chem., 31, 190-199, 1967)과 니코마이신(nikkomycin; H. P. Fieder, J. Chem. Tech. Biotechnol., 32271-32280, 1982)이 보고되었으나, 여러 가지 문제점으로 인해 널 리 이용되지 못하고 있는 실정이다.

에르고스테롤(ergosterol)은 아세틸-CoA로부터 여러 단계를 거쳐 합성되며 그 저해제로는 주로 라노스테롤(Lanosterol)에서부터 에르고스테롤 합성경로에 주로 집중되어 많은 화합물들이 보고되었으며, 의약용과 농업용으로 주로 이용하고 있다 (F. J. Schwinn, Pestic. Sci., 15, 40-47, 1983). 농업용 살균제로 이용되고 있는 에르고스테롤 생합성 저해제는 주로 14α-탈메틸화, △⁸→△⁷ 이성질화 및 △¹⁴-환원 저해제가 주종을 이루고 있다 (G. K. Dixson, et al., Antifungal Agents-Discovery and Mode of Action, Bios Scientific Publishers, Oxford, p.59-68, 1995).

또한, 세포막 내부 성분인 포스포리피드(phospholipid)의 조성은 식물체와 동물의 포스포리피드 구성 성분과 유사하나 합성 경로는 다른 진핵 세포와 유사한 경로로 합성되어 선택 독성을 나타내지 않을 것으로 예상되었으나, 포스파티딜콜린 저해제인 에디펜포스(Edifenphos), 이프로 벤포스(Iprobenfos) 및 이노시톨 (Inositol) 생합성 저해제로 추정되는 바리다마이신(validamycin) 등이 벼의 문고병 방제제로 이용되면서 포스포리피드 생합성도 선택 독성을 나타내는 잠재적인 목표물로 알려지게 되었다 (G. K. Dixson, et al., Antifungal Agents-Discovery and Mode of Action, Bios Scientific Publishers, Oxford, p.77-97, 1995 ).

이외에 기존의 살균제(fungicide)나 정균제(fungistatic) 개념과는 다른 화합물들이 보고되었는데, 이 화합물들은 식물체 발병을 효과적으로 억제하나 곰팡이 병원균의 생육에는 전혀 영향을 미치지 않거나 약간의 영향만을 나타내는 것으로 보고되었다. 대표적인 화합물로는 벼의 도열병에 효과적인 프로베나졸(Probenazole)과 트리싸이클라졸(Tricyclazole)이 있다. 프로베나졸의 작용 기작은 아직 밝혀져 있지 않은 반면, 부착기의 멜라닌 합성을 저해하는 트리싸이클라졸은 초기 발병 시 부착기 형성을 억제하는 것으로 알려져서 이 화합물들도 살균제로 통칭되고 있다 (H. Lyr, et al., Modern Fungicides and Antifungal Compounds, Intercept, Andover, p.3-15, 1996).

한편, 미생물을 이용한 생물학적 방제 연구는 1900년대 초부터 많은 종류의 세균과 곰팡이를 이용하여 식물 병원균을 억제하기 위해 많은 노력을 기울여 왔으며, 지금까지 보고된 생물학적 방제제의 대부분이 Agrobacterium sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp. 등의 세균류와 Gliocladium virens, Trichoderma sp. 등의 곰팡이를 이용한 개발 연구들이다. 길항 미생물을 이용한 살균제로는 지금까지 가장 성공적인 연구결과로는 Agrobacterium radiobacter를 이용한 식물 뿌리의 뿌리혹병(crown gall) 예방으로, 이 병은 Agrobacterium tumefaciens라는 토양 세균에 의해 발생하는 과수의 뿌리병이다. 이 병의 방제에 화학합성 농약은 전혀 효과가 없으나 길항 미생물 A. radiobacter가 생산하는 아그로신(agrocin)이라는 항생물질이 A. tumefaciens의 침입을 억제한다고 밝혀졌다 (A. Kerr, Plant Dis., 64, 25-30, 1980).

