KR100502275B1

KR100502275B1 - Methods for quantitative determination of serum enzymes using immunoassay and methods for diagnosis of hepatic disease thereby

Info

Publication number: KR100502275B1
Application number: KR10-2002-0053113A
Authority: KR
Inventors: 최의열; 정소영; 김광중; 최성아; 김정수; 김현미; 안미애
Original assignee: 바디텍메드 주식회사
Priority date: 2002-09-04
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2005-07-20
Also published as: KR20040021768A

Abstract

본 발명은 면역분석법을 이용한 혈청 효소의 정량적 측정방법 및 이 방법을 이용한 간 질환 검사방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 혈청 효소, 특히 알라닌 아미노전이효소(ALT) 또는 아스팔테이트 아미노전이효소(AST)에 대한 단일클론 항체를 이용하여 샌드위치 효소매개면역분석법(ELISA)으로 피검체의 혈액 시료와 반응시켜 이 시료 중에 존재하는 ALT 또는 AST 단백질을 측정하는 것을 포함하여, 피검체의 혈액내 ALT 또는 AST를 정량적으로 측정하는 방법; 상기 선발된 단일클론 항체를 이용하여 샌드위치 효소매개면역분석법으로 피검체의 혈액 시료와 반응시켜 이 시료 중에 존재하는 ALT- 또는 AST-항체 복합체의 농도를 측정하는 것을 포함하여, 피검체의 혈액내 ALT- 또는 AST-항체 복합체를 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 돼지의 ALT 또는 AST 단백질을 항원으로 이용하여 샌드위치 효소매개면역분석법으로 피검체의 혈액 시료와 반응시켜 시료 중의 항-ALT 또는 항-AST 자가항체의 존재 및 농도를 측정하는 것을 포함하여, 피검체의 혈액내 ALT 또는 AST에 대한 자가항체를 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 효소-항체 복합체 측정방법에 따라 간 질환이 의심되는 피검체의 혈액 시료를 분석하여 측정된 AST- 또는 ALT-항체 복합체 수치 및 상기 자가항체 측정방법에 따라 측정된 자가항체 수치에 근거하여 간 질환을 검사하는 방법을 제공한다. 또한, 전술한 단일클론 항체를 이용하여 병명을 이미 알고 있는 간 질환자 및 정상인 혈액내의 ALT 또는 AST에 대한 효소-항체 복합체를 그 항체 유형별로 샌드위치 효소매개분석법(ELISA)으로 정량적으로 측정한 뒤, 각 혈액내 그 항체 유형별 정량적 측정치와 그 항체의 생화학적 효소활성도 측정치를 상호관련시켜 확인한 각 항체유형별 상호관련성 특이성 패턴을 기본 패턴으로 삼아, 미지의 환자 혈액에 존재하는 효소-항체 복합체의 항체유형별 정량적 측정치와 생화학적 효소활성도 측정치를 상기 기본 패턴과 비교함으로써 간 질환의 여부 내지는 간 질환의 진행정도를 검사하는 방법을 제공한다.The present invention relates to a method for quantitative determination of serum enzymes using an immunoassay method and a method for testing liver disease using the method. More specifically, it reacts with blood samples of subjects by sandwich enzyme mediated immunoassay (ELISA) using monoclonal antibodies against serum enzymes, in particular alanine aminotransferase (ALT) or asphaltate aminotransferase (AST). Quantitatively measuring ALT or AST in the blood of a subject, including measuring the ALT or AST protein present in the sample; The ALT- or AST-antibody complex present in the sample is measured by reacting with the blood sample of the subject by a sandwich enzyme-mediated immunoassay using the selected monoclonal antibody. Or alternatively, a method for quantitatively measuring an AST-antibody complex. In addition, the present invention includes the use of the pig ALT or AST protein as an antigen to react with the blood sample of the subject by sandwich enzyme-mediated immunoassay to determine the presence and concentration of anti-ALT or anti-AST autoantibodies in the sample Thus, the present invention provides a method for quantitatively measuring autoantibodies against ALT or AST in blood of a subject. In addition, the present invention is an AST- or ALT-antibody complex value measured by analyzing blood samples of a suspected liver disease according to the enzyme-antibody complex measuring method and the autoantibody value measured according to the autoantibody measuring method Provides a method for testing liver disease based on. In addition, by using the above-described monoclonal antibody, enzyme-antibody complexes for ALT or AST in liver disease and normal blood of known liver disease were quantitatively measured by sandwich enzyme mediated assay (ELISA) for each antibody type, and then each Quantitative measurements of the enzyme-antibody complexes in the unknown patient's blood, based on the interspecific specificity pattern of each antibody type identified by correlating the quantitative measurement of the antibody type in the blood with the measurement of the biochemical enzyme activity of the antibody. By comparing the biochemical enzyme activity measurements with the basic pattern provides a method for examining the progress of liver disease or liver disease.

이 방법들에 따르면, 정확하게 간 질환 내지는 간 질환 진행정도를 검사할 수 있으며, 특히 효소활성도 측정법에 의한 임상 검사시 특이성이 낮아 적용할 수 없던 만성적인 간 질환 진단에도 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대한다.According to these methods, it is possible to accurately test the progress of liver disease or liver disease, and in particular, it is expected that it can be effectively used for the diagnosis of chronic liver disease, which cannot be applied due to its low specificity in clinical tests by enzyme activity assay. .

Description

METHODS FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF SERUM ENZYMES USING IMMUNOASSAY AND METHODS FOR DIAGNOSIS OF HEPATIC DISEASE THEREBY}

본 발명은 면역분석법을 이용한 혈청 효소 또는 이에 대한 자가항체 또는 효소-항체 복합체의 정량적 측정방법 및 이 방법을 이용한 간 질환 검사방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 혈청 효소, 특히 알라닌 아미노전이효소(ALT) 또는 아스팔테이트 아미노전이효소(AST)에 대한 단일클론 항체를 이용하여 샌드위치 효소매개면역분석법으로 혈액 시료를 반응시켜 자가항체와 결합하지 않은 혈청 효소 ALT 또는 AST 단백질을 정량적으로 측정하거나; ALT 또는 AST에 대한 단일클론 항체를 이용하여 샌드위치 효소매개면역분석법으로 혈액 시료를 반응시켜 효소-항체 복합체를 정량적으로 측정하거나; 또는 ALT 또는 AST 항원에 대한 자가항체를 샌드위치 효소매개면역분석법으로 정량적으로 측정하는 방법 및 이 방법들을 이용한 간 질환 내지는 간 질환 진행정도를 검사하는 방법을 제공한다.The present invention relates to a method for quantitative measurement of serum enzymes or autoantibodies or enzyme-antibody complexes thereof using immunoassay and liver disease testing using the method. More specifically, blood samples are reacted by sandwich enzyme-mediated immunoassays using monoclonal antibodies against serum enzymes, in particular alanine aminotransferase (ALT) or asphaltate aminotransferase (AST), to bind autoantibodies. Quantitatively measuring serum enzyme ALT or AST protein; Quantitatively measuring enzyme-antibody complexes by reacting blood samples with sandwich enzyme mediated immunoassays using monoclonal antibodies against ALT or AST; Alternatively, the present invention provides a method for quantitatively measuring autoantibodies against ALT or AST antigen by sandwich enzyme-mediated immunoassay, and a method for examining liver disease or liver disease progression using these methods.

보고에 따르면, 전 세계적으로 약 5억 여명이 간염 바이러스에 만성적으로 감염되어 있는 것으로 추측되고 있다. 간경화는 세계적으로 주요 사망 원인들 중 하나를 차지하고 있으며, 간경화를 일으키는 주요 원인들 중 하나로 만성적인 C형 간염바이러스의 감염을 들고 있다. 간암 역시 전 세계적으로 다섯번째의 암 사망률을 기록하고 있으며, 사망자의 대부분이 아시아와 아프리카에서 나타나고 있다. 그렇기 때문에, 간 질환에 대한 정확한 조기진단은 간경화나 간암으로 인한 사망률을 낮추는데 있어서 많은 기여를 할 것으로 기대한다.It is estimated that around 500 million people worldwide are chronically infected with the hepatitis virus. Liver cirrhosis is one of the leading causes of death worldwide and one of the leading causes of cirrhosis is the chronic hepatitis C virus infection. Liver cancer is also the fifth most common cancer mortality worldwide, with most deaths occurring in Asia and Africa. Therefore, accurate early diagnosis of liver disease is expected to contribute to lower mortality from cirrhosis and liver cancer.

과거로부터 지속적으로 발전해온 생화학적 분석방법의 꾸준한 도입으로, 지금까지 약 50여종 이상의 효소가 간 질환을 비롯한 여러 가지 임상검사에 사용되어 왔다. 임상검사 항목에 있어서 GOT(글루타메이트-옥살아세테이트 아미노전이효소)와 GPT(글루타메이트-피루베이트 아미노전이효소) 검사로 불리던 항목은 각각 AST(아스팔테이트 아미노전이효소), ALT(알라닌 아미노전이효소)라고도 불려지며, 현재는 GOT/GPT 보다 AST/ALT라는 용어를 주로 사용한다.With the continuous introduction of biochemical assays that have been developed continuously in the past, more than 50 enzymes have been used in various clinical tests including liver disease. In the clinical test items, the GOT (glutamate-oxalacetate aminotransferase) and GPT (glutamate-pyruvate aminotransferase) tests were also referred to as AST (asphatate aminotransferase) and ALT (alanine aminotransferase), respectively. It is called and currently uses the term AST / ALT rather than GOT / GPT.

1950년대 중반에 AST와 ALT 효소활성도(enzyme activity) 수치를 진단 항목의 하나로 사용하기 시작하였으며, AST/ALT 비율의 측정방법은 1955년 드 리티스(de Ritis)에 의해 처음으로 제시되었다. 1961년 플레이셔(Fleisher)와 와킴(Wakim)에 의해 두 가지 형태, 즉 세포질형과 미토콘드리아형의 AST 단백질이 존재한다는 것이 보고되었으며, 1960년대 후반, 보이드(Boyde)와 이데오(Ideo) 등에 의해 혈청 미토콘드리아형 AST를 측정하여 진단에 적용하려는 시도가 있었다. 1980년대, 항체제조기술의 발달로 각 효소의 이소자임(isozyme)에 대한 항체를 제작하여 면역학적 방법으로 혈중 AST 및 ALT를 측정하려는 연구가 활발해졌으며, 면역학적 진단방법개발의 시도가 시작되었다. 이와 같이 ALT와 AST는 1950년대 중반에 처음 소개되어 반세기가 넘도록 임상검사에서 꾸준히 사용되고 있다.In the mid-1950s, AST and ALT enzyme activity levels were used as one of the diagnostic items, and the method for measuring the AST / ALT ratio was first presented by de Ritis in 1955. In 1961, Fleisher and Wakim reported the existence of two types of AST proteins, cytoplasmic and mitochondrial, and in the late 1960s by Boyde and Ideo et al. Attempts have been made to measure and measure serum mitochondrial AST. In the 1980s, with the development of antibody manufacturing technology, researches to prepare antibodies for isozyme of each enzyme and to measure blood AST and ALT by immunological methods have been active, and attempts to develop immunological diagnostic methods have begun. As such, ALT and AST were first introduced in the mid-1950s and have been used in clinical tests for over half a century.

아미노전이효소란 아미노산으로부터 아미노기를 떼어내 옥소 엑시드(oxo acid)로 전달하는(가역반응) 효소를 말하며, 50여가지 이상이 알려져 있다. AST와 ALT 효소가 매개하는 반응식은 다음과 같다.An aminotransferase refers to an enzyme that removes an amino group from an amino acid and transfers it to oxo acid (reversible reaction), and more than 50 kinds are known. The reaction mediated by the AST and ALT enzymes is as follows.

ASTAST

L-아스팔테이트 + 2-옥소글루타레이트↔ 옥살로아세테이트 + L-글루타메이트L-asphatate + 2-oxoglutarate↔ oxaloacetate + L-glutamate

ALTALT

L-알라닌 + 2-옥소글루타레이트 ↔ 피루베이트 + L-글루타메이트L-alanine + 2-oxoglutarate ↔ pyruvate + L-glutamate

즉, ALT는 알라닌과 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate) 사이에 가역적인 아미노전이반응(transamination)을 촉매하여 피루베이트(pyruvate)와 글루타메이트 (glutamate)가 생성되게 하며, 포도당과 아미노산의 중간대사(intermediary metabolism)에서 중요한 역할을 담당한다. 반면에 AST는 아스팔테이트와 2-옥소글루타레이트 사이의 가역적인 아미노전이반응에 의한 옥살로아세테이트 (oxaloacetate)와 글루타메이트 생성반응을 촉매한다.In other words, ALT catalyzes the reversible aminotransamination between alanine and 2-oxoglutarate, resulting in the production of pyruvate and glutamate, and intermediates between glucose and amino acids. It plays an important role in intermediary metabolism. AST, on the other hand, catalyzes the production of oxaloacetate and glutamate by the reversible aminotransition reaction between asphaltene and 2-oxoglutarate.

