KR100538311B1 - 밀리타리스동충하초로부터 분리된 항암활성이 있는 신물질과 그 제조방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris) 자실체에서 추출된 항암 활성이 있는 신물질(이하, 밀리타린이라 함)과 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
밀리타리스동충하초를 메탄올로 추출하고 헥산, 부탄올, 에틸 아세테이트 및 물 순으로 분획한 후 각 분획에 대하여 MTT 분석법으로 항암 효과를 측정하여 가장 강한 활성을 나타낸 부탄올 분획에 대하여 1차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 2차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC를 차례로 실시하여 최종적인 단일 화합물을 얻을 수 있었다. 이와같이 분리된 화합물은 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, hetero COSY, LC-MS및 FT-IR 등의 분석을 통하여 그 구조를 확인할 수 있었고, 이는 MTT 분석 결과 B16F10(흑색종), DU145(전립선암), Hela(자궁경부암) 등의 암세포에 강한 억제작용을 나타내므로 다양한 암에 대한 예방 및 치료제로서 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris) 자실체에서 분리된 항암 활성이 있는 신물질 밀리타린(militarin)과 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
동충하초는 예로부터 인삼, 녹용과 더불어 중국의 진귀한 3대보약 중의 하나로 알려지고 있으며 그 중에서 밀리타리스동충하초는 동충하초속의 표준종(Type Species)으로 세계적으로 한국에 많이 분포한다.
밀리타리스동충하초의 자실체는 폐를 보호하고 신장을 튼튼히 하는 것으로 알려져 있고, 결핵, 황달 등의 치료와 강장제로서의 효과가 인정되어 많이 이용되고 있으며, 주로 병후의 신체조절, 보약 등에 사용되는 고가의 한방 약재로 이용되고 있으며, 특히 밀리타리스동충하초의 약리성분에는 면역기능을 강화하는 성질이 함유되어 있어 감기, 폐결핵, 만성 기침, 천식, 발작, 빈혈, 남성의 성적 기능 장애, 고혈압 등에 효과를 나타내고 있다.
특히, 약제로 사용되고 있는 자실체의 성분 중 퀸익산(quinic acid)의 이성체인 코디세핀(Cordycepin)과 같은 유용한 약리 성분이 밝혀지면서 [참조: Cunningham, K, G., Hutchinso, S, A., Manson, W,. and Spring, F. S. 1951. Cordycepin, a metabolic product from cultures of Cordyceps militaris(Linn) Link. Pt. 1. Isolation and Characteristics, J. Chem. Soc. 51:2290∼2300] 밀리타리스동충하초에 관한 관심이 날로 증가되고 있다.
또한 중국, 일본 등의 최근 연구 결과에 의하면 밀리타리스동충하초에는 면역 기능을 강화시키는 성분이 함유되어 있어 세포면역과 체액면역을 촉진시키고 면역기능을 현저히 보강시켜 각종 종양과 바이러스 감염에 대한 저항력을 높이는 등의 효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 한국에서도 이에 대한 연구로 항암성분인 에르고스테롤 페록사이드(ergosterol peroxide) [참조: Ha-Won Kim et al. 2001. In vitro Antitumor Activity of Ergosterol Peroxide Isolated from Cordyceps militaris on Cancer Cell Lines from Korean Patients]가 밝혀져 있다.
