JP4164804B2

JP4164804B2 - Monoclonal antibody specific for tartrate-resistant acid phosphatase 5b and use thereof

Info

Publication number: JP4164804B2
Application number: JP2003115212A
Authority: JP
Inventors: 建也大橋; 俊英三浦; 吉彦五十嵐; 久美子笹川; 勝博片山
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2003-04-21
Publication date: 2008-10-15
Anticipated expiration: 2023-04-21
Also published as: JP2004026805A

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ 5b（TRACP 5b：別名、破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いたTRACP 5bの検出方法、並びにこれに用いるキットに関する。
本発明のモノクローナル抗体によれば、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ 5bの活性を特異的に測定することが可能であり、骨吸収のマーカーとして骨疾患の医学的治療や臨床検査の分野において極めて有効である。
【０００２】
【従来の技術】
血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRACP：Tartrate Resistant acid Phosphatase EC3.1.3.2）はその大部分が破骨細胞由来の酸性ホスファターゼとされ、その測定は、破骨細胞の機能を評価する指標として有用とされており、骨吸収マーカーとして興味が持たれている（非特許文献１）。一方、血清中の酸性ホスファターゼは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、原点より0〜5の6つのバンドに分けられ、その中で5番目が酒石酸抵抗性であることから、Band 5酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRACP 5）と呼ばれている。これはさらに電気泳動により糖鎖へのシアル酸結合の多い5aと、ほとんどシアル酸結合のない5bに分けられる。そして、5aは血小板やその他からの酵素であって血中値が変動しないのに対して、5bのみが骨吸収に伴い変動するため、5bが破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの本体であると考えられている（特許文献１）。
なお、Clinical Chemistry誌（非特許文献２）でも破骨細胞由来のACPを、TRACP 5bと略記することを勧めている。よって本明細書においても破骨細胞由来で骨吸収の指標となるACPを意味するものはTRACP 5bとして、破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼと酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ 5bを同義としてTRACP 5bと表記する。
【０００３】
破骨細胞の活性を表す酸性ホスファターゼの指標としてTRACP活性を求める従来の活性測定法は、特異性、感度、測定の煩雑さおよび測定時間の点で問題を有している。
一般的に活性測定法によるTRACP 5bの測定は、酒石酸の存在下で合成基質としてリン酸エステルを用いて酵素反応により生ずる反応生成物（アルコールやフェノール類）を比色定量することにより酵素活性を求めている。その際、酒石酸が前立腺由来酸性ホスファターゼを阻害し、残存した酸性ホスファターゼ活性を基質で測定することにより、TRACP活性をTRACP 5b活性とみなして求めている。しかしながら、検体中に存在する破骨細胞由来以外の赤血球由来や血小板由来の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼも測定してしまうため、特異性の点で問題を有する。上記方法の改善法としては、血清を５倍に希釈した液を３７℃で１時間インキュベートする前処理をした後、残りのTRACP活性を、酒石酸存在下、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸（pNPP）を用いて測定する方法が知られている（非特許文献３、非特許文献４）。この方法は赤血球由来酸性ホスファターゼの影響は回避できるが、血小板由来酸性ホスファターゼの影響は除くことは出来ない。さらにより特異的な活性測定法として、本発明者らは、TRACP 5bと赤血球や血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性がフッ素に対する感受性に差のあることを利用したTRACP 5b測定法を報告した（特許文献２）。しかしながら、赤血球及び血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの影響はないものの、TRACP 5aの影響を除くことができず、またTRACP 5b活性を総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性からフッ素存在下で阻害されなかった活性を差し引きすることにより求めており、精度の点でさらなる改良が求められている。さらに上記フッ素を利用した方法にTRACP 5aの阻害物質を組み合わせて用いることにより、より特異的にTRACP 5b活性を測定する方法が報告されている（特許文献３）。しかしながら、フッ素のみを用いる方法はより特異的ではあるものの、やはり差し引きで破骨細胞由来TRACP 5b活性を求めているため同様に、精度の点で問題を残している。
【０００４】
一方、免疫学的測定法によるTRACP 5bの測定方法として、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いた免疫測定法も知られている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。これらの方法は、TRACP 5aおよびTRACP 5bの両者を測定してしまうため、TRACP 5aの影響を無視できない。さらに、TRACP 5bをより特異的に測定する免疫学的測定法が報告されている（特許文献４、特許文献５）。この方法はよりTRACP 5b活性に特異的であるが、測定に用いる抗体がTRACP 5bに特異的ではなく、TRACP 5aとも反応するため、TRACP 5aとTRACP 5bの至適pHの差を利用して活性測定で測定値を算出している。そのため、末期腎疾患などのTRACP 5aが亢進している患者検体での影響が懸念され、また、健常者検体と骨吸収が亢進している患者検体での差が小さく、骨吸収マーカーとして感度は十分とは言えない（非特許文献１１）。
【０００５】
【特許文献１】
特表2002-510050号公報
【特許文献２】
特開平10−37198号公報
【特許文献３】
特開2001−231595号公報
【特許文献４】
WO99/50662号公報
【特許文献５】
特表2002-510050号公報
【非特許文献１】
骨代謝マーカー，福永仁夫，中村利孝，松本俊夫編，メディカルレビ
ュー社，１９９５
【非特許文献２】
Clin.Chem.47:1497.2001
【非特許文献３】
日大医誌.49:904-911.1990
【非特許文献４】
Clin.Chem.33:458-462.1987
【非特許文献５】
J Clin Endocrinol Metab.71:442-451.1990
【非特許文献６】
J Bone Miner Res.13:683-687.1998
【非特許文献７】
Immunol Lett.70:143-149.1999
【非特許文献８】
J Bone Miner Res.14:464-469.1999
【非特許文献９】
Clin Chem.45:2150-2157.1999
【非特許文献１０】
Clin Chem.46:1751-1754.2000
【非特許文献１１】
Clin. Chim. Acta 301:147-158, 2000
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
かかる問題に鑑み、本発明は、骨吸収マーカーである破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRACP 5b）に対して特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いたTRACP 5bの検出方法およびそれに使用するキットを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ 5b（TRACP 5b：別名、破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）に対する反応性が、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ 5a（TRACP 5a）に対する反応性よりも高く、TRACP 5bに対してより高い特異性を有するTRACP 5bに対するモノクローナル抗体に関する。
更に本発明は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
更に本発明は、上記のモノクローナル抗体を用いて検体中のTRACP 5bを検出するTRACP 5bの検出方法に関する。
更に本発明は、上記のモノクローナル抗体を構成成分として含む、TRACP 5bの検出に用いるためのキットに関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト破骨細胞から精製されたTRACP 5bを免疫原として使用することにより得ることができる。本明細書の以後に記載する実施例では正常破骨細胞から精製されたTRACP 5bを抗原として用いて免疫を行ったが、これに限らず破骨細胞腫瘍などのTRACP 5bも抗原として用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、例えば精製ヒトTRACP 5bを免疫原として動物を免疫し、その動物が産生する抗ヒトTRACP 5b抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることによって得られるハイブリドーマによって産生される。
【０００９】
上記ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち、上述のようにして得たヒトTRACP 5bを、フロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等の既に公知のものを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に1〜3週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は1μg〜100mgの間とされているが、一般的には50μg程度が好ましい。免疫回数は2〜7回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞とを融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラットなどの脾臓等より得ることができる。
上記融合法としては、既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Nature.256,495.1975）によってポリエチレングリコール（PEG）を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。
【００１０】
上記融合した細胞からヒトTRACP 5bを認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から限界希釈法によってHAT培地およびHT培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。96穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にヒトTRACP 5bに対する抗体が含まれている場合には、ヒトTRACP 5bをプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン-HRP標識抗体等の2次標識抗体を反応させるELISA法により、ヒトTRACP 5bに対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質にはHRPの他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤であるBSAのみを結合したアッセイプレートによるELISAを同時に行うことでヒトTRACP 5b特異的抗体のスクリーニングができる。つまりヒトTRACP 5bプレートで陽性であり、BSAによるELISAで陰性のクローンを選択できる。
【００１１】
本発明のハイブリドーマとしては、ヒトTRACP 5bを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、特にヒトTRACP 5bと反応し、かつ赤血球、血小板、好中球、前立腺由来の酸性ホスファターゼと交差反応しないモノクローナル抗体を産生するものが望ましい。たとえば本発明者が樹立したハイブリドーマTrk62が挙げられる。
特に本発明のモノクローナル抗体としては、臨床検査に用いた時その検査結果が骨吸収をより明確に反映するために、ヒトTRACP 5aよりもヒトTRACP 5bに親和性が高いモノクローナル抗体が好ましく、特にヒトTRACP 5aよりもヒトTRACP 5bに対して検出系中で2倍以上の反応性を示すものが望ましい。このようなハイブリドーマとしては例えば本発明者が確立したハイブリドーマTrk62が挙げられる。ハイブリドーマTrk62は、平成14年2月14日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてFERM BP-7890が付与されている。
【００１２】
上記ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えばα-MEM、RPMI1640、ASF、S-cloneなどで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。
上記の上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。たとえば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ、プロテインGなどによるアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１３】
かくして得られる本発明のモノクローナル抗体は、TRACP 5bに対する反応性が、TRACP 5aに対する反応性よりも高く、TRACP 5bに対してより高い特異性を有するものである。具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、TRACP 5bに対する反応性がTRACP 5aに対する反応性の2倍以上であり、より具体的には、等量の活性を示すTRACP 5aおよび5bをそれぞれ反応させた時、TRACP 5bに対する反応性がTRACP 5aに対する反応性の2倍以上であるものが好ましい。更に具体的には、以後の実施例１の（８）の特異性検定の項で明らかにされているように、酒石酸もしくは酒石酸塩の存在下でパラニトロフェニルリン酸（pNPP）を基質として用いてpH5.7（TRACP 5aとTRACP 5bが等しい酵素活性を示すpH）で反応させた時に10U/Lの酵素活性を示すTRACP 5aおよびTRACP 5bのそれぞれを、プレートに固定した本発明のモノクローナル抗体と反応させ、次いで該抗体に結合したそれぞれのTRACP 5aおよびTRACP 5bの酵素活性を、酒石酸もしくは酒石酸塩の存在下で上記基質pNPPを用いてpH6.1（TRACP 5bの至適pH）で測定した時に、TRACP 5bに対する反応性がTRACP 5aの反応性の２倍以上、より具体的には３倍以上である、モノクローナル抗体が特に好ましい。
更に本発明のモノクローナル抗体は、同様に実施例１の（８）の特異性検定の項で明らかにされているように、赤血球、血小板、好中球および前立腺由来の酸性ホスファターゼに対しては実質的に交差反応性を示さないものである。また、実施例１の（７）のウエスタン・ブロッティングの項および実施例４で明らかにされているように、本発明のモノクローナル抗体は、TRACP 5bのネイティブな酵素としての立体構造を認識するものである。
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法によって検体中のTRACP 5bを高感度で且つ特異的に検出することができる。対象となる検体としては、血液、血清、血漿、骨などの組織等が挙げられる。
本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法による検出方法としては、TRACP 5bの酵素活性の測定を利用した免疫測定法、サンドイッチアッセイELISA法、組織免疫染色法等が挙げられる。
【００１５】
TRACP5bの酵素活性の測定を利用した免疫測定法としては、例えば、検体、例えば血清中のTRACP 5bを、本発明のモノクローナル抗体に結合させ、結合したTRACP 5bに対して、TRACP 5bの酵素基質、例えばP‐ニトロフェニルリン酸またはその塩を酵素反応させて、その酵素活性を測定することにより検体中のTRACP 5bを免疫測定できる方法が挙げられる。その方法においては、具体的には、TRACP 5bを以下のようにして測定できる。まず、固相支持体に吸着している本発明のモノクローナル抗体に、測定すべき検体を加え、検体中のTRACP 5bと抗体とを抗原抗体反応させてTRACP 5bを抗体に結合させる。次いで、その固相支持体を洗浄液で洗浄して、抗体に吸着しなかった検体由来の成分を除去した後、反応系にTRACP 5bの酵素基質、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸またはその塩を加え、抗体に結合しているTRACP 5bと基質とを反応させる。反応停止液で酵素反応を停止した後、反応により生成したフェノール類、例えば、ｐ−ニトロフェノールを、通常390nm〜450nm、好ましくは400〜430nmの波長で吸光度を測定する。その吸光度の大きさは、TRACP 5b酵素活性を反映するので、その値から、検体中のTRACP 5bを測定できる。