최근에는 분자생물학 기법을 이용한 식물의 병 저항성 기작 연구를 통하여 식물의 병원체에 대한 방어 기작을 많이 이해하게 되어 상당수의 병 저항성 유전자 가 클로닝되어 특허화되었고 (Plant Physiol., 104, 1109-1112, 1994), 이러한 기작 연구를 통해 살균제 개발에 필요한 새로운 표적을 찾기 위한 수단으로서 연구의 대상이 되고 있다. 이와 같이 나날이 변화해 가는 첨단 분자 생물학 기법을 이용한 식물병 방어 기작의 이해는 식물-미생물, 미생물-미생물 간의 상호 작용의 이해뿐만 아니라 생태계의 환경에 악 영향을 끼치지 않는 새로운 살균제의 개발을 위한 새로운 목표물이 될 것으로 예상된다.

본 발명자들은 식물 병원균들의 작용점에 특이적으로 작용하는 환경 친화적인 새로운 살균제의 개발을 위해 우리나라에 널리 분포하는 자생 식물로부터 식물병원균의 세포벽 구성 성분인 키틴합성을 저해하는 활성저해물질을 생산하는 식물체를 탐색하여 홀아비꽃대를 선별하였다. 홀아비꽃대는 산한, 거풍, 행어, 해독의 효능이 있고 풍한해수, 월경폐지, 풍양을 치료하며 홀아비꽃대의 함유 성분인 세스퀴락톤(sesquilactone) 화합물들이 쥐의 백혈병 암세포인 L-5178Y 세포의 성장을 억제한다고 보고되었다 (배기환 등, 한국의 약용식물, 교학사, p.164, 2000). 그러나, 현재까지 발표된 바에 따르면 홀아비꽃대가 키틴합성 저해 활성을 가지고 있어 살균활성이 있음이 보고된 바는 없다.

본 발명자들은 국내에 널리 분포되어 있는 자생 식물로부터 키틴합성효소 저해제를 탐색하던 중 홀아비꽃대 추출물로부터 S. cerevisiae 유래 키틴합성효소 Ⅱ에 대한 저해 활성 및 식물 병원균에 대한 항진균력이 우수한 홀아비꽃대 추출물을 탐색하고, 홀아비꽃대 추출물로부터 키틴합성효소 Ⅱ에 우수한 저해 활성을 나타내면서 동시에 항진균 활성을 나타내는 신규 화합물을 분리 정제하여 그 구조를 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 천연물의 일종이며 국내에서 쉽게 재료를 구할 수 있고, 특정 조성의 유효활성 성분이 포함되어 홀아비꽃대 추출물이 함유된 천연 살균제를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 홀아비꽃대 추출물로부터 분리한 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 및 이의 분리방법 및 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 살균제를 제공하는데 다른 목적이 있다.

본 발명은 키틴합성효소 Ⅱ의 활성 저해 및 식물병원균에 대한 항진균 활성이 우수한 홀아비꽃대 추출물과, 이 추출물로부터 분리 정제된 다음 화학식 1로 표시되는 신규 활성 화합물과, 이들의 추출 및 분리 정제방법, 그리고 이들을 유효성분으로 함유하는 살균제를 그 특징으로 한다.

[화학식 1]

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 홀아비꽃대로부터 추출한 추출물이 키틴합성효소 Ⅱ의 활성 저해 및 항진균 활성이 있음을 최초로 밝혀낸 발명이다.

본 발명에서는 홀아비꽃대를 이용하여 다양한 방법으로 특정 조성의 추출물을 얻어내고, 이러한 특정 조성의 추출물을 효과적인 살균제의 상품으로 제품화할 수 있는 실질적인 기틀을 마련한 것이다.

본 발명에서 홀아비꽃대 추출물을 제조하기 위해서는 여러 가지 방법들이 제안될 수 있으나, 본 발명에서는 단순한 추출 방법에서부터 지용성 성분까지 추출할 수 있는 모든 방법이 적용될 수 있으며, 이러한 추출 방법은 항진균 활성을 나타내는 홀아비꽃대 추출물로 제조하는 방법이라면 어느 방법이나 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따른 홀아비꽃대 추출물의 추출방법의 일례로서는 증류수 중탕 추출법, 유기용매 추출법이 적용될 수 있으며, 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올을 포함하는 지방족 알콜 또는 알콜 수용액, 헥산, 에틸아세테이트 등이 사용될 수 있다.

