JPWO2009044561A1 - Anti-proNT / NMN monoclonal antibody - Google Patents

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徹 望月
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Abstract

proNeurotensin/Neuromedin N（ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ）タンパクに対する特異的モノクローナル抗体と、それを用いた高感度のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの検出／測定法を確立することにより、小細胞肺癌の早期診断法等を提供するものである。ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクのアミノ酸配列−１〜３８番、又は８〜８７番のペプチド断片を含む抗原を、マウスに免疫することにより７種類の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体を作製し、さらにそれらの抗体を用いたｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ測定法を確立した。Providing a specific monoclonal antibody against proNeurotensin / Neuromedin N (proNT / NMN) protein and a highly sensitive proNT / NMN protein detection / measurement method by using it to provide an early diagnosis method for small cell lung cancer Is. Seven types of anti-proNT / NMN monoclonal antibodies were prepared by immunizing mice with an antigen containing the peptide fragment of amino acid sequence Nos. 1-38 or Nos. 8-87 of proNT / NMN protein. The proNT / NMN measurement method used was established.

Description

本発明は、小細胞肺癌の腫瘍マーカーであるproNeurotensin/Neuromedin N（ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ）のモノクローナル抗体と、それを用いたｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの検出／測定法や、小細胞肺癌の診断方法・診断キットに関する。   The present invention relates to a proNeurotensin / Neuromedin N (proNT / NMN) monoclonal antibody which is a tumor marker for small cell lung cancer, a proNT / NMN protein detection / measurement method using the same, and a diagnostic method / diagnosis kit for small cell lung cancer About.

癌治療における診断・判定法として血中腫瘍マーカーの検出・計測を挙げることができる。腫瘍マーカーは腫瘍または腫瘍と反応した正常細胞が作る物質の中で、血中や尿中などに放出され腫瘍の体外診断を可能としているものである。   Examples of diagnosis / determination methods in cancer treatment include detection and measurement of blood tumor markers. A tumor marker is a substance produced by a tumor or normal cells that have reacted with the tumor, and is released into blood, urine, etc. to enable in vitro diagnosis of the tumor.

上記腫瘍マーカーに関しては、乳癌患者と正常人の胸部組織に差異的に発現する遺伝子を使用した悪性腫瘍、特に乳癌を予想、診断 、予後判定、予防および処置するための新規な組成物、方法および使用（例えば、特許文献１参照）や、肝炎ウイルスの感染に起因し慢性肝炎または肝硬変を発症した患者に対し、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を評価することによって肝臓癌の発癌リスクを評価する方法（例えば、特許文献２参照）や、その遺伝子産物がＣＬＬ細胞および前立腺癌細胞の新生物性または腫瘍形成性増殖を抑制するｍｉＲ１５およびｍｉＲ１６のコピー数、変異状態または遺伝子発現を検出することによる慢性リンパ性白血病または前立腺癌の診断方法（例えば、特許文献３参照）や、無症候性期または初期段階の患者における発癌過程の存在を検出するのに適当な迅速な癌の診断方法や、癌患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素ＩＩの活性化化合物、すなわち腫瘍マーカー、該癌の診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者の癌を検出することを特徴とする癌の処置方法ならびに該癌の診断方法を行うためのキット（例えば、特許文献４参照）等が知られている。   Regarding the tumor marker, a novel composition, method and method for predicting, diagnosing, prognosing, preventing and treating malignant tumors, particularly breast cancer, using genes differentially expressed in breast tissue of breast cancer patients and normal humans Carcinogenesis of liver cancer by evaluating the base sequence of mitochondrial DNA of patients infected with hepatitis virus against patients who have developed chronic hepatitis or cirrhosis due to use (for example, see Patent Document 1) or infection with hepatitis virus A method for assessing risk (see, for example, Patent Document 2), and the copy number, mutation state, or gene expression of miR15 and miR16 whose gene product suppresses neoplastic or tumorigenic growth of CLL cells and prostate cancer cells. Diagnosis of chronic lymphocytic leukemia or prostate cancer by detection (for example, see Patent Document 3), or asymptomatic A rapid cancer diagnostic method suitable for detecting the presence of a carcinogenic process in a patient in sexual phase or early stage, or an activated compound of carbonic anhydrase II present in the serum of a cancer patient, ie a tumor marker, the cancer A method for treating cancer characterized by detecting a cancer in an asymptomatic or early stage patient according to the diagnostic method, and a kit for performing the method for diagnosing the cancer (for example, see Patent Document 4) It has been.

また、肺癌は小細胞癌と非小細胞癌の２つの型に大きく分類され、非小細胞癌はさらに腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌の３タイプに分類され、それぞれのタイプによって発生する部位がある程度決まっており、小細胞癌と扁平上皮癌は肺門部に、腺癌と大細胞癌は肺野部にできやすい肺癌といわれている。肺癌に関して、小細胞肺癌 (ＳＣＬＣ）を患う患者を治療し、またはＳＣＬＣ腫瘍の存在を検出するための、比較的短いペプチド、詳細には、α−コノトキシンペプチドＭＩＩおよびＵ００２を使用して小細胞肺癌の存在または位置を決定することにより検出する方法（例えば、特許文献５参照）や、血清中の優れた肺癌マーカーとしての血管透過性因子を測定することにより、特に化学発光検出系酵素免疫測定法を用いて高感度で測定することにより、肺癌の早期診断、さらには治療効果の判定、経過観察を行う方法（例えば、特許文献６参照）等が知られている。   In addition, lung cancer is broadly classified into two types, small cell cancer and non-small cell cancer, and non-small cell cancer is further classified into three types, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, and large cell carcinoma, and occurs depending on each type. The site is determined to some extent, and small cell carcinoma and squamous cell carcinoma are said to be easily formed in the hilar region, and adenocarcinoma and large cell carcinoma are easily found in the lung region. With respect to lung cancer, small cells using relatively short peptides, specifically α-conotoxin peptides MII and U002, for treating patients suffering from small cell lung cancer (SCLC) or detecting the presence of SCLC tumors A method for detecting lung cancer by determining the presence or location of lung cancer (see, for example, Patent Document 5), and measuring vascular permeability factor as an excellent lung cancer marker in serum. A method of performing early diagnosis of lung cancer, determination of therapeutic effect, follow-up observation (for example, see Patent Document 6) and the like by measuring with high sensitivity using a method is known.

特開２００４−１５９６４０号公報JP 2004-159640 A 特開２００４−１２１０２９号公報JP 2004-121029 A 特表２００６−５０６４６９号公報JP 2006-506469 A 特表２００１−５２４８１５号公報JP-T-2001-524815 特表平１１−５０６７３７号公報Japanese National Patent Publication No. 11-506737 特開平９−３３５３１号公報JP 9-33531 A

現在日本において肺癌は男性の癌死亡率の第１位であり、女性では胃癌に次いで第２位であることから、肺癌特異的な腫瘍マーカーを開発することにより、肺癌の早期診断・治療成績の向上が期待されていた。本発明の課題は、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクに対する特異的モノクローナル抗体と、それを用いた高感度のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの検出／測定法を確立することにより、小細胞肺癌の早期診断法等を提供することにある。   Currently, lung cancer is the first cancer mortality rate in men in Japan, and second in women after gastric cancer. By developing a lung cancer-specific tumor marker, early diagnosis and treatment results of lung cancer Improvement was expected. An object of the present invention is to provide a method for early diagnosis of small cell lung cancer by establishing a specific monoclonal antibody against proNT / NMN protein and a highly sensitive proNT / NMN protein detection / measurement method using the same. There is.