本発明では、上記した測定法から明らかな通り、抗体は固相支持体に結合させて用いるのが好ましく、固相支持体としては、通常、ELISA法等の固相免疫測定法に用いる固相支持体が用いられるが、特に限定されない。例えば、固相支持体の材料として、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ポリエチレン、ナイロン、メタアクリレートなどが挙げられる。固相支持体の形状としては、プレート、ビーズ等が挙げられる。
固相支持体に吸着している抗体を調製するには、直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して固相支持体にTRACP 5bに対する抗体を結合させる。感作抗体量は、1ng〜100mg/mlの範囲であることが多い。
【００１６】
本発明の測定方法を実施するときは、TRACP 5bを免疫測定するためのキットであって、ｉ）固相支持体、ｉｉ）本発明抗体、およびｉｉｉ）TRACP 5b酵素基質を含むキットを用いて行える。
このキットにおいては、ｉ）固相支持体、ｉｉ）本発明抗体に関しては、固相支持体と抗体溶液とを別々に作製しておき、TRACP 5bを測定する際、抗体を固相支持体に吸着させてもよく、あらかじめ、抗体を固相支持体に吸着させた状態で提供してもよい。このキットにおいては、検体中のTRACP 5bを抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。
本発明において、このキットを使用するときは、酵素反応停止液を含むことが好ましい。酵素停止液としては、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ水溶液を使用できる。
さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、EDTA・2Na等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
【００１７】
本発明においては、本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイELISA法により、TRACP 5bを測定することもできる。この場合、モノクローナル抗体として、本発明抗体以外に、他のTRACP 5bに対する別な抗体も用いて実施することができる。サンドイッチアッセイによるTRACP 5bを測定する方法の具体例は、以下の通りである。まず、一次抗体として本発明抗体を、固相支持体、例えば、プレートに吸着させ、検体、例えば、血清中のTRACP 5bと反応させ、固相支持体を洗浄し、次いで、吸着したTRACP 5bと、ビオチン化した２次抗体、例えばビオチン化した別なTRACP 5bに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とを反応させ、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと反応させた後、ペルオキシダーゼ酵素反応、次いで、発色反応を行うことにより、TRACP 5bを検出することができる。また、２次抗体を直接ペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼ等により酵素標識したものを用いることにより、同様の測定をすることができる。また、2次標識抗体に結合させる物質は測定方法によって酵素に限られるものではなく、放射線同位元素、蛍光物質、磁性物質、コロイドなどでもよい。
【００１８】
本発明において、本発明抗体を用いたサンドイッチアッセイELISAを行うときは、サンドイッチアッセイELISA用のキットを用いて実施することができる。
サンドイッチアッセイELISA法で本発明の測定方法を実施するときは、例えば、TRACP 5bを免疫測定するためのキットであって、ｉ）固相支持体、ｉｉ）本発明抗体、ｉｉｉ）標識された、別なTRACP 5bに対する抗体、及びｉｖ）標識を検出するための成分を含むキットを用いることによっても、TRACP 5bを測定することができる。
標識を検出するための成分とは、抗体が標識されたものを測定するための成分で、標識がビオチンの場合、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ酵素基質、及び過酸化水素を含む試薬であり、標識がアルカリホスファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルリン酸を含む試薬である。このキットには、必要に応じ、洗浄液を含んでいてもよい。
本発明において、このキットを使用するときは、検体中のTRACP 5bを抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、EDTA・2Na等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
【００１９】
更に本発明においては、検体中のTRACP 5bの存在を、本発明のモノクローナル抗体を利用した組織免疫染色法によって検出することもできる。即ち、例えば、ヒトの破骨細胞組織などから通常の方法により、例えば凍結切片を調製し、これに本発明のモノクローナル抗体を反応させ、次いで例えば、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素で標識した二次抗体と反応させ、次いで発色させることにより、TRACP 5bの存在を特異的に検出することができる。
このような、組織免疫染色法による検出は、i）本発明のモノクローナル抗体、ｉｉ）標識された二次抗体およびｉｉｉ）発色試薬を構成成分として含むキットを用いて実施できる。標識された二次抗体としては、例えばペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素で標識した、動物由来の抗IgG抗血清、抗IgGポリクローナル抗体などが挙げられ、発色試薬としては、標識に用いた酵素を発色するための通常用いられる発色基質などの試薬が用いられる。
【００２０】
【実施例】
以下に好ましい実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例等により何ら限定されるものではない。
実施例１
破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ TRACP 5b ）に対して特異性の高いモノクローナル抗体の作成およびその特性
（１）TRACP 5b の精製
インフォームド・コンセントを行った後、外科的手術により摘出されたヒト大腿骨骨頭部130gを液体窒素中で凍結させ、ハンマーで粉砕後、プロテアーゼインヒビター等を含む緩衝液（50mM Tris-HCl, 0.3M KCl pH7.5）200mL中に懸濁させ、超音波ホモジナイザーにてホモジナイズした。4℃一晩攪拌後、10,000rpm、20分遠心分離し、その上清を10ｍM トリス緩衝液 pH8.2に透析後CM−Sepharoseカラム[シグマ社]に付し、吸着したタンパク質をNaClを含む上記トリス緩衝液の直線濃度勾配で溶出した。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性は、基質pNPPを用い測定し、活性の高いフラクションをプールした。それを濃縮後、0.7M NaClを含む20mM トリス緩衝液 pH7.2に透析し、Superdex 200カラム [アマシャムファルマシア社]に付し、同様に溶出したフラクションの酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を測定し、活性フラクションをプールした。それをHiTrap Heparin HPカラム[アマシャムファルマシア社]に付し、吸着したタンパク質をNaClを含む上記20mMトリス緩衝液pH7.4の直線塩濃度勾配により溶出した。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ高活性フラクションをプールし、濃縮することにより、精製TRACP 5bを0.4mg得た。なお、タンパク量はA₂₈₀により確認し、純度はSDS-PAGE[TIFCO社]を行い銀染色の結果、分子量35,000付近でシングルバンドであることによりTRACP 5bであることを確認した（図１）。単一バンドになった酵素は精製TRACP 5bとして免疫抗原とした。
【００２１】
（２）精製ヒト TRACP 5b によるマウスの免疫
精製ヒトTRACP 5bを250μg/mlとなるように50mMクエン酸緩衝液（pH5.5）で希釈し、25μg（100μl）をとってフロインド完全アジュバンド[和光純薬工業社]100μlと乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液をBalb/c 6週齢雌マウス[日本クレアー社]にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。2週間後には同量のTRACP 5b（25μg/ml）をフロインド不完全アジュバンド[和光純薬工業社]と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降2週間後に同様の操作を行い、4回目には最終免疫としてTRACP 5bは25μg/mlを50mMクエン酸緩衝液（pH5.5）で調製しマウス尾静脈注射により投与した。
【００２２】
（３）ハイブリドーマの確立
最終免疫より3日後にTRACP 5bにより感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Nature.256,495.1975）に従って行われ、ポリエチレングリコール（PEG4000）[メルク社]を用いて脾細胞と骨髄腫細胞P3-X63-Ag8-U1（P3U1）を融合した。TRACP 5b融合時の融合比率は脾臓細胞数8×10⁷個に対して骨髄腫細胞P3-X63-Ag8-U1（P3U1）2×10⁷個で、約4：1であった。融合細胞は10％FCS [INVITROGEN社] α-MEM [IRVINE社] HAT[コスモバイオ社]培地に分散し96穴マイクロタイターカルチャープレート[住友ベークライト社]に分注して37℃、5％CO₂条件にて培養した。
【００２３】
（４）コロニーのスクリーニング
約2週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。実施したスクリーニング方法を以下に述べる。
スクリーニング用プレートを作製するために上記（１）にて精製したTRACP 5bを50ｍMクエン酸緩衝液中に溶解し、0.5μg/100μl/wellとなるように96穴マイクロタイタープレート[Nunc社]に分注した。プレートを4℃で2晩静置した後に0.05% Tween 20[和光純薬社]を含むトリス緩衝液で3回洗浄し、非特異的反応を抑えるために1.5％BSA[SIGMA社]溶液を200μl分注して、更に4℃で1晩静置した。完成したプレートを0.05% Tween 20を含むトリス緩衝液で3回洗浄した後に、上記（３）で得られたハイブリドーマの培養上清100μlを反応させ、更に洗浄を行った後に２次抗体であるHRP標識抗マウスイムノグロブリン抗体[Zymed社]を加えて反応させた。洗浄後にHRPの発色基質である3mg/ml o-フェニレンジアミン（OPD）[ナカライ社]クエン酸発色溶液を100μl加えて一定時間の発色後、1N硫酸[和光純薬社]を停止液として更に100μl添加し、測定波長492nmにて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チエックした。
【００２４】
（５）抗体の確認
ELISAによって精製TRACP 5bとの反応性を確認すると、精製TRACP 5bのプレートと反応するクローンTrk62およびTrk49が得られた。クローンTrk62が産生するモノクローナル抗体Trk62は精製TRACP 5bと強い反応性を示していた。一方、モノクローナル抗体Trk49は、反応性が弱かった。本発明のモノクローナル抗体Trk62はコントロールのBSAプレートとは全く反応しなかった。上記の抗体をモノクローナル抗体タイピングキット[アマシャムファルマシア社]にて検定した結果、モノクローナル抗体Trk62およびTrk49は、以下のような特性を有していた。
クラスサブクラス軽鎖
IgG IgG1 κ
【００２５】
（６）モノクローナル抗体の作製及び精製
上記（４）で得られたハイブリドーマTrk62 1×10⁷細胞個を、プリスタン[アルドリッチ社]0.5ml投与後2週間のBalb/cマウス[日本クレアー社]（10週齢、雌性）に腹腔内投与し、約2週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジエチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。上記（４）のコロニーのスクリーニングで行ったと同様のELISA法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安40％で処理し、PBSに透析した後、プロテインGカラム[アマシャムファルマシア社]により精製してSDS-PAGEにより確認した。するとモノクローナル抗体Trk62は非還元では分子量約150,000に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約50,000のバンドと25,000の2本のバンドが確認された。精製されたモノクローナル抗体はマウス１匹あたり約15mgであって工業的利用を行うには十分量であった。同様にして、モノクローナル抗体Trk49も、ハイブリドーマTrk49から得た。ハイブリドーマTrk49は、平成14年11月27日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてFERM BP-8249が付与されている。
【００２６】
（７）ウエスタン・ブロッティング
ウエスタン・ブロッティングの結果等からモノクローナル抗体Trk62は、SDS処理のTRACP 5は認識せず、ネイティブなTRACP 5を認識することが分かった。以下に詳述する。
ウエスタン・ブロッティング用サンプルとして既に公知の方法（Clin.Chem.24:7,1105-1108.1978）によりインフォームド・コンセプトを行なったヒトさい帯血よりTRACPを精製した。このときヒトTRACP はTRACP 5a及びTRACP 5bの2種類に分けられた。TRACP 5aおよびTRACP 5bはディスク電気泳動法（Clin.Chem.24:2,309-312.1978）（図２）およびフッ素阻害による活性測定法（Clin.Chem.46:4,469-473.2000）により確認した。また別に昆虫細胞を利用したヒト組換えTRACP（Baculoviral rhTRACP）を既に公知となっているハイマンらの方法（J.Biol.Chem.269,1294-1300.1994）を参考として作製し、精製した後に抗原の一種とした（図３に示したフラクション26、27および28を合わせたものを用いた）。上記3種の酵素蛋白質（ヒトTRACP 5a、TRACP 5b、 Baculoviral rhTRAC）を各2μgにあわせて非還元条件下にてSDS-PAGEを行い、ウエスタン・ブロッティング法により反応性を確認したところ、Trk62はヒトTRACP 5a、TRACP 5b、Baculoviral rhTRACPの全てに反応しなかった。しかしポジティブコントロールとして実験した抗TRACPモノクローナル抗体9C5[Zymed社]（Hybridoma,16:175-182,1997;BioTec Histochem,73:316-324,1998）は33kDaヒトTRACP 5a、TRACP 5b、Baculoviral rhTRACP及び3種全てにみられた16kDaのスモールフラグメントと反応していた（図４）。抗TRACPモノクローナル抗体9C5は加熱変性処理などを行った変性16kDaスモールフラグメントと反応することが既に知られている（Hybridoma,16:175-182,1997;BioTec Histochem,73:316-324,1998）。
この結果はヒトTRACP 5a、TRACP 5b、Baculoviral rhTRACPが界面活性剤SDSによって立体構造を変化させ、本発明のモノクローナル抗体Trk62はTRACP 5a、TRACP 5b、Baculoviral rhTRACPの立体構造を認識するモノクローナル抗体であるため反応性を失ったことを示しており、モノクローナル抗体Trk62がTRACPのNativeな構造を認識していることを示している。
【００２７】
（８）特異性検定
モノクローナル抗体Trk62の特異性を以下の通り検討した。測定方法は次の（i）から（v）のステップからなる。
（ｉ）上記（４）のコロニーのスクリーニングで使用したマイクロタイタープレート[Nunc社]に1μｇ/100μl/wellになるように抗マウスイムノグロブリン[ダコ社]を分注し、プレートを4℃で2晩静置した。その後0.05% Tween 20を含むトリス[SIGMA社]緩衝液で3回洗浄し、非特異的反応を抑えるために1.5％BSA[SIGMA社]溶液を200μl分注して、更に4℃で1晩静置した。
（ｉｉ）完成したプレートを0.05% Tween 20を含むトリス緩衝液で3回洗浄した後に本発明のモノクローナル抗体Trk62、または比較例としてモノクローナル抗体O1A（Suomen Bioanalytiikka Oy社 BoneTRAP Assayキットに附属、WO99/50662号公報、特表2002-510050号公報に記載のモノクローナル抗体）を400ng/100μl/wellにあわせて室温、1時間反応させ、更に0.05% Tween 20を含むトリス緩衝液で3回洗浄を行った。
（ｉｉｉ）次にモノクローナル抗体Trk62、O1Aを反応させたプレートに各種酸性ホスファターゼを反応させた。使用した検体は上記（７）のウエスタン・ブロッティングで使用した精製ヒトTRACP 5a、Baculoviral rhTRACPの他に、感作に使用したTRACP 5b、赤血球抽出液、血小板抽出液、好中球抽出液、前立腺由来酸性ホスファターゼ（PAP）[SIGMA社]である。これらのACPアイソフォームを含む検体はTRACPの酵素活性を全て10U/L（基質溶液pNPP 8mM 酢酸ナトリウム0.1M 酒石酸ナトリウム40mM pH5.7で測定した活性値）に合わせ、その100μlを抗体結合プレート上に加えた。
（ｉｖ）室温、1時間反応させた後、0.05% Tween 20を含むトリス緩衝液で3回洗浄を行い、基質溶液（8mM pNPP、100ｍM 酢酸ナトリウム、40ｍM 酒石酸ナトリウム pH6.1）100μlを加えて37℃、1時間発色させた。405nmにおける吸光度を測定して、モノクローナル抗体Trk62およびO1Aのそれぞれに反応した各種ACPアイソフォームの量を求めた。測定値は、各検体の吸光度より生理食塩水を検体として用いたブランク吸光度を差し引き算出した。得られた測定値を表１に示した。
【００２８】
【表１】

