KR100512384B1 - 포도 껍질에서 추출한 천연염색염료 - Google Patents

Abstract

포도로부터 껍질을 분리하여 교반하고, 소정 시간동안 실온에서 저장하여 원심분리로 포도껍질 액을 추출하고 이를 침전시켜서 상층 용액을 분리하여 제조되며, DNA 염색제 또는 생체조직 염색제로써 사용되는 것을 특징으로 하는 천연염색염료가 개시된다. 따라서, 천연의 포도 껍질에서 추출한 염색 염료는 무독성이고 환경 친화적인 염색 염료일 뿐만 아니라, DNA을 비롯한 각종 조직을 모두 염색할 수 있다.

Description

포도 껍질에서 추출한 천연염색염료{Natural dye material extracted from outer surface of grapes(GE)}

본 발명은 DNA 및 각종 조직을 염색할 수 있는 천연물 유래의 염색 염료에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 천연물 유래의 포도 껍질에서 추출한 추출 용액을 DNA 및 각종 조직의 염색 염료로 사용함으로써 DNA 및 각종 조직을 모두 염색할 수 있으며, 무독성이고, 환경 친화적인 천연 염색 염료에 관한 것이다.

DNA 및 각종 조직 등을 관찰하기 위해서는 먼저 관찰 대상을 염색해야 한다. 이러한 관찰 대상을 염색하는 염색 염료는 일반적으로 복합 유기 화학적으로 제조되며, 성능에서 종종 어떤 변이원성(變異原性) 등에 따라서 다양한 등급으로 분류된다. 이러한 다양한 등급 중에서 가장 비독성인 염색 염료를 DNA, 조직 및 세포 복합물에 대한 염색 염료의 사용 등급으로 분류되었다.

일반적으로 DNA를 염색하기 위한 염색 염료로는 DNA 염색 염료를 사용하며, 조직을 염색하기 위한 염색 염료로는 Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색 염료 등을 사용하였다. 그러나, 이와 같은 DNA 및 각종 조직의 염색 염료는 하나의 염색 염료로서 DNA를 비롯한 각종 조직을 모두 염색할 수 없기 때문에 염색물의 대상에 따라 적용되는 별도의 염색 염료를 필요하였다.

또한 이들 염색 염료의 대부분은 독성 및 악취를 포함하고 있으며, 어떤 것은 손 또는 옷에 묻은 후에 그 반점을 지울 수 없는 것도 있었다. 따라서 이러한 염색 용액을 취급하기 위해서는 숙달된 기술과 조심성이 요구되었다.

본 발명은 목적은 DNA를 비롯한 각종 조직을 모두 염색할 수 있으며, 무독성이고, 환경 친화적인 염색 염료를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 각종 조직을 염색하는 경우에 고정제를 이용하지 않고 염색 염료와 염색 대상만을 혼합하여 충분하게 염색할 수 있는 염색 방법을 제공하는데 있다.

포도로부터 껍질을 분리하여 교반하고, 소정 시간동안 실온에서 저장하여 원심분리로 포도껍질 액을 추출하고 이를 침전시켜서 상층 용액을 분리하여 제조되며, DNA 염색제 또는 생체조직 염색제로써 사용되는 것을 특징으로 하는 천연염색염료가 개시된다.이하, 본 발명을 실시예 및 비교예와 연결시켜 상세히 설명하면 다음과 같으며, 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