本発明者らは、先にヒト肺癌由来培養細胞株の培養上清に放出されるたんぱく質・ペプチドのプロテオーム解析を行い、小細胞肺癌培養細胞株であるＳＢＣ３の培養上清にｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが放出されているが、小細胞肺癌以外の肺癌細胞株（腺癌・大細胞癌・扁平上皮癌）の培養上清にはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが検出されないとの知見を得て、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが有用な腫瘍マーカーであることを明らかにしている（特願２００７−０８６８３１号公報）。そこで、本発明者らは、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクのアミノ酸配列−１〜３８番（配列番号２）、又は８〜８７番（配列番号３）のペプチド断片を含む抗原を、マウスに免疫することにより７種類の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体を作製し、さらに、それらの抗体を用いたｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ測定法を確立し、本発明を完成するに至った。   The present inventors previously conducted proteomic analysis of proteins and peptides released into the culture supernatant of human lung cancer-derived cultured cell lines, and proNT / NMN was released into the culture supernatant of SBC3, a small cell lung cancer cultured cell line. However, proNT / NMN is useful because it has been found that proNT / NMN is not detected in the culture supernatant of lung cancer cell lines other than small cell lung cancer (adenocarcinoma, large cell carcinoma, squamous cell carcinoma). It is revealed that it is a tumor marker (Japanese Patent Application No. 2007-086831). Therefore, the present inventors immunized mice with an antigen containing a peptide fragment of amino acid sequence Nos. 1 to 38 (SEQ ID NO: 2) or 8 to 87 (SEQ ID NO: 3) of proNT / NMN protein. Seven types of anti-proNT / NMN monoclonal antibodies were prepared, and a proNT / NMN measurement method using these antibodies was further established to complete the present invention.

すなわち本発明は、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１や、（２）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２や、（３）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）及び配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号４〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３や、（４）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４に関する。   That is, the present invention relates to (1) a monoclonal antibody produced by immunization with an antigen comprising the peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein the peptide fragment proNT / NMN Monoclonal antibody SCC-MGD-001, which binds to (aa-1 to 38) and does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 8, and (2) SEQ ID NO: 2 A monoclonal antibody prepared by immunization with an antigen containing a peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) having the amino acid sequence shown below, which binds to the peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) and has a sequence It does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequences shown in Nos. 3 to 8 A monoclonal antibody prepared by immunization with an antigen comprising a monoclonal antibody SCC-MGD-002 and (3) a peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; It binds to the fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) and the peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 to 8 A monoclonal antibody produced by immunization with an antigen comprising the monoclonal antibody SCC-MGD-003 and (4) the peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein the peptide Ligated with the fragment proNT / NMN (aa-1 to 38), SEQ ID NO: 3 Relates to a monoclonal antibody SCC-MGD-004, characterized in that does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequence of.

また本発明は、（５）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５や、（６）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６や、（７）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７に関する。   The present invention also relates to (5) a monoclonal antibody produced by immunization with an antigen containing the peptide fragment proNT / NMN (aa8 to 87) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein the peptide fragment proNT / NMN (aa8 To 87), and a peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 5 to 7, and does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4 and 8 A monoclonal antibody prepared by immunization with an antigen containing MGD-005 or (6) a peptide fragment proNT / NMN (aa 8 to 87) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein the peptide fragment proNT / NMN ( aa8-87) and the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 5-7. A monoclonal antibody SCC-MGD-006 characterized by binding to a peptide fragment and not binding to any peptide fragment consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4 and 8; and (7) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. A monoclonal antibody produced by immunization with an antigen containing the peptide fragment proNT / NMN (aa 8 to 87), comprising the peptide fragment proNT / NMN (aa 8 to 87) and the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 5 to 7 The monoclonal antibody SCC-MGD-007 is characterized in that it binds to any peptide fragment consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, and 8.

また本発明は、（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定する方法や、（９）ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定する方法が、サンドイッチＥＬＩＳＡ法であることを特徴とする上記（８）記載の方法や、（１０）上記（１）〜（４）のいずれか記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体と、上記（５）〜（７）のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体とを、組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法であることを特徴とする上記（９）記載の方法や、（１１）上記（１）〜（７）のいずれか記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株に関する。   The present invention also provides (8) proNT / NMN protein detection / measurement using one or more monoclonal antibodies selected from the monoclonal antibodies according to any one of (1) to (7) above. And (9) the method of detecting / measuring proNT / NMN protein is a sandwich ELISA method, or (10) the method of (1) to (4) above, A combination of one or more monoclonal antibodies selected from any one of the monoclonal antibodies and one or more monoclonal antibodies selected from the monoclonal antibodies described in any of (5) to (7) above Or (11) any one of (1) to (7) above, wherein the sandwich ELISA method is used. Producing monoclonal antibodies relates to a hybridoma cell line or cell lines derived therefrom.

さらに本発明は、（１２）上記（１）〜（７）のいずれか記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を用いて、試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定することを特徴とする小細胞肺癌の診断方法や、（１３）上記（１）〜（７）のいずれか記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を備え、試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定しうることを特徴とする小細胞肺癌の診断キットに関する。   Furthermore, the present invention (12) detects / measures proNT / NMN protein in a sample using one or more monoclonal antibodies selected from the monoclonal antibodies according to any one of (1) to (7) above. A diagnostic method for small cell lung cancer, (13) one or more monoclonal antibodies selected from the monoclonal antibodies according to any one of (1) to (7) above, and proNT / The present invention relates to a diagnostic kit for small cell lung cancer, which is capable of detecting / measuring NMN protein.

ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの構造と本発明で抗原として用いた領域を示す図である。It is a figure which shows the structure of proNT / NMN protein, and the area | region used as an antigen by this invention. 本発明で得られた８種の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、小細胞癌由来細胞株であるＳＢＣ３細胞の無血清培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの発現を検出した結果を示す図である。Results of detection of proNT / NMN protein expression in the serum-free culture supernatant of SBC3 cells, a cell line derived from small cell carcinoma, by Western blotting using the eight anti-proNT / NMN monoclonal antibodies obtained in the present invention FIG. 本発明で得られた８種の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、小細胞癌由来細胞株であるＳＢＣ３細胞の細胞抽出液中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの発現を検出した結果を示す図である。The result of having detected the expression of proNT / NMN protein in the cell extract of SBC3 cell which is a cell line derived from small cell carcinoma by Western blotting using 8 kinds of anti-proNT / NMN monoclonal antibodies obtained in the present invention is shown. FIG. 本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４を用いたＥＬＩＳＡにより、ＳＢＣ３細胞の無血清培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの濃度を測定した結果を示す図である。The proNT / NMN monoclonal antibodies SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, and SCC-MGD-004 of the present invention were subjected to ELISA using the proNT / S in the serum-free culture supernatant of SBC3 cells. It is a figure which shows the result of having measured the density | concentration of NMN protein. 本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４を用いたＥＬＩＳＡにより、培養液の影響を検討した結果を示す図である。The figure which shows the result of having examined the influence of the culture solution by ELISA using the anti-proNT / NMN monoclonal antibodies SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, and SCC-MGD-004 of the present invention. is there. エピトープ解析に用いたペプチドを示す図である。It is a figure which shows the peptide used for the epitope analysis. エピトープ解析の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of an epitope analysis. エピトープ解析の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of an epitope analysis. 本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４を用いたＥＬＩＳＡによる標準曲線を示す図である。標準物質はそれぞれブロックで囲まれた中に記載されている。It is a figure which shows the standard curve by ELISA using the anti-proNT / NMN monoclonal antibodies SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, and SCC-MGD-004 of the present invention. Each standard is listed in a block. 本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７を用いたＥＬＩＳＡによる標準曲線を示す図である。標準物質はそれぞれブロックで囲まれた中に記載されている。It is a figure which shows the standard curve by ELISA using the anti-proNT / NMN monoclonal antibodies SCC-MGD-005, SCC-MGD-006, and SCC-MGD-007 of the present invention. Each standard is listed in a block. 本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２及びＳＣＣ−ＭＧＤ−００５を用いて、ＳＢＣ３細胞の培養上清（希釈倍率１〜１０７）中のｐｒｏＮＴ／ＮＭタンパク濃度を測定した結果を示す図である。The proNT / NM protein concentration in the culture supernatant (dilution factor 1 to 107) of SBC3 cells is shown using the anti-proNT / NMN monoclonal antibodies SCC-MGD-002 and SCC-MGD-005 of the present invention. FIG. 本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２及びＳＣＣ−ＭＧＤ−００５を用いて、小細胞癌由来細胞株であるＳＢＣ１、ＳＢＣ２、ＳＢＣ３、ＳＢＣ５、ＮＣＩ−Ｈ６９、及び対照としての大細胞癌由来細胞株であるＮＣＩ−Ｈ６６１、Ｌｕ６５、Ｌｕ９９の無血清培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ免疫活性を測定した結果を示す図である。Using the anti-proNT / NMN monoclonal antibodies SCC-MGD-002 and SCC-MGD-005 of the present invention, small cell carcinoma-derived cell lines SBC1, SBC2, SBC3, SBC5, NCI-H69, and large cells as controls It is a figure which shows the result of having measured the proNT / NMN immunoactivity in the serum-free culture supernatant of NCI-H661, Lu65, and Lu99 which are cancer origin cell lines. 本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２を用いたウエスタンブロッティングにより、各種肺癌細胞株の各無血清培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの発現を検出した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having detected the expression of proNT / NMN protein in each serum-free culture supernatant of various lung cancer cell lines by Western blotting using the anti-proNT / NMN monoclonal antibody SCC-MGD-002 of the present invention.

本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原をマウスに免疫することにより作製されたモノクローナル抗体であり、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクに由来するペプチド断片である、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）：配列番号２、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜３８）：配列番号４、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）：配列番号３、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）：配列番号５、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）：配列番号６、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）：配列番号７、及びｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ６６〜８７）：配列番号８のうち、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１はｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２はｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３はｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）及びｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（８〜８７）を、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４はｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を、それぞれインビトロで認識する。これらＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４が認識するエピトープは、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクのアミノ酸配列−１〜７番にあると推定される。   The anti-proNT / NMN monoclonal antibody, SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, and SCC-MGD-004 of the present invention are peptide fragments proNT / NMN consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. ProNT / NMN (aa-1 to 38), which is a monoclonal antibody produced by immunizing mice with an antigen containing (aa-1 to 38) and is a peptide fragment derived from proNT / NMN protein: SEQ ID NO: 2, proNT / NMN (aa 26-38): SEQ ID NO: 4, proNT / NMN (aa 8-87): SEQ ID NO: 3, proNT / NMN (aa 26-87): SEQ ID NO: 5, proNT / NMN (aa 39-87): SEQ ID NO: 6, proNT / NMN (aa 47-87): SEQ ID NO: 7, and roNT / NMN (aa66 to 87): Among SEQ ID NO: 8, SCC-MGD-001 is proNT / NMN (aa-1 to 38), and SCC-MGD-002 is proNT / NMN (aa-1 to 38). , SCC-MGD-003 recognizes proNT / NMN (aa-1 to 38) and proNT / NMN (8 to 87), and SCC-MGD-004 recognizes proNT / NMN (aa-1 to 38) in vitro. To do. The epitope recognized by these SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, and SCC-MGD-004 is presumed to be in amino acid sequences -1 to 7 of the proNT / NMN protein.

また、本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原をマウスに免疫することにより作製されたモノクローナル抗体であり、これら３種の抗体は、上記ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクに由来する７種のペプチド断片のうちのｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）、及びｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）をインビトロで認識する。これらＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７が認識するエピトープは、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクのアミノ酸配列４７〜６６番にあると推定される。   In addition, the anti-proNT / NMN monoclonal antibody, SCC-MGD-005, SCC-MGD-006, and SCC-MGD-007 of the present invention are peptide fragments proNT / NMN (aa8 to 87 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3). These three antibodies are proNT / NMN (aa8-87) of the seven peptide fragments derived from the proNT / NMN protein. , ProNT / NMN (aa 26-87), proNT / NMN (aa 39-87), and proNT / NMN (aa 47-87) are recognized in vitro. The epitope recognized by these SCC-MGD-005, SCC-MGD-006, and SCC-MGD-007 is presumed to be in the amino acid sequence 47-66 of the proNT / NMN protein.

本発明のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮを検出／測定する方法としては、上記本発明のモノクローナル抗体 、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントを用いる方法であれば特に制限されるものではなく、したがって、本発明のモノクローナル抗体には、これらモノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントも便宜上含まれる。これら本発明のモノクローナル抗体等を用いて、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の免疫学的測定方法を行うことによりｐｒｏＮＴ／ＮＭＮを特異的かつ正確に測定することができる。例えば、固相化された本発明の第１のモノクローナル抗体と、これらモノクローナル抗体とは認識部位を異にする、標識化された第２のモノクローナル抗体とを用いる方法を挙げることができる。以下、かかるｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを認識する本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法及びサンドイッチＥＬＩＳＡ法について説明する。   The method for detecting / measuring proNT / NMN of the present invention is not particularly limited as long as it uses the monoclonal antibody of the present invention and an antibody fragment containing an antibody binding site consisting of the variable region of the monoclonal antibody. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention includes an antibody fragment containing an antibody binding site consisting of the variable region of these monoclonal antibodies for convenience. Using these monoclonal antibodies of the present invention, proNT / NMN is made specific by performing immunological measurement methods such as RIA method, ELISA method, fluorescent antibody method, plaque method, spot method, hemagglutination method, octalony method, etc. Can be measured accurately and accurately. For example, a method using a solid-phased first monoclonal antibody of the present invention and a labeled second monoclonal antibody having a different recognition site from these monoclonal antibodies can be mentioned. Hereinafter, a direct competitive ELISA method and a sandwich ELISA method using the monoclonal antibody of the present invention that recognizes the proNT / NMN protein will be described.