또한, 홀아비꽃대로부터 상기 화학식 1로 표시되는 활성 화합물의 분리 정제하는 방법은 다음과 같은 단계가 포함되어 구성된다 : 1) 홀아비꽃대(Chloranthus japonicus)의 전초를 지방족 알콜 또는 알콜 수용액, 헥산 및 에틸아세테이트 중에서 선택된 용매로 추출하여 유기층을 분리하는 단계; 2) 상기 유기층을 칼럼 크로마토그래피(실리카 또는 C18 또는 Sephadex LH-20)에 흡착시킨 후 용출시켜 활성 분획을 분리하는 단계; 및 3) 박막 크로마토그래피(TLC)를 이용하여 가장 우수한 저해 활성을 나타내는 분획을 분리한 후, 컬럼 크로마토그래피(HPLC)로 정제하는 단계.

우선, 건조된 홀아비꽃대의 잎과 줄기를 추출한 후 여과하여 액상의 추출액을 얻는다. 이때 추출용매로는 지방족 알콜 또는 알콜 수용액, 헥산 및 에틸아세테이트 중에서 선택된 유기용매가 사용될 수 있으며, 지방족 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올을 포함하며, 바람직하게는 메탄올을 사용하는 것이다. 구체적으로 설명하면, 홀아비꽃대 분쇄물 중량대비 0.5 ∼ 10 배량의 메탄올을 사용하여 추출한다. 이 추출액을 감압 농축한 후 헥산에 용해한 후 물을 넣어 분획한다. 이때 키틴합성효소 Ⅱ에 대한 저해 활성은 유기용매 층에서 검출된다.

상기에서 얻어진 유기층을 감압 농축한 후 이 농축액으로 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 분리한다. 예를 들어 상기 농축액을 칼럼에 가하여 흡착시킨 후 헥산과 에틸아세테이트를 100 : 0 내지 0 : 100의 비율로 변화시키면서 가하여 비극성 물질과 극성 물질을 제거한 후 80 : 20에서 분리되어 나오는 활성 물질을 부분 정제한다. 얻어진 부분 정제된 활성 분획을 더욱 정제하기 위해 컬럼 크로마토그래피(실리카켈, C₁₈, Sephadex LH-20)를 한번 더 수행한다. 정제된 활성 분획으로 박막 크로마토그래피(C₁₈ TLC)를 수행하여 항진균 활성이 가장 우수한 분획을 분리한 후 고압 칼럼 크로마토그래피(HPLC)로 정제하여 얻는다.

이렇게 얻은 활성 분획을 정제하여 이 화합물의 구조를 NMR로 분석한 결과, 노란색을 띠는 오일(oil) 형태의 화합물로써 분자식이 C₁₅H₁₈O₂이고, 분자량이 230이 며, 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물로서, 메탄올에는 용해되나, 헥산, 에틸아세테이트, 물에는 용해되지 않는다. 이 화합물의 이화학적 성질은 다음 표 1에 나타내었다. 또한, 신규 화합물은 키틴합성효소 Ⅱ에 대한 IC₅₀이 약 39.6 ㎍/㎖로서 우수한 저해활성을 나타내었으며, 여러 가지 식물 병원성 진균류에 대하여 우수한 항진균력을 나타내었다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 범위가 하기 실시 예에만 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 증류수 중탕 추출

생 홀아비꽃대와 건조 홀아비꽃대로부터 수용성 활성물질을 추출하기 위한 방법으로 증류수 중탕 추출법을 사용하였다. 홀아비꽃대를 잘게 썰고, 홀아비꽃대 분쇄물 중량 대비 2배의 물을 혼합하여 60 ℃ ∼ 100 ℃ 온도에서 20분간 중 탕하여 갈녹색의 용액을 추출물로 얻었다.

실시예 2. 유기용매 추출

홀아비꽃대로부터 항진균 활성을 나타내는 성분을 추출하기 위하여, 건조한 홀아비꽃대 1 kg을 잘게 분쇄한 후, 여기에 메탄올 2 L를 가하여 48시간 동안 방치한 다음 여과하여 액상과 고체 부분으로 분리하였다. 액상을 모아서 감압 하에서 농축한 후 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올을 차례로 가하여 용해시키고 용해된 유기용매 층을 얻었다.