이들 두 효소는 각각 세포질형(cytosolic)과 미토콘드리아형(mitochondrial)으로 나누어지며, 체내 대부분의 기관에 널리 분포되어 있다. 이로 인해 여러 가지 질병의 진단에 넓게 활용될 가능성이 있지만, 상대적으로 특정 질환에 대한 특이성은 떨어지는 것으로 알려져 있다. AST와 ALT는 특히 심장, 신장, 간의 조직에 많이 분포되어 있는 것으로 보고되어 있으며(혈청 효소활성수치의 350배~7700배), AST의 경우 적혈구에서도 상당한 수준의 효소활성수치가 보고되어 있다(혈청 수치의 40배). 이 효소들은 체내 조직의 세포가 손상을 입었을 때 순환계(혈액)로 방출되며, 혈청 내에서 특정 대사기능을 수행하지는 않는 것으로 알려져 있다. AST의 경우 세포내에 분포하는 특성상, 세포질형 AST가 먼저 방출되며, 완전한 세포의 괴사가 일어난 후에 미토콘드리아형 AST가 방출되는 것으로 알려져 있다.These two enzymes are divided into cytosolic and mitochondrial, respectively, and are widely distributed in most organs of the body. Because of this, it is possible to be widely used for the diagnosis of various diseases, but it is known that the specificity of the specific disease is relatively low. In particular, AST and ALT are reported to be widely distributed in tissues of the heart, kidneys, and liver (350-7700 times the serum enzyme activity), and in the case of AST, significant levels of enzyme activity have been reported in red blood cells (serum). 40 times the figure). These enzymes are released into the circulatory system (blood) when cells in tissues are damaged and are known to not perform specific metabolic functions in serum. In the case of AST, cytoplasmic AST is released first and mitochondrial AST is released after complete cell necrosis.

혈청에서 이들의 효소활성도 증가는 간 손상에 대한 가장 민감한 표지인자들 중 하나로 알려져 있다. 효소활성수치의 주된 상승원인이 간 손상에 있다고 알려져 있지만, 효소활성도 수치의 상승만으로는 간 손상의 원인이나 간 질환의 진행정도를 알 수 없다. 더욱이 만성적인 간 질환을 앓고 있는 환자의 경우에는 ALT와 AST의 효소활성도 수치가 정상인과 크게 다르지 않아 진단에 거의 도움이 되지 않는다.Their increased enzyme activity in serum is known to be one of the most sensitive markers for liver damage. Liver damage is known to be the major cause of enzyme activity, but the increase in enzyme activity alone does not reveal the cause of liver damage or the progression of liver disease. Moreover, in patients with chronic liver disease, the enzyme activity levels of ALT and AST are not significantly different from those of normal people, and thus are hardly helpful for diagnosis.

현재 사용되고있는 효소활성도 측정방법은, 혈청의 효소(AST 또는 ALT)가 기질을 분해하고 대사산물을 생성하는 과정에서, 반응에 첨가한 발색시약에 의한 색의 변화를 측정하는 방법이다(Karmen A, J. Clin. Invest. 1955, 34 : 131-133). 이러한 측정방법은, 같은 사람에 대해서도 측정시간과 날짜에 따른 수치변화가 많이 나타나며, 운동 전후나 채혈자세 등의 요인에 의해서도 측정수치가 다르게 나타나는 것으로 보고된 바 있다. 또한, 이 수치는 병원간 및 개인간에 서로 비교를 할 수 없으며, 간의 염증정도를 1:1로 정확히 반영해 주는 것은 아니어서 100이었던 수치가 200으로 증가했다고 간염이 2배 악화되었다고는 할 수 없다. 더불어, 사람의 혈청에는 수천 가지의 유기 또는 무기화합물과 함께 효소활성수치에 영향을 줄 수 있는 여러 가지 인자(factor)가 존재하므로, 효소활성도 측정방법의 문제점이 계속해서 제기되어 왔다. 그러므로, 이 방식을 보완하거나 대체할만한 방법의 필요성이 제기됨과 동시에, 새로운 측정방법의 개발이 시도되어 왔다. 앞에서 소개한 바와 같이, 그 동안 면역분석법(immunoassay)을 이용하여 혈청 ALT와 AST의 양을 측정하려는 시도가 1978년 레지(Rej)에 의해 처음 발표된 이래로, 보다 정확하고 정교한 면역분석법을 개발하기 위한 노력이 이어져 왔으나(Hirano, 1984, Suzuki 1987), 기존의 효소활성도 분석법을 대체할 만한 수준에는 이르지 못하였다.The enzyme activity measuring method currently used is a method of measuring the color change by the coloring reagent added to the reaction in the process of the enzyme (AST or ALT) of the serum to decompose the substrate and produce metabolites (Karmen A, J. Clin. Invest. 1955, 34: 131-133). In the measurement method, the numerical value of the same person varies depending on the measurement time and date, and the measurement value is also reported to be different depending on factors such as before and after exercise or blood collection posture. In addition, this number is not comparable between hospitals and individuals, and does not accurately reflect the degree of inflammation of the liver in a 1: 1 scale. . In addition, there are several factors (factors) that can affect the enzyme activity value along with thousands of organic or inorganic compounds in human serum, and the problem of the method for measuring enzyme activity has been continuously raised. Therefore, with the necessity of a method to complement or replace this method, the development of a new measurement method has been attempted. As introduced earlier, since attempts to measure serum ALT and AST levels using immunoassays were first published in 1978 by Rej, to develop more accurate and sophisticated immunoassays. Efforts have been made (Hirano, 1984, Suzuki 1987), but have not reached the level that would replace the existing enzyme activity assays.

면역학적 측정방법은 기본적으로 항원-항체반응을 이용하기 때문에 혈청에 존재하는 실질적인 단백질의 양을 측정할 수 있다. 즉, 단백질의 효소활성 유무에 상관없이 그 양을 측정할 수 있으며, 정상적인 형태의 단백질과 분해된 형태의 단백질 모두를 측정할 수 있는 가능성이 있다. 세포질형과 미토콘드리아형 단백질은 서로 수행하는 효소반응이 같을 뿐, 아미노산 서열에는 많은 차이가 있다. 효소활성도 측정법과는 달리, 면역학적 측정법은 각 타입의 단백질을 구분하여 측정할 수 있으며, 이러한 점이 측정결과와 특정질환사이의 상관관계를 높일 수 있을 것으로 기대하고 있다.Immunological assays basically use antigen-antibody responses to measure the amount of substantial protein present in serum. That is, the amount can be measured regardless of the enzyme activity of the protein, and there is a possibility of measuring both the normal form and the degraded form. Cytoplasmic and mitochondrial proteins have the same enzymatic reactions, but there are many differences in amino acid sequences. Unlike enzyme activity assays, immunological assays can be used to separate and measure each type of protein, which is expected to increase the correlation between measurement results and specific diseases.

따라서, 본 발명은 종래 기술의 효소활성도 측정법의 문제점을 해결하기 위하여 효소활성도 측정법을 보완하거나 대체할 수 있으며, 혈청 효소, 이 효소에 대한 단일클론 항체 및 여러 가지 형태의 자가항체를 측정할 수 있는 면역분석법 및 이 면역분석법을 이용한 간편하고 정확한 간 질환 검사법을 제공하기 위한 것이다.Therefore, the present invention can supplement or replace the enzyme activity measurement method to solve the problems of the enzyme activity measurement method of the prior art, and can measure serum enzymes, monoclonal antibodies to the enzyme and various forms of autoantibodies. An immunoassay and a simple and accurate liver disease test using the immunoassay.

본 발명은 일 관점으로서 혈청 효소, 특히 알라닌 아미노전이효소(ALT) 또는 아스팔테이트 아미노전이효소(AST)에 대한 단일클론 항체를 제조하고, 이 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제작한 뒤, 이 하이브리도마 세포 배양액으로부터 수득되고 인간의 ALT 또는 AST와 반응성이 우수한 단일클론 항체를 선발하여 샌드위치 효소매개면역분석법(ELISA)으로 피검체의 혈액 시료와 반응시킴으로써 자가항체와 결합하지 않은 혈청 효소 ALT 또는 AST를 검출하는 것을 포함하여, 피검체의 혈액내 ALT 또는 AST를 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a monoclonal antibody against a serum enzyme, in particular alanine aminotransferase (ALT) or asphaltate aminotransferase (AST), and a hybridoma cell line producing the monoclonal antibody. Subsequently, a serum obtained from this hybridoma cell culture and selected from a monoclonal antibody that is highly reactive with human ALT or AST and reacted with the blood sample of the subject by sandwich enzyme-mediated immunoassay (ELISA) was not bound to autoantibodies. Provided are methods for quantitatively measuring ALT or AST in the blood of a subject, including detecting the enzyme ALT or AST.

구체적 양태로서, 본 발명의 측정 방법에서 사용된 단일클론 항체를 제작하기 위하여 사람의 ALT 및 AST와 아미노산 서열면에서 상동성이 매우 높은 것으로 알려져 있는 돼지에서 정제한 ALT 및 AST를 면역원으로 사용할 수 있다. 돼지의 ALT와 AST는 순수 정제되어 시그마 케미칼스(Sigma Chemicals) 사 등에서 연구용으로 판매되고 있다.As a specific embodiment, in order to produce the monoclonal antibody used in the measuring method of the present invention, ALT and AST purified from pigs known to have high homology with human ALT and AST can be used as an immunogen. . Pig ALT and AST are purely purified and sold for research by Sigma Chemicals.

단일클론 항체 생산 방법으로는 당해 기술 분야에 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 간략히 설명하면, 면역원으로 사용한 돼지 효소를 같은 부피의 완전 프로인트 보조제와 혼합하여 암컷 BALB/c 마우스 복강에 주사하고, 1차 주사 후 3 내지 4주의 간격을 두고 3 내지 4회 추가 접종한다. 이 마우스로부터 지라세포를 분리하여 무한증식성 세포, 예컨대 SP2/o-Ag-14 골수종 세포와 융합시킨다. 세포 배양 상등액을 가지고 돼지효소항원에 대한 ELISA 실험으로 양성 콜로니를 선별하고, 제한희석법으로 우수한 항체생산세포주를 선발한다(Galfre and Milstein, 1981; Choi et al., 1995). 그 다음, 이 항체생산세포 배양액을 마우스 복강에 주사하여 복수를 생산하고, 이 복수를 단백질-G 컬럼을 통해 통과시켜 정제하여 대량의 단일클론항체를 수득한다.As a monoclonal antibody production method, a method conventional in the art can be used. Briefly, the porcine enzyme used as an immunogen is mixed with the same volume of complete Freund's adjuvant and injected into female BALB / c mouse intraperitoneally and inoculated 3 to 4 times at intervals of 3 to 4 weeks after the first injection. The splenocytes are isolated from these mice and fused with infinitely proliferative cells such as SP2 / o-Ag-14 myeloma cells. Positive colonies are selected by ELISA experiments on porcine enzyme antigens with cell culture supernatants, and excellent antibody producing cell lines are selected by restriction dilution (Galfre and Milstein, 1981; Choi et al., 1995). The antibody-producing cell culture is then injected into the mouse abdominal cavity to produce ascites, which is passed through a Protein-G column to purify to obtain a large amount of monoclonal antibody.