【００２９】
表１の結果から分かるように、モノクローナル抗体O1AおよびTrk62はヒトTRACP 5b 、TRACP 5aおよびBaculoviral rhTRACPとしか反応せず、他のACPアイソフォームと交差性を示さなかった。しかしその反応比率は異なっていた。即ち、TRACP 5bに対する反応性を100％とすると、Baculoviral rhTRACPに対する反応性は両抗体とも約70％の反応性であったが、TRACP 5aではモノクローナル抗体O1Aで65％であったのに対して、モノクローナル抗体Trk62では32％であった。このことは、モノクローナル抗体Trk62が特にTRACP 5bにアフィニティーが高いことを示している。即ち、TRACP 5bとTRACP 5aの反応性の比（TRACP 5b/TRACP 5a）を比べると、モノクローナル抗体O1Aが1.54に対しモノクローナル抗体Trk62が3.13であり、モノクローナル抗体Trk62がモノクローナル抗体O1Aに比して約2倍、TRACP 5bに対して特異性が高いことを示している。
更に以上の結果から、本発明のモノクローナル抗体Trk62は、以下のような特性を有している。
即ち、酒石酸ナトリウムの存在下でパラニトロフェニルリン酸（pNPP）を基質として用いてpH5.7で反応させた時に10U/Lの酵素活性を示すTRACP 5aおよびTRACP 5bのそれぞれを、プレートに固定した本発明のモノクローナル抗体と反応させ、次いでそれに結合したそれぞれのTRACP 5aおよびTRACP 5bの酵素活性を、酒石酸もしくは酒石酸ナトリウムの存在下で上記基質pNPPを用いてpH6.1で測定した時に、TRACP 5bに対する反応性がTRACP 5aの反応性の3.13倍である。
【００３０】
実施例２
モノクローナル抗体 Trk62 を用いた TRACP 5b の酵素活性の測定を利用した免疫測定法による臨床検体の測定
モノクローナル抗体Trk62の骨吸収関連疾患における臨床的意義を確認するためにホルモン補充療法（HRT）を施された患者血清を検体として検体中のTRACP 5bを測定した。
（１）方法
モノクローナル抗体Trk62を使用してのTRACP 5bの測定方法は、実施例１の（８）の特異性検定と全く同様の方法で行った。ただし、標準品としてBoneTRAP Assay（Suomen Bioanalytiikka Oy社）キット附属の組換えTRACPを測定し、その検量線より、吸光度をU/Lの酵素活性単位に変換して測定値を算出した。また、比較例として生化学法の総TRACP活性測定（Clin.Chem.,44:221-225,1998）及びTRACP 5bのELISA測定をBoneTRAP Assayをそのまま用いて測定を行った。検体はインフォームド・コンセントを行って集められ、測定まで-80℃で保管した。また、HRT前後の間隔は平均で7.4ヶ月であった。
（２）結果
得られた結果を表２に示した。
【００３１】
【表２】