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 얻은 증류수 중탕 추출물 및 유기용매 추출물 각각에 대한 항진균 활성을 측정한 결과는 다음 표 2에 나타내었다. 상기 방법으로 얻은 홀아비꽃대 추출물의 키틴합성효소 Ⅱ에 대한 저해활성은 280 ㎍/㎖에서 80%로 우수하였다.

실시예 3. 홀아비꽃대로부터 신규 화합물의 분리

대한민국 중부 이남 지역에 주로 자생하는 홀아비꽃대(Chloranthus japonicus) 1 kg을 잘게 부순 후 여기에 100% 메탄올 2 L를 가하고 상온에서 48시간 동안 방치한 다음 여과하여 액상과 고체 부분으로 분리하였다. 액상을 모아서 감압 하에서 농축한 후 이 농축액에 1 L의 헥산을 가하여 용해시키고 물 1L을 가하여 유기용매 층과 물 층으로 분리시켰다. 용해된 유기용매 층은 아래 참고예 1 내지 3의 방법에 따라 키틴합성효소 저해 활성 및 항진균력을 측정하여 유기용매 층에 활성물질이 포함되어 있음을 확인하였다.

활성물질이 포함된 유기용매 층을 모아 감압 하에서 농축하고 순상 크로마토그라피 컬럼(Merck, Kiesegel 60, 230∼400 mesh)에 흡착시킨 후, 헥산과 에틸아세테이트의 비율을 100 : 0에서 50 : 50으로 변화시키면서 80 : 20에서 용출되는 활 성 분획을 분리하였다. 얻어진 활성 분획을 역상 크로마토그라피 컬럼(Merck, Lichroprep RP-18, 40∼63 ㎛)에 흡착시킨 다음, 메탄올과 물로 용출시켜 부분 정제된 활성물질을 얻었다. 이어서, 이 물질을 100% 메탄올을 용매로 하여 겔 필터 크로마토그라피(Sephadex LH-20)를 실시한 후, 얻어진 활성 분획을 메탄올과 물의 혼합액(80:20, v/v)을 사용한 프리페라티브 TLC(preparative TLC)로 정제하였다. 최종적으로 가장 높은 활성을 나타내는 분획을 고압 액체 크로마토그라피(HPLC)하여 순수한 화합물을 분리하였고, 이 화합물을 CJ-01로 명명하였다. 이때 HPLC 컬럼으로는 에질런트(Agilent)사의 에클립스(Eclipse) XDB-C8 ODS(4.6×150 mm) 컬럼을 사용하였다.

실시예 4. 신규 화합물의 구조 분석

본 실험을 통해 분리된 화합물의 분자량 및 분자식 결정을 위해, 핵자기 공명(Varian UNITY 300 MHz, 500 MHz NMR)을 이용하여 ¹H, ¹³C, COSY, HMQC, HMBC 및 NOESY 스펙트럼을 얻었다. 또한 UV 흡광도 분석, IR(infrared) 흡광도 분석 및 Mass 분석을 실시하였다. 구체적으로, UV 흡광도 분석은 UV-가시화 분광 시스템(UV-visible spectroscopy system, Shimazu사, UV-250)을 사용하여 측정하였으며, IR 흡광도는 디스크 형태로 제조하여 부루커(Bruker)사의 EQUINOX 55 분광기를 사용하여 측정하였고, 질량분석기(Hewlett packard 5989A)를 이용하여 분자량 및 분자식을 결정하였으며, 그 결과를 도 1 내지 3 및 다음 표 3에 나타내었다.

상기 분리 정제된 신규 화합물은 노란색의 오일상을 형성하고 있는 화합물로서, 분자식이 C₁₅H₁₈O₂이고, 분자량이 230이며, 이 화합물을 CJ-01로 명명하였으며, 그 구조식은 다음 화학식 1에 나타내었다.