본 발명의 측정방법에 있어서, 인간의 ALT 또는 AST와 반응성이 우수한 단일클론 항체를 선발하기 위하여, 생산된 단일클론항체에 대해서 인간의 ALT와 AST에 대한 반응성을 시험한다. 이 시험에 사용한 인간 ALT 단백질은 인간의 ALT1 유전자의 염기서열을 바탕으로 PCR(중합효소연쇄반응)을 통한 유전자 재조합 과정을 거쳐, 대장균에서 발현한 재조합 단백질을 포함한다. 인간 ALT 단백질의 생산에 대하여 구체적으로 설명하면, 인간의 ALT 유전자는 인간 간 cDNA 라이브러리(human liver cDNA library, Takara, Japan)를 주형으로 Taq DNA 중합효소(Takara, Japan)를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 중합효소연쇄반응(PCR)에 사용한 프라이머는 인간 ALT의 mRNA 염기서열을 기준으로 제작하였으며(Melanie et al, 1997), 본 명세서에 서열번호 1로 제시되는 순방향 프라이머 5'-ATAGAATTCATGGCCTCGAGCACAGGTGACCGG-3'와 서열번호 2로 제시되는 역방향 프라이머 5'-AGTAAGCTTGGAGTACTCGAGGGTGAACTTGGC-3'로 구성되어 있다. 중합효소연쇄반응은 일반적인 조건에서 30회(cycle)를 수행하였다. 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물은 1,503bp이며, 제한효소 EcoRI과 Hind III로 잘려진 후 pET21a(+) 발현벡터(Novagen, Milwaukee, WI)에 클로닝하였다. 이어, 양성 콜로니에 대해 염기서열을 분석하고 대장균 BL21 형질전환에 이용하였다. 형질전환된 대장균에서 재조합 단백질 발현은 1mM IPTG(isopropylthio-beta-D-galactoside)를 사용하여 유도하였다. 재조합 단백질의 발현 조건과 정제방법은 pET 발현 시스템의 제조사(Novagen)의 방법을 따랐다.In the measuring method of the present invention, in order to select monoclonal antibodies which are highly reactive with human ALT or AST, the produced monoclonal antibody is tested for reactivity with human ALT and AST. The human ALT protein used in this test includes a recombinant protein expressed in Escherichia coli through a process of genetic recombination through PCR (polymerase chain reaction) based on the nucleotide sequence of the human ALT1 gene. Specifically, the human ALT gene can be amplified using Taq DNA polymerase (Takara, Japan) as a template using the human liver cDNA library (Takara, Japan). . For example, primers used in polymerase chain reaction (PCR) were prepared based on the mRNA sequence of human ALT (Melanie et al, 1997), forward primer 5′-ATAGAATTCATGGCCTCGAGCACAGGTGACCGG- 3 'and reverse primer 5'-AGTAAGCTTGGAGTACTCGAGGGTGAACTTGGC-3' as shown in SEQ ID NO: 2. The polymerase chain reaction was performed 30 times under normal conditions. The product amplified by the polymerase chain reaction was 1,503bp, which was cut by restriction enzymes EcoRI and Hind III and cloned into pET21a (+) expression vectors (Novagen, Milwaukee, WI). Subsequently, the sequences were analyzed for positive colonies and used for E. coli BL21 transformation. Recombinant protein expression in transformed Escherichia coli was induced using 1 mM IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside). Expression conditions and purification methods of the recombinant protein followed the method of the manufacturer of the pET expression system (Novagen).

이와 유사한 방법으로, 인간 AST 단백질도 생산할 수 있다. 단, 이 AST 단백질 생산에 사용된 프라이머는 인간 세포질형 AST의 mRNA 염기서열을 기준으로 제작하였으며, 본 명세서에 서열번호 3으로 제시되는 순방향 프라이머 5'-GAATTCATGGCACCTCCGTCAGTCTTTGC-3'와 서열번호 4로 제시되는 역방향 프라이머 5'-CTCGAGCTGGATTTTGGTGACTGCTTCAT-3'과 같다. PCR 반응 조건은 ALT에서와 동일하며, 증폭된 산물은 1,251bp이고, 제한효소 EcoRI과 Xho I로 잘려진 후 pET21a(+) 발현벡터(Novagen, Milwaukee, WI)에 클로닝하였다. 이후 형질전환과 단백질의 발현 및 정제는 ALT 단백질 생산 방법과 동일하다.In a similar manner, human AST proteins can also be produced. However, the primers used for the production of this AST protein were prepared based on the mRNA sequence of the human cytoplasmic AST, and are represented by the forward primers 5'-GAATTCATGGCACCTCCGTCAGTCTTTGC-3 'and SEQ ID NO: 4 as set forth in this specification. Reverse primer 5'-CTCGAGCTGGATTTTGGTGACTGCTTCAT-3 '. PCR reaction conditions were the same as in ALT, and the amplified product was 1251 bp, was cut by restriction enzymes EcoRI and Xho I and cloned into pET21a (+) expression vectors (Novagen, Milwaukee, WI). The transformation and expression and purification of the protein is then the same as the ALT protein production method.

피검체의 혈액내 ALT 또는 AST를 정량적으로 측정하기 위한 샌드위치 효소매개면역분석법(ELISA)으로는 2중 샌드위치 엘리자(two-site sandwich ELISA) 방식을 선택할 수 있다. 이 방식은 96웰 평판위에 고정시킨 1차 항체(capture antibody)가 시료에 포함된 AST 또는 ALT 단백질과 결합하면, 2차 항체(detector antibody)가 다시 1차 항체와 결합된 단백질에 결합하여 샌드위치 구조를 이루게 되는 것으로서, 이 때 2차 항체에는 표지체가 부착되어 있어 표지체가 기질과 반응하여 발생시키는 신호를 측정하는 방식이다. 피검체의 혈액 시료로는 간 질환자로 의심되는 환자에서 채취한 전혈(whole blood) 또는 혈청 등을 포함한다. 바람직하게는 혈청이 적합하다.Two-site sandwich ELISA may be selected as a sandwich enzyme-mediated immunoassay (ELISA) to quantitatively measure ALT or AST in blood of a subject. In this method, when a primary antibody (capture antibody) immobilized on a 96-well plate binds to the AST or ALT protein contained in the sample, the secondary antibody (detector antibody) binds to the protein bound to the primary antibody and sandwiches the structure. At this time, the secondary antibody is attached to the label is a method of measuring the signal generated by the label reacts with the substrate. The blood sample of the subject includes whole blood or serum obtained from a patient suspected of having liver disease. Preferably serum is suitable.

또한, 본 발명은 다른 관점으로서 전술한 바와 같이 선발된 단일클론 항체를 이용하여 샌드위치 효소매개면역분석법(ELISA)으로 피검체의 혈액 시료와 반응시켜 이 시료 중에 존재하는 ALT- 또는 AST-항체 복합체의 농도를 측정하는 것을 포함하여, 피검체의 혈액내 ALT- 또는 AST-항체 복합체를 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention is a reaction of the ALT- or AST-antibody complex present in the sample by reacting with a blood sample of the subject by a sandwich enzyme-mediated immunoassay (ELISA) using the selected monoclonal antibody as described above Provided are methods for quantitatively measuring ALT- or AST-antibody complexes in the blood of a subject, including measuring the concentration.

효소-항체 복합체로는 ALT-IgG, ALT-IgM, ALT-IgA, AST-IgG, AST-IgM 또는 AST-IgA를 포함한다. 샌드위치 효소매개면역분석법에 사용된 1차 항체(또는 포획(capture) 항체라고도 부름)로는 전술한 바와 같이 선발된 돼지 ALT 또는 AST 단백질에 대한 마우스 단일클론 항체를 포함하고, 2차 항체(또는 검출(detector) 항체라고도 부름)로는 항인간 IgG, IgM 또는 IgA 염소 항체, 또는 토끼 항체, 또는 마우스 항체를 포함한다.Enzyme-antibody complexes include ALT-IgG, ALT-IgM, ALT-IgA, AST-IgG, AST-IgM or AST-IgA. Primary antibodies (also called capture antibodies) used in sandwich enzyme-mediated immunoassays include mouse monoclonal antibodies against swine ALT or AST proteins selected as described above, and secondary antibodies (or detection ( Also called detector antibodies) include anti-human IgG, IgM or IgA goat antibodies, or rabbit antibodies, or mouse antibodies.

또한, 본 발명은 다른 관점으로서 돼지의 ALT 또는 AST 단백질을 항원으로 이용하여 샌드위치 효소매개면역분석법(ELISA)으로 피검체의 혈액 시료와 반응시켜 시료 중의 항-ALT 또는 항-AST 자가항체의 존재 및 농도를 측정하는 것을 포함하여, 피검체의 혈액내 ALT 또는 AST에 대한 자가항체를 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention is the presence of anti-ALT or anti-AST autoantibodies in the sample by reacting with a blood sample of the subject using a sandwich enzyme-mediated immunoassay (ELISA) using the pig ALT or AST protein as an antigen and A method of quantitatively measuring autoantibodies to ALT or AST in a subject's blood, including measuring concentrations, is provided.

이 방법에서 사용되는 검출 항체로는 항인간 IgG, IgM 또는 IgA 염소 항체, 또는 토끼 항체, 또는 마우스 항체를 포함한다.Detection antibodies used in this method include anti-human IgG, IgM or IgA goat antibodies, or rabbit antibodies, or mouse antibodies.

ALT와 AST에 대한 자가항체에 대해서는 1970년대 후반, 콘티넨(Konttinen) 그룹에 의해 혈청에 AST와 항체가 결합되어 만들어진 복합체가 존재한다는 보고가 있었고[Konttinen A. et al., Clin. Chim. Acta. 1978, 84 : 145-147], 이후에 발표된 보고들에 따르면, 일부의 환자나 정상인에게서만 AST에 대한 자가항체가 발견되는 것으로 알려져 있다. 이러한 보고를 바탕으로 본 발명자들은 정상인과 간 질환자 그룹이 ALT 또는 AST에 대한 자가항체를 가지고 있는지 여부와, 자가항체가 효소-항체 복합체를 형성하여 존재하는지 여부를 조사하였다.In the late 1970s, autoantibodies against ALT and AST have been reported by the Konttinen group to have a complex of AST and antibody conjugated in serum [Konttinen A. et al., Clin. Chim. Acta. 1978, 84: 145-147], and later reports indicate that autoantibodies to AST are found only in a few patients or normal individuals. Based on these reports, we investigated whether normal and liver disease groups had autoantibodies against ALT or AST, and whether autoantibodies exist in the form of enzyme-antibody complexes.

자가항체를 측정하기 위하여 돼지 ALT 또는 AST 효소를 96웰 판에 코팅하고 여기에 혈청 시료를 첨가하여 반응시킨 후, 세척하고, 여기에 표지된 항인간 Ig 염소항체를 첨가하여 반응시키고 충분히 세척한 다음 기질액을 첨가하여 발색반응시켜 흡광도를 측정하였다. 그 결과 종래의 보고와 달리 본 연구에 참가한 간 질환을 가지고 있는 대부분의 환자들이 자가항체를 보유하고 있는 것으로 관찰되었다.To measure autoantibodies, porcine ALT or AST enzyme was coated on a 96-well plate and reacted by adding serum samples to it, followed by washing, followed by addition of a labeled anti-human Ig chlorine antibody, followed by sufficient washing. The absorbance was measured by the addition of the substrate solution and color reaction. As a result, contrary to the previous report, it was observed that most patients with liver disease in this study had autoantibodies.

효소-항체 복합체를 검출하기 위하여 항-AST, 또는 항-ALT 마우스 단일클론항체를 1차 항체로 사용하고, 항-인간 IgG, IgM, 또는 IgA 염소 항체를 2차 항체로 사용하였다. 실험결과, 대부분의 환자에게서 AST와 ALT에 대한 자가항체가 발견되었으며, 효소-항체 복합체 역시 존재한다는 것을 알 수 있었다. 더욱이 정상인 그룹에서도 AST-, ALT-항체 복합체가 존재하는 것으로 나타났다(이하에 기재한 실시예 4 및 5 참조).Anti-AST, or anti-ALT mouse monoclonal antibodies were used as primary antibodies and anti-human IgG, IgM, or IgA goat antibodies were used as secondary antibodies to detect enzyme-antibody complexes. As a result, autoantibodies against AST and ALT were found in most patients, and the enzyme-antibody complex was also present. Furthermore, AST- and ALT-antibody complexes were also present in the normal group (see Examples 4 and 5 described below).

또 다른 관점으로서, 본 발명은 전술한 본 발명의 효소-항체 복합체 측정방법에 따라 간 질환이 의심되는 피검체의 혈액 시료를 분석하여 시료에 존재하는 AST- 또는 ALT-항체 복합체 수치를 측정하고, 이와 함께 대조군으로서 정상인의 혈액 시료도 함께 분석하여 정상인의 AST- 또는 ALT-항체 복합체 수치를 측정하여, 그 수치 차이가 현저하게 큰 경우 간 질환자로 판단할 수 있는 것을 특징으로 하는 간 질환 검사 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention by analyzing the blood sample of a subject suspected of liver disease according to the enzyme-antibody complex measuring method of the present invention described above to determine the level of AST- or ALT-antibody complex present in the sample, In addition, the blood samples of normal people are also analyzed as a control group, and the AST- or ALT-antibody complex levels of normal people are measured. to provide.

이 방법의 바람직한 구체예에서, AST- 또는 ALT-항체 복합체 수치는 그 수치가 정상인과 비교했을 때 가장 큰 차이를 보이는 AST-IgA 또는 ALT-IgA 복합체 수치인 것이 가장 바람직하다.In a preferred embodiment of this method, the AST- or ALT-antibody complex level is most preferably the AST-IgA or ALT-IgA complex level, which shows the greatest difference when compared to normal.