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< 시료의 제조>

1. 포도 껍질(GE)로부터 GE 염색 염료의 제조

포도 포도 껍질을 채취하여 팽팽하게 균질화하고, 이를 대략 10분 동안 격렬하게 교반한다. 상기 교반에 의해 포도껍질에서 포도껍질의 액이 추출되며, 이 포도껍질 및 포도껍질에서 추출된 액의 혼합물을 대략 10분 정도 실온에서 저장한 후, 1시간 동안에 약 16000g로 원심분리한다. 원심분리 후, 상기 포도껍질 및 포도껍질에서 포도껍질 만을 분리하여 포도껍질로부터 추출된 포도껍질 액을 얻은 다음, 상기 포도껍질 액으로부터 상층 용액을 추출하여 약 4℃에서 저장한다. 상기 상층 용액의 추출은, 예를 들어, 포도껍질 액을 일정 시간 방치하여 침전을 시키면 비중이 무거운 침전물은 밑으로 가라앉고 순수한 액체 성분만 위로 뜨게 되며, 여기서 침전물을 제외한 순수한 액체성분만을 상층 용액으로 분리할 수 있다.

2. DNA 시료의 제작

DNA(Promega, PCR mixture, PCR product, λHind III, λEcoR I/Hind III로부터 제조)를 Seakem LE 아가로스(Rockand, Maine USA)를 사용하여 1.5% 겔로 만들어 사용한다.

3. 조직 시료의 제작

쥐(300g)에서 간장, 허파, 폐, 뇌, 비장, 신장 등의 조직을 채취한다. 채취한 조직을 알맞은 중간물에 넣고, 투과하여 관찰할 수 있도록 얇은 조각으로 단면화하고, 용이한 처리 및 염색을 위하여 고정법을 사용한다. 광학 현미경에서 일반적인 염료고정제로서 중성 완충 포르말린을 사용하여, 교차결합 단백질을 조직의 살아 있는 것과 같은 형상을 유지시킨다. 조직에 포함되어 있는 많은 물은 50% 알코올로부터 100% 알코올까지 등급이 증가하는 알코올욕을 사용하여 제거하고, 조직은 용융 파라핀과 혼합할 수 있는 화학물질인 크실렌으로 처리한다. 조직에서 세포 겹침과 세포외 혼합을 구별하기 위하여 조직을 파라핀에 완전히 스며들 때까지 넣은 후에 단면으로 절단한다.

조직의 블록이 과잉의 삽입물질로 제거된 후에 마이크로톰으로 각 단면의 두께를 약 2μm가 되도록 절단한다. 접착제로 피복된 유리 슬라이드 위에 고정시키고, 65℃에서 30분간 방치한 후에 사용한다.

<실시예>

실시예 1. 포도(GE) 껍질에서 추출한 염색 염료를 이용한 DNA의 염색

제작한 DNA 시료인 λHind III DNA 0.25ug, 0.5ug, 0.75ug, 1ug, 1.25ug을 같은 량의 GE 염료 용액에 혼합하고, 1.5% 한천겔을 GE 염료 용액에 혼합하였다. 그 위에 λHind III DNA의 농도 차이에 따른 염색능력을 확인하기 위하여 전기영동하였다. 전기영동 후, 겔을 ddH₂O에 5분 동안 세척하고, 적당한 Et-Br 용액에 침지하였다.

비교예 1. Blue/Orange 6X 염색 염료를 이용한 DNA의 염색

실시예 1과 동일하게 λHind III DNA 0.25ug, 0.5ug, 0.75ug, 1ug, 1.25ug을 같은 량의 DNA 염색 염료인 Blue/Orange 6X 염료 용액과 혼합(promega)하고, 1.5% 한천겔을 혼합하였다.

실시예 1 및 비교예 1의 결과 비교 분석

도 1a는 1.5% 아가로스 전기영동한 것으로 Blue/Orange 6X 염색 염료와 GE 염색 염료로서 염색하고, 자외선 조사 후의 형광 밴드 차를 나타낸 모습이다. 이때, 1~4는 Blue/Orange 6X 염색 염료를 사용한 것이고, 5~8은 GE 염색 염료를 사용한 것이다. 도 1b는 Blue/Orange 6X 염색 염료와 GE 염색 염료의 농도를 비교한 것이다. 이때, 1~5는 Blue/Orange 6X 염색 염료를 사용한 것이고, 6~10은 GE 염색 염료를 사용한 것이며, 1, 6은 0.25ug, 2, 7은 0.5ug, 3, 8은 0.75ug, 4, 9는 1ug 및 5, 10은 1.25ug을 사용한 것이다.

