KR100520315B1 - 해양성 와편모조류 린구로디늄 폴리에드룸으로부터 디에이치에이 및 이피에이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 최초로 해양성 와편모조류 린굴로디니늄 폴리에드룸(Lingulodinium polyedrum)을 농축, 또는 동결 건조하여 도코사헥사에노인산[Docosahexaenoic acid(DHA)]와 에이코사펜타에노인산[Eicosapentaenoic acid(EPA)] 건조물의 제조 및 린굴로디니늄 폴리에드룸을 저급 알코올 등의 유기 용매를 사용하여 고순도의 DHA 및/또는 EPA의 회수방법에 관한 것이다. 즉, 대량 배양된 와편모조류인 린굴로디니늄 폴리에드룸 세포를 동결 건조하여 수분을 제거한 후, 저급 알코올과 디클로로메탄의 혼합 용매로 추출하고, 얻어진 추출물을 감압하에서 용매를 증발시켜 얻어진 잔류물을 다시 저급 알코올과 헥산 용매로 분배 추출하여 얻어진 알코올층의 분획물을 증발시켜 용매를 제거한 다음, 그 잔류물을 에틸아세테이트와 물로 분배 추출하였다. 얻어진 에틸아세테이트층과 전 단계에서 얻어진 헥산 층을 합하고, 이를 감압 증발시켜 용매를 제거하여 얻어진 잔류물을 크로마토그래피로 정제하여 고순도의 DHA와 EPA를 높은 수율로 얻는 방법도 제공한다.

Description

해양성 와편모조류 린구로디늄 폴리에드룸으로부터 디에이치에이 및 이피에이의 제조방법 {PROCESS FOR PREPARING DHA AND EPA FROM LINGULODINIUM POLYEDRUM, MARINE FLAGELLUM ALGA}

본 발명은 해양성 와편모조류인 린굴로디늄 폴리에드룸을 이용한 DHA와 EPA의 생산에 관한 것이다. DHA와 EPA는 ω(오메가)-3계열의 불포화지방산이며, 상기 DHA와 EPA는 식품첨가제로 상용화되어 있다. 상기의 DHA는 뇌의 구성성분으로, 혈중지질(콜레스테롤, 중성지방)의 저하에 영향을 미치며, EPA는 혈소판 응고(혈액응고)억제, 콜레스테롤 개선, 두뇌 망막의 구성성분으로 알려져 있다(M. de U. A. Urquiza et al., Science, 2000, 290, 2140-2144; R. Uauy -Dagach et al., Prog. Food. Nutr. Sci., 1992, 16, 199-243). 지금까지 DHA와 EPA는 어유의 지방산으로부터 분리 정제하여 생산되어왔다. 어유로부터 DHA와 EPA의 분리 정제 방법은 특허 공보 JP9052866, GB2241503 CN12000369에 개시되어 있다. 상기의 특허 공보에 개시된 방법들은 어유 지방산으로부터 EPA 및 DHA를 주성분으로 하는 고도불포화지방산을 혼합물상태로 농축하는 유용한 방법이나, 이러한 방법들은 고순도의 DHA와 EPA를 분획하는 수단은 되지 못하고 있으며, 어유지방산으로부터 DHA 및 EPA를 경제적 및 효율적으로 대량 생산할 수 있는 방법으로는 적합하지 못하다.

전술한 바와 같이, 어유로부터 DHA 및/또는 EPA를 분리 생산하는 데는 어려움이 있고, 공정 단계가 길어 제조단가가 상승할 뿐만 아니라, 순도와 수율이 낮은 등 공업화하는데 여러 가지로 문제점이 있었다.

본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 해양 와편모조류인 린굴로디늄 폴리에드룸(Lingulodinium polyedrum; 이하, LP라 약칭한다)에 관하여 연구를 계속하여 오던 중, LP가 전체 유기물 건조중량의 약 20%에 이르는 DHPA와 EPA를 생산함을 발견하고, LP를 동결건조하여 DHA와 EPA의 건조품으로 상용으로 제공할 수 있으며, 또한 이를 분리 정제하여 DHA와 EPA를 고순도, 고수율로 회수할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 이르렀다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 DHA와 EPA의 대량 생산은, 추출시료인 린굴로디늄 폴리에드룸을 동결 건조하여 종래의 제품에 비하여 DHA와 EPA가 다량 함유된 건조품을 얻을 수 있다. 이 건조품은 인체에 무해하기 때문에 별도의 정제 과정을 거치지 않고, 식품으로 사용할 수 있다.