Cordyceps종으로부터 보고된 생리활성 물질의 예로 항균제 및 항암물질로 알려진 코디세핀 [참조: Kuo YC, Lin CY, Tsai WJ, Wu CL, Chen CF, Shiao MS. Growth inhibitors against tumor cells in Cordyceps sinensis other than cordycepin and polysaccharides. Cancer Invest 1994;12(6):611-5.; Chassy BM, Suhadolnik RJ. Nucleoside antibiotics. IV. Metabolic fate of adenosine and cordycepin by Cordyceps militaris during cordycepin biosynthesis. Biochim Biophys Acta 1969 Jun 17;182(2):307-15.], 항균제로 알려진 orhicodin [참조: Kneifel H, Konig WA, Loeffler W, Muller R. Ophiocordin, an antifungal antibiotic of Cordyceps ophioglossoides. Arch Microbiol 1977 May 13;113(1-2):121-30.], 항암활성이 있는 polysaccharide [참조: Ohmori T, Tamura K, Tsuru S, Nomoto K. Antitumor activity of protein-bound polysaccharide from Cordyceps ophioglossoides in mice. Jpn J Cancer Res 1986 Dec;77(12):1256-63. Yamada H, Kawaguchi N, Ohmori T, Takeshita Y, Taneya S, Miyazaki T. Structure and antitumor activity of an alkali-soluble polysaccharide from Cordyceps ophioglossoides. Carbohydr Res 1984 Jan 10;125(1):107-15.]와 galactomannan[참조: Kiho T, Nagai K, Miyamoto I, Watanabe T, Ukai S. {Polysaccharides in fungi. XXV. Biological activities of two galactomannans from the insect-body portion of Chan hua (fungus: Cordyceps cicadae)} Yakugaku Zasshi 1990 Apr;110(4):286-8.] 등이 있다.
그러나 본 연구결과에서 얻어진 밀리타린은 신물질로서 어디에서도 보고된 바 없으며 기존의 밀리타리스동충하초에서 분리된 코디세핀 및 에르고스테롤 페록사이드보다 월등한 항암 효과를 지닌 물질임을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 밀리타리스동충하초로부터 분리된 새로운 항암 활성물질인 밀리타린을 제공하고, 이를 항암제 조성물로서 이용하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 밀리타리스동충하초에서 분리되는 새로운 항암 활성물질인 밀리타린의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 기술적 과제는 밀리타리스동충하초를 메탄올로 추출하고, 추출물을 헥산, 부탄올, 에틸 아세테이트 및 물 순으로 분획하고, 부탄올 분획물에 1차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 2차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC를 차례로 실시하여 밀리타린을 얻고, 밀리타린의 구조를 규명하고, 밀리타린의 항암활성을 검정함으로써 달성하였다.
본 발명은 밀리타리스동충하초를 메탄올로 추출하는 단계; 메탄올 추출물을 헥산, 부탄올, 에틸 아세테이트 및 물 순으로 분획하는 단계; 부탄올 분획물에 대하여 1차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 2차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC를 차례로 실시하여 최종적인 단일 화합물 밀리타린을 얻는 단계; NMR, FT-IR 등의 분석을 통해 밀리타린의 구조를 규명하는 단계; MTT 방법을 사용하여 밀리타린의 항암효과를 검정하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 밀리타리스동충하초의 메탄올 추출 및 분획
본 실험에 사용된 번데기 동충하초(Cordyceps militaris) 균주는 강원대학교 생물환경학부의 성재모 교수 연구실에서 제공받아, 주식회사 머쉬텍에서 인공 대량생산된 자실체를 건조하여 가늘게 세절한 후 냉동고에 보관하면서 시료로 사용하였고, 추출용매인 메탄올, 헥산, 부탄올 및 에틸 아세테이트 등의 유기용매들은 특급시약을 사용하였다.
번데기 동충하초 30g을 50℃ 드라이오븐에서 말린 후 블랜더로 잘게 갈아서 메탄올 500ml에 70℃에서 추출한 후 60℃에서 감압증류하여 메탄올 추출물(powder)을 얻었다. 메탄올 추출물 25g을 1L의 물에 녹인 후 헥산, 부탄올, 에틸 아세테이트 및 물 순으로 분획하였다. 각각의 분획물을 60℃에서 감압증류하여 용매를 완전히 날려서 농축물을 얻었으며, 수율을 계산하였다. (도 1 참조)
메탄올 추출물 60g으로부터 헥산 8.95g, 부탄올 3.24g, 에틸 아세테이트 0.78g, 물 32.04g의 분획물을 얻었으며 물 분획물의 수율이 53%로 가장 높았다. (표 1)
[표 1]
번데기 동충하초의 추출용매에 따른 수득율
메탄올 | 헥산 | n-부탄올 | 에틸 아세테이트 | 물 | |
추출용매의 양(ml) | 8000 | 2000 | 2000 | 6000 | - |
추출양(g) | 60 | 8.95 | 3.24 | 0.78 | 32.04 |
수득율(%) | 15(1) | 14(2) | 12(3) | 1.1(4) | 53(5) |
추출전의 시료의 양 ; 400g (1) ; (Methanol의 추출양 ÷추출전의 시료의 양) ×100 (2), (3), (4), (5) ; (각각의 추출양 ÷ethanol의 추출양) ×100 |
실험예 1: HPLC에 의한 각 분획물의 유효성분 확인
KNAUER(Wellchrom HPLC-pumpK-1001,Wellchrom fast scanning spectrophotometer K-2600, and 4 channel degasser K-500) 시스템을 사용하여 각 분획물에 대한 HPLC 분석을 진행하였다. 컬럼(column)은 Vydac C18을 사용하였으며, 용매는 3차 증류수와 아세토니트릴(Acetonitril)을 사용하였다. 시료는 모두 DMSO, 아세톤, 클로로포름에 녹인 후 사용하였고 각 분획물은 20ul씩 주입하였다.