도 1a 및 도 1b와 같이 GE 염색 염료는 1,000 염기쌍 DNA 이상에서 Blue/Orange 6X 염색 염료와 거의 같은 형광 밴드를 갖으며 유사하게 염색되고, 1,000 염기쌍 DNA 이하에서 Blue/Orange 6X 염색 염료보다 염색능력이 다소 약하였다. 그러나 GE 염색 염료의 기능 및 양적인 차이는 종래 염색 염료인 Blue/Orange 6X 염색 염료와 거의 없다. 단지 1,000 염기쌍 DNA 이하에서 염색능력이 조금 떨어지는 것은 GE 염색 염료가 포도당 특성을 갖으며, 글리세롤과 매우 유사한 점성 특성을 갖기 때문이다. 따라서, 자연물인 GE 염색 염료는 그들의 복합이온이 DNA 및 DNA 상호작용에 영향을 미치는 것을 파악된다. 이와 같이 GE 염색 염료는 종래 염색 염료와 같은 형광 밴드를 갖고, DNA 농도의 양에 대해 약간 다른 민감대를 갖는다. 염색 염료의 민감대에서 GE 염색 염료의 민감대는 종래의 염색 염료와 쉽게 구별된다.

실시예 2. 포도(GE) 염색 염료를 이용한 조직의 염색

조직의 제작과정과 같이 쥐에서 채취한 간장, 심장, 폐, 뇌, 비장 및 신장 등의 장기 조직을 4시간 동안 10%의 중성 완충제 포르말린 용액에 응고시킨다. 이 후에 조직을 인산염완충식염수(PBS)으로 세척하였다. 각 조직을 파라핀에 담그고 4μm으로 절단하였다. 그 후, GE 염색 염료를 사용하여 염색하였다.

비교예 2. H&E 염색 염료를 이용한 조직의 염색

실시예 3과 동일한 쥐에서 채취한 간장, 심장, 폐, 뇌, 비장 및 신장 등의 장기 조직을 동일한 조건하에서 Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색 염료를 이용하여 염색하였다.

비교예 3. GE 염색 염료와 H&E 염색 염료를 모두 이용한 조직의 염색

실시예 3과 동일한 쥐에서 채취한 간장, 심장, 폐, 뇌, 비장 및 신장 등의 장기 조직을 동일한 조건하에서 먼저 H&E 염색 염료를 이용하여 염색하고, GE 염색 염료로서 다시 염색하였다.

실시예 2, 비교예 2 및 비교예 3의 결과 비교

GE 염색 염료와 H&E 염색 염료를 사용한 조직의 염색 사진은 도 2a~2r과 같다. 도 2a, 2d, 2g, 2j, 2m, 2p는 H&E 염색 염료로 염색된 조직이고, 도 2b, 2e, 2h, 2k, 2n, 2q는 GE 염색 염료로 염색된 조직이며, 도 2c, 2f, 2i, 2l, 2o, 2r은 GE 염색 염료와 H&E 염색 염료로 함께 염색된 조직이다. 이 때, 도 2a, 2b, 2c는 폐조직의 염색사진이고, 도 2d, 2e, 2f는 비장조직의 염색사진이고, 도 2g, 2h, 2i는 간장조직의 염색사진이며, 도 2j, 2k, 2l은 신장조직의 염색사진이고, 도 2m, 2n, 2o는 심장조직의 염색사진 및 2p, 2q, 2r은 뇌조직의 염색사진이다.