그러나, 고순도의 DHA와 EPA를 제조하기 위하여는 상기 건조품을 C_6-8 알칸/물, 에테르/물, 에틸아세테이트/물 등의 유기용매/물의 혼합용매 또는 저급 알코올과 디클로로메탄, 저급알코올/클로로포름 등의 혼합유기용매로 추출하고, 유기용매/물의 혼합용매로 추출한 경우 유기용매층을 감압증발시켜 얻어진 잔류물을 바로 크로마토그래피로 정제하거나, 또는 혼합유기용매로 추출한 경우 용매를 감압증발시켜 얻어진 잔류물을 다시 저급 알코올과 탄소수 6내지 8의 알칸으로 분배 추출하여 얻어진 저급 알코올층을 증발시킨 후, 그 잔류물을 다시 에틸아세테이트와 물로 분배 추출하여 얻어진 에틸아세테이트층을 다시 증발시킨 후, 용매가 탄소수 6 내지 8의 알칸과 에틸아세테이트인 추출물을 합쳐 크로마토그래피로 분리 정제하여 DHA와 EPA를 회수하는 과정으로 이루어진다.

상기에서 저급 알코올이란 탄소수 1∼3의 직쇄 또는 분지쇄의 알코올을 의미하고, 탄소수 6 내지 8의 알칸이란 헥산, 헵탄, 이소옥탄을 의미한다.

상기와 같은 추출방법에 의해서 추출시료인 LP의 유기용매층(탄소수 6 내지 8의 알칸과 에틸아세테이트층)의 건조중량의 10.2%에 해당하는 DHA와 건조중량의 8.14%에 해당하는 EPA를 회수할 수 있었다.

LP의 채집, 단종체 분리 및 대량배양 방법은 다음과 같다. 현장에서 채집한 시료들은 가능한 한 신속하게 실험실로 운반하여 해부현미경 또는 인버트 현미경 하에서 순수 분리시켰다. 처음 생시료를 6-웰 챔버에 넣고 마이크로피펫을 이용하여 적조생물을 분리하여 여러 번 희석한 후, 1 셀(cell)을 24-웰 챔버의 각 웰에 넣는 싱글 셀 분리법을 이용하여 린굴로디늄 폴리에드룸의 단종 배양체를 확립하였다. 단종 배양체를 계속 강화 f/2(Si) 배지(enriched f/2(-Si) medium)에서 배양하였다. 배양 조건은 다음과 같다. 온도는 15-25℃, 광도는 주로 약 50 -200 μEm^-2s^-1 연속광 하에서 배양하였다. 배양의 배지 교환 주기는 성장속도에 따라 다르나, 일반적으로 7일 내지 15일 이내에 새로운 배양액에 옮겨 주었다. 최종적으로 200ℓ 배양수조에서 세포수가 1㎖당 5000셀(cell) 정도가 될 때까지 배양한 후, LP 세포를 여과하여 분리하였다. 즉, 대량 배양한 린굴로디늄 폴리에드룸(300ℓ, 5316cells/㎖)을 CF/F(47 mm) 거름종이로 여과하여 배양세포를 분리하였다. 또 다른 분리 방법으로는 연속원심분리기를 이용하였다. 분리한 린굴로디늄 폴리에드룸 세포는 거름종이와 함께 동결 건조시킨 후, 상기 시료를 3번에 걸쳐 각각 저급 알코올/디클로로메탄(1/2)의 혼합 유기 용매 1000㎖로 상온에서 추출하였다. 이어서 상기의 추출물을 감압하에서 증발시켜 용매를 제거하여 잔류물을 얻고, 그 잔류물을 저급 알코올과 탄소수 6 내지 8의 알칸으로 1차 분배 추출하였다. 그 다음, 용매가 저급 알코올인 추출물을 감압하에서 증발시켜 잔류물을 얻고, 그 잔류물을 물과 에틸아세테이트로 2차 분배 추출하였다.

한편, 이상의 과정에서 극성정도가 각각 다른 용매, 즉, 물, 에틸아세테이트 및 n-헥산으로 추출하여 상기의 3가지 추출물을 얻었고, 이 들 각각에 대해서 코트랜스펙션 앗세이(cotransfection assay)를 이용한 RXR의 활성을 살펴 본 결과, 상기 3가지 추출물 중에서 n-헥산과 에틸아세테이트 추출물에서 RXR에 대한 활성을 보였다.