【００３２】
理想的な臨床検査試薬はHRT後に治療前よりもダイナミックにその検査値が減少することで治療効果が的確に判断出来るものである。よって治療後の測定値が治療前よりもできるだけ小さくなればよいことになる。表２の結果を見ると実施例１で得られたモノクローナル抗体Trk62を使用したELISAでは治療効果判定のための治療後検査値は治療前測定値の平均33.6％であり、非常に大きな変化率を示していた。この結果は比較例であるTRACP測定例の生化学測定法による総TRACP測定77.0％及びTRACP 5b測定のBoneTRAP Assay 56.4％より有用であった。
【００３３】
なお、従来の骨代謝マーカーで同一検体を測定すると、B-ALP（オステオリンク「BAP」：血清中骨型アルカリ性ホスファターゼ測定 ELISA法）80.5％、NTx（オステオマークNTx：尿中Ｉ型コラーゲン分解N-テロペプチド測定 ELISA法）57.5％、Pyr（尿中総ピリジノリン測定 HPLC法）68.6％、D-Pyr（尿中総デオキシピリジノリン測定 HPLC法）52.8％、D-Pyr（オステオリンク「DPD」：Free 尿中デオキシピリジノリン測定 ELISA法）77.8％であった。
この結果から本発明のモノクローナル抗体Trk62によるTRACP 5bの測定が、従来の骨代謝マーカーの測定よりもHRT前後の変化率が大きく、骨代謝マーカーとして、臨床的に有用性が高いことを示している。
【００３４】
実施例３
モノクローナル抗体 Trk62 を用いた pH5.65 における成人および小児血清中の TRACP 5b の測定
本発明のモノクローナル抗体を用いた、骨吸収能の安定した成人血清と骨吸収の盛んな小児血清中のTRACP 5bの測定を行った。
（１）方法
測定は実施例２と同様に行い、基質試薬のpHのみをpH6.1からpH5.65に変更して測定した。また、比較例として、前記モノクローナル抗体O1Aを用いたBoneTRAP Assayでも測定した。検体はインフォームド・コンセントを行って得られた成人と小児血清、各2検体である。小児検体では盛んな骨代謝から骨吸収を表すTRACP 5bが成人よりも高値を示すと言われている。
（２）結果
得られた結果を表３に示した。
【００３５】
【表３】

【００３６】
表３から分かるように、結果的にモノクローナル抗体Trk62を用いた場合、成人と小児のTRACP測定値比率は4.44倍であり、BoneTRAP Assayキットの1.24倍より大きく、pH5.65の測定においてもTRACP 5bの最適pH付近の6.1で測定を行っている比較例のTRACP 5b測定に比して、骨吸収をはるかに感度よく表しているものと考えられた。なお、小児検体では盛んな骨代謝から骨吸収を表すTRACP 5bが成人よりも高値を示すと言われている。
【００３７】
実施例４
成人健常人血清検体と正常小児血清検体中の TRACP 5b のサンドイッチアッセイ ELISA 法による測定
本発明以外のモノクローナル抗体Trk49、本発明のモノクローナル抗体Trk62を利用して活性としてではなく蛋白質量としてTRACP 5bを測定することができる。上記2種のモノクローナル抗体を利用して以下のような実験を行った。
（１）方法
はじめにTRACP 5b蛋白量測定キットの測定原理、方法を示す。測定方法は簡単には以下の（１）から（４）のステップである。（１）予め固層プレートに抗TRACP 5bモノクローナル抗体Trk62を1μg/100μLとなるように分注し、4℃、2日間反応させて抗体結合プレートを作り、（スクリーニング）と同様にブロッキングを行う。（２）使用時には0.05% Tween 20を含むトリス緩衝液で3回洗浄した後に、血清検体50μlとクエン酸緩衝液50μlを別にプレートに加えて室温、1時間、検体中のTRACP 5bをプレート上の抗体複合体に結合させる。（３）洗浄を行った後、抗体に結合して残ったTRACP 5bに対して西洋ワサビパーオキシダーゼを標識したTrk49希釈2次標識抗体液100μlを加えて室温、1時間反応させてサンドイッチ複合体を作製する。（４）3回洗浄後にHRPの発色基質である3mg/mL OPD[ナカライ社]溶液を加えて吸光度を測定する。測定は測光波長490nmで実行した。一定時間の後に1N硫酸反応停止液を加える。検体の発色値（OD）は精製TRACP 5bの標準曲線から計算することによって濃度換算ができる。上記のようにして血清中のTRACP 5bを測定した。
【００３８】
（２）結果
実際に成人健常人血清6検体と正常小児血清6検体を測定すると表４のような結果であった。成人健常人血清6検体の平均値は9.92 ng/ｍLであったのに対して、骨吸収の活発な小児血清では平均値34.00 ng/ｍLであった。この結果は本測定系もまた活性測定法同様に骨吸収を反映するということを示している。
【００３９】
【表４】