본 실시예 및 비교예에서 GE 염색 염료와 H&E 염색 염료의 염색감도 및 염색 조직의 차이는 없으나 GE의 염색 과정이 H&E 염색 염료의 염색과정보다 빠르다. 사진과 같이, 각 부분의 염색특성에서 차이점이 나타난다. 즉, H&E 염색 염료로 염색된 핵은 어두운 파란색이고, 세포질 및 연결 조직 섬유 모두는 분홍-빨간색이다. GE 염색 염료 + H&E 염색 염료를 사용할 때에는 폐, 비장 및 신장의 부위의 세포질에서 노란색으로 염색된다. GE 염색 염료를 사용했을 때에는 각 조직의 세포기질, 세포질 및 핵 세부를 좀더 명확하게 염색할 수 있다. 비장의 각 부분은 가장 큰 임파선 조직으로 나타낸다. GE 염색 하에서 비장 및 간장의 현미경 검사는 면역세포와 근접하게 유사한 검사이다.

또한 표 1과 같이 폐, 신장, 간장, 신장, 심장 및 뇌조직의 각 부분에 대하여 핵, 세포질, 콜라겐 등을 염색할 수 있는 H&E 염색 염료에 비하여 GE 염색 염료는 폐에서 세포기질, Lysozome을 더 염색할 수 있고, 비장에서 면역세포, 세포기질 및 Lysozome을 더 염색할 수 있으며, 간장에서는 세포기질, Lysozome, 형질세포, 림프구 및 대식세포를 더 염색하고, 심장에서는 세포기질 및 Lysozome을 더 염색하며, 뇌에서는 세포기질 및 Lysozome을 더 염색할 수 있다. 따라서, 각 조직의 염색에서 GE 염색 염료의 사용 분야는 매우 다양함을 알 수 있다.

GE 및 H&E 염색 염료의 각 조직별 염색 특성

조직	GE 염색 염료	H&E 염색 염료
폐	세포기질, Lysozome, 세포질, 핵	핵, 세포질, 콜라겐
간장	세포기질, Lysozome, 형질세포, 림프구, 핵, 세포질, 대식세포	핵, 세포질, 콜라겐
비장	면역세포, 세포기질, Lysozome, 세포질	핵, 세포질, 콜라겐
심장	세포기질, Lysozome, 세포질, 핵	핵, 세포질, 콜라겐
뇌	세포기질, Lysozome, 세포질, 핵	핵, 세포질, 콜라겐

이와 같이, 본 발명의 포도 껍질에서 추출한 염색 염료는 DNA를 비롯한 각종 조직의 염색에 모두 사용할 수 있다. 따라서, 종래의 염색 염료와 같이 필요한 부위에 따라서 다양한 염색 염료가 필요 없다.

또한 본 발명의 염색 염료는 조직을 염색하는 경우에도 종래 염색 염료와 비교하여 임파선, 면역세포, 림프구 등 다양한 부위의 염색이 가능하다.

또한, 천연의 포도 껍질 껍질에서 추출한 염색 염료는 무독성으로 제조가 간편할 뿐만 아니라, 염료가 무독성임에 따라 종래와 같이 염색을 위한 조직의 전처리 등도 불필요하며, 조직의 손상도 적은 환경 친화적인 천연 염색 염료를 얻을 수 있다.

도 1a는 종래의 Blue/Orange 6X 염색 염료와 본 발명의 포도(GE) 염색 염료로서 염색한 λ Hind III DNA의 형광 밴드 차이를 나타낸 도면이다.

도 1b는 종래의 Blue/Orange 6X 염색 염료와 본 발명의 포도(GE) 염색 염료로서 염색한 λ Hind III DNA의 농도 차이를 나타낸 도면이다.

도 2a ~ 2r은 종래의 H&E 염색 염료와 본 발명의 포도(GE) 염색 염료를 사용한 각 조직의 염색 효과를 비교한 사진이다.

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3. 포도로부터 껍질을 분리하여 교반하고, 소정 시간동안 실온에서 저장하여 원심분리로 포도껍질 액을 추출하고 이를 침전시켜서 상층 용액을 분리하여 제조되며, DNA 염색제 또는 생체조직 염색제로써 사용되는 것을 특징으로 하는 천연염색염료.
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