또 다른 바람직한 구체예에서, 간 질환으로는 급성간염, 만성간염 또는 간경화 등을 포함한다.In another preferred embodiment, the liver disease includes acute hepatitis, chronic hepatitis or cirrhosis and the like.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 전술한 본 발명의 자가항체 측정방법에 따라 간 질환이 의심되는 피검체의 혈액 시료를 분석하여 시료에 존재하는 항-AST 자가항체 또는 항-ALT 자가항체 수치를 측정하고, 이와 함께 대조군으로서 정상인의 혈액 시료도 함께 분석하여 정상인의 항-AST 자가항체 또는 항-ALT 자가항체 수치를 측정하여, 그 수치 차이가 현저하게 큰 경우 간 질환자로 판단할 수 있는 것을 특징으로 하는 간 질환 검사 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention is to measure the anti-AST autoantibodies or anti-ALT autoantibodies present in the sample by analyzing a blood sample of a suspected liver disease according to the above-described autoantibody measuring method of the present invention In addition, the blood sample of the normal person is also analyzed as a control, and the anti-AST autoantibody or anti-ALT autoantibody level of the normal person is measured, and when the difference in the value is remarkably large, the liver disease can be judged. It provides a liver disease test method.

이 방법의 바람직한 구체예에서, 항-AST 또는 항-ALT 자가항체 수치가 AST 또는 ALT에 대한 IgA 수치인 것이 특히 바람직하다.In a preferred embodiment of this method, it is particularly preferred that the anti-AST or anti-ALT autoantibody levels are IgA levels for AST or ALT.

이 방법이 효과적으로 사용될 수 있는 간 질환으로는 급성간염, 만성간염 또는 간경화 등을 포함한다.Liver diseases in which this method can be used effectively include acute hepatitis, chronic hepatitis or cirrhosis.

또한, 본 발명은 전술한 혈청 효소 측정 방법에서 제시된 단일클론 항체를 이용하여 병명을 이미 알고 있는 간 질환자 및 정상인 혈액내의 ALT 또는 AST에 대한 효소-항체 복합체를 그 항체 유형별로 샌드위치 효소매개면역분석법(ELISA)으로 정량적으로 측정한 뒤, 각 혈액내 그 항체 유형별 정량적 측정치와 그 항체의 생화학적 효소활성도 측정치를 상호관련시켜 확인한 각 항체유형별 상호관련 특이성 패턴을 기본 패턴으로 삼아, 미지의 환자 혈액에 존재하는 효소-항체 복합체의 항체유형별 정량적 측정치와 생화학적 효소활성도 측정치를 상기 기본 패턴과 비교함으로써 간 질환의 여부 내지는 간 질환의 진행정도를 검사하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is a sandwich enzyme-mediated immunoassay method for the enzyme-antibody complex for ALT or AST in the liver disease and normal blood of the liver disease known to the disease by using the monoclonal antibody presented in the above-described serum enzyme measurement method ( Quantitatively determined by ELISA, and then present in unknown patient blood, using the specific pattern of correlations for each antibody type identified by correlating the quantitative measurement of each antibody type in each blood with the measurement of biochemical enzyme activity of that antibody. The present invention provides a method for examining the presence of liver disease or the progression of liver disease by comparing the quantitative and biochemical enzyme activity of each enzyme-antibody complex with the basic pattern.

이 방법의 바람직한 구체예에 있어서, 병명을 이미 알고 있는 간 질환자는 급성간염환자, 만성간염환자 또는 간경화환자를 포함한다.In a preferred embodiment of this method, liver diseases for which the disease name is already known include acute hepatitis patients, chronic hepatitis patients or cirrhosis patients.

또한, 상기 방법에서 정량적으로 측정되는 효소-항체 복합체가 AST-IgA 또는 ALT-IgA인 것이 그 상호관련 특이성 면에서 특히 바람직하다.It is also particularly preferred in terms of their interrelated specificities that the enzyme-antibody complexes quantitatively measured in the method are AST-IgA or ALT-IgA.

AST-IgA 상호관련 특이성은 급성간염환자의 경우 높은 AST 효소활성도 수치와 낮은 AST-IgA 복합체 수치를 나타내고, 간경화 환자의 경우 낮은 AST 효소활성도 수치와 높은 AST-IgA 복합체 수치를 나타내며, 만성간염환자의 경우 상기 급성간염환자와 간경화환자의 중간값을 나타내는 것을 특징으로 한다.AST-IgA correlation specificity showed high AST enzyme activity and low AST-IgA complex level in acute hepatitis patients, low AST enzyme activity and high AST-IgA complex level in liver cirrhosis patients. When the acute hepatitis patients and liver cirrhosis patients characterized in that it represents the median.

ALT 또는 AST에 대한 자가항체 또는 효소-항체 복합체를 그 항체 유형별로 정량 측정하는 방법은 전술한 ALT 또는 AST 정량 측정방법에서 기술한 바와 같은 ELISA법을 이용하여 수행할 수 있으며, 단 자가항체 유형별 측정을 위해 2차 항체로서 예컨대 표지된 항인간 IgG 염소항체, 표지된 항인간 IgM 염소 항체 또는 표지된 항인간 IgA 염소항체 등을 이용하면 된다. 이와 같은 측정방법으로 정상인 및 간 질환자의 혈청에서 3가지 유형(즉, IgG, IgM, IgA)의 자가항체를 검출할 수 있다.Quantitative determination of autoantibodies or enzyme-antibody complexes for ALT or AST by their antibody type can be performed using the ELISA method as described in the above-described ALT or AST quantitative determination method, except for measurement by autoantibody type For example, a labeled anti-human IgG goat antibody, a labeled anti-human IgM goat antibody or a labeled anti-human IgA goat antibody may be used as the secondary antibody. Such measurement method can detect autoantibodies of three types (ie IgG, IgM, IgA) in the serum of normal and liver disease.

이를 기초로 하여, AST-유형별 자가항체 복합체 측정수치와 고전적인 생화학적 효소활성도 분석수치를 여러 가지 조합으로 접목시켜 본 결과, 이하 실시예에 상세히 설명되는 바와 같이 AST-IgA 복합체의 ELISA 측정수치와 고전적 효소활성도 분석수치가 정상인과, 환자 그룹(예컨대, 급성 간염, 만성 간염 및 간경화), 그리고 간 질환의 진행정도 간의 구별성이 뚜렷하다는 것을 발견하였는 바, 이에 기초하여 본 발명은 특히 바람직한 구체예로서 AST-IgA 복합체의 ELISA 측정수치와 효소활성도 분석수치의 조합 결과에 근거하여 간 질환 내지는 간 질환 진행정도를 검사하는 방법을 제공한다.On the basis of this, the combination of AST-type autoantibody complex measurement values and classical biochemical enzyme activity analysis values were combined into various combinations. As a result, the ELISA measurement values of the AST-IgA complexes are described in detail in the following examples. It was found that there is a clear distinction between normal persons, normal enzyme activity values, patient groups (eg, acute hepatitis, chronic hepatitis and cirrhosis), and the progression of liver disease. Based on this, the present invention is a particularly preferred embodiment. As a method of testing the progress of liver disease or liver disease based on the combination of the ELISA measurement value and enzyme activity analysis value of the AST-IgA complex.

또한, ALT에 대한 분석항목의 조합에서도 AST에서와 동일한 경향을 보이는 바, 본 발명은 특히 바람직한 또 다른 구체예로서 ALT-IgA 복합체의 ELISA 측정수치와 효소활성도 분석수치의 조합 결과에 근거하여 간 질환 내지는 간 질환 진행정도를 검사하는 방법을 제공한다.In addition, the combination of assay items for ALT shows the same tendency as in AST. The present invention is another particularly preferred embodiment based on the combination of ELISA measurement value and enzyme activity analysis value of ALT-IgA complex with liver disease. Or to provide a method for examining the progress of liver disease.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 이 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 도면을 참조로 하여 예시하는 것으로, 본 발명의 범위나 영역을 한정하기 위한 것이 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. This example illustrates various embodiments of the invention with reference to the drawings and is not intended to limit the scope or scope of the invention.

<실시예><Example>

실시예 1. ALT와 AST에 대한 단일클론항체의 생산Example 1 Production of Monoclonal Antibodies to ALT and AST

단일클론항체 제작을 위한 면역원(immunogen)으로 돼지에서 정제한 효소 단백질 ALT와 AST는 순수-정제되어 시그마 케미컬(Sigma Chemical)사 등에서 연구용으로 판매되고 있는 것을 구입하여 사용하였다.Enzyme proteins ALT and AST purified from pigs as immunogens for monoclonal antibody production were pure-purified and sold for use in research by Sigma Chemical.

이 돼지 ALT와 AST 효소를 같은 부피의 완전 프로인트 보조제(complete Freund's adjuvant)와 혼합하여 6~8주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강에 주사하였다. 1회 주사하는 부피는 0.5ml가 되게 하고 50㎍의 항원 단백질이 포함되게 하였다. 1차 주사(접종)후에 3~4주의 간격을 두고 3~4회의 추가 접종을 하였다. 세포융합실험을 위해, 가는 핀셋을 사용하여 마우스로부터 적출한 지라로부터 지라세포를 준비하였고, 준비된 지라세포와 SP2/o-Ag-14 골수종(myeloma)세포를 혼합하였다. 여기에 50% PEG (폴리에틸렌 글리콜) 1500 이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 1ml을 60초에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 세포융합실험 2주일 후에, 세포배양 상등액을 가지고 돼지 효소항원에 대한 엘리자 실험을 수행하여 양성 콜로니(colony)를 선별하였다. 선별된 양성 콜로니는 먼저 냉동시켰다가 녹인 후, 연속적인 2회의 제한희석법(limiting dilution)을 통해 우수한 항체 생산 세포주(융합세포주 또는 하이브리도마 클론이라고도 지칭함)를 선별하였다(Galfre and Milstein, 1981; Choi et al, 1995).The porcine ALT and AST enzymes were mixed with the same volume of complete Freund's adjuvant and injected into the abdominal cavity of 6-8 week old female BALB / c mice. The single injection volume was 0.5 ml and contained 50 μg of antigenic protein. After the first injection (inoculation), three to four boosters were given 3-4 weeks apart. For cell fusion experiments, spleen cells were prepared from spleens extracted from mice using fine tweezers, and the prepared splenocytes and SP2 / o-Ag-14 myeloma cells were mixed. To this was slowly added 1 ml of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 50% PEG (polyethylene glycol) 1500 over 60 seconds. Two weeks after the cell fusion experiment, positive colonies were selected by performing ELISA experiments on porcine enzyme antigens with the cell culture supernatant. Selected positive colonies were first frozen and thawed, followed by two consecutive limiting dilution procedures to select good antibody producing cell lines (also called fusion cell lines or hybridoma clones) (Galfre and Milstein, 1981; Choi). et al, 1995).

단일클론항체의 대량생산을 위해 1×10⁷개의 융합세포를 준비하고, 일주일전 프리스탄(pristine)을 미리 주사한 마우스의 복강에 주사하여 복수(ascites)를 생산하였다. 생산된 복수는 단백질-G 컬럼을 통과시킨 다음 0.1M 글리신-HCl (pH 2.5)로 추출하여 정제하였다. 여기에 1M 트리스-HCl(pH 8.0)를 넣어 중화시키고 PBS(인산염 완충식염수)에서 투석하였다.1 × 10 ⁷ fusion cells were prepared for mass production of monoclonal antibodies, and ascites were produced by injection into the abdominal cavity of mice pre-injected with pristine a week ago. The resulting ascites was purified by passing through a Protein-G column and then extracted with 0.1M glycine-HCl (pH 2.5). It was neutralized with 1M Tris-HCl (pH 8.0) and dialyzed in PBS (phosphate buffered saline).

단일클론항체의 선별을 위해, 2㎍/ml 농도의 항원을 96 웰판(96 well plate)에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 그 다음, 웰판을 PBST(PBS-tween 20)로 충분히 세척하고 융합세포주의 배양상등액을 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이어, HRP(Horseradish peroxidase)가 접합된 항-마우스 IgG 염소 항체(HRP-conjugated goat anti-mouse IgG)를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 충분히 세척하고 50㎕의 TMB 기질액을 첨가하여 발색반응이 일어나게 하였다. 10mM 황산(H₂SO₄)을 첨가하여 발색반응을 정지시키고 흡광도(450nm)를 측정하였다.For selection of monoclonal antibodies, 2 μg / ml concentration of antigen was placed in 96 well plates and coated overnight at 4 ° C. Then, the well plate was sufficiently washed with PBST (PBS-tween 20) and the culture supernatant of the fusion cell line was added and reacted for 1 hour. Then, HRP (Horseradish peroxidase) conjugated anti-mouse IgG goat antibody (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG) was added and reacted for 1 hour. After washing sufficiently with PBS, 50 μl of TMB substrate solution was added to cause color reaction. 10 mM sulfuric acid (H ₂ SO ₄ ) was added to stop the color reaction and absorbance (450 nm) was measured.