直接競合ＥＬＩＳＡ法では、抗マウスＩｇＧ抗体を担体に固相化（固相化二次抗体）する。これにヒト血液（血清）や尿等の検体、酵素標識抗原、及び抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体（一次抗体）を加え、抗体抗原反応により形成される一次抗体と検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ、又は酵素標識抗原の抗原抗体複合体と、固相化二次抗体を結合させる。抗体に結合しなかった酵素標識抗原を除去し、基質を加えて酵素反応を行う。検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮと標識抗原の一次抗体への結合は競合するため、検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ量と酵素活性は逆の相関関係を示し、既知量のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮと二次抗体に標識した酵素活性との関係を示す検量線から、検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ量を求めることができる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体を担体に固相化（固相化一次抗体）し、これにヒト血液（血清）や尿等の検体を加え、抗原抗体反応により検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮを抗原抗体反応により固相化一次抗体に結合させる。次に酵素標識した認識部位を異にする抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体（酵素標識二次抗体）を反応させ、抗原抗体反応により酵素標識二次抗体を上記固相化一次抗体に結合している抗原に結合させる。その後、抗原に結合しなかった酵素標識二次抗体を除去し、基質を加えて酵素反応を行うことにより、既知量のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮと二次抗体に標識した酵素活性との関係を示す検量線から、検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ量を求めることができる。これらのＥＬＩＳＡ法を用いて測定されたｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパク測定値は、肺癌細胞の有無の指標として用いることができる。   In the direct competitive ELISA method, an anti-mouse IgG antibody is immobilized on a carrier (immobilized secondary antibody). Samples such as human blood (serum) and urine, enzyme-labeled antigen, and anti-proNT / NMN monoclonal antibody (primary antibody) are added thereto, and the primary antibody formed by the antibody antigen reaction and proNT / NMN in the sample, or enzyme The antigen-antibody complex of the labeled antigen is bound to the immobilized secondary antibody. The enzyme-labeled antigen that did not bind to the antibody is removed, and the substrate is added to perform the enzyme reaction. Since the binding of proNT / NMN in the sample and the labeled antigen to the primary antibody competes, the amount of proNT / NMN in the sample and the enzyme activity show an inverse correlation, and the known amount of proNT / NMN and the secondary antibody are labeled. The amount of proNT / NMN in the sample can be determined from a calibration curve showing the relationship with the enzyme activity. In the sandwich ELISA method, an anti-proNT / NMN monoclonal antibody is immobilized on a carrier (immobilized primary antibody), and a specimen such as human blood (serum) or urine is added thereto, and proNT / NMN is bound to the immobilized primary antibody by antigen-antibody reaction. Next, an antigen obtained by reacting an anti-proNT / NMN monoclonal antibody (enzyme-labeled secondary antibody) having a different enzyme-labeled recognition site and binding the enzyme-labeled secondary antibody to the above-mentioned solid-phased primary antibody by an antigen-antibody reaction. To join. After that, the enzyme-labeled secondary antibody that did not bind to the antigen was removed, and a substrate was added to perform the enzyme reaction, whereby a calibration curve showing the relationship between the known amount of proNT / NMN and the enzyme activity labeled on the secondary antibody. From this, the amount of proNT / NMN in the sample can be determined. The proNT / NMN protein measurement value measured using these ELISA methods can be used as an indicator of the presence or absence of lung cancer cells.

上記ＥＬＩＳＡ 法において、本発明のモノクローナル抗体に便宜上含まれるモノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントも使用することができる。モノクローナル抗体に代えて、例えば、Ｆ(ａｂ′)2、Ｆａｂなどの該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含むｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに結合する抗体フラグメントを使用することもできる。また、これらモノクローナル抗体や抗体フラグメントを標識する酵素としては、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等を例示することができ、これら酵素は「酵素標識法(生物化学実験法 27 ) 」 (第１版、石川栄治著、学会出版センター、１９９１年) などに記載されている方法で標識することができる。またこれら酵素に代えて、例えば、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ等のラジオアイソトープや、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることもできる。一方、固相としては、シリコン、ナイロン、プラスチック、ガラスからなるビーズ、マイクロプレート、試験管、フィルター、メンブレン等を用いることができる。In the ELISA method, an antibody fragment containing an antibody binding site consisting of a variable region of a monoclonal antibody included for convenience in the monoclonal antibody of the present invention can also be used. Instead of the monoclonal antibody, for example, an antibody fragment that binds to proNT / NMN including an antibody binding site consisting of the variable region of the monoclonal antibody such as F (ab ′) 2 or Fab can be used. Examples of enzymes that label these monoclonal antibodies and antibody fragments include β-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, etc., and these enzymes are “enzyme labeling method (biochemical experimental method 27)” (first edition). , Eiji Ishikawa, Academic Publishing Center, 1991) and the like. Further, instead of these enzymes, for example, radioisotopes such as 125 I, 32 P, 35 S, and 3 H, fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) and tetramethylrhodamine isocyanate, GFP (green fluorescent protein) and the like A fusion protein in which a fluorescent protein or the like is fused can also be used. On the other hand, as the solid phase, silicon, nylon, plastic, glass beads, microplates, test tubes, filters, membranes and the like can be used.

本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、配列番号２に示されるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原や配列番号３に示されるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば配列番号２に示されるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）や配列番号３に示されるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）をそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、本件モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。   The monoclonal antibody-producing hybridoma immunizes, for example, an antigen containing the peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) shown in SEQ ID NO: 2 or the peptide fragment proNT / NMN (aa8 to 87) shown in SEQ ID NO: 3. The monoclonal antibody-producing hybridoma can be produced by fusing immunized mouse antibody-producing cells and mouse myeloma cells with a conventional method and screening with immunofluorescent staining patterns. Examples of animals to be immunized include mice, rats, rabbits and horses. For immunization, for example, the peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) shown in SEQ ID NO: 2 or the peptide fragment proNT / NMN (aa8 to 87) shown in SEQ ID NO: 3 is used directly or with an appropriate adjuvant, subcutaneously in animals. It is performed by intramuscularly or intraperitoneally administering 1 to 2 times / month for 1 to 6 months. Separation of antibody-producing cells is performed by collecting from the immunized animal 2 to 4 days after the final immunization. As myeloma cells, those derived from mice and rats can be used. The antibody-producing cells and the myeloma cells are preferably derived from the same species. Cell fusion can be performed, for example, by mixing antibody-producing cells and myeloma cells in a medium such as Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) in the presence of a fusion promoter such as polyethylene glycol. After completion of cell fusion, the hybridoma is selected by diluting appropriately with DMEM, centrifuging, suspending the precipitate in a selective medium such as HAT medium and culturing, and then using the culture supernatant by the enzyme antibody method. An antibody-producing hybridoma can be searched and cloned by limiting dilution or the like to obtain a hybridoma that produces this monoclonal antibody. As described above, antibody-producing hybridomas can be cultured in culture medium or in vivo, and monoclonal antibodies can be collected from the culture. As a method for separating and purifying monoclonal antibodies from the culture or ascites, protein purification can be performed. Any method can be used as long as it is a commonly used method. For example, it can be carried out by an ammonium sulfate fractionation method commonly used for IgG purification, chromatography using an anion exchanger or a column such as protein A or G. .

本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７をそれぞれ産生する本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、静岡県立静岡がんセンター研究所遺伝子診療研究部（日本国静岡県駿東郡長泉町下長窪１００７番地）に保管されており、一定の条件下で分譲を受けることができる。   Anti-proNT / NMN monoclonal antibody of the present invention, SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, SCC-MGD-004, SCC-MGD-005, SCC-MGD-006, SCC-MGD- This monoclonal antibody-producing hybridoma that produces 007 is stored in the Shizuoka Prefectural Shizuoka Cancer Center Research Institute Genetic Medicine Research Department (1007 Shimo-Nagabo, Nagaizumi-cho, Shizuoka-ken, Japan) and sold under certain conditions. Can receive.