즉, 상기의 에틸아세테이트와 n-헥산의 추출물을 감압하에서 증발시켜 잔류물(1.29g)을 얻었다. 이 잔류물 1.29g은 C-18 역상 반-분취 HPLC 컬럼(C-18 reversed phase semi-preparative HPLC column(Vydac, 10 um, 250×10 mm, ELSD 검출기, 자외선 검출기 파장 210 nm , 용출 속도 3.0 ㎖/min)상에서 용리유체로 아세토니트릴: 0.01%TFA(6:4)을 사용하여 크로마토그래피하여 용출물을 얻은 다음, 그 용출물을 감압하에서 증발시켜 무결정 형태의 2종의 화합물(129mg, 105mg)을 얻었다. 상기에서 분리된 여러 물질에 대한 RXR 활성을 코트랜스팩션 앗세이를 통해 살펴본 결과, 이 두 물질이 RXR의 활성을 보임을 확인할 수 있었다.

여기서, 코트랜스팩션 앗세이란 동물세포를 5% 이산화탄소 환경 하에서 10%의 소혈청과 1%의 항생제를 첨가한 DMEM 배지에 하루 동안 배양하고, 배양된 세포에 인간의 핵수용체인 RXR 단백질 발현 유전자와 RXR에 의해서 조절되는 발광유전자를 포함하는 벡터를 세포 내에 주입하여 발현시킨 후에 추출물이나 화합물을 넣어 하루를 더 배양하고, 발광유전자의 발현 정도를 확인하여 핵수용체 RXR의 활성을 확인하는 보편적인 방법으로, 베타갈락토시데이즈 유전자를 이용하여 시료 첨가 시 나타나는 피펫팅의 오류를 보정한다.

(실시예)

이하, 실시예를 들어 본 발명의 방법을 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 (해양성 와편모조류인 린굴로디늄 폴리에드룸으로부터 DHA와 EPA의 생산)

린굴로디늄 폴리에드룸의 세포수가 1㎖당 5000셀 정도로 되면 세포배양액에서 LP 세포를 분리하였다. 분리된 LP 세포(여과법 또는 연속원심분리법)는 동결 건조한 후, 상기 시료를 3번에 걸쳐 각각 1:2 비율의 메탄올:디클로로메탄(CH₂Cl₂)의 혼합 유기 용매 1000㎖로 상온에서 추출하였다. 이어서 상기의 추출물을 감압하에서 증발시켜 잔류물을 얻고, 그 잔류물을 메탄올 1000㎖와 n-헥산 1000㎖으로 1차 분배 추출하였다. 그 다음, 용매가 메탄올인 추출물을 감압하에서 증발시켜 잔류물을 얻고, 그 잔류물을 물과 에틸아세테이트로 2차 분배 추출하였다. 여기서 얻어진 에틸아세테이트 층과 전단계의 n-헥산 층을 모아 최종적으로 용매를 감압 증류하여 얻어진 잔류물 1.29g은 C-18 역상 반-분취 HPLC 컬럼(C-18 reversed phase semi-preparative HPLC column(Vydac, 10 μm, 250×10mm, ELSD 검출기, 자외선 검출기 파장 210nm, 용출 속도 3.0 ㎖/min)상에서 용리유체로 아세토니트릴: 0.01%TFA(6:4)을 사용하여 크로마토그래피하여 용출물을 얻은 다음, 그 용출물을 감압하에서 증발시켜 무결정 형태의 두 화합물 DHA(129 mg) 및 EPA(105 mg)을 얻었다.

상기 무결정 화합물들(129 mg, 105 mg)의 동정(同定)과정은 DHA와 EPA의 표준 시료의 ¹H-NMR 스펙트럼(도 2 및 도 6)과의 실시예에서 얻은 DHA EPA의 ¹H-NMR 스펙트럼(도 1 및 도 5) 및 DHA와 EPA의 표준 시료의 LRCIMS 스펙트럼(도 4 및 도 6) 및 상기 실시예에서 얻은 DHA EPA의 LRCIMS 스펙트럼(도 3 및 도 7)의 결과를 분석함으로써 이루어졌다.