【００４０】
実施例５
モノクローナル抗体 Trk62 を用いた組織免疫染色による TRACP 5b の測定
（１）方法
2μmに薄切された凍結ヒト破骨細胞腫瘍組織を-20℃アセトンで処理して組織固定し、洗浄後3％過酸化水素水処理を行い内因性ペルオキシダーゼ処理を施した。同一検体のパラフィン抱埋切片はミクロトームにて薄切し、キシレン各5分ずつ3回の処理で完全にパラフィンを除き、100％エチルアルコールから10％ずつ濃度を下げた50％までの6段階下降系列のアルコール溶液をくぐらせた後、50mMクエン酸緩衝液（pH6.0）に浸潤させた。以降凍結切片、パラフィン切片を同様に反応させている。つまり5％BSAを含む50mMクエン酸緩衝液（pH6.0）でブロッキングし、洗浄後に腹水から精製されたモノクローナル抗体Trk62を5％BSAを含む50mMクエン酸緩衝液（pH6.0）で10μg/mlに希釈し組織と室温２時間反応させた。陽性コントロールとして（ウエスタン・ブロッティング）で使用した抗TRAP抗体9C5[ZYMED社]を反応させた。５回洗浄を行ってENVISIONキット[ダコ社]を室温で1時間反応させ、２次抗体反応後、更に５回洗浄を行ってDAB発色キット[ダコ社]により発色させた。洗浄後、顕微鏡観察した。
【００４１】
（２）結果
顕微鏡観察の結果を図５に示した。
モノクローナル抗体Trk62は凍結切片の破骨細胞の細胞質のみが選択的に染まっていた。またパラフィン切片は全く反応が認められなかった。一方、抗TRAP抗体9C5は凍結切片では全く反応が認められず、パラフィン切片では破骨細胞が染色されていた。
この結果から、モノクローナル抗体Trk62は酵素の立体構造が保持された凍結切片のみと反応性を持つことからも、立体構造を保持したTRACP 5bを認識することが証明できた。また手術時に手術検体などを本発明のモノクローナル抗体によって素早く染色することによって組織学的判断を行う一助になり得る事も証明された。
【００４２】
【発明の効果】
以上に詳細に説明したように、本発明のモノクローナル抗体は、TRACP 5bに対する反応性がTRACP 5aに対する反応性よりも高く、TRACP 5bに対してより高い特異性を有するものである。従って、本発明のモノクローナル抗体により検体中のTRACP 5bを特異的に検出することができる。骨吸収マーカーとして検体中のTRACP 5bを本発明のモノクローナル抗体で高感度で且つ特異的に検出することができ、従って骨疾患の臨床検査等に本発明のモノクローナル抗体は極めて有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト大腿骨骨頭部から単離精製されたTRACP 5bをSDS-PAGEにより分析した結果を示す。
【図２】図２は、ヒトさい帯血より精製されたTRACP 5aおよびTRACP 5bをディスク電気泳動法により分析した結果を示す。
【図３】図３は、昆虫細胞を宿主細胞として産生された組換えTRACPをSDS-PAGEで分析した結果を示す。
【図４】図４は、ポジティブコントロールとして用いた抗TRACPモノクローナル抗体9C5の、ヒトTRACP 5a、TRACP 5bおよび組換えTRACPに対する反応性をウエスタンブロッティングにより分析した結果を示す。
【図５】図５は、本発明のモノクローナル抗体Trk62をヒト破骨細胞腫瘍組織の凍結切片と反応させた後の顕微鏡観察の結果を表す。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a monoclonal antibody specific to tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP 5b: also known as osteoclast-derived tartrate-resistant acid phosphatase), a hybridoma producing the monoclonal antibody, and TRACP 5b using the monoclonal antibody. The present invention relates to a detection method and a kit used therefor.
According to the monoclonal antibody of the present invention, the activity of tartrate-resistant acid phosphatase 5b can be specifically measured, and it is extremely effective as a bone resorption marker in the fields of medical treatment and clinical examination of bone diseases. .
[0002]
[Prior art]
The serum tartrate-resistant acid phosphatase (TRACP: Tartrate Resistant acid Phosphatase EC3.1.3.2) is mostly made of osteoclast-derived acid phosphatase, and its measurement is an index for evaluating the function of osteoclasts. It is considered useful and is of interest as a bone resorption marker (Non-patent Document 1). On the other hand, acid phosphatase in serum is divided into 6 bands from 0 to 5 from the origin by polyacrylamide gel electrophoresis, and the fifth is tartrate resistant, so Band 5 tartrate resistant acid phosphatase (TRACP 5). This can be further divided by electrophoresis into 5a, which has many sialic acid bonds to the sugar chain, and 5b, which has almost no sialic acid bonds. And 5a is an enzyme from platelets and others and the blood level does not change, whereas only 5b changes with bone resorption, so 5b is the main body of osteoclast-derived tartrate-resistant acid phosphatase (Patent Document 1).
In addition, the Clinical Chemistry magazine (Non-patent Document 2) recommends abbreviation of ACP derived from osteoclasts as TRACP 5b. Therefore, in this specification, ACP that is derived from osteoclasts and is an index of bone resorption is denoted as TRACP 5b, and osteoclast-derived tartrate-resistant acid phosphatase and tartrate-resistant acid phosphatase 5b are synonymously expressed as TRACP 5b. To do.
[0003]
Conventional activity measurement methods for determining TRACP activity as an index of acid phosphatase representing osteoclast activity have problems in terms of specificity, sensitivity, measurement complexity, and measurement time.
In general, the measurement of TRACP 5b by the activity measurement method is to measure enzyme activity by colorimetric determination of reaction products (alcohols and phenols) generated by enzymatic reaction using phosphate ester as a synthetic substrate in the presence of tartaric acid. Looking for. At that time, tartaric acid inhibits prostate-derived acid phosphatase, and the remaining acid phosphatase activity is measured with a substrate, so that TRACP activity is regarded as TRACP 5b activity. However, since tartrate-resistant acid phosphatase derived from erythrocytes and platelets other than those derived from osteoclasts present in the sample is also measured, there is a problem in terms of specificity. As an improved method of the above-mentioned method, a pre-treatment in which a serum diluted 5-fold is incubated at 37 ° C. for 1 hour, and the remaining TRACP activity is converted into p-nitrophenyl phosphate (pNPP) as a substrate in the presence of tartaric acid. ) Is known (Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4). Although this method can avoid the influence of erythrocyte-derived acid phosphatase, the influence of platelet-derived acid phosphatase cannot be excluded. As a more specific activity measurement method, the present inventors have reported a TRACP 5b measurement method using the difference between TRACP 5b and red blood cell and platelet-derived tartrate-resistant acid phosphatase activity in sensitivity to fluorine (patent) Reference 2). However, the effects of TRACP 5a could not be excluded, but the TRACP 5b activity was not inhibited in the presence of fluorine from the total tartrate-resistant acid phosphatase activity, although there was no effect of red blood cell and platelet-derived tartrate resistant acid phosphatase. Further improvement is demanded in terms of accuracy. Furthermore, a method for measuring TRACP 5b activity more specifically by using a combination of TRACP 5a inhibitors in the above-described method using fluorine has been reported (Patent Document 3). However, although the method using only fluorine is more specific, it still requires a problem in terms of accuracy since the osteoclast-derived TRACP 5b activity is still obtained by subtraction.
[0004]
On the other hand, immunoassay methods using polyclonal antibodies and monoclonal antibodies are also known as methods for measuring TRACP 5b by immunological measurement methods (Non-patent document 5, Non-patent document 6, Non-patent document 7, Non-patent document). 8, Non-Patent Document 9, Non-Patent Document 10). Since these methods measure both TRACP 5a and TRACP 5b, the influence of TRACP 5a cannot be ignored. Furthermore, immunological measurement methods for measuring TRACP 5b more specifically have been reported (Patent Documents 4 and 5). Although this method is more specific for TRACP 5b activity, the antibody used for the measurement is not specific for TRACP 5b and reacts with TRACP 5a. Therefore, it is active using the difference in the optimum pH between TRACP 5a and TRACP 5b. The measured value is calculated by measurement. For this reason, there are concerns about the effects of patient specimens with increased TRACP 5a, such as end-stage renal disease, and the difference between healthy specimens and patient specimens with increased bone resorption is small, and the sensitivity as a bone resorption marker is low. It is not enough (Non-Patent Document 11).
[0005]
[Patent Document 1]
Special table 2002-510050 gazette
[Patent Document 2]
Japanese Patent Laid-Open No. 10-37198
[Patent Document 3]
JP 2001-231595 A
[Patent Document 4]
WO99 / 50662 Publication
[Patent Document 5]
Special table 2002-510050 gazette
[Non-Patent Document 1]
Bone metabolism marker, Hitoshi Fukunaga, Toshitaka Nakamura, Toshio Matsumoto, Medical Levi
New Company, 1995
[Non-Patent Document 2]
Clin.Chem.47: 1497.2001
[Non-Patent Document 3]
Nihon University Medical Journal.49: 904-911.1990
[Non-Patent Document 4]
Clin.Chem.33: 458-462.1987
[Non-Patent Document 5]
J Clin Endocrinol Metab. 71: 442-451.1990
[Non-Patent Document 6]
J Bone Miner Res. 13: 683-687.1998
[Non-Patent Document 7]
Immunol Lett. 70: 143-149.1999
[Non-Patent Document 8]
J Bone Miner Res. 14: 464-469.1999
[Non-patent document 9]
Clin Chem. 45: 2150-2157.1999
[Non-Patent Document 10]
Clin Chem. 46: 1751-1754.2000
[Non-Patent Document 11]
Clin. Chim. Acta 301: 147-158, 2000
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
In view of such problems, the present invention provides a monoclonal antibody specific to osteoclast-derived tartrate-resistant acid phosphatase (TRACP 5b), a bone resorption marker, a hybridoma producing the same, and TRACP 5b using the monoclonal antibody. It is an object of the present invention to provide a method for detecting the above and a kit used therefor.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has a higher reactivity to tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP 5b: also known as osteoclast-derived tartrate-resistant acid phosphatase) than to tartrate-resistant acid phosphatase 5a (TRACP 5a), and TRACP 5b Relates to a monoclonal antibody against TRACP 5b having a higher specificity for.
Furthermore, the present invention relates to a hybridoma that produces the above monoclonal antibody.
Furthermore, the present invention relates to a TRACP 5b detection method for detecting TRACP 5b in a specimen using the above monoclonal antibody.
Furthermore, the present invention relates to a kit for use in the detection of TRACP 5b, comprising the above monoclonal antibody as a constituent component.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The monoclonal antibody of the present invention can be obtained by using TRACP 5b purified from human osteoclasts as an immunogen. In the examples described later in this specification, immunization was performed using TRACP 5b purified from normal osteoclasts as an antigen. However, TRACP 5b such as osteoclast tumor may also be used as an antigen. it can. The monoclonal antibody of the present invention is produced, for example, by a hybridoma obtained by immunizing an animal using purified human TRACP 5b as an immunogen and fusing an anti-human TRACP 5b antibody-producing cell produced by the animal with a bone marrow tumor cell. .
[0009]
The hybridoma can be obtained by the following method. That is, human TRACP 5b obtained as described above was mixed together using a known Freund's complete, incomplete adjuvant, aluminum hydroxide adjuvant, pertussis adjuvant, etc. to prepare a sensitive adjuvant solution. The animals are immunized by intraperitoneal subcutaneous or tail vein administration every 1 to 3 weeks, divided into several times. The amount of sensitizing antigen is between 1 μg and 100 mg, but generally about 50 μg is preferred. The number of immunizations is generally 2 to 7, but various methods are known. Next, antibody-producing cells derived from the spleen and the like are fused with cells having proliferation ability in a test tube such as bone marrow tumor cells (myeloma cells). Antibody-producing cells can be obtained from mice, nude mice, spleens of rats and the like.
As the above-mentioned fusion method, fusion can be carried out by using polyethylene glycol (PEG) according to the conventional method of Kohler and Milstein (Nature. 256, 495.1975) which is already known per se. Fusion can also be performed by Sendai virus or electrofusion.
[0010]
A method for selecting a hybridoma that produces an antibody recognizing human TRACP 5b from the fused cells can be performed as follows. That is, hybridomas are selected from colonies produced by cells surviving in the HAT medium and HT medium from the fused cells by the limiting dilution method. If colony culture supernatant made of fused cells in 96-wells contains antibodies to human TRACP 5b, the supernatant is placed on an assay plate with human TRACP 5b immobilized on the plate. In addition, a monoclonal antibody-producing clone against human TRACP 5b can be selected by an ELISA method in which a secondary labeled antibody such as an anti-mouse immunoglobulin-HRP labeled antibody is reacted after the reaction. In addition to HRP, enzymes such as alkaline phosphatase, fluorescent substances, radioactive substances and the like can be used as the labeling substance for the labeled antibody. As a control, human TRACP 5b-specific antibodies can be screened by simultaneously performing ELISA using an assay plate bound only with BSA, which is a blocking agent. In other words, clones that are positive in the human TRACP 5b plate and negative in BSA ELISA can be selected.
[0011]
As the hybridoma of the present invention, among the hybridomas producing monoclonal antibodies that recognize human TRACP 5b, in particular, monoclonal antibodies that react with human TRACP 5b and do not cross-react with erythrocytes, platelets, neutrophils, prostate-derived acid phosphatase Those that produce are desirable. An example is the hybridoma Trk62 established by the present inventor.
In particular, the monoclonal antibody of the present invention is preferably a monoclonal antibody having a higher affinity for human TRACP 5b than human TRACP 5a in order that the test results more clearly reflect bone resorption when used in clinical tests. It is desirable to have a reactivity twice or more in the detection system with respect to human TRACP 5b rather than TRACP 5a. An example of such a hybridoma is a hybridoma Trk62 established by the present inventor. Hybridoma Trk62 was deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on February 14, 2002, and assigned the accession number FERM BP-7890.
[0012]
The hybridoma can be cultured in a medium usually used for cell culture, such as α-MEM, RPMI1640, ASF, S-clone, and the monoclonal antibody can be recovered from the culture supernatant. Alternatively, an animal from which a hybridoma is derived or a nude mouse can be treated in advance with pristane, and ascites can be retained by intraperitoneal injection of cells into the animal, and a monoclonal antibody can be recovered from the ascites.
As a method for recovering the monoclonal antibody from the above supernatant or ascites, a usual method can be used. For example, salting-out method using ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography using protein A, protein G, and the like can be mentioned.
[0013]
The thus obtained monoclonal antibody of the present invention has a higher reactivity to TRACP 5b than that to TRACP 5a and a higher specificity to TRACP 5b. Specifically, the monoclonal antibody of the present invention has a reactivity to TRACP 5b that is more than twice the reactivity to TRACP 5a. More specifically,