本発明の小細胞肺癌の診断（判定）方法としては、上記本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を用いて、ヒト血清等の試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定する方法であれば特に制限されず、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの検出／測定方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッテイング、免疫染色、免疫拡散法等の免疫学的測定方法を挙げることができ、また、直接競合ＥＬＩＳＡ法及びサンドイッチＥＬＩＳＡ法を好適に例示することができる。   As a method for diagnosing (determining) small cell lung cancer of the present invention, one or more monoclonal antibodies selected from the above-mentioned anti-proNT / NMN monoclonal antibodies of the present invention are used, and proNT / NMN in a sample such as human serum is used. It is not particularly limited as long as it is a method for detecting / measuring protein. Examples of the method for detecting / measuring proNT / NMN protein include radioimmunoassay, enzyme immunoassay, fluorescent immunoassay, luminescence immunoassay, immunoprecipitation method, immunoturbidimetric method, Examples include immunological measurement methods such as flow cytometry, western blotting, immunostaining, and immunodiffusion, and direct competitive ELISA and sandwich ELISA can be preferably exemplified.

本発明の小細胞肺癌の診断（判定）キットとしては、上記本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を備え、試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定しうるキットであれば特に制限されず、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体固相化ＥＬＩＳＡ用アッセイプレートや標識化抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体等の１又は２以上の本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体の他、各種緩衝液、反応終了液、検出基質などを含んでいてもよい。   The diagnostic (determination) kit for small cell lung cancer of the present invention comprises one or more monoclonal antibodies selected from the above-mentioned anti-proNT / NMN monoclonal antibodies of the present invention, and detects / measures proNT / NMN protein in a sample. The anti-proNT / NMN monoclonal antibody-immobilized ELISA assay plate and the labeled anti-proNT / NMN monoclonal antibody or one or more of the anti-proNT / NMN monoclonal antibodies of the present invention are not particularly limited. In addition, various buffers, reaction completion solutions, detection substrates, and the like may be included.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.

［抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体の作製］
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮは、１４７アミノ酸からなる分子量１７２３６のタンパク質である（配列番号１）。配列番号２及び３に示す２種類のペプチド、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）及びｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を合成し、キャリアであるＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）と結合させ、抗原となるｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）−ＫＬＨおよびｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）−ＫＬＨを作製した。免疫方法として、初回は、免疫原とフロイント完全アジュバンドを用いてエマルジョンを作製し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌、７週齢）腹腔内に投与した（ペプチド換算約０．２ｍｇ／マウス）。２回目からは、同様に調製したエマルジョンをマウス腹腔内に投与し（ペプチド換算約０．１ｍｇ／マウス）、計６回の追加免疫を行った後、最終免疫より４週間後にブート免疫を行い、その３日後に細胞融合を行った。[Preparation of anti-proNT / NMN monoclonal antibody]
proNT / NMN is a protein having a molecular weight of 17236 consisting of 147 amino acids (SEQ ID NO: 1). Two types of peptides shown in SEQ ID NOs: 2 and 3, proNT / NMN (aa-1 to 38) and proNT / NMN (aa8 to 87) were synthesized, and combined with carrier KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) ProNT / NMN (aa-1 to 38) -KLH and proNT / NMN (aa8 to 87) -KLH were prepared. As an immunization method, at first, an emulsion was prepared using an immunogen and Freund's complete adjuvant and administered intraperitoneally to mice (Balb / c, female, 7 weeks old) (peptide equivalent of about 0.2 mg / mouse). From the second time, the emulsion prepared in the same manner was intraperitoneally administered to the mouse (peptide equivalent of about 0.1 mg / mouse), and after 6 boosts in total, boot immunization was performed 4 weeks after the final immunization, Three days later, cell fusion was performed.

免疫マウスより脾臓細胞を調製し、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と細胞融合した。標準抗原としてｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）ペプチド、標識抗原としてビオチン標識ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）ペプチドを用い酵素免疫測定法による一次スクリーニングを行い、陽性ハイブリドーマを選出した後、さらに限界希釈法によるスクリーニングを行った。上記のスクリーニングにより選出されたハイブリドーマ細胞をヌードマウス腹腔内に投与し腹水を作製し、その腹水を回収した。脱脂後プロテインＡアフィニティーカラムにより、腹水よりモノクローナル抗体を精製し、Isotyping Test kit（大日本製薬製）を用いてIsotypeを調べた。その結果、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を抗原とする５種類の抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００８）と、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８−８７）を抗原とする３種類の抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７）を得た（図１）。   Spleen cells were prepared from the immunized mice and fused with mouse myeloma cells P3U1 using polyethylene glycol. After proNT / NMN (aa-1 to 38) peptide as a standard antigen and biotin-labeled proNT / NMN (aa-1 to 38) peptide as a labeled antigen, primary screening by enzyme immunoassay was performed, and positive hybridomas were selected. Furthermore, screening by the limiting dilution method was performed. The hybridoma cells selected by the above screening were administered into the abdominal cavity of nude mice to produce ascites, and the ascites was collected. After defatting, the monoclonal antibody was purified from ascites using a protein A affinity column, and the Isotype was examined using an Isotyping Test kit (Dainippon Pharmaceutical). As a result, five types of antibodies (SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, SCC-MGD-004, SCC-MGD-) using proNT / NMN (aa-1 to 38) as antigens. 008) and three types of antibodies (SCC-MGD-005, SCC-MGD-006, SCC-MGD-007) using proNT / NMN (aa8-87) as antigens (FIG. 1).

［モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング］
上記の抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、培養上清中及び培養細胞抽出液中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの検出を行った。小細胞癌由来細胞株であるＳＢＣ３細胞を１×１０６となるよう１０ｃｍシャーレに播種し、一晩インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。培地は１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０を用いた。次にＰＢＳで２回洗浄した後、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。ＲＰＭＩ１６４０培地で１時間インキュベートした後、培地を捨て、ＰＢＳでさらに２回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地を７ｍｌ加えた。４８時間インキュベートした後この培地を回収した。また、培養後の細胞を０．２５ｍｌのlysis buffer（７．５Ｍ urea，２．５Ｍ thiourea，１２．５％ glycerol，５０ｍＭ Tris，２．５％ N-octylglucoside，６．２５ｍＭ ＴＣＥＰ［Tris-carboxyethyl phosphine hydrocholine］，１．２５ｍＭ protease inhibitor）で溶解し、細胞抽出液を調製した。[Western blotting using monoclonal antibodies]
Western blotting using the above-described antibody was performed, and proNT / NMN protein was detected in the culture supernatant and the cultured cell extract. SBC3 cells, which are a small cell carcinoma-derived cell line, were seeded in a 10 cm petri dish so as to be 1 × 10 6, and incubated overnight to adhere the cells to the petri dish. As the medium, RPMI1640 containing 10% FBS was used. Next, after washing twice with PBS, the medium was replaced with RPMI1640 medium containing no FBS. After incubation with RPMI 1640 medium for 1 hour, the medium was discarded, washed twice more with PBS, and 7 ml of RPMI 1640 medium was added. The medium was collected after 48 hours of incubation. In addition, the cultured cells were treated with 0.25 ml of lysis buffer (7.5 M urea, 2.5 M thiourea, 12.5% glycerol, 50 mM Tris, 2.5% N-octylglucoside, 6.25 mM TCEP [Tris-carboxyethyl phosphine hydrocholine], 1.25 mM protease inhibitor) to prepare a cell extract.