이 선별과정을 반복적으로 실시한 결과, ALT에 대한 20개의 융합균주와 AST에 대한 18개의 융합균주가 선별되었다. 이후의 실험과정에서, 항체 생산능력을 잃어버린 클론과 제한희석법을 통해 항원과의 반응성이 떨어지는 클론들은 제거하였다.As a result of this screening process, 20 fusion strains for ALT and 18 fusion strains for AST were selected. In later experiments, clones that had lost their ability to produce antibodies and clones that were less reactive with the antigen were removed by restriction dilution.

실시예 2. 단일클론항체의 선발 및 특성규명Example 2. Selection and Characterization of Monoclonal Antibodies

인간의 혈청효소와의 반응성Reactivity with Human Serum Enzymes

선발된 단일클론 항체가 인간의 ALT 또는 AST와 반응성이 있는지 시험하였다.The selected monoclonal antibodies were tested for reactivity with human ALT or AST.

실험에 사용한 인간 ALT 단백질은, 인간의 ALT1 유전자의 염기서열을 바탕으로 PCR(중합효소연쇄반응)을 통한 유전자 재조합 과정을 거쳐, 대장균에서 발현한 재조합 단백질을 사용하였다(도 1 및 도 2).As the human ALT protein used in the experiment, a recombinant protein expressed in Escherichia coli was used through a gene recombination process through PCR (polymerase chain reaction) based on the nucleotide sequence of the human ALT1 gene (FIGS. 1 and 2).

구체적으로 설명하면, 인간 ALT의 유전자는 인간 간 cDNA 라이브러리(human liver cDNA library, Takara, Japan)를 주형으로 Taq DNA 중합효소(Takara, Japan)를 사용하여 증폭하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)에 사용한 프라이머는 인간 ALT의 mRNA 염기서열을 기준으로 제작하였으며(Melanie et al, 1997), 서열번호 1에 제시되는 순방향 프라이머 5'-ATAGAATTCATGGCCTCGAGCACAGGTGACCGG-3'와 서열번호 2에 제시되는 역방향 프라이머 5'-AGTAAGCTTGGAGTACTCGAGGGTGAACTTGGC-3'로 구성되어 있다. 중합효소연쇄반응은 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분간 반응시키는 조건에서 30회(cycle)를 수행하였다. 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물은 1,503bp이며, 제한효소 EcoRI과 Hind III로 절단한 후 pET21a(+) 발현벡터(Novagen, Milwaukee, WI)에 클로닝하였다. 이어, 양성 콜로니에 대해 염기서열을 분석하였고 대장균 BL21의 형질전환에 이용하였다. 형질전환된 대장균에서 재조합 단백질 발현은 1mM IPTG(isopropylthio-beta-D-galactoside)를 사용하여 유도하였다. 재조합 단백질의 발현 조건과 정제방법은 pET 발현 시스템의 제조사(Novagen)의 방법을 따랐다.Specifically, the gene of human ALT was amplified using Taq DNA polymerase (Takara, Japan) as a template using a human liver cDNA library (Takara, Japan). The primers used in the polymerase chain reaction (PCR) were prepared based on the mRNA sequence of human ALT (Melanie et al, 1997), and the forward primers 5'-ATAGAATTCATGGCCTCGAGCACAGGTGACCGG-3 'and SEQ ID NO: 2 are shown in SEQ ID NO: 1. The reverse primer 5'-AGTAAGCTTGGAGTACTCGAGGGTGAACTTGGC-3 'is shown. The polymerase chain reaction was performed 30 times under conditions of reacting for 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 58 ° C, and 2 minutes at 72 ° C. The product amplified by the polymerase chain reaction was 1,503bp, which was digested with restriction enzymes EcoRI and Hind III and cloned into pET21a (+) expression vectors (Novagen, Milwaukee, WI). Subsequently, nucleotide sequences were analyzed for positive colonies and used for transformation of Escherichia coli BL21. Recombinant protein expression in transformed Escherichia coli was induced using 1 mM IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside). Expression conditions and purification methods of the recombinant protein followed the method of the manufacturer of the pET expression system (Novagen).

항체제작 과정에서 돼지의 ALT를 면역원으로 사용하였지만, 엘리자 실험결과, 생산된 대부분의 단일클론항체는 재조합 인간 ALT와 비교적 강한 항원-항체 반응을 보였다(도 3).Porcine ALT was used as an immunogen in the antibody production process, but as a result of ELISA experiment, most of the monoclonal antibodies produced showed a relatively strong antigen-antibody reaction with recombinant human ALT (FIG. 3).

단일클론항체의 특이성을 조사하기 위하여 인간 ALT 단백질을 발현하도록 만든 대장균의 총 단백질(total protein)과, 인간의 간 조직으로부터 얻은 총 단백질을 대상으로 웨스턴 블럿(western blot)을 수행하였다. 웨스턴 블럿은 다음과 같이 수행하였다. 먼저 단백질을 12% SDS-PAGE에서 전개시키고 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 이동-고정시켰다. 멤브레인을 5% 탈지분유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)로 블러킹하고, 1차 항체를 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. TBST(TBS-Tween 20)로 충분히 세척하고 HRP가 접합된 항 마우스 Ig 염소 항체를 2차 항체로 처리하였다. 다시 TBST로 충분히 세척한 후에 검출시액 제조사(Pierce, Rockford, IL)의 지시에 따라 화학발광법(chemiluminescence)에 의한 항원-항체 반응을 검출하였다. 단백질의 정량은 브래드포드(Bradford) 분석법에 따라 결정하였다(Bradford, 1976).In order to investigate the specificity of the monoclonal antibody, Western blot was performed on the total protein of E. coli and the total protein obtained from human liver tissue. Western blot was performed as follows. The protein was first developed on 12% SDS-PAGE and transfer-fixed to nitrocellulose membrane. The membrane was blocked with Tris buffered saline (TBS) containing 5% skim milk powder, and reacted for 1 hour by treating the primary antibody. Washed sufficiently with TBST (TBS-Tween 20) and HRP conjugated anti mouse Ig goat antibody was treated with secondary antibody. After washing again with TBST, the antigen-antibody reaction by chemiluminescence was detected according to the instructions of the manufacturer of the detection solution (Pierce, Rockford, IL). Quantification of the protein was determined according to the Bradford assay (Bradford, 1976).

그 결과, 두 가지 총 단백질 모두에서 55kDa과 30kDa 크기의 단백질 띠를 확인할 수 있었다(도 4). 30kDa의 단백질 띠는 55kDa 단백질의 조각으로 추측하고 있다. 최근에 양(Yang) 그룹이 ALT2 유전자를 클로닝하였다고 보고하였으며(Yang 2002), 아마도 미토콘드리아형 ALT일 것으로 추정하고 있다. As a result, protein bands of 55kDa and 30kDa size were confirmed in both total proteins (FIG. 4). A 30 kDa protein band is assumed to be a 55 kDa protein fragment. The Yang group recently reported cloning the ALT2 gene (Yang 2002), presumably a mitochondrial ALT.

생산한 단일클론항체가 세포질형 ALT(ALT1)와 반응한다는 것을 알아보기 위해, 인간의 간 조직으로부터 세포질 분획(fraction)과 미토콘드리아 분획을 준비하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 그 결과 생산한 단일클론항체는 세포질 분획에 결합하는 것을 확인하였으며, 미토콘드리아 단백질 분획에는 전혀 결합하지 않았다. 이로써, 본 발명자들이 생산한 단일클론항체가 세포질형 ALT와 결합한다는 것을 확인하였다(도 5).In order to determine that the produced monoclonal antibody reacts with cytoplasmic ALT (ALT1), Western blot was performed by preparing cytoplasmic fraction and mitochondrial fraction from human liver tissue. As a result, the produced monoclonal antibody was confirmed to bind to the cytoplasmic fraction, did not bind to the mitochondrial protein fraction at all. As a result, it was confirmed that the monoclonal antibodies produced by the present inventors bind to the cytoplasmic ALT (FIG. 5).

돼지의 AST를 가지고 만든 단일클론항체 중 3종류만 이 엘리자 실험에서 인간 AST와 다양한 세기로 결합하였다. 특이하게도, 이 중 하이브리도마 클론 1c5에서 생산되는 한 종류의 단일클론항체는 돼지의 AST보다 인간 AST에 더 잘 결합하는 양상을 보여주었다(도 6). 부분-정제된 인간 AST 단백질과 인간의 간 조직으로부터 준비한 총단백질에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 약 45kDa 크기에 하나의 띠를 형성하였으며, 이것은 이미 알려진 AST의 크기와 일치하는 결과이다(도 7).Only three of the monoclonal antibodies made with porcine AST bound to human AST in varying degrees in this Eliza experiment. Specifically, one type of monoclonal antibody produced from hybridoma clone 1c5 showed better binding to human AST than pig AST (FIG. 6). Western blot of partially purified human AST protein and total protein prepared from human liver tissue resulted in a band about 45 kDa, which is consistent with the known size of AST (FIG. 7). ).

단일클론항체의 세포질형 AST에 대한 특이성을 알아보기 위해, 인간 간 조직으로부터 세포질 및 미토콘드리아 분획을 준비하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 실험결과 단일클론항체는 세포질 분획에만 결합하는 것으로 나타났다(도 8). 또한, 인간의 간 세포로부터 유래한 HepG2 세포에 단일클론항체를 처리하여 면역형광현미경법(immunofluorescence microscopic assay)을 실시한 결과에서도, 단일클론항체가 세포내 미토콘드리아에 결합하지 않는 것을 확인하였다.To determine the specificity of the cytoplasmic AST of monoclonal antibodies, Western blots were performed by preparing cytoplasmic and mitochondrial fractions from human liver tissue. Experimental results showed that the monoclonal antibody only binds to the cytoplasmic fraction (FIG. 8). In addition, HepG2 cells derived from human liver cells were treated with monoclonal antibodies, and the results of immunofluorescence microscopic assay confirmed that the monoclonal antibodies did not bind to intracellular mitochondria.

실시예 3. 효소 단백질을 측정하는 샌드위치 엘리자법을 이용한 환자 시료중의 ALT 및 AST의 측정Example 3 Determination of ALT and AST in Patient Samples Using the Sandwich Eliza Method for Measuring Enzyme Proteins

본 실험에 사용된 환자의 혈청은 춘천 성심병원으로부터 제공받았다. 혈청 시료는 20명의 급성간염 환자와 28명의 만성간염 환자, 그리고 29명의 간경화 환자의 혈액에서 준비하였다. 대조군으로 46명의 건강한 자원자의 혈청을 사용하였다. 환자의 혈청에 대해서는 애보트사(Abbot Laboratories, North Chicago, IL)의 엘리자 키트를 사용하여 HBV와 HCV의 감염여부를 조사하였으며, 대조군과 환자 모두의 혈청을 대상으로 혈청 ALT 및 AST의 효소활성 수치를 측정하였다. 정상인과 환자군의 평균연령 및 연령분포에는 큰 차이가 없으며, 실험에 사용된 혈액 및 혈청은 환자와 자원자의 동의를 얻어 제공되었다(표 1).Serum of patients used in this experiment was provided by Chuncheon Sacred Heart Hospital. Serum samples were prepared from the blood of 20 acute hepatitis patients, 28 chronic hepatitis patients, and 29 cirrhosis patients. Serum of 46 healthy volunteers was used as a control. The serum of patients was examined for infection with HBV and HCV using Abbot Laboratories (North Chicago, IL) Elisa kit. Serum levels of ALT and AST were measured in serum of both control and patients. Measured. There was no significant difference in mean age and age distribution between normal and patient groups, and the blood and serum used in the experiments were provided with the consent of patients and volunteers (Table 1).