TRACP

5a and 5b exhibiting the same amount of activity are reacted with each other. The reactivity to TRACP 5b is preferably at least twice that of TRACP 5a. More specifically, as clarified in the specificity test section of Example 1 (8) below, paranitrophenyl phosphate (pNPP) was used as a substrate in the presence of tartaric acid or tartrate. Each of TRACP 5a and TRACP 5b, which show enzyme activity of 10 U / L when reacted at pH 5.7 (pH at which TRACP 5a and TRACP 5b have the same enzyme activity) and the monoclonal antibody of the present invention immobilized on a plate, When the enzymatic activity of each TRACP 5a and TRACP 5b bound to the antibody was measured at pH 6.1 (optimal pH of TRACP 5b) using the substrate pNPP in the presence of tartaric acid or tartrate. Particularly preferred is a monoclonal antibody whose reactivity to TRACP 5b is at least twice that of TRACP 5a, more specifically at least 3 times.
Further, the monoclonal antibody of the present invention is also substantially effective against acid phosphatase derived from erythrocytes, platelets, neutrophils and prostate, as clearly shown in the specificity assay section of Example 1 (8). In particular, it does not show cross-reactivity. Further, as revealed in the Western blotting section of Example 1 (7) and Example 4, the monoclonal antibody of the present invention recognizes the three-dimensional structure of TRACP 5b as a native enzyme. is there.
[0014]
TRACP 5b in a sample can be detected with high sensitivity and specificity by an immunoassay using the monoclonal antibody of the present invention. Examples of the target specimen include tissues such as blood, serum, plasma, and bone.
Examples of the detection method by immunoassay using the monoclonal antibody of the present invention include immunoassay utilizing measurement of enzyme activity of TRACP 5b, sandwich assay ELISA method, tissue immunostaining method and the like.
[0015]
As an immunoassay utilizing measurement of the enzyme activity of TRACP5b, for example, TRACP 5b in a specimen, for example serum, is bound to the monoclonal antibody of the present invention, and the bound TRACP 5b is compared with the enzyme substrate of TRACP 5b, For example, there can be mentioned a method in which TRACP 5b in a sample can be immunoassayed by enzymatic reaction of P-nitrophenyl phosphate or a salt thereof and measuring the enzyme activity. In the method, specifically, TRACP 5b can be measured as follows. First, a sample to be measured is added to the monoclonal antibody of the present invention adsorbed on a solid support, and TRACP 5b and the antibody in the sample are subjected to an antigen-antibody reaction to bind TRACP 5b to the antibody. Next, the solid support is washed with a washing solution to remove components derived from the specimen that was not adsorbed to the antibody, and then an enzyme substrate of TRACP 5b, for example, p-nitrophenyl phosphate or a salt thereof is added to the reaction system Then, the substrate is reacted with TRACP 5b bound to the antibody. After stopping the enzyme reaction with the reaction stop solution, the absorbance of phenols produced by the reaction, for example, p-nitrophenol, is usually measured at a wavelength of 390 nm to 450 nm, preferably 400 to 430 nm. Since the magnitude of the absorbance reflects the TRACP 5b enzyme activity, TRACP 5b in the sample can be measured from the value.
In the present invention, as is apparent from the measurement method described above, the antibody is preferably bound to a solid support, and the solid support is usually a solid phase used in a solid phase immunoassay such as ELISA. A support is used, but is not particularly limited. For example, examples of the material for the solid support include polystyrene, polypropylene, polycarbonate, polyethylene, nylon, and methacrylate. Examples of the shape of the solid support include plates and beads.
In order to prepare an antibody adsorbed to a solid support, an antibody against TRACP 5b is bound to the solid support directly or indirectly using physical bond, chemical bond, or affinity. The amount of sensitizing antibody is often in the range of 1 ng to 100 mg / ml.
[0016]
When carrying out the measurement method of the present invention, a kit for immunoassay of TRACP 5b, comprising: i) a solid support, ii) the antibody of the present invention, and iii) a TRACP 5b enzyme substrate Yes.
In this kit, i) a solid support, and ii) the antibody of the present invention, a solid support and an antibody solution are prepared separately, and when measuring TRACP 5b, the antibody is used as a solid support. The antibody may be adsorbed, or may be provided in a state where the antibody is adsorbed on a solid support in advance. This kit preferably contains a washing solution in order to remove components that have not been adsorbed to the solid support after binding TRACP 5b in the specimen to the antibody. As the cleaning liquid, for example, a Tris buffer containing a surfactant can be used.
In the present invention, when this kit is used, it is preferable to include an enzyme reaction stop solution. As the enzyme stop solution, for example, an alkaline aqueous solution such as potassium hydroxide or sodium hydroxide solution can be used.
Furthermore, the kit of the present invention may contain a sample diluent as necessary. As the sample dilution solution, for example, a buffer solution such as Tris can be used. If necessary, a chelating agent such as EDTA · 2Na and an inorganic salt such as sodium chloride may be added to the buffer solution.
[0017]
In the present invention, TRACP 5b can also be measured by a sandwich assay ELISA method using the monoclonal antibody of the present invention. In this case, as a monoclonal antibody, in addition to the antibody of the present invention, another antibody against other TRACP 5b can be used. A specific example of a method for measuring TRACP 5b by sandwich assay is as follows. First, the antibody of the present invention as a primary antibody is adsorbed to a solid support, for example, a plate, reacted with TRACP 5b in a specimen, for example, serum, the solid support is washed, and then the adsorbed TRACP 5b By reacting with a biotinylated secondary antibody, for example, a monoclonal antibody or polyclonal antibody against another biotinylated TRACP 5b, reacting with peroxidase-labeled streptavidin, followed by peroxidase enzyme reaction, followed by color reaction, TRACP 5b can be detected. Moreover, the same measurement can be performed by using a secondary antibody that is directly labeled with peroxidase, alkaline phosphatase, or the like. The substance to be bound to the secondary labeled antibody is not limited to the enzyme depending on the measurement method, and may be a radioisotope, a fluorescent substance, a magnetic substance, a colloid, or the like.
[0018]
In the present invention, sandwich assay ELISA using the antibody of the present invention can be performed using a kit for sandwich assay ELISA.
When the measurement method of the present invention is performed by sandwich assay ELISA method, for example, a kit for immunoassay of TRACP 5b, comprising i) a solid support, ii) an antibody of the present invention, iii) labeled, TRACP 5b can also be measured by using a kit comprising another antibody against TRACP 5b and iv) a component for detecting the label.
The component for detecting the label is a component for measuring the labeled antibody, and when the label is biotin, a reagent containing peroxidase-labeled streptavidin, a peroxidase enzyme substrate of tetramethylbenzidine, and hydrogen peroxide When the label is alkaline phosphatase, the reagent contains p-nitrophenyl phosphate. This kit may contain a washing solution as necessary.
In the present invention, when this kit is used, it is preferable to include a washing solution in order to remove components that have not been adsorbed to the solid support after binding TRACP 5b in the specimen to the antibody. As the cleaning liquid, for example, a Tris buffer containing a surfactant can be used. Furthermore, the kit of the present invention may contain a sample diluent as necessary. As the sample dilution solution, for example, a buffer solution such as Tris can be used. If necessary, a chelating agent such as EDTA · 2Na and an inorganic salt such as sodium chloride may be added to the buffer solution.
[0019]
Furthermore, in the present invention, the presence of TRACP 5b in a sample can also be detected by a tissue immunostaining method using the monoclonal antibody of the present invention. That is, for example, a frozen section is prepared from a human osteoclast tissue by a conventional method, the monoclonal antibody of the present invention is reacted therewith, and then a secondary labeled with an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase, for example. The presence of TRACP 5b can be specifically detected by reacting with an antibody followed by color development.
Such detection by tissue immunostaining can be carried out using a kit containing i) the monoclonal antibody of the present invention, ii) a labeled secondary antibody, and iii) a chromogenic reagent as components. Examples of the labeled secondary antibody include animal-derived anti-IgG antiserum and anti-IgG polyclonal antibody labeled with an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase. The coloring reagent is a color developing enzyme used for labeling. A commonly used reagent such as a chromogenic substrate is used.
[0020]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
Osteoclast-derived tartrate-resistant acid phosphatase ( TRACP 5b Of monoclonal antibodies with high specificity for)
(1)TRACP 5b Purification
After informed consent, 130 g of human femoral head removed by surgical operation was frozen in liquid nitrogen, crushed with a hammer, and then buffered with protease inhibitors and the like (50 mM Tris-HCl, 0.3 (M KCl pH 7.5) was suspended in 200 mL and homogenized with an ultrasonic homogenizer. After stirring overnight at 4 ° C, the mixture is centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes, and the supernatant is dialyzed against 10 mM Tris buffer pH 8.2 and applied to a CM-Sepharose column (Sigma), and the adsorbed protein contains NaCl. Elute with a linear concentration gradient of Tris buffer. Tartrate-resistant acid phosphatase activity was measured using the substrate pNPP and the highly active fractions were pooled. After concentrating it, dialyzed against 20 mM Tris buffer pH 7.2 containing 0.7 M NaCl, applied to a Superdex 200 column [Amersham Pharmacia], and similarly measured the tartrate-resistant acid phosphatase activity of the eluted fraction. Fractions were pooled. It was applied to a HiTrap Heparin HP column (Amersham Pharmacia), and the adsorbed protein was eluted with a linear salt concentration gradient of the above 20 mM Tris buffer pH 7.4 containing NaCl. The tartaric acid resistant acid phosphatase highly active fractions were pooled and concentrated to obtain 0.4 mg of purified TRACP 5b. The amount of protein is A₂₈₀The purity was determined by SDS-PAGE [TIFCO] and silver staining revealed that it was TRACP 5b by a single band at a molecular weight of around 35,000 (FIG. 1). The enzyme that became a single band was used as an immunizing antigen as purified TRACP 5b.
[0021]
(2)