調整した培養上清及び細胞抽出液におけるｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパク発現を、ウエスタンブロッティングにより検討した。対照として、すでに市販されている２種類の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ抗体（いずれもSanta Cruz Biotechnology社製）を用いた。図２に培養上清の、図３に細胞抽出液のウエスタンブロッティングの結果を示す。本発明の８種の抗体のうち、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００８以外の全ての抗体により２０ｋＤａのバンドが検出された。これはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの分子量と一致しており、さらに、対象の抗体で検出されたバンド位置と一致していることから、本発明のモノクローナル抗体はウエスタンブロッティングによりｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出することが可能あることが示された（図２及び３）。また、上清と細胞抽出液の両方に関して、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３により複数のバンドが検出されたことから、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３は非特異的に他のタンパクを認識する可能性が示された。以上の結果より、実施例１で得られたモノクローナル抗体のうち、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００８以外の７種の抗体が、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの測定系に使用できる可能性が示された。   ProNT / NMN protein expression in the prepared culture supernatant and cell extract was examined by Western blotting. As controls, two types of commercially available anti-proNT / NMN antibodies (both manufactured by Santa Cruz Biotechnology) were used. FIG. 2 shows the culture supernatant, and FIG. 3 shows the results of Western blotting of the cell extract. Of the eight antibodies of the present invention, a 20 kDa band was detected by all antibodies except SCC-MGD-008. This is consistent with the molecular weight of the proNT / NMN protein, and further matches the band position detected with the antibody of interest, so that the monoclonal antibody of the present invention can detect the proNT / NMN protein by Western blotting. Was shown to be possible (FIGS. 2 and 3). Moreover, since multiple bands were detected by SCC-MGD-003 for both the supernatant and the cell extract, SCC-MGD-003 showed the possibility of recognizing other proteins non-specifically. . From the above results, it was shown that among the monoclonal antibodies obtained in Example 1, seven types of antibodies other than SCC-MGD-008 could be used in the proNT / NMN protein measurement system.

［直接競合ＥＬＩＳＡ法（化学発色）］
さらに、実施例１で作製した抗体を用いた酵素免疫測定を行い、培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの測定を行った。酵素免疫測定の測定系は以下に示す通りである。０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Cosmo Bio社製）を９６ウェルプレートへ分注し４℃で一晩静置した。その後、ブロックエース（大日本製薬製）を用い４℃で一晩静置しブロッキングを行った。これを抗マウスＩｇＧ抗体固定化プレート（プレート）とし、以下のアッセイに用いた。プレートの各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−））で３回洗浄後、ビオチン標識した、又は標識していないｐｒｏＮＴ／ＮＭＮペプチドを緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−））で希釈し、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体とともにプレートに分注し、室温で３時間反応させた（シェーカー１００ｒｐｍ）。洗浄液で４回洗浄後、緩衝液で希釈したStreptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate（メルク社製）溶液を分注し室温で２時間反応させた（シェーカー１００ｒｐｍ）。洗浄液で４回洗浄後、ＯＰＤ基質溶液［基質溶解液（０．０６７Ｍリン酸水素二ナトリウム十二水和物、０．０３３Ｍクエン酸一水和物および０．０１５％Ｈ２Ｏ２）にＯＰＤ錠（Sigma社製）を使用直前に溶解］を分注し室温で２０分間反応させた（静置）。１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用い標識抗原の酵素活性をＯ．Ｄ．４９２ｎｍで測定した。[Direct competitive ELISA method (chemical coloring)]
Furthermore, enzyme immunoassay using the antibody prepared in Example 1 was performed, and proNT / NMN protein in the culture supernatant was measured. The measurement system for enzyme immunoassay is as follows. A goat anti-mouse IgG (Fc) antibody (manufactured by Cosmo Bio) diluted with 0.1 M sodium bicarbonate solution was dispensed into a 96-well plate and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Thereafter, blocking was performed by leaving overnight at 4 ° C. using Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). This was used as an anti-mouse IgG antibody-immobilized plate (plate) and used in the following assay. After washing each well of the plate 3 times with a washing solution (PBS (−) containing 0.05% Tween 20), a biotin-labeled or unlabeled proNT / NMN peptide was added to a buffer solution (PBS containing 0.1% BSA). (-)), Diluted with anti-proNT / NMN monoclonal antibody, and allowed to react at room temperature for 3 hours (shaker 100 rpm). After washing 4 times with the washing solution, a solution of Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate (manufactured by Merck) diluted with a buffer solution was dispensed and reacted at room temperature for 2 hours (shaker 100 rpm). After washing 4 times with the washing solution, the OPD substrate solution [OPD was added to the substrate solution (0.067M disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, 0.033M citric acid monohydrate and 0.015% H 2 O 2 ). The tablets (dissolved immediately before use) were dispensed and allowed to react at room temperature for 20 minutes (standing). The reaction was stopped with 1 mol / L H 2 SO 4 , and the enzyme activity of the labeled antigen was determined using an O.D. D. Measured at 492 nm.

実施例２でｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを認識することが確認された４種類のモノクローナル抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４）を用いて直接競合ＥＬＩＳＡ法を行い、ＳＢＣ３細胞の培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭタンパク濃度を測定した。測定系には、標識抗原としてビオチン標識ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）ペプチドを用い、標準抗原としてｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）ペプチドを用いた。また、ＳＢＣ３無血清培養上清（５、１２、２５、３８および５０μｌ）を標識抗原としてビオチン標識ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）ペプチドと競合させ濃度を測定した。図４に示すように、全ての抗体において、培養上清の量にともなってＯ．Ｄ．値が低くなることが明らかとなった。また、このような阻害曲線は培養液のみを測定した結果では得られなかった（図５）。これらの結果から、本測定系により培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭタンパクを特異的に測定できることが示された。   Directly using 4 types of monoclonal antibodies (SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, SCC-MGD-004) confirmed to recognize proNT / NMN protein in Example 2 A competitive ELISA was performed to measure the proNT / NM protein concentration in the culture supernatant of SBC3 cells. In the measurement system, biotin-labeled proNT / NMN (aa39 to 87) peptide was used as a labeled antigen, and proNT / NMN (aa8 to 87) peptide was used as a standard antigen. Moreover, SBC3 serum-free culture supernatant (5, 12, 25, 38 and 50 μl) was used as a labeled antigen to compete with biotin-labeled proNT / NMN (aa-1 to 38) peptide, and the concentration was measured. As shown in FIG. 4, in all antibodies, O.D. D. The value became clear. Moreover, such an inhibition curve was not obtained as a result of measuring only the culture solution (FIG. 5). From these results, it was shown that proNT / NM protein in the culture supernatant can be specifically measured by this measurement system.