피검자 정보Subject Information 정상인(n=46명)Normal person (n = 46 people) 급성간염환자(n=20명)Acute hepatitis patients (n = 20) 만성간염환자(n=28명)Chronic hepatitis patients (n = 28) 간경화환자(n=29명)Liver cirrhosis patients (n = 29) ^*연령 ^* Age 41±13(6-76)41 ± 13 (6-76) 46±17(20-79)46 ± 17 (20-79) 39±14(16-64)39 ± 14 (16-64) 49±10(33-67)49 ± 10 (33-67) 성별(남자/여자)Gender (male / female) 27/1927/19 14/614/6 24/424/4 27/227/2 효소활성도 수지(IU/L)Enzyme Activity Resin (IU / L) ^*ALT ^* ALT 24±11(10-73)24 ± 11 (10-73) 732±991(35-4185)732 ± 991 (35-4185) 96±76(17-293)96 ± 76 (17-293) 49±80(5-386)49 ± 80 (5-386) ^*AST ^* AST 23±7(14-40)23 ± 7 (14-40) 1286±3782(28-17240)1286 ± 3782 (28-17240) 76±65(21-293)76 ± 65 (21-293) 71±78(28-428)71 ± 78 (28-428) 질환의 원인Causes of Disease 알코올중독 및알코올성 질환Alcoholism and Alcoholic Diseases -- 33 -- 2222 HBV 감염HBV infection -- 55 2323 99 HCV 감염HCV infection -- -- 55 33 간 독소 원인(Toxic hepatitis)Toxic hepatitis -- 88 -- -- 기타Etc -- 55 -- -- ^* 모든 데이터는 '평균값±표준편차(범위)'의 형식으로 나타내었음 ^* All data are presented in the form of 'mean value ± standard deviation (range)'.

혈청 ALT와 AST(자가항체와 결합하지 않은 상태)의 측정을 위한 샌드위치 엘리자는 다음과 같이 수행하였다. 96 웰판에 2 ㎍/ml의 1차 항체 50 ㎕씩을 넣어 밤새 코팅한 후, 5 mg/ml의 피쉬 젤라틴(fish gelatin)이 포함된 PBST로 1시간 동안 블러킹(blocking) 하였다. 이어, 각 웰에 50㎕의 시료 혈청을 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척하고 바이오틴이 접합된 항 마우스 IgG 염소 항체를 1 ㎍/ml 농도로 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 다시 PBST로 3회 세척하고 HRP가 접합된 스트렙트아비딘(1 ㎍/ml)을 100ul씩 넣은 다음 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 충분히 세척한 후에 기질액을 첨가하고 450nm에서 흡광도를 측정하였다.Sandwich eliza for measurement of serum ALT and AST (unbound with autoantibodies) was performed as follows. 50 μl of the 2 μg / ml primary antibody was added to the 96 well plate and coated overnight, and then blocked with PBST containing 5 mg / ml of fish gelatin for 1 hour. Then, 50 μl of sample serum was added to each well and allowed to react for 2 hours. Washed three times with PBST and reacted for 2 hours by adding a biotin conjugated anti mouse IgG goat antibody at a concentration of 1 μg / ml. After washing three times with PBST again, 100 μl of HRP conjugated streptavidin (1 μg / ml) was added and reacted for 1 hour. After sufficient washing with PBST, the substrate solution was added and the absorbance was measured at 450 nm.

실시예 4. 효소-항체 복합체를 측정하는 샌드위치 엘리자법을 이용한 환자 시료중의 ALT 및 AST의 측정Example 4 Determination of ALT and AST in Patient Samples Using the Sandwich Eliza Method for Measuring Enzyme-Antibody Complexes

혈청 ALT와 AST의 측정을 위한 효소-항체 복합체의 측정에는 다음과 같은 방법을 사용하였다. 50㎕의 단일클론항체를 96 웰판에 넣고 밤새 코팅하고 1% 피쉬 젤라틴 용액(5% 슈크로스, PBST)으로 블러킹하였다. 희석하지 않은 혈청 시료 50㎕를 넣고 2시간 동안 반응시킨 후, PBST로 3회 세척하였다. 여기에 HRP가 접합된 항 인간 Ig 염소항체(goat anti-human immunoglobulin)를 50㎕씩 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 충분히 세척한 후에 기질액을 첨가하고 450nm에서 흡광도를 측정하였다.The following method was used to measure the enzyme-antibody complex for the measurement of serum ALT and AST. 50 μl of monoclonal antibody was placed in a 96 well plate and coated overnight and blocked with 1% fish gelatin solution (5% sucrose, PBST). 50 μl of undiluted serum sample was added and reacted for 2 hours, followed by washing three times with PBST. HRP-conjugated anti-human Ig goat antibody (goat anti-human immunoglobulin) was treated with 50 μl and reacted for 1 hour. After sufficient washing with PBST, the substrate solution was added and the absorbance was measured at 450 nm.

실시예 5. 샌드위치 엘리자법을 이용한 환자 시료중의 ALT 및 AST에 대한 자가항체의 측정Example 5 Measurement of Autoantibodies for ALT and AST in Patient Samples Using the Sandwich Eliza Method

ALT와 AST에 대한 자가항체(ALT 또는 AST와 결합하지 않고 단독으로 존재하는 형태)를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 사용하였다. PBS에 5 ㎍/ml 농도로 녹인 돼지 효소(ALT 또는 AST)를 96 웰판에 50㎕씩 넣어 밤새 코팅하고 1% 피쉬 젤라틴 용액으로 1시간 동안 블러킹 하였다. 여기에 혈청 시료를 50ul씩 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후 PBST로 3회 세척하였다. HRP가 접합된 항 인간 Ig 염소 항체를 처리하여 1시간 동안 반응시키고 충분히 세척하였다. 기질액을 첨가하여 발색반응이 일어난 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.The following method was used to measure autoantibodies against ALT and AST (forms that are present alone without binding to ALT or AST). 50 μl of porcine enzyme (ALT or AST) dissolved in PBS at a concentration of 5 μg / ml was coated overnight in 96 well plates and blocked for 1 hour with 1% fish gelatin solution. 50ul of serum samples were added thereto and reacted for 1 hour, and then washed three times with PBST. HRP conjugated anti human Ig goat antibody was treated and reacted for 1 hour and washed well. The absorbance was measured at 450 nm after the addition of the substrate solution.

실시예 6. 샌드위치 엘리자 방식에 적합한 1차, 2차 항체의 조합 검색Example 6 Combination Screening of Primary and Secondary Antibodies Suitable for a Sandwich Eliza Mode

샌드위치 엘리자 방식에 적합한, 즉 ALT 또는 AST 항원에 대한 감수성이 우수한 1차, 2차 항체의 조합을 찾기 위하여, 선발된 다양한 항체들을 각각 서로 1차, 2차 항체로서 번갈아 조합하여 면역분석을 실시하였고, 단, 정제한 단일클론항체는 바이오틴으로 표지하였다. 이는 단일클론항체들이 모두 마우스에서 생산된 것이므로 상호간의 교차반응을 막기 위한 것이다.In order to find a combination of primary and secondary antibodies suitable for the sandwich eliza method, ie, highly susceptible to ALT or AST antigens, immunoassay was performed by combining various selected antibodies as primary and secondary antibodies, respectively. However, purified monoclonal antibodies were labeled with biotin. This is to prevent cross-reaction with each other since all monoclonal antibodies are produced in mice.

항원 농도를 대비하기 위한 샌드위치 엘리자 방법의 표준곡선을 작성하기 위하여, 표준곡선작성을 위한 시액은 PBST 용액에 돼지의 ALT와 AST를 녹여서 준비하였는데, 이는 ALT와 AST를 포함하지 않은 혈청을 준비할 수가 없었기 때문이다. 표준곡선 작성실험 결과 샌드위치 엘리자에서의 ALT의 최저 검출한계는 약 0.5 ng/ml 이었으며, AST의 경우는 1 ng/ml인 것으로 나타났다. 표준곡선에 따르면 ALT의 경우, 혈청을 희석하지 않은 상태에서, 0.5~100 ng/ml의 범위가 유용 측정범위로 나타났으며, AST의 경우에는 1~200 ng/ml 범위에서 표준곡선의 직선성이 유지되었다(도 9 및 도 10).To prepare the standard curve of the sandwich Eliza method to prepare for antigen concentration, the test solution was prepared by dissolving pig ALT and AST in PBST solution, which could be used to prepare serum without ALT and AST. Because it was not. As a result of the standard curve preparation, the minimum detection limit of ALT in sandwich eliza was about 0.5 ng / ml, and that of AST was 1 ng / ml. According to the standard curve, in the case of ALT, the range of 0.5-100 ng / ml was found to be a useful measurement range without diluting serum. This was maintained (FIGS. 9 and 10).

이 표준곡선을 기초로 하여 측정한 결과, 다양한 항체 조합 중 가장 우수한 ALT 측정을 위한 조합으로는 13C1번과 15C2번 클론이, AST 측정을 위한 조합에는 22C25번과 1C5번 클론이 각각 1차 항체와 2차 항체로 선택되었다.Based on this standard curve, the 13C1 and 15C2 clones were used for the best ALT measurement among the various antibody combinations, and the 22C25 and 1C5 clones were used for the AST assay. It was chosen as a secondary antibody.

실시예 7. 면역학적 방법을 통한 혈청 ALT와 AST의 정량 및 효소활성도와의 상호관계 분석Example 7 Quantification of Serum ALT and AST and Analysis of Correlation with Enzyme Activity by Immunological Methods

실시예 3에 기술된 2중 샌드위치 엘리자 방법을 사용하여 정상인과 세 부류의 환자그룹(급성간염 환자군, 만성간염 환자군, 간경화 환자군)에 대해 혈청 ALT와 AST의 정량실험을 실시하였다. 실험결과 대부분의 정상인에서 낮은 수준의 단백질 양이 관찰되었는데, 이러한 결과는 기존의 효소활성도 측정결과와 일치하는 것이다. 정상인의 경우 혈청 ALT와 AST에 대한 효소활성수치와 단백질 양의 측정결과는 연령이나 성별에 따라 큰 차이를 나타내지 않았다(도 11 내지 도 14). 정상인의 경우 평균 33±10 ng/ml의 AST가 검출되었는데, 이것은 이전에 보고된 결과들, 84±18 ng/ml(Hirano, 1984)와 65~145 ng/ml(Niblock, 1986)보다 낮은 수치이다. 반면에 세 부류의 환자그룹에서는 많은 양의 AST가 검출되었는데, 급성간염 환자그룹이 가장 높은 AST 양을 보였으며, 만성간염 환자그룹이 그 뒤를 이었다. 간경화 환자그룹은 가장 낮은 양이 검출되었다(도 15). Quantitative tests of serum ALT and AST were performed on normal and three groups of patients (acute hepatitis patients, chronic hepatitis patients, liver cirrhosis patients) using the double sandwich eliza method described in Example 3. Experimental results showed that low levels of protein were observed in most normal subjects, which is in agreement with previous enzyme activity measurements. In normal subjects, enzyme activity and protein levels of serum ALT and AST did not show significant differences according to age or gender (FIGS. 11 to 14). In normal subjects, an average of 33 ± 10 ng / ml of AST was detected, which is lower than previously reported results, 84 ± 18 ng / ml (Hirano, 1984) and 65-145 ng / ml (Niblock, 1986). to be. On the other hand, a large amount of AST was detected in the three groups of patients, with the acute hepatitis group showing the highest amount of AST, followed by the chronic hepatitis group. The lowest amount was detected in the cirrhosis patient group (FIG. 15).

2중 샌드위치 엘리자 결과를 효소활성도 수치와 비교해 본 결과, 두 측정값 사이에 높은 상관관계가 있는 것으로 나타났다(도 16). 도 16은 혈청 AST의 효소활성수치와 효소단백질 농도 사이의 상관관계를 나타낸 것이다. 두 검사항목의 상관계수 r값은 0.931로 비교적 상관관계가 높은 것을 예시하고 있다. 효소활성수치는 log값으로 나타내었으며, 데이터의 통계적 처리에 있어서 P값은 0.0001보다 작다. 이와 같은 결과는 항체를 이용한 면역분석법이 기존의 생화학적 효소활성도 측정법을 대체할 수 있음을 보여주는 것이다.Comparing the results of the double sandwich ELISA with enzyme activity, the results showed a high correlation between the two measurements (FIG. 16). Figure 16 shows the correlation between the enzyme activity level and enzyme protein concentration of serum AST. The correlation coefficient r of the two test items is 0.931, which shows a relatively high correlation. Enzyme activity value is expressed as log value, and P value is less than 0.0001 in statistical processing of data. These results show that the immunoassay using antibodies can replace the conventional biochemical enzyme activity assay.