각 추출물의 HPLC 패턴을 비교해 보면 메탄올 추출물은 major peak(retention time)이 13분-22분, 그리고 50분-74분 사이에서 나타났고, 헥산 분획물은 62분-76분 사이에, 부탄올 분획물은 49분, 에틸 아세테이트 분획물은 15분-22분, 물분획물은 10분-17분 사이에서 각각 나타났다. 이번에 사용된 컬럼은 역상(reverse phase)으로써, 극성이 가장 높은 물층의 major peak가 먼저 나왔고 그리고 순서대로 에틸 아세테이트, 부탄올 그리고 극성이 가장 낮은 헥산의 major peak가 가장 뒤에 나왔다.(도 2,3 참조) 따라서 HPLC에 의한 유효성분 비교실험 결과, 각 분획물이 서로 상이한 성분을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 2 : 각 분획물의 항암효과 측정
암세포주(cancer cell line)은 B16F10 (melanoma); 흑색종, HeLa (carcinoma); 자궁경부암, SK-OV3 (adenocarcinoma); 난소암, DU145 (carcinoma); 전립선암, K562 (lymphoma); 백혈병, Hep2 (hepatoblastoma); 간암, MKN-45 (stomach adenocarcinoma); 위암 그리고 A549 (lung carcinoma); 폐암 세포주를 사용하였다. 정상세포로는 NIH3T3 (fibroblast) ; 피부, 293 (embryonal kidney); 신장, CHO-K1 (hamster ovary); 햄스터 난소 세포주를 사용하였다. 모든 세포주는 10% FBS DMEM 또는 RPMI1640 medium [penicillin (100 units/ml), streptomycin (100 ㎍/ml)] 으로 키웠으며 배양 조건은 5% CO2, 37℃로 유지되는 incubator에서
배양하였다. 모든 세포주들은 서울대학교 세포주 은행 및 ATCC에서 구입 하였다.
각각의 분획물을 DMSO에 녹여, DMEM이나 RPMI1640 medium으로 희석하여 최종농도가 5, 10, 50, 100, 200ug/ml이 되게 만든다. 세포의 증식억제 실험을 하기 위해 부착성 세포주 및 비부착성 세포주의 96-well plate에 1x104 cells/well이 되도록 배양한다. 1일 후, 0.5% medium으로 24시간 동안 starvation시킨 후 샘플을 첨가하고 1일, 2일, 3일 후 3mg/ml MTT 시약(pH 7.4, PBS에 용해)을 주입한 후 3시간 동안 37℃ 에서 방치 후 이소프로판올(100ul)로 세포를 용해시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포증식 억제 정도를 정량화하였다. 항암 활성은 다음과 같은 방식으로 계산하였다.
항암(%)=100*OD570 of test/ OD570 of control.