[화학식 1]

실시예 5 : 키틴합성효소 Ⅱ에 대한 신규 화합물의 저해활성 검정

본 발명이 홀아비꽃대로부터 분리한 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물은, 아래 실험예 1의 방법에 따라 키틴합성효소 Ⅱ에 대한 저해 활성을 측정하였다. 그 결과, IC₅₀이 39.6 ㎍/㎖로 확인되어 기존의 키틴합성효소 Ⅱ의 저해제로 알려진 폴리옥신(polyoxin) D (IC₅₀ = 70 ㎍/㎖, E. Cabib, Antimicrob. Agents Chemocher., 35, 170-173, 1991) 보다 저해 활성이 1.8배나 더 강하다는 것을 확인하였다.

실시예 6 : 식물 병원성 진균류를 이용한 신규 화합물의 항진균력 검정

홀아비꽃대로부터 분리한 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 이용하여 여러 종류의 식물 병원균에 대한 항진균력을 측정한 결과를 다음 표 4에 나타내었다. 다음 표 4의 결과에 의하면, 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cinerea), 뿌리썩음병균 (Pythium ultimum), 역병균 (Phytophthora capsici)에 대한 MIC 값은 50 ㎍/㎖으로 강한 항진균력를 나타내었으며, 그 외 시험에 이용한 다른 병원균에 대 해서는 100 ㎍/㎖에서 항진균력을 나타내었다.

실시예 7. 신규 화합물의 급성 독성시험

신규 화합물 CJ-01에 대해서 체중 25 g 정도의 5 주령 ddy 마우스(대한실험동물협회)를 대상으로 급성독성 시험을 수행하였다. 먼저 화학식 1의 시험물질을 멸균한 증류수로 혼합하여 투여직전에 조제하였다. 그리고, 대조군은 멸균 증류수를 사용하였으며, 약 3시간 절식시킨 시험계에 대하여 경구 투여용 존데를 이용하여 시험물질을 강제 투여하였다. 투여 당일은 투여 후 1시간 내지 6시간까지 매시간, 투여 익일부터 14일까지는 매일 1회씩 일반 상태의 변화, 중독 증상 및 사망 동물의 유무를 관찰하였다. 관찰기간 종료 후 CO₂ 마취 하에 방열 치사시켜 내부 장기의 육안적 이상 유무를 상세히 관찰하였다. 그 결과 이 화합물 은 1회 100 mg까지 투여하고 14일 동안 지속적으로 관찰하여도 커다란 독성이 없음을 확인하였다.

실험예 1 : 키틴합성효소 Ⅱ의 활성 저해 활성 검정

키틴합성효소 Ⅱ의 저해 활성은 UDP-[¹⁴C]GlcNAc(N-acetyl-D-glucosamine) (400,000 cpm/μmol)을 기질로 하여 Won-Ja Choi 등(Anal. Biochem. 219, 368-372, 1994)의 방법을 사용하여 저해활성을 측정하였다. 32 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1.6 mM 코발트 아세테이트, 1.1 mM UDP-[¹⁴C]GlcNAc, 20 μL의 S. cerevisiae 유래 키틴합성효소 Ⅱ의 조효소액, 14 μL의 시험하고자 하는 시료, 2 μL의 트립신(2 mg/mL)을 가하여 30 ℃에서 15분 동안 예비 반응을 시켰다.

이 반응액에 2 μL의 트립신 저해제(4 mg/mL)를 첨가하여 얼음에서 10분 동안 방치한 후 32 mM N-아세틸글루코사민을 전체 용적이 50 μL되게 첨가한 후 30 ℃에서 90분 동안 반응시켰다. 이 반응액에 1 mL의 10% 트리클로로아세트산을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 GF/C 여과지를 이용하여 여과하였다. 이 여과지를 건조시킨 후 3 mL의 칵테일을 첨가하여 액체 섬광계수기를 이용하여 방사능을 측정하였으며 키틴합성효소 Ⅱ의 저해 활성은 다음 수학식 1에 의해 계산하였다.

상기 수학식 1에서, Control은 반응액에 시료를 첨가하지 않았으며, Blank는 시료 와 키틴합성효소를 첨가하지 않고 반응시켜 방사능을 측정하였다.