실시예 8. 다양한 간 질환자에서 나타나는 효소-항체 복합체의 항체유형별 특이성 측정Example 8 Determination of Specificity by Antibody Type of Enzyme-Antibody Complexes in Various Liver Diseases

정상인, 급성간염환자, 만성간염환자 및 간경화환자의 혈청내 존재하는 효소-항체 복합체를 자가항체 유형별로 정량적으로 측정하기 위하여 실시예 4에 기술된 엘리자법을 기초로 하고, 먼저 IgG 측정에는 2차 항체로 항-인간 IgG 염소 항체를 사용하였다. 실험결과, 대부분의 환자에게서 AST에 대한 AST-IgG 복합체가 발견되었으며, 더욱이 정상인 그룹에서도 AST-항체 복합체가 존재하는 것으로 나타났다. 전체적으로 환자그룹이 정상인 보다 높은 AST-IgG 복합체 수치를 보였으며, 만성간염 환자그룹에서 가장 높은 AST-IgG 복합체 수치를 보였다(도 17). 다음으로, 우리는 IgG 항체 이외에, IgM과 IgA 타입에서도 효소-항체 복합체를 이루는지 여부를 조사하였다. 그 결과, IgM과 IgA에 의해 형성된 효소-항체 복합체 역시 존재하며, 이들의 측정수치가 IgG의 수치보다 질병과의 상관관계가 높은 것으로 나타났다(도 18 및 도 19). 특히, 세포질형 AST-IgA 복합체의 경우, 환자그룹이 정상인 그룹보다 훨씬 높은 수치를 갖는 것으로 나타났다(도 19). 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 환자그룹에서는 혈청에 존재하는 AST 중 상당부분이 자가항체와 결합하여 AST-항체 복합체의 형태로 존재하는 것으로 추측되며, 여러 형태의 복합체 중에서도, AST-IgA 복합체가 정상인과 환자그룹을 구분하는데 있어 가장 좋은 표지인자가 될 것으로 판단되었다.In order to quantitatively measure enzyme-antibody complexes present in serum of normal, acute hepatitis patients, chronic hepatitis patients, and cirrhosis patients by autoantibody type, the ELISA method described in Example 4 was used. Anti-human IgG goat antibody was used as the antibody. As a result, AST-IgG complexes for AST were found in most patients, and moreover, AST-antibody complexes were also present in the normal group. Overall, the patient group showed higher AST-IgG complex levels than normal and the highest AST-IgG complex levels in the chronic hepatitis patient group (FIG. 17). Next, we examined whether enzyme-antibody complexes were formed in IgM and IgA types in addition to IgG antibodies. As a result, enzyme-antibody complexes formed by IgM and IgA were also present, and their measured values were higher in correlation with disease than IgG levels (FIGS. 18 and 19). In particular, for the cytoplasmic AST-IgA complex, the patient group was found to have significantly higher levels than the normal group (FIG. 19). Taken together, these results suggest that a significant proportion of the ASTs present in the serum are present in the form of AST-antibody complexes in combination with autoantibodies. Among the complexes, the AST-IgA complex is normal. It was judged to be the best marker in distinguishing between patients and patients.

ALT에 대하여 동일한 실험을 실시한 결과, ALT 역시 자가항체와 ALT-항체 복합체가 정상인과 환자그룹의 혈청 모두에 존재한다는 것을 알 수 있었다. 정상인과 환자그룹 간의 자가항체 및 효소-항체 복합체의 측정결과를 비교한 결과는 AST에서와 동일한 경향을 보였으며, 역시 ALT에서도 ALT-IgA 복합체가 간 질환 진단에 있어서 가장 좋은 표지인자가 될 수 있음을 보여주었다(도 20 내지 도 22).The same experiments with ALT showed that ALT also contained autoantibodies and ALT-antibody complexes in the serum of both normal and patient groups. The comparison of autoantibodies and enzyme-antibody complexes between normal and patient groups showed the same trends as in AST, and ALT-IgA complex may be the best marker for liver disease diagnosis in ALT. Was shown (FIGS. 20-22).

실시예 9. 다양한 간 질환자에서 나타나는 자가항체 유형별 특이성 측정Example 9 Measurement of Specificity by Type of Autoantibodies in Various Liver Diseases

혈청 내에 효소와 결합하지 않고 단독으로 존재하는 자가항체의 유형별 특이성을 조사하기 위하여 실시예 5에 기술하였듯이, 먼저 96-웰 바닥에 돼지 AST 단백질을 고정시키고 여기에 시료혈청을 반응시켜 혈청에 존재하는 항-AST 자가항체가 돼지 AST에 결합하도록 하였다. 결합된 자가항체를 인지하기 위한 2차 항체로서 항-인간 IgG(또는 IgM 이나 IgA) 염소 항체를 사용하였으며, 실험결과 모든 유형(IgG, IgM, IgA)의 자가항체가 정상인과 환자의 혈청에서 검출되었다. 자가항체의 측정수치와 간 질환과의 상관관계를 분석한 결과, 효소-항체 복합체의 경우와 유사한 경향을 나타내었다(도 23 내지 25). IgA 자가항체의 경우, 간경화 환자그룹에서 가장 높은 수치를 나타냈으며, 이어서 만성간염과 급성간염 환자그룹이 뒤를 이었다. 정상인 그룹의 경우 가장 낮은 수치를 기록하였다. ALT에 대한 자가항체에 대해서도 동일한 방식으로 조사하였으며, AST에서와 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 즉, 간경화 환자에게서 가장 높은 수치가 나타났으며, 뒤를 이어 만성간염, 급성간염환자 순으로 나타났고, 정상인 그룹이 가장 낮은 수치를 나타냈다(도 26 내지 28).As described in Example 5 to investigate the specificity of the type of autoantibodies which are present alone without binding to enzymes in the serum, the pig AST protein is first immobilized on the 96-well bottom and the sample serum is reacted to the Anti-AST autoantibodies were allowed to bind to porcine AST. Anti-human IgG (or IgM or IgA) goat antibody was used as a secondary antibody for recognizing bound autoantibodies, and the results showed that all types of autoantibodies (IgG, IgM, IgA) were detected in the serum of normal and patients. It became. As a result of analyzing the correlation between measured values of autoantibodies and liver disease, similar trends were observed with enzyme-antibody complexes (FIGS. 23 to 25). The highest levels of IgA autoantibodies were found in the cirrhosis patients group, followed by the chronic and acute hepatitis patients. The lowest value was recorded for the normal group. Autoantibodies against ALT were examined in the same manner and the same results as in AST were obtained. In other words, hepatic cirrhosis patients showed the highest values, followed by chronic hepatitis and acute hepatitis patients, and the normal group showed the lowest values (FIGS. 26 to 28).

실시예 10. ALT와 AST에 대한 IgA 자가항체와 간 질환 진행정도와의 상관관계 패턴 분석Example 10 Analysis of Correlation Patterns between IgA Autoantibodies and Liver Disease Progression for ALT and AST

세포질형 AST 및 ALT와 관련되어 본 발명에 기술된 면역분석법으로 측정 가능한 항목이 적어도 7가지 이상이 된다. AST 및 ALT 단백질이 그 하나이고, 세 종류의 AST- 및 ALT-항체 복합체와 다시 세 종류의 자가항체가 나머지 항목을 이룬다. 여기에 생화학적 방법에 의한 효소활성도 수치 역시 알 수 있기 때문에, 한 사람의 혈청에 대해 모두 8가지 항목의 분석결과를 얻을 수 있다. 본 발명자들은 앞서 나열한 여러 가지 분석항목의 결과를 다양하게 조합함으로써 간 질환의 정도를 예측하는데 가장 좋은 조합을 찾고자 하였다. AST 분석항목에 대해 여러 가지 조합을 시도한 결과, AST-IgA 복합체와 효소활성도 수치의 조합이 정상인과 환자그룹, 그리고 간 질환의 진행정도를 가장 잘 구별한다는 것을 발견하였다. 대부분의 급성간염 환자들은 높은 AST 효소활성도 수치를 보이는 대신 낮은 AST-IgA 복합체 수치를 나타내었다(도 29). 반면, 간경화 환자들은 낮은 효소활성도 수치와 높은 AST-IgA 복합체 수치를 나타내었다(도 30). 만성간염 환자의 경우 두 가지 변수에서 모두, 급성간염환자와 간경화 환자의 중간 값을 가지고 있었으며, 정상인의 경우 두 변수 모두에서 가장 낮은 수치를 나타내었다(도 31). <내용삭제> 통계적 데이터의 유의성을 입증하기 위하여 t-검정을 실시하였으며, p 값(p-value)은 p<0.05를 유의수준으로 삼았다.There are at least seven items that can be measured by the immunoassay described herein in connection with the cytoplasmic AST and ALT. AST and ALT proteins are one, and three kinds of AST- and ALT-antibody complexes and three kinds of autoantibodies make up the rest. In addition, the enzyme activity values obtained by the biochemical method can also be known, and thus, all 8 items can be obtained from a single serum. The present inventors have tried to find the best combination for predicting the degree of liver disease by various combinations of the results of the various analysis items listed above. Various combinations of AST assays have shown that the combination of AST-IgA complex and enzyme activity levels best distinguishes the progression of normal, patient and liver disease. Most acute hepatitis patients showed low AST-IgA complex levels instead of high AST enzyme activity levels (FIG. 29). In contrast, liver cirrhosis patients showed low enzyme activity and high AST-IgA complex levels (FIG. 30). In the case of chronic hepatitis patients, both variables had a median value between acute hepatitis patients and cirrhosis patients, and the normal group showed the lowest values in both variables (FIG. 31). In order to prove the significance of statistical data, t-test was performed, and p-value was defined as p <0.05 as the significance level.

이러한 결과로 볼 때, 간의 손상이 커질수록 혈청의 AST-IgA 복합체 수치가 올라간다는 것을 알 수 있다. ALT에 대한 분석항목의 조합에서도 AST에서와 동일한 경향이 나타남을 관찰하였다(도 32 내지 도 34).These results indicate that the greater the damage to the liver, the higher the serum AST-IgA complex level. It was observed that the same trends as in AST were also observed in the combination of assays for ALT (FIGS. 32 to 34).

결론적으로, 이와 같은 여러 간 질환자들, 즉 급성간염환자, 만성간염환자 및 간경화환자와 대조군으로서 정상인의 AST-IgA 복합체 수치 대 효소활성도를 조합하여 그래프로 도시해 본 결과, 도 35와 같은 질환 그룹별 위치가 지정되었다. 따라서, 피검자의 전혈 또는 혈청을 비롯한 혈액을 분석하여 효소-IgA 복합체의 수치와 효소활성도 수치를 알고 있다면, 피검자가 어느 간 질환 그룹에 속할지를 예측할 수 있을 것으로 기대한다.In conclusion, a combination of these liver diseases, namely, acute hepatitis patients, chronic hepatitis patients, and cirrhosis patients, as a control group, showed a graphical combination of AST-IgA complex levels and enzyme activity. The star location is specified. Therefore, if the analysis of the blood, including the whole blood or serum of the subject knows the level of enzyme-IgA complex and enzyme activity, it is expected that the subject can be predicted which liver disease group.

본 발명에서는 보다 정확한 면역분석법을 개발하기 위해, 먼저 사람의 ALT와 AST에 대한 단일클론항체를 제조하였으며, 이 항체를 이용하여 혈청에서 효소 단백질의 양을 측정할 수 있는 샌드위치 엘리자 방법을 개발하였다. 이 방법을 이용하여 혈청 ALT와 AST를 수 나노그람 수준까지 검출할 수 있었으며, ALT와 AST가 혈액에서 자가항체와 결합하여 다양한 형태의 효소-항체 복합체를 이루어 존재한다는 것을 발견하였다. 이러한 연구결과는 순환계에 존재하는 여러 가지 다른 효소의 양을 정확히 측정하는데 있어서도 새로운 방식의 분석방법에 대한 가능성을 보여주는 것으로 생각된다. 또한, 본 발명의 분석방법을 통해 혈청 AST의 효소활성수치와 효소단백질 농도 사이에 높은 상관관계가 존재한다는 것을 발견하였고, 특히 피검자의 혈청을 분석하여 효소-IgA 복합체의 수치와 효소활성도 수치를 알면, 다양한 간 질환자들의 AST-IgA 복합체 수치 대 효소활성도를 조합하여 도시한 그래프에 기초하여 피검자가 어느 간 질환 그룹에 속할지를 예측할 수 있을 것으로 추정된다.In the present invention, in order to develop a more accurate immunoassay, a monoclonal antibody against human ALT and AST was first prepared, and a sandwich eliza method for measuring the amount of enzyme protein in serum using the antibody was developed. Using this method, serum ALT and AST could be detected up to several nanogram levels, and ALT and AST were found to bind to autoantibodies in the blood to form various forms of enzyme-antibody complexes. These findings suggest the possibility of a new method of analysis in the accurate determination of the amount of different enzymes present in the circulation. In addition, the analysis method of the present invention found that a high correlation exists between the enzyme activity level and the enzyme protein concentration of serum AST. In particular, by analyzing the serum of the subject, the enzyme-IgA complex level and the enzyme activity value were known. In addition, it is estimated that the subject belongs to which liver disease group based on a graph showing a combination of AST-IgA complex level and enzyme activity of various liver disease patients.