즉, ¹H-NMR 스펙트럼의 해석 결과, 상기 실시예에서 얻어진 2종의 물질(물질 A와 B라 한다)은 불포화 지방산 계열임을 확인할 수 있었으며, MS에서 물질 A의 m/z [M+H]⁺는 328.10, B의 m/z [M+H]⁺는 303.15 ion peak를 확인할 수 있었다. 이 자료로부터 지금까지 알려진 불포화지방산 계열들의 ¹H-NMR 스펙트럼과 Mass data를 비교 분석한 결과, 물질 A는 DHA, 물질 B는 EPA임을 확인할 수 있었다.

상기 화합물들(129 mg, 105 mg)과 표준 시료 DHA와 EPA에 대해서 NMR 실험을 하였는데, 클로로포름-d, 메탄올-d ₄ 등의 용매에서 상기 화합물의 NMR 스펙트럼을 확인한 결과 클로로포름-d에서 피크의 분리가 가장 좋았다. 상기 무결정 화합물들과 표준시료인 DHA와 EPA의 ¹H-NMR 실험을 통하여 상기 무결정 화합물들의 구조들이 DHA와 EPA임을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 화합물(129 mg)에 대해서 LRCIMS를 측정해 본 결과 m/z 329.10에서 [M+H]⁺이온이 확인되었는데, 이는 표준 시료의 DHA의 m/z와 일치하였다. 상기의 다른 화합물(105 mg)에 대해서 LRCIMS를 측정해 본 결과, m/z 303.15에서 [M+H]⁺이온이 확인되었는데, 이는 표준 시료의 DHA의 m/z와 일치하였다.

이상의 실험에 근거하여 상기 화합물들(129 mg, 105 mg)은 DHA, EPA와 동일한 물질임이 확인되었다.

린굴로디늄 폴리에드룸에서 분리정제한 DHA와 EPA는 각각 추출된 유기물 건조중량의 10.2%와 8.14%에 해당하였다.

본 발명에 의하면 해양성 와편모조류인 린굴로디늄 폴리에드룸으로부터 간단하게 DHA와 EPA의 건조물을 얻을 수 있다. 또한, 이 건조물을 유기 용매로 추출하여 효과적이고도 경제적이며, 고순도 및 고수율의 DHA 및/또는 EPA를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 하는 의약 및 건강식품을 고순도로 저렴하게 제공할 수 있는 제조하는 유용한 발명이다.

도 1은 린굴로디늄 폴리에드룸에서 분리한 DHA의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 2는 표준시료 DHA의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 3은 린굴로디늄 폴리에드룸에서 분리한 DHA의 LRCIMS를 나타낸다.

도 4는 표준시료 DHA의 LRCIMS을 나타낸다.

도 5는 린굴로디늄 폴리에드룸에서 분리한 EPA의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 6은 표준시료 EPA의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 7은 린굴로디늄 폴리에드룸에서 분리한 EPA의 LRCIMS를 나타낸다.

도 8은 표준시료 EPA의 LRCIMS을 나타낸다.

Claims (3)

1. 대량 배양된 와편모조류인 린굴로디니늄 폴리에드룸 세포를 동결 건조시킴을 특징으로 하는 DHA와 EPA의 건조물의 제조방법.
2. 제 1항 기재의 DHA와 EPA의 건조물을 저급 알코올/디클로로메탄, 저급 알코올/클로로포름의 혼합유기용매로 추출하고, 용매를 감압 증발시켜 얻어진 잔류물을 다시 저급 알코올/C6-8알칸 용매로 분배 추출하여 저급 알코올층의 분획물을 얻고, 이를 증발시켜 용매를 제거한 다음, 그 잔류물을 에틸아세테이트/물로 분배 추출하고, 얻어진 에틸아세테이트층과 상기 C6-8알칸 층을 합한 후, 이를 감압 증발시켜 얻어진 잔류물을 크로마토그래피로 분리 정제시킴을 특징으로 하는 고순도의 DHA 및 EPA의 제조방법.
3. 제 1항 기재의 DHA와 EPA의 건조물을 C6-8알칸/물, 에테르/물, 에틸아세테이트/물의 유기용매/물의 혼합용매로 추출하고, 유기용매층을 감압증발시켜 얻어진 잔류물을 크로마토그래피로 분리 정제시킴을 특징으로 하는 고순도의 DHA 및 EPA의 제조방법.