실험 결과, 번데기동충하초의 메탄올추출물의 각 분획 중 부탄올 분획이 가장 강한 활성을 가진 것으로 모든 세포주에서 나타났다. (도 4 참조)
그 중 전립선암 세포주인 DU145 (IC50; 20ug/ml,48hr), 폐암세포주 A549 (IC50; 25ug/ml, 48hr), 림프구성 백혈병 세포주 K562 (IC50; 76ug/ml, 48hr) 그리고 자궁경부암(Hela), 난소암(SK-OV3), 흑색종(B16F10)순으로 세포증식 억제 효과가 강한 것으로 나타났다. 정상 세포주인 NIH3T3, 293, CHO-K1는 모두 실험에 사용된 농도에서 안정성을 보였다. (표 2)
[표 2]
번데기 동충하초 부탄올 분획의 암세포 및 정상세포에 대한 활성
메탄올추출물의 각 분획 중 핵산 분획 또한 항암 활성을 보였으나, 정상세포에 대한 독성을 나타내었으므로 앞으로의 항암물질 정제과정에서 제외하였다. 따라서 위 실험에서 여러가지 암세포주에 가장 항암 활성이 있는 분획이 부탄올 분획 이라는 것을 알 수 있었고 암세포에 특이적으로 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 부탄올 분획물의 정제에 의한 밀리타린의 분리
상기 실험예 2에서 가장 강한 항암활성이 확인된 부탄올 분획물에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 [Silica gel60(0.2~0.5), MERCK]를 7.5Cm X 30Cm 컬럼에 packing한 후 클로로폼 100% 에서 메탄올 100%로 순차적으로 흘려줌으로써 부탄올 분획의 1차 분리를 실시하였으며, 이 때 용매는 메탄올 : 클로로폼의 비율을 0:100, 20:80, 40:60, 60:40, 80:20, 100:0으로 단계적으로 변화시켰다.
1차 실리카겔 크로마토그래피를 통하여 얻어진 Si20 분획에 대하여 다시 2차 실리카겔 크로마토그래피를 실시하였다. 용매조건은 메탄올 : 클로로폼의 비율을 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 80:20으로 단계적으로 변화시켰다. 2차 실리카겔 크로마토그래피를 통하여 7개의 분획을 얻었으며, 각 분획의 생리활성을 확인한 결과, Si20/Si4 분획이 강한 항암 활성을 있음을 확인할 수 있었다.
Si20/Si1 분획에 대하여 세파덱스 컬럼 크로마토그래피 (Sephadex-LH20, 파마시아)을 2.5Cm X 100Cm 컬럼에 packing한 후 메탄올 100%로 흘려주었고, 그 후 HPLC를 통하여 최종 단일물질인 밀리타린을 얻을 수 있었다. (도5 참조)
실시예 3 : 밀리타린(militarin)의 구조 분석
밀리타린의 구조를 규명하기 위하여 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, FT-IR, LC-MS 등 여러 가지 분석을 진행하였다.
FT-IR에서 3500(-OH)cm-1의 넓고 매우 강한 흡광 스펙트럼을 확인할 수 있었으므로 여러 개의 OH기를 예상 할 수 있었다. 1H-NMR 분석에서 δ3.64ppm 스펙트럼은 1H~8H protone의 반복된 에톡시기를 확인할 수 있었고 δ3.3936ppm, δ3.4067ppm, δ3.4194ppm에서는 14H를, δ3.4622ppm δ3.4752ppm에서는 16H, 15H, 9H, 10H를, δ3.5330ppm, δ3.5393ppm, δ3.5462ppm에서는 11H를, δ3.5689ppm, δ3.5756ppm, δ3.5820ppm에서는 12H, 13H를, δ7.2764ppm, δ7.2583ppm, δ6.8428ppm, δ6.8211ppm에서는 17~20H(phenol grub)를, δ0.6719ppm에서는 29~37H를, δ1.2926ppm 에서는 21~26H를, δ1.6792ppm에서는 27H, 28H를 확인할 수 있었다.
결국 1H-NMR 스펙트럼을 통하여 밀리타린이 4개의 부분적 단위로 구성된(aliphatic grub, phenolic grub, open saccharide grub and poly ethoxy grub) 물질임을 예상할 수 있었다. 또한 13C-NMR 에서 나타난 δ55ppm ~ δ75 ppm은 전형적인 글루코스(glucose) 스펙트럼인데, 전체적으로 아래쪽으로 이동한 것으로 보아 전체적으로 open된 당의 형태임을 확인할 수 있었다. 최종적으로 hetero COSY 및 COSY를 통하여 전체적인 구조의 배열을 확인하였고 FAB-MS를 통하여 분자량이 MW634임을 확인할 수 있었다.(도 6,7,8,9 참조)
밀리타린(C32H58O12)의 구조식
실시예 4 : 밀리타린의 항암활성 검정
상기 실시예 3에서 확인된 본 발명 밀리타린에 대하여 MTT 방법으로 항암 활성을 검정하였다. 밀리타린의 항암효과와 비교하기 위해, 본 실험 중 밀리타리스동충하초에서 분리된 기존의 항암 활성물질인 F4p(코디세핀)과 시그마사(Sigma co)에서 구입한 코디세핀에 대한 MTT assay도 함께 실시하였다.