도 1은 인간 ALT cDNA 유전자를 pET21a(+) 발현 벡터에 클로닝한 것을 보여주는 1.2% 아가로스겔 전기영동 사진.1 is a 1.2% agarose gel electrophoresis picture showing cloning of the human ALT cDNA gene into a pET21a (+) expression vector.

도 2는 재조합 인간 ALT 단백질의 대장균에서의 발현 결과를 나타내는 SDS-PAGE 사진.2 is an SDS-PAGE photograph showing the results of expression in E. coli of recombinant human ALT protein.

도 3은 본 발명에서 제조된 단일클론항체 생산 세포주들의 돼지 ALT 및 인간 ALT 항원에 대한 반응성을 비교한 막대그래프.Figure 3 is a bar graph comparing the reactivity to the porcine ALT and human ALT antigen of the monoclonal antibody-producing cell lines prepared in the present invention.

도 4는 본 발명의 단일클론 항체가 인간 ALT 단백질에 결합하는 것을 보여주는, 상기 항체를 이용하여 돼지 ALT와 인간 ALT를 분석한 웨스턴 블럿 사진.4 is a Western blot photograph of the analysis of porcine ALT and human ALT using the antibody, showing that the monoclonal antibody of the present invention binds to human ALT protein.

도 5는 본 발명의 단일클론 항체가 세포질형 ALT에 대해 반응성임을 입증하는 웨스턴 블럿 사진.5 is a Western blot photograph demonstrating that the monoclonal antibody of the present invention is responsive to cytoplasmic ALT.

도 6은 본 발명에서 제조된 단일클론항체 생산 세포주들의 돼지 AST 및 인간 AST 항원에 대한 반응성을 비교한 막대그래프.Figure 6 is a bar graph comparing the reactivity to the porcine AST and human AST antigen of the monoclonal antibody-producing cell lines prepared in the present invention.

도 7은 본 발명의 단일클론 항체가 인간 AST 단백질에 결합하는 것을 보여주는, 상기 항체를 이용하여 돼지 AST 및 인간 AST 단백질을 분석한 웨스턴 블럿 사진.7 is a Western blot photograph of the analysis of porcine AST and human AST protein using the antibody, showing that the monoclonal antibody of the present invention binds to the human AST protein.

도 8은 본 발명의 단일클론 항체가 세포질형 AST에 대해 반응성임을 입증하는 웨스턴 블럿 사진.8 is a Western blot photograph demonstrating that the monoclonal antibody of the present invention is reactive to cytoplasmic AST.

도 9는 돼지 ALT 단백질을 이용하여 샌드위치 엘리자 방법으로 작도한 항원-항체반응 표준 곡선.9 is a standard curve of antigen-antibody response constructed by Sandwich Eliza method using porcine ALT protein.

도 10은 돼지 AST 단백질을 이용하여 샌드위치 엘리자 방법으로 작도한 항원-항체반응 표준 곡선.10 is an antigen-antibody response standard curve constructed by the sandwich Eliza method using porcine AST protein.

도 11은 정상인의 나이와 성별에 따른 혈청 ALT의 효소활성수치를 측정한 그래프.Figure 11 is a graph measuring the enzyme activity of serum ALT according to age and sex of normal people.

도 12는 정상인의 나이와 성별에 따른 혈청 AST의 효소활성수치를 측정한 그래프.12 is a graph measuring the enzyme activity level of serum AST according to the age and sex of a normal person.

도 13은 정상인의 나이와 성별에 따른 혈청 ALT의 양을 샌드위치 엘리자 방법으로 측정한 그래프.Figure 13 is a graph measuring the amount of serum ALT according to the age and sex of a normal person by the sandwich Eliza method.

도 14는 정상인의 나이와 성별에 따른 혈청 AST의 양을 샌드위치 엘리자 방법으로 측정한 그래프.14 is a graph measuring the amount of serum AST according to the age and sex of a normal person by the sandwich Eliza method.

도 15는 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 환자의 혈청에서 세포질형 AST의 농도를 측정한 그래프.Figure 15 is a graph measuring the concentration of cytoplasmic AST in the serum of normal people and patients by the sandwich Eliza method.

도 16은 혈청 AST의 효소활성수치와 효소단백질 농도 사이의 상관관계를 나타낸 그래프.Figure 16 is a graph showing the correlation between the enzyme activity level and enzyme protein concentration of serum AST.

도 17은 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서 AST-IgG 복합체 양을 측정한 그래프.Figure 17 is a graph measuring the amount of AST-IgG complex in the serum of normal people and liver disease by the sandwich Eliza method.

도 18은 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서 AST-IgM 복합체의 양을 측정한 그래프.18 is a graph measuring the amount of AST-IgM complex in the serum of normal people and liver disease by the sandwich Eliza method.

도 19는 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서 AST-IgA 복합체의 양을 측정한 그래프.19 is a graph measuring the amount of AST-IgA complex in the serum of normal people and liver disease by the sandwich Eliza method.

도 20은 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서 ALT-IgG 복합체의 양을 측정한 그래프.20 is a graph measuring the amount of ALT-IgG complex in the serum of normal and liver disease by the sandwich Eliza method.

도 21은 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서 ALT-IgM 복합체의 양을 측정한 그래프.Figure 21 is a graph measuring the amount of ALT-IgM complex in the serum of normal and liver disease by sandwich Eliza method.

도 22는 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서 ALT-IgA 복합체의 양을 측정한 그래프.Figure 22 is a graph measuring the amount of ALT-IgA complex in the serum of normal people and liver disease by the sandwich Eliza method.

도 23은 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서, AST에 대한 IgG형 자가항체의 양을 측정한 그래프.Figure 23 is a graph measuring the amount of IgG type autoantibodies to AST in the serum of normal and liver disease by the sandwich Eliza method.

도 24는 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서, AST에 대한 IgM형 자가항체의 양을 측정한 그래프.24 is a graph measuring the amount of IgM type autoantibodies against AST in the serum of normal and liver disease by sandwich Eliza method.

도 25는 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서, AST에 대한 IgA형 자가항체의 양을 측정한 그래프.25 is a graph measuring the amount of IgA type autoantibodies to AST in the serum of normal people and liver disease by the sandwich Eliza method.

도 26은 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서, ALT에 대한 IgG형 자가항체의 양을 측정한 그래피.Figure 26 is a measure of the amount of IgG-type autoantibodies to ALT in the serum of normal and liver disease by sandwich Eliza method.

도 27은 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서, ALT에 대한 IgM형 자가항체의 양을 측정한 그래프.Figure 27 is a graph measuring the amount of IgM type autoantibodies against ALT in the serum of normal and liver disease by sandwich eliza method.

도 28은 샌드위치 엘리자 방법으로 정상인과 간 질환자의 혈청에서, ALT에 대한 IgA형 자가항체의 양을 측정한 그래프.Figure 28 is a graph measuring the amount of IgA type autoantibodies against ALT in the serum of normal and liver disease by sandwich eliza method.

도 29는 정상인과 급성간염환자 혈청의 효소활성수치와 AST-IgA 복합체 수치를 동시에 나타낸 그래프.29 is a graph showing the enzymatic activity and AST-IgA complex values of serum of normal and acute hepatitis patients at the same time.

도 30은 정상인과 간경화 환자 혈청의 효소활성수치와 AST-IgA 복합체 수치를 동시에 나타낸 그래프.30 is a graph showing the enzyme activity and AST-IgA complex levels of serum of normal and liver cirrhosis patients at the same time.

도 31은 정상인과 만성간염환자 혈청의 효소활성수치와 AST-IgA 복합체 수치를 동시에 나타낸 그래프.FIG. 31 is a graph showing the enzyme activity and AST-IgA complex levels in serum of normal and chronic hepatitis patients.

도 32는 정상인과 급성간염환자 혈청의 효소활성수치와 ALT-IgA 복합체 수치를 동시에 나타낸 그래프.32 is a graph showing the enzymatic activity and ALT-IgA complex values of serum of normal and acute hepatitis patients at the same time.

도 33은 정상인과 만성간염환자 혈청의 효소활성수치와 ALT-IgA 복합체 수치를 동시에 나타낸 그래프.33 is a graph showing the enzyme activity and ALT-IgA complex levels of normal and chronic hepatitis serum.

도 34는 정상인과 간경화환자 혈청의 효소활성수치와 ALT-IgA 복합체 수치를 동시에 나타낸 그래프.34 is a graph showing the enzyme activity and ALT-IgA complex values of serum of normal and liver cirrhosis patients at the same time.

도 35는 정상인과 간 질환자 혈청의 효소활성수치와 AST-IgA 복합체 수치 사이의 상호 특이성 패턴을 나타낸 그래프.FIG. 35 is a graph showing the interspecific pattern between enzyme activity and AST-IgA complex levels in normal and liver disease serum.

<110> BODITECH INC. <120> METHODS FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF SERUM ENZYMES USING IMMUNOASSAY AND METHODS FOR DIAGNOSIS OF HEPATIC DISEASE THEREBY <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALT forward primer <400> 1 atagaattca tggcctcgag cacaggtgac cgg 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALT reverse primer <400> 2 agtaagcttg gagtactcga gggtgaactt ggc 33 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AST forward primer <400> 3 gaattcatgg cacctccgtc agtctttgc 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AST reverse primer <400> 4 ctcgagctgg attttggtga ctgcttcat 29<110> BODITECH INC. <120> METHODS FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF SERUM ENZYMES USING IMMUNOASSAY AND METHODS FOR DIAGNOSIS OF HEPATIC DISEASE THEREBY <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALT forward primer <400> 1 atagaattca tggcctcgag cacaggtgac cgg 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALT reverse primer <400> 2 agtaagcttg gagtactcga gggtgaactt ggc 33 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AST forward primer <400> 3 gaattcatgg cacctccgtc agtctttgc 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AST reverse primer <400> 4 ctcgagctgg attttggtga ctgcttcat 29

Claims

Monoclonal antibodies against alanine aminotransferase (ALT) or asphaltate aminotransferase (AST) were prepared, and hybridoma cell lines producing this monoclonal antibody were prepared and obtained from the hybridoma cell culture. And detecting monoclonal antibodies that are highly reactive with human ALT or AST proteins and reacting with blood samples of subjects by sandwich enzyme-mediated immunoassay (ELISA) to detect serum enzymes ALT or AST that do not bind autoantibodies. To quantitatively measure ALT or AST in the blood of the subject.

The method of claim 1, wherein ALT or AST of pig is used as an immunogen for producing the monoclonal antibody, wherein the ALT or AST in blood of the subject is quantitatively measured.

The human ALT protein used for selecting monoclonal antibodies is a recombinant expression product of a gene amplified from a PCR reaction using primers set forth in SEQ ID NOs: 1 and 2, and the human used to select monoclonal antibodies. A method for quantitatively measuring ALT or AST in blood of a subject, characterized in that the AST protein is a recombinant expression product of a gene amplified from a PCR reaction using the primers set forth in SEQ ID NOs: 3 and 4.

The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the subject is a patient suspected of having liver disease, wherein the ALT or AST in the blood of the subject is quantitatively measured.

The method of claim 4, wherein the liver disease comprises acute hepatitis patients, chronically infected patients, or liver cirrhosis patients.

The method of claim 1, wherein the blood sample of the subject comprises whole blood or serum.

ALT- or AST present in the sample by reacting with a blood sample of the subject by a sandwich enzyme mediated immunoassay (ELISA) using a monoclonal antibody prepared in any one of claims 1 to 3. -Quantitatively measuring the ALT- or AST-antibody complex in the blood of the subject, including measuring the concentration of the antibody complex.

8. The ALT- or AST in the blood of a subject according to claim 7, wherein the enzyme-antibody complex comprises ALT-IgG, ALT-IgM, ALT-IgA, AST-IgG, AST-IgM or AST-IgA. -Quantitative determination of antibody complexes.

8. The ALT- or AST- in blood of a subject according to claim 7, wherein the sandwich enzyme mediated immunoassay comprises an anti-human IgG, IgM or IgA goat antibody, rabbit antibody, or mouse antibody as the detector antibody. Method for quantitatively measuring antibody complexes.

Including using the pig ALT or AST protein as an antigen and reacting with the blood sample of the subject by sandwich enzyme-mediated immunoassay (ELISA) to determine the presence and concentration of anti-ALT or anti-AST autoantibodies in the sample, A method for quantitatively measuring autoantibodies to ALT or AST in a subject's blood.

The method of claim 10, wherein the sandwich enzyme-mediated immunoassay comprises an anti-human IgG, IgM or IgA goat antibody, rabbit antibody, or mouse antibody as a detector antibody. How to quantitatively measure autoantibodies.

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