Purified human

TRACP

5b Immunization of mice by
Dilute purified human TRACP 5b with 50 mM citrate buffer (pH 5.5) to a concentration of 250 μg / ml, take 25 μg (100 μl) well until emulsified with 100 μl Freund complete adjuvant [Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] Mixed. The prepared suspension was intraperitoneally administered to a Balb / c 6-week-old female mouse [Clea Japan Co., Ltd.] under diethyl ether anesthesia. Two weeks later, the same amount of TRACP 5b (25 μg / ml) was mixed with Freund's incomplete adjuvant [Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] to give an emulsified suspension by the same procedure as Freund's complete adjuvant. Sensitized to mice. Thereafter, the same operation was carried out 2 weeks later. In the fourth round, 25 μg / ml of TRACP 5b was prepared as a final immunization in 50 mM citrate buffer (pH 5.5) and administered by mouse tail vein injection.
[0022]
(3)Establishment of hybridoma
Three days after the final immunization, the spleen surgically removed under diethyl ether anesthesia from mice sensitized with TRACP 5b was aseptically dispersed to prepare spleen cells. Fusion was performed according to the method of Kohler and Milstein (Nature.256, 495.1975), and spleen cells and myeloma cells P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) were fused using polyethylene glycol (PEG4000) [Merck]. Fusion ratio during TRACP 5b fusion is 8 × 10 spleen cells⁷Myeloma cells per cell P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) 2 × 10⁷It was about 4: 1. Fusion cells are dispersed in 10% FCS [INVITROGEN] α-MEM [IRVINE] HAT [Cosmo Bio] medium and dispensed into 96-well microtiter culture plates [Sumitomo Bakelite] at 37 ° C, 5% CO₂Cultured under conditions.
[0023]
(4)Colony screening
About 2 weeks later, the colonies were confirmed for growth and screened. The screening method performed is described below.
To prepare the screening plate, TRACP 5b purified in (1) above was dissolved in 50 mM citrate buffer and dispensed into a 96-well microtiter plate [Nunc] to 0.5 μg / 100 μl / well. Noted. The plate was allowed to stand at 4 ° C. for 2 nights, then washed 3 times with Tris buffer containing 0.05% Tween 20 [Wako Pure Chemical Industries], and 200 μl of 1.5% BSA [SIGMA] solution was added to suppress non-specific reactions. The aliquot was dispensed and allowed to stand at 4 ° C. overnight. The completed plate was washed 3 times with a Tris buffer containing 0.05% Tween 20, and then 100 μl of the culture supernatant of the hybridoma obtained in (3) above was reacted. After further washing, HRP as a secondary antibody was obtained. A labeled anti-mouse immunoglobulin antibody [Zymed] was added and reacted. After washing, add 100 μl of 3 mg / ml o-phenylenediamine (OPD) [Nacalai] citric acid coloring solution, which is a color developing substrate for HRP, and after a certain period of color development, further 100 μl with 1N sulfuric acid [Wako Pure Chemical Industries] The absorbance was measured at a measurement wavelength of 492 nm. Clones that became positive as described above were recloned by limiting dilution and the supernatant was checked again.
[0024]
(5)Antibody confirmation
When the reactivity with purified TRACP 5b was confirmed by ELISA, clones Trk62 and Trk49 were obtained that reacted with the purified TRACP 5b plate. The monoclonal antibody Trk62 produced by clone Trk62 showed strong reactivity with purified TRACP 5b. On the other hand, the monoclonal antibody Trk49 was weakly reactive. The monoclonal antibody Trk62 of the present invention did not react at all with the control BSA plate. As a result of assaying the above antibody with a monoclonal antibody typing kit [Amersham Pharmacia], the monoclonal antibodies Trk62 and Trk49 had the following characteristics.
class Subclass Light chain
IgG IgG1 κ
[0025]
(6)Production and purification of monoclonal antibodies
Hybridoma Trk62 1 × 10 obtained in (4) above⁷Cells were intraperitoneally administered to Balb / c mice [CLEA Japan Inc.] (10 weeks old, female) for 2 weeks after administration of 0.5 ml of pristane [Aldrich], and ascites collected in the abdominal cavity of the mice about 2 weeks later. It was surgically collected under diethyl ether anesthesia. When the ascites was serially diluted as a sample by the same ELISA method as performed in the colony screening in (4) above, a high concentration of monoclonal antibody was contained. This ascites was treated with 40% ammonium sulfate, dialyzed against PBS, purified by a protein G column [Amersham Pharmacia] and confirmed by SDS-PAGE. Monoclonal antibody Trk62 was found to have a single molecular weight of about 150,000 when non-reduced, and two bands of about 50,000 and 25,000 molecular weight when mercaptoethanol was reduced. The purified monoclonal antibody was about 15 mg per mouse and was sufficient for industrial use. Similarly, monoclonal antibody Trk49 was also obtained from hybridoma Trk49. Hybridoma Trk49 was deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on November 27, 2002, and has been assigned FERM BP-8249.
[0026]
(7)Western blotting
From the results of Western blotting and the like, it was found that the monoclonal antibody Trk62 does not recognize SDS-treated TRACP 5, but recognizes native TRACP 5. This will be described in detail below.
TRACP was purified from human cord blood subjected to informed concept by a method already known as a Western blotting sample (Clin. Chem. 24: 7, 1105-1108.1978). At this time, human TRACP was divided into two types, TRACP 5a and TRACP 5b. TRACP 5a and TRACP 5b were confirmed by disc electrophoresis (Clin. Chem. 24: 2,309-312.1978) (FIG. 2) and activity measurement by fluorine inhibition (Clin. Chem. 46: 4,469-473.2000). Separately, human recombinant TRACP using insect cells (Baculoviral rhTRACP) was prepared by referring to the method of Hyman et al. (J. Biol. Chem. 269, 1294-1300.1994) that has already been known, and after purification, One type was used (the combination of fractions 26, 27 and 28 shown in FIG. 3 was used). When the above three enzyme proteins (human TRACP 5a, TRACP 5b, and Baculoviral rhTRAC) were combined with 2 μg each, SDS-PAGE was performed under non-reducing conditions, and the reactivity was confirmed by Western blotting. It did not react with all of TRACP 5a, TRACP 5b, and Baculoviral rhTRACP. However, anti-TRACP monoclonal antibody 9C5 [Zymed] (Hybridoma, 16: 175-182, 1997; BioTec Histochem, 73: 316-324, 1998), which was tested as a positive control, was used for 33 kDa human TRACP 5a, TRACP 5b, Baculoviral rhTRACP and 3 It reacted with a 16 kDa small fragment found in all species (FIG. 4). It is already known that the anti-TRACP monoclonal antibody 9C5 reacts with a denatured 16 kDa small fragment subjected to heat denaturation treatment or the like (Hybridoma, 16: 175-182, 1997; BioTec Histochem, 73: 316-324, 1998).
This result shows that human TRACP 5a, TRACP 5b, and Baculoviral rhTRACP change the three-dimensional structure by the surfactant SDS, and the monoclonal antibody Trk62 of the present invention is a monoclonal antibody that recognizes the three-dimensional structure of TRACP 5a, TRACP 5b, and Baculoviral rhTRACP. This indicates that the reactivity has been lost, and that the monoclonal antibody Trk62 recognizes the native structure of TRACP.
[0027]
(8)Specificity test
The specificity of the monoclonal antibody Trk62 was examined as follows. The measurement method includes the following steps (i) to (v).
(I) Anti-mouse immunoglobulin [Dako] was dispensed at 1 μg / 100 μl / well to the microtiter plate [Nunc] used for the colony screening in (4) above, and the plate was washed at 4 ° C. I left still overnight. Then, it was washed 3 times with Tris [SIGMA] buffer containing 0.05% Tween 20, and 200 μl of 1.5% BSA [SIGMA] solution was dispensed to suppress non-specific reaction, and the plate was further left overnight at 4 ° C. I put it.
(Ii) The completed plate was washed three times with a Tris buffer containing 0.05% Tween 20, and then the monoclonal antibody Trk62 of the present invention or, as a comparative example, monoclonal antibody O1A (supplied with BoneTRAP Assay kit of Suomen Bioanalytiikka Oy, WO99 / 50662) And monoclonal antibody described in JP-T 2002-510050) were reacted at 400 ng / 100 μl / well at room temperature for 1 hour, and further washed three times with a Tris buffer containing 0.05% Tween 20.
(Iii) Next, various acid phosphatases were reacted with the plates reacted with the monoclonal antibodies Trk62 and O1A. Specimens used include purified human TRACP 5a and Baculoviral rhTRACP used in Western blotting in (7) above, TRACP 5b used for sensitization, erythrocyte extract, platelet extract, neutrophil extract, prostate-derived Acid phosphatase (PAP) [SIGMA]. Specimens containing these ACP isoforms are all adjusted to 10 U / L of the enzyme activity of TRACP (activity value measured with substrate solution pNPP 8 mM sodium acetate 0.1 M sodium tartrate 40 mM pH 5.7), and 100 μl thereof is placed on the antibody-binding plate. added.
(Iv) After reacting at room temperature for 1 hour, the plate was washed 3 times with a Tris buffer containing 0.05% Tween 20, and 100 μl of a substrate solution (8 mM pNPP, 100 mM sodium acetate, 40 mM sodium tartrate pH 6.1) was added to 37 Color was developed for 1 hour at ℃. Absorbance at 405 nm was measured to determine the amount of various ACP isoforms that reacted with each of the monoclonal antibodies Trk62 and O1A. The measured value was calculated by subtracting the blank absorbance using physiological saline as a sample from the absorbance of each sample. The obtained measured values are shown in Table 1.
[0028]
[Table 1]

[0029]
As can be seen from the results in Table 1, the monoclonal antibodies O1A and Trk62 reacted only with human TRACP 5b, TRACP 5a and Baculoviral rhTRACP, and did not show cross-reactivity with other ACP isoforms. However, the reaction ratio was different. That is, assuming that the reactivity to TRACP 5b is 100%, the reactivity to Baculoviral rhTRACP was about 70% for both antibodies, whereas TRACP 5a was 65% for monoclonal antibody O1A, It was 32% for the monoclonal antibody Trk62. This indicates that the monoclonal antibody Trk62 has particularly high affinity for TRACP 5b. That is, comparing the reactivity ratio between TRACP 5b and TRACP 5a (TRACP 5b / TRACP 5a), monoclonal antibody O1A is 1.54, monoclonal antibody Trk62 is 3.13, and monoclonal antibody Trk62 is approximately compared to monoclonal antibody O1A. 2 times higher specificity for TRACP 5b.
Furthermore, from the above results, the monoclonal antibody Trk62 of the present invention has the following characteristics.
That is, each of TRACP 5a and TRACP 5b, which showed enzyme activity of 10 U / L when reacted at pH 5.7 using paranitrophenyl phosphate (pNPP) as a substrate in the presence of sodium tartrate, was immobilized on the plate. When the enzyme activity of each TRACP 5a and TRACP 5b bound to the monoclonal antibody of the present invention and then bound thereto was measured at pH 6.1 using the substrate pNPP in the presence of tartaric acid or sodium tartrate, it was effective against TRACP 5b. The reactivity is 3.13 times that of TRACP 5a.
[0030]
Example 2
Monoclonal antibody Trk62

Used

TRACP

5b Of clinical samples by immunoassay using measurement of enzyme activity
In order to confirm the clinical significance of monoclonal antibody Trk62 in bone resorption-related diseases, TRACP 5b was measured in sera of patients treated with hormone replacement therapy (HRT).
(1) Method
The measurement method of TRACP 5b using the monoclonal antibody Trk62 was performed in exactly the same manner as the specificity test of (8) of Example 1. However, recombinant TRACP attached to the BoneTRAP Assay (Suomen Bioanalytiikka Oy) kit was measured as a standard product, and the measured value was calculated by converting the absorbance into U / L enzyme activity units from the calibration curve. In addition, as a comparative example, measurement of total TRACP activity by biochemical method (Clin. Chem., 44: 221-225,1998) and ELISA measurement of TRACP 5b were performed using BoneTRAP Assay as it was. Samples were collected by informed consent and stored at −80 ° C. until measurement. The average interval before and after HRT was 7.4 months.
(2) Results
The obtained results are shown in Table 2.
[0031]
[Table 2]