［モノクローナル抗体のエピトープ解析］
続いて、実施例３の直接競合ＥＬＩＳＡ法を用い、７種のモノクローナル抗体のエピトープを解析した。解析には以下に示す７種のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮペプチドを用いた（図６）。
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）：配列番号２
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜３８）：配列番号４
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７） ：配列番号３
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）：配列番号５
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）：配列番号６
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）：配列番号７
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ６６〜８７）：配列番号８[Epitope analysis of monoclonal antibodies]
Subsequently, using the direct competition ELISA method of Example 3, the epitopes of 7 types of monoclonal antibodies were analyzed. The following seven proNT / NMN peptides were used for the analysis (FIG. 6).
proNT / NMN (aa-1 to 38): SEQ ID NO: 2
proNT / NMN (aa 26-38): SEQ ID NO: 4
proNT / NMN (aa 8 to 87): SEQ ID NO: 3
proNT / NMN (aa 26-87): SEQ ID NO: 5
proNT / NMN (aa 39-87): SEQ ID NO: 6
proNT / NMN (aa 47-87): SEQ ID NO: 7
proNT / NMN (aa 66-87): SEQ ID NO: 8

各測定では、一次抗体として０．５μｇ／ｍｌに希釈した各モノクローナル抗体、及び５−１０００ｎｇ／ｍｌの非標識ペプチドを用いた。また、ビオチン標識抗原として、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４の検討には２０ｎｇ／ｍｌのｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を（図７）、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７の検討には１０ｎｇ／ｍｌのｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）を用いた（図８）。   In each measurement, each monoclonal antibody diluted to 0.5 μg / ml and 5-1000 ng / ml unlabeled peptide were used as primary antibodies. In addition, as a biotin-labeled antigen, 20 ng / ml proNT / NMN (aa-1 to 38) was used to examine SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, and SCC-MGD-004 ( 7), 10 ng / ml of proNT / NMN (aa39 to 87) was used for the examination of SCC-MGD-005, SCC-MGD-006, and SCC-MGD-007 (FIG. 8).

図７に、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）の免疫により作製した４種類の抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４）の測定結果を、図８に、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）の免疫により作製した３種類の抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７）の測定結果を示す。図７に示すように、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）の免疫により作製した４種類の抗体は全て、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を認識すること、その阻害濃度はほぼ同じであることが明らかとなった。また、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３のみがｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）にも結合を示したが、それ以外のペプチドに関しては、５種類すべての抗体が全く認識しないことが明らかとなった。一方、図８に示すように、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）の免疫により作製した３種類の抗体では、３種類全てがｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）を認識したが、それぞれのペプチドに対する各抗体の親和性は異なっており、
ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５とＳＣＣ−ＭＧＤ−００６では、
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）＞ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）＝ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）＞ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）、
ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７は、
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）＞ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）＞ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）＞ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）であった。
以上の結果から、本発明において作製された抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体は、異なる性質を持つことが確認された。FIG. 7 shows the measurement of four types of antibodies (SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, SCC-MGD-004) prepared by immunization with proNT / NMN (aa-1 to 38). The results are shown in FIG. 8 for three types of antibodies (SCC-MGD-005, SCC-MGD-006, SCC-MGD-007) prepared by immunization with proNT / NMN (aa8-87). As shown in FIG. 7, all four types of antibodies produced by immunization with proNT / NMN (aa-1 to 38) recognize proNT / NMN (aa-1 to 38) and their inhibitory concentrations are almost the same. It became clear that. In addition, only SCC-MGD-003 showed binding to proNT / NMN (aa 8 to 87), but it was revealed that all five types of antibodies were not recognized at all for other peptides. On the other hand, as shown in FIG. 8, in the three types of antibodies prepared by immunization with proNT / NMN (aa8 to 87), all three types are proNT / NMN (aa8 to 87), proNT / NMN (aa26 to 87), ProNT / NMN (aa39-87) and proNT / NMN (aa47-87) were recognized, but the affinity of each antibody for each peptide was different,
In SCC-MGD-005 and SCC-MGD-006,
proNT / NMN (aa47 to 87)> proNT / NMN (aa8 to 87) = proNT / NMN (aa39 to 87)> proNT / NMN (aa26 to 87),
SCC-MGD-007 is
proNT / NMN (aa 8 to 87)> proNT / NMN (aa 47 to 87)> proNT / NMN (aa 39 to 87)> proNT / NMN (aa 26 to 87).
From the above results, it was confirmed that the anti-proNT / NMN monoclonal antibody prepared in the present invention has different properties.

［直接競合ＥＬＩＺＡ法（化学発光）］
基質溶液として、ＯＰＤ基質溶液に代えてBM ChemiluminescenceELISA Substrate（ＰＯＤ）（Roche社製）を用い、マルチプレートリーダーで９６穴プレートの各ウェルの発光を測定する以外は、実施例３と同様に直接競合ＥＬＩＳＡ法を行い、標準物質による標準曲線を作成した。すなわち、ＥＬＩＺＡ反応後の９６穴プレートの各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−））で４回洗浄し、 Substrate reagent A : Starting reagent B ＝１００：１で混合後、各ウェルに１００ｍｌずつ分注し、３分間反応させてマルチプレートリーダーで９６穴プレートの各ウェルの発光を測定することにより、標準物質による標準曲線を作成した。抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４はすべてｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）ペプチドを標準物質とした。これらの標準曲線を図９に示す。また、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５（標準物質；ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮａａ３９〜８７）、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６（標準物質；ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮａａ８〜８７）、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７（標準物質；ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮａａ−１〜３８）の標準曲線を図１０に示す。[Direct competitive ELIZA method (chemiluminescence)]
Direct competition in the same manner as in Example 3 except that BM Chemiluminescence ELISA Substrate (POD) (Roche) was used as the substrate solution instead of the OPD substrate solution, and the luminescence of each well of the 96-well plate was measured with a multiplate reader. An ELISA method was performed to prepare a standard curve with a standard substance. That is, each well of the 96-well plate after the ELIZA reaction was washed 4 times with a washing solution (PBS (−) containing 0.05% Tween 20), mixed with Substrate reagent A: Starting reagent B = 100: 1, and then each well. A standard curve with a standard substance was prepared by dispensing 100 ml each and reacting for 3 minutes and measuring the luminescence of each well of a 96-well plate with a multiplate reader. Anti-proNT / NMN monoclonal antibodies SCC-MGD-001, SCC-MGD-002, SCC-MGD-003, and SCC-MGD-004 all used proNT / NMN (aa-1 to 38) peptides as standard substances. These standard curves are shown in FIG. In addition, anti-proNT / NMN monoclonal antibodies SCC-MGD-005 (standard substance; proNT / NMNaa 39 to 87), SCC-MGD-006 (standard substance; proNT / NMNaa 8 to 87), SCC-MGD-007 (standard substance; proNT A standard curve of / NMNaa-1 to 38) is shown in FIG.

次に、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２及びＳＣＣ−ＭＧＤ−００５を用いて、ＳＢＣ３細胞の培養上清（希釈倍率１〜１０７）中のｐｒｏＮＴ／ＮＭタンパク濃度を測定した。結果を図１１に示す。図１１より、ＳＢＣ３細胞の無血清培養上清の測定値と標準曲線とが平行関係にあり、直接競合ＥＬＩＺＡ法（化学発光）により試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭタンパク濃度を測定できることがわかる。そこで、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２及びＳＣＣ−ＭＧＤ−００５を用いて、小細胞癌由来細胞株であるＳＢＣ１、ＳＢＣ２、ＳＢＣ３、ＳＢＣ５、ＮＣＩ−Ｈ６９、及び対照としての大細胞癌由来細胞株であるＮＣＩ−Ｈ６６１、Ｌｕ６５、Ｌｕ９９の無血清培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ免疫活性を測定した。結果を図１２に示す。図１２より、ＳＢＣ１、ＳＢＣ２、ＳＢＣ３、特にＳＢＣ３の無血清培養上清中に高いｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ濃度が測定されることがわかる。   Next, using the anti-proNT / NMN monoclonal antibodies SCC-MGD-002 and SCC-MGD-005, the proNT / NM protein concentration in the culture supernatant (dilution ratio 1 to 107) of SBC3 cells was measured. The results are shown in FIG. FIG. 11 shows that the measured value of the serum-free culture supernatant of SBC3 cells and the standard curve are in a parallel relationship, and the proNT / NM protein concentration in the sample can be measured by the direct competitive ELIZA method (chemiluminescence). Therefore, using anti-proNT / NMN monoclonal antibodies SCC-MGD-002 and SCC-MGD-005, SBC1, SBC2, SBC3, SBC5, NCI-H69 as small cell carcinoma-derived cell lines, and large cell cancer as a control The proNT / NMN immunoreactivity in serum-free culture supernatants of NCI-H661, Lu65, and Lu99 derived cell lines was measured. The results are shown in FIG. FIG. 12 shows that a high proNT / NMN concentration is measured in the serum-free culture supernatant of SBC1, SBC2, SBC3, particularly SBC3.