실험예 2 : 식물 병원균을 이용한 생육 억제 활성 검정 (disk 법)

식물 병원성 진균류들을 25 ℃에서 포테이토 텍스트로스 배지에서 3∼5일 동안 충분히 배양하고 호모게나이저로 균체를 파쇄한 후 분광분석기를 이용하여 A₅₅₀에서 1.5 농도로 조절하여 접종원으로 사용하였다. 이 후 균액과 0.8% 한천이 함유된 포테이토 텍스트로스 한천 배지와 1:9로 희석하여 오버레이(overlay)용 접종원으로 이용하였다. 먼저, 페트리디쉬(petri-dish)에 포테이토 텍스트로스 한천 배지를 10 mL 분주하여 오버레이용 평판을 제조한 후 오버레이용 접종원 5 mL을 분주하여 검정용 평판을 제조하였다. 제조된 평판에 1 mg/disk 농도로 추출액을 디스크에 흡수시킨 후 평판 위에 올려놓고 2∼5일 동안 관찰하여 생육저지환을 측정하였다.

실험예 3 : 식물 병원균을 이용한 항진균력 검정 (MIC)

여러 종류의 식물 병원균들을 포테이토 텍스트로스 한턴 배지를 이용하여 25 ℃에서 7∼14일 동안 충분히 배양하여 접종원으로 사용하였다. 접종 균액을 멸균된 증류수를 이용하여 2배 희석 계열을 만든 후 멸균하여 50 ℃로 유지시킨 포테이토 텍스트로스 한천 배지를 접종 균액과 9:1의 비율로 혼합하여 최종 농도가 1,000∼1.95 ㎍/㎖이 되도록 5 cm 크기의 평판에 분주하였다. 배지가 고형화되 면 위에서 제조한 접종 균액을 각 평판마다 일정량씩 접종하여 25∼30 ℃에서 1∼2일 동안 배양한 후 육안으로 관찰하여 균의 생육이 억제된 농도를 최소 생육저지 농도(MIC)로 정하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 기술한 홀아비꽃대 추출물은 키틴합성효소 Ⅱ에 대한 선택적 활성이 우수하고, 식물 병원균에 대한 항진균력이 우수하므로 홀아비꽃대로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 하는 살균제로 사용할 수 있다. 또한, 홀아비꽃대로부터 분리된 상기 화학식 1로 표시되는 신규 활성 화합물은 키틴합성효소 Ⅱ에 대한 선택적 저해 활성이 우수하고, 이로 인해 식물 병원균에 대한 항진균활성이 우수하므로 이 역시 살균제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

홀아비꽃대(Chloranthus japonicus) 추출물이 함유되어 있고, 키틴합성효소 Ⅱ의 저해 활성 및 식물 병원균에 대한 항진균 활성을 가지는 것임을 특징으로 하는 농업용 살균제(fungicide).
제 1 항에 있어서, 상기 추출물의 추출용매가 물, 지방족 알콜 또는 알콜 수용액, 헥산 및 에틸아세테이트 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 농업용 살균제(fungicide).
다음 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물 :

[화학식 1]
다음 화학식 1로 표시되는 화합물이 함유되어 있고, 키틴합성효소 Ⅱ의 저해 활성 및 식물 병원균에 대한 항진균 활성을 가지는 것임을 특징으로 하는 농업용 살균제(fungicide) :

[화학식 1]
1) 홀아비꽃대(Chloranthus japonicus)의 전초를 지방족 알콜 또는 알콜 수용액, 헥산 및 에틸아세테이트 중에서 선택된 용매로 추출하여 유기층을 수득하는 단계;

2) 상기 유기층을 순상 크로마토그라피 컬럼에 흡착시킨 후, 헥산과 에틸아세테이트의 비율을 100 : 0에서 50 : 50 부피비로 변화시키면서 용출시켜, 80 : 20에서 용출되는 분획을 수득하는 단계;

3) 상기 분획을 역상 크로마토그라피 컬럼에 흡착시킨 후, 메탄올과 물로 차례로 용출시켜 정제하는 단계;

4) 상기 정제된 분획을 메탄올 용매를 사용하여 겔 필터 크로마토그라피하는 단계; 및

5) 상기 분획을 메탄올과 물의 혼합액(80:20, v/v)을 사용하여 박막 크로마토그라피하는 단계를

포함하는 것을 특징으로 하는 홀아비꽃대(Chloranthus japonicus)로부터 다음 화학식 1로 표시되는 화합물의 분리방법 :

[화학식 1]