[0032]
The ideal clinical test reagent can be used to accurately determine the therapeutic effect by reducing the test value dynamically after HRT than before treatment. Therefore, the measured value after treatment should be as small as possible before treatment. Looking at the results in Table 2, in the ELISA using the monoclonal antibody Trk62 obtained in Example 1, the post-treatment test value for determining the therapeutic effect was an average of 33.6% of the pre-treatment measurement value, indicating a very large rate of change. Was showing. This result was more useful than 77.0% of the total TRACP measurement by the biochemical measurement method of the TRACP measurement example as a comparative example and 56.4% of the BoneTRAP Assay by TRACP 5b measurement.
[0033]
When the same specimen was measured with a conventional bone metabolism marker, B-ALP (osteolink “BAP”: serum bone alkaline phosphatase measurement ELISA method) 80.5%, NTx (osteomark NTx: urinary type I collagen degradation N -Telopeptide measurement ELISA method 57.5%, Pyr (HPLC method for urinary total pyridinoline measurement) 68.6%, D-Pyr (HPLC method for urinary total deoxypyridinoline measurement) 52.8%, D-Pyr (osteolink “DPD” : Free urinary deoxypyridinoline measurement ELISA method) 77.8%.
This result shows that the measurement of TRACP 5b with the monoclonal antibody Trk62 of the present invention has a higher rate of change before and after HRT than the conventional bone metabolism marker measurement, and is highly useful as a bone metabolism marker. .
[0034]
Example 3
Monoclonal antibody Trk62 Used pH5.65 In adult and pediatric sera

TRACP

5b Measurement
Using the monoclonal antibody of the present invention, TRACP 5b was measured in adult serum with stable bone resorption ability and serum of children with strong bone resorption.
(1) Method
The measurement was performed in the same manner as in Example 2, and only the pH of the substrate reagent was changed from pH 6.1 to pH 5.65. As a comparative example, measurement was also performed using a BONETRAP Assay using the monoclonal antibody O1A. Samples are adult and pediatric sera obtained by informed consent, 2 samples each. In pediatric specimens, TRACP 5b, which represents bone resorption due to thriving bone metabolism, is said to be higher than adults.
(2) Results
The obtained results are shown in Table 3.
[0035]
[Table 3]

[0036]
As can be seen from Table 3, when the monoclonal antibody Trk62 was used as a result, the ratio of measured TRACP in adults and children was 4.44 times, greater than 1.24 times that of the BoneTRAP Assay kit, and TRACP 5b was also measured at pH 5.65. Compared to the TRACP 5b measurement in the comparative example, which was measured at 6.1 near the optimum pH, bone resorption was considered to be much more sensitive. In pediatric specimens, TRACP 5b, which represents bone resorption due to thriving bone metabolism, is said to be higher than adults.
[0037]
Example 4
Among normal healthy human serum samples and normal pediatric serum samples

TRACP

5b Sandwich assay ELISA Measurement by method
By using the monoclonal antibody Trk49 other than the present invention and the monoclonal antibody Trk62 of the present invention, TRACP 5b can be measured not as activity but as protein mass. The following experiment was conducted using the above two monoclonal antibodies.
(1) Method
First, the measurement principle and method of the TRACP 5b protein measurement kit are shown. The measuring method is simply the following steps (1) to (4). (1) Dispense anti-TRACP 5b monoclonal antibody Trk62 to a solid layer plate at 1 μg / 100 μL in advance, react at 4 ° C. for 2 days to prepare an antibody-binding plate, and perform blocking in the same manner as in (Screening). (2) In use, after washing three times with Tris buffer containing 0.05% Tween 20, add 50 μl of serum sample and 50 μl of citrate buffer separately to the plate, and add TRACP 5b in the sample to the plate at room temperature for 1 hour. Bind to antibody complex. (3) After washing, 100 μl of Trk49 diluted secondary labeled antibody solution labeled with horseradish peroxidase was added to the remaining TRACP 5b bound to the antibody and reacted at room temperature for 1 hour to form a sandwich complex. Make it. (4) After washing three times, add 3 mg / mL OPD [Nacalai] solution, which is a HRP chromogenic substrate, and measure the absorbance. The measurement was performed at a photometric wavelength of 490 nm. After a certain time, 1N sulfuric acid stop solution is added. The color development value (OD) of the sample can be converted to a concentration by calculating from the standard curve of purified TRACP 5b. TRACP 5b in serum was measured as described above.
[0038]
(2) Results
Actually, 6 samples of healthy adult human serum and 6 samples of normal child serum were measured, and the results were as shown in Table 4. The average value of 6 samples of healthy adult human serum was 9.92 ng / mL, whereas the average value of sera of children with active bone resorption was 34.00 ng / mL. This result shows that this measurement system also reflects bone resorption as well as the activity measurement method.
[0039]
[Table 4]

[0040]
Example 5
Monoclonal antibody Trk62 By tissue immunostaining using

TRACP

5b Measurement
(1) Method
Frozen human osteoclast tumor tissue sliced to 2 μm was treated with -20 ° C. acetone to fix the tissue, washed, and then treated with 3% hydrogen peroxide and treated with endogenous peroxidase. The paraffin-embedded section of the same specimen is sliced with a microtome, the paraffin is completely removed by 3 treatments of 5 minutes each for xylene, and the concentration is lowered in 6 steps from 100% ethyl alcohol to 50%. A series of alcohol solutions was passed through and then infiltrated with 50 mM citrate buffer (pH 6.0). Thereafter, frozen sections and paraffin sections are reacted in the same manner. That is, blocking with 50 mM citrate buffer (pH 6.0) containing 5% BSA, and 10 μg / ml of monoclonal antibody Trk62 purified from ascites after washing with 50 mM citrate buffer (pH 6.0) containing 5% BSA And the tissue was allowed to react for 2 hours at room temperature. The anti-TRAP antibody 9C5 [ZYMED] used as a positive control (Western blotting) was reacted. After washing 5 times, the ENVISION kit [Dako] was reacted at room temperature for 1 hour. After the secondary antibody reaction, the plate was further washed 5 times and developed with the DAB coloring kit [Dako]. After washing, it was observed with a microscope.
[0041]
(2) Results
The result of microscopic observation is shown in FIG.
Monoclonal antibody Trk62 selectively stained only the cytoplasm of osteoclasts in the frozen section. The paraffin section showed no reaction at all. On the other hand, anti-TRAP antibody 9C5 did not react at all in the frozen section, and osteoclasts were stained in the paraffin section.
From this result, it was proved that the monoclonal antibody Trk62 was able to recognize TRACP 5b retaining the three-dimensional structure, because it was reactive only with the frozen section retaining the three-dimensional structure of the enzyme. It has also been proved that histological judgment can be helped by quickly staining surgical specimens with the monoclonal antibody of the present invention during surgery.
[0042]
【The invention's effect】
As described in detail above, the monoclonal antibody of the present invention has a higher reactivity to TRACP 5b than that to TRACP 5a and a higher specificity to TRACP 5b. Therefore, TRACP 5b in the specimen can be specifically detected by the monoclonal antibody of the present invention. As a bone resorption marker, TRACP 5b in a specimen can be detected with high sensitivity and specificity with the monoclonal antibody of the present invention. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention can be used very effectively for clinical examination of bone diseases. it can.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of SDS-PAGE analysis of TRACP 5b isolated and purified from the human femoral head.
FIG. 2 shows the results of analyzing TRACP 5a and TRACP 5b purified from human umbilical cord blood by disc electrophoresis.
FIG. 3 shows the results of SDS-PAGE analysis of recombinant TRACP produced using insect cells as host cells.
FIG. 4 shows the results of Western blotting analysis of the reactivity of anti-TRACP monoclonal antibody 9C5 used as a positive control to human TRACP 5a, TRACP 5b and recombinant TRACP.
FIG. 5 shows the results of microscopic observation after reacting the monoclonal antibody Trk62 of the present invention with a frozen section of human osteoclast tumor tissue.

Claims

Reactivity to tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP5b: also known as osteoclast-derived tartrate-resistant acid phosphatase) is higher than reactivity to tartrate-resistant acid phosphatase 5a (TRACP5a), and in the presence of tartaric acid or tartrate Each of TRACP5a and TRACP5b, which show enzyme activity of 10 U / L when reacted at pH 5.7 using paranitrophenyl phosphate (pNPP) as a substrate, was reacted with the monoclonal antibody and then bound to the antibody. The TRACP5a and TRACP5b enzyme activities were measured at pH 6.1 using the substrate pNPP in the presence of tartaric acid or tartrate at pH 6.1 and at least twice the reactivity of TRACP5a and 3.13 times less. so Ri, red blood cells, platelets, no cross reactivity against neutrophils and prostate-derived acid phosphatase, monoclonal antibodies against TRACP5b with higher specificity against TRACP5b.

The monoclonal antibody according to claim 1, which recognizes a three-dimensional structure as a native enzyme of TRACP5b.

A hybridoma producing the monoclonal antibody according to claim 1 or 2.

The hybridoma according to claim 3, which is deposited under the accession number FERM BP-7890 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.

A method for detecting TRACP5b, wherein TRACP5b in a sample is detected by immunoassay using the monoclonal antibody according to claim 1 or 2.

6. The detection method according to claim 5, wherein TRACP5b in the sample is bound to the monoclonal antibody of claim 1 or 2, and then the enzyme activity of the bound TRACP5b is measured to detect TRACP5b in the sample.

6. The detection method according to claim 5, wherein TRACP5b in the specimen is detected by sandwich assay ELISA using the monoclonal antibody of claim 1 or 2.

The detection method according to claim 5, wherein the presence of TRACP5b in the specimen is detected by a tissue immunostaining method using the monoclonal antibody according to claim 1 or 2.

The detection method according to any one of claims 5 to 8, which is used as a bone resorption marker in a clinical examination of a bone disease.

A kit for use in detecting TRACP5b, comprising the monoclonal antibody of claim 1 or 2 as a constituent component.

A kit for use in the detection method according to claim 6, comprising a solid phase support, the monoclonal antibody according to claim 1 or 2 and an enzyme substrate of TRACP5b as constituent components.

A kit for use in the detection method of claim 7, comprising a solid phase support, the monoclonal antibody of claim 1 or 2, an antibody against another labeled TRACP5b, and components for detecting the label 11. Kit according to claim 10, comprising as a component.

A kit for use in the detection method of claim 8, comprising the monoclonal antibody of claim 1 or 2, a labeled secondary antibody, and a coloring reagent as constituent components.