また、実施例２に記載されている方法に準じて、各種肺癌細胞株の各無血清培養上清１ｍｌを濃縮し、電気泳動後、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図１３に示す。図１３より、ＳＢＣ１、ＳＢＣ２、ＳＢＣ３、特にＳＢＣ３の無血清培養上清中に高い濃度のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが発現していることがわかる。   In addition, according to the method described in Example 2, 1 ml of each serum-free culture supernatant of various lung cancer cell lines was concentrated, and after electrophoresis, Western blotting was performed using anti-proNT / NMN monoclonal antibody SCC-MGD-002. Blotting was performed. The results are shown in FIG. FIG. 13 shows that high concentration of proNT / NMN is expressed in the serum-free culture supernatant of SBC1, SBC2, SBC3, particularly SBC3.

［小細胞肺癌の診断］
小細胞肺癌患者の血清５０μｌを、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２を用いて、実施例５の直接競合ＥＬＩＺＡ法（化学発光）により患者血清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを測定したところ、７ｐｍｏｌ／ｍｌのｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクが検出された。一方、対照となる健常人の血清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮペプチドの測定値は有意に低かった。[Diagnosis of small cell lung cancer]
When 50 μl of serum of a small cell lung cancer patient was measured for proNT / NMN protein in the patient serum by the direct competitive ELIZA method (chemiluminescence) of Example 5 using the anti-proNT / NMN monoclonal antibody SCC-MGD-002, 7 pmol / ml proNT / NMN protein was detected. On the other hand, the measured value of proNT / NMN peptide in the serum of a healthy person as a control was significantly low.

本発明の７種類の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体は、それぞれ異なる配列への結合能を有しており、これらの抗体を単独または組み合わせて使用することにより、高感度で確実なｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ検出・測定法を確立することができる。   The seven types of anti-proNT / NMN monoclonal antibodies of the present invention have the ability to bind to different sequences, and by using these antibodies alone or in combination, it is possible to detect proNT / NMN with high sensitivity and reliability. A measurement method can be established.

Claims (13)

配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１。 A monoclonal antibody produced by immunization with an antigen containing a peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, comprising the peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) and A monoclonal antibody SCC-MGD-001 which binds and does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 3 to 8. 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２。 A monoclonal antibody produced by immunization with an antigen containing a peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, comprising the peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) and A monoclonal antibody SCC-MGD-002 which binds and does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 3 to 8. 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）及び配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号４〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３。 A monoclonal antibody produced by immunization with an antigen comprising a peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein the peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) and A monoclonal antibody SCC-MGD-003 which binds to a peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 8. 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４。 A monoclonal antibody produced by immunization with an antigen containing a peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, comprising the peptide fragment proNT / NMN (aa-1 to 38) and A monoclonal antibody SCC-MGD-004 which binds and does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 3 to 8. 配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５。 A monoclonal antibody produced by immunization with an antigen containing a peptide fragment proNT / NMN (aa8-87) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein the peptide fragment proNT / NMN (aa8-87), and SEQ ID NO: 5 A monoclonal antibody SCC-MGD-005 which binds to a peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in -7 and does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4 and 8. 配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６。 A monoclonal antibody produced by immunization with an antigen containing a peptide fragment proNT / NMN (aa8-87) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein the peptide fragment proNT / NMN (aa8-87), and SEQ ID NO: 5 A monoclonal antibody SCC-MGD-006, which binds to a peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in -7 and does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4 and 8. 配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７。 A monoclonal antibody produced by immunization with an antigen containing a peptide fragment proNT / NMN (aa8-87) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein the peptide fragment proNT / NMN (aa8-87), and SEQ ID NO: 5 A monoclonal antibody SCC-MGD-007, which binds to a peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in -7 and does not bind to any peptide fragment consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4 and 8. 請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定する方法。 A method for detecting / measuring proNT / NMN protein, wherein one or more monoclonal antibodies selected from the monoclonal antibodies according to claim 1 are used. ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定する方法が、サンドイッチＥＬＩＳＡ法であることを特徴とする請求項８記載の方法。 The method according to claim 8, wherein the method for detecting / measuring proNT / NMN protein is a sandwich ELISA method. 請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体と、請求項５〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体とを、組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法であることを特徴とする請求項９記載の方法。 The 1 or 2 or more monoclonal antibody selected from the monoclonal antibody in any one of Claims 1-4, and the 1 or 2 or more monoclonal antibody selected from the monoclonal antibody in any one of Claims 5-7 The method according to claim 9, wherein the sandwich ELISA method is used in combination. 請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株。 A hybridoma cell line producing the monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 7, or a cell line derived therefrom. 請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を用いて、試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定することを特徴とする小細胞肺癌の診断方法。 Diagnosis of small cell lung cancer, comprising detecting / measuring proNT / NMN protein in a sample using one or more monoclonal antibodies selected from the monoclonal antibodies according to any one of claims 1 to 7 Method. 請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を備え、試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定しうることを特徴とする小細胞肺癌の診断キット。 A diagnosis of small cell lung cancer, comprising one or more monoclonal antibodies selected from the monoclonal antibodies according to any one of claims 1 to 7 and capable of detecting / measuring proNT / NMN protein in a sample. kit.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103308689B (en) * 2012-03-08 2017-04-12 思芬构技术有限公司 A method for predicting the risk of getting cancer or diagnosing cancer in a female subject
RU2671578C2 (en) * 2012-10-02 2018-11-02 Сфинготек Гмбх Method for predicting risk of getting cancer or diagnosing cancer in female subject
CA2897245A1 (en) * 2013-01-08 2014-07-17 Sphingotec Gmbh A method for predicting the risk of getting cancer or diagnosing cancer in a subject
WO2015185478A1 (en) * 2014-06-02 2015-12-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-neurotensin long fragment antibodies and uses thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5114637B2 (en) * 2006-03-31 2013-01-09 静岡県 Determination method of small cell lung cancer

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6007007593; 杉野幸夫編， 「バイオテクノロジーシリーズ モノクローナル抗体」， 初版， 株式会社講談社， （１９８６）， ｐ．１-１６ *
JPN6008064812; Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， （２００６）， ２７， ［７］， ｐ．１７８７-１７９３ *
JPN6008064814; 日本癌学会学術総会記事， （２００６）， ６５， ｐ．３８９ *

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