암세포는 B16F10(흑색종), DU145(전립선암) 그리고 HeLa(자궁경부암)이 사용되었고, 모든 세포주는 10% FBS DMEM 또는 RPMI1640 medium [penicillin (100 units/ml), streptomycin (100 ug/ml)] 으로 키웠으며 배양 조건은 5% CO2, 37℃로 유지되는 인큐베이터에서 배양하였다. 각 물질은 DMSO에 100mg/ml로 녹인 후 배지로 희석하여 최종농도가 5, 10, 50, 100 및 200 ug/ml가 되게 하여 투여하였다.
각각의 암세포의 50% 억제를 보이는 밀리타린의 농도는 B16F10(흑색종)은 8ug/ml, DU145(전립선암)은 5ug/ml 그리고 Hela(자궁경부암)은 4ug/ml이었고, 기존의 항암 활성물질인 코디세핀의 50%억제 농도는 B16F10(흑색종)은 70ug/ml, DU145(전립선암)은 25ug/ml 그리고 Hela(자궁경부암)은 12ug/ml이었다. F4p(코디세핀)과 시그마사에서 구입한 코디세핀의 항암 효과는 거의 같은 활성을 보였다. (도 10 참조)
실험의 결과, 새로운 항암 물질인 밀리타린이 기존의 번데기동충하초에서 분리된 코디세핀보다 월등한 항암효과를 지닌 물질임을 확인할 수 있었다.
상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명의 밀리타리스동충하초에서 분리된 밀리타린은 흑색종, 전립선암, 자궁경부암에 강한 세포독성을 나타내므로 항암제 조성물로서 이용할 수 있어 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 밀리타리스동충하초를 메탄올에 추출한 후 감압증류하여 메탄올 추출물을 얻고 이를 헥산, 부탄올, 에틸 아세테이트, 물 순으로 분획하는 과정을 도시한 것이다.
도 2는 HPLC를 이용하여 메탄올, 헥산 및 부탄올 분획을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HPLC를 이용하여 에틸 아세테이트, 물 및 DMSO를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 메탄올, 헥산, 부탄올, 에틸 아세테이트 및 물 분획의 흑색종, 전립선암 세포에 대한 항암효과를 실험한 후 그 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 밀리타리스동충하초로부터 최종적인 단일 물질들을 얻기 위해 1차, 2차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC를 통하여 정제하는 과정을 도시한 것이다.
도 6은 밀리타리스동충하초에서 최종 분리된 밀리타린의 1D NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 밀리타린의 COSY NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 밀리타린의 hetero COSY NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 밀리타린의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 밀리타리스동충하초에서 최종 분리된 F1(밀리타린)과 F4p(코디세핀) 그리고 시그마사(Sigma co)에서 구입한 코디세핀의 항암효과를 실험한 후 그 결과를 나타낸 그래프이다.
Claims (5)
- 하기의 구조식을 갖는 화합물.
- 제1항의 구조식을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 흑색종 억제용 조성물.
- 제1항의 구조식을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 전립선암 억제용 조성물.
- 제1항의 구조식을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 억제용 조성물.
- 밀리타리스동충하초를 말린 후 잘게 갈아서 메탄올로 추출한 후 감압증류하여 메탄올 추출물을 얻는 단계;상기 메탄올 추출물을 물에 녹인 후 헥산, 부탄올, 에틸 아세테이트 및 물 순으로 분획하고 각각의 분획물을 감압증류하여 용매를 날려서 농축물을 얻는 단계;부탄올 분획의 농축물에 대하여 1차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 2차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC를 차례로 실시하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 구조식을 갖는 화합물의 제조방법
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