KR100825116B1

KR100825116B1 - Diagnosing agent and kit for quantitative analysis of alanine aminotransferase for liver disease

Info

Publication number: KR100825116B1
Application number: KR1020050109954A
Authority: KR
Inventors: 최의열; 김현정; 이원희
Original assignee: 최의열
Priority date: 2005-11-17
Filing date: 2005-11-17
Publication date: 2008-04-25
Also published as: KR20070052385A

Abstract

본 발명은 면역분석법을 이용한 알라닌 아미노전이효소 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것으로, (a) 인간 유래의 알라닌 아미노전이효소 2 또는 이와 실질적으로 동일한 단백질을 포함하는 단수형 항원, 및 상기 단백질과 인간 유래의 알라닌 아미노전이효소 1 또는 이와 실질적으로 동일한 단백질을 포함하는 복수형 항원으로 이루어지는 군에서 선택된 항원; 또는The present invention relates to a composition for diagnosing alanine aminotransferase using immunoassay and a diagnostic kit using the same. (A) Singular antigen comprising alanine aminotransferase 2 derived from human or a protein substantially identical thereto, and the protein and human An antigen selected from the group consisting of alanine aminotransferase 1 derived or a plural antigen comprising a protein substantially identical thereto; or

(b) 상기 알라닌 아미노전이효소 2 또는 이와 실질적으로 동일한 단백질에 특이적으로 반응하는 단일클론항체, 및 상기 알라닌 아미노전이효소 1 또는 이와 실질적으로 동일한 단백질에 특이적으로 반응하는 단일클론항체로 이루어지는 군에서 선택된 항체; (b) a group consisting of a monoclonal antibody that specifically reacts with the alanine aminotransferase 2 or a protein substantially the same, and a monoclonal antibody that specifically reacts with the alanine aminotransferase 1 or a protein substantially the same An antibody selected from;

가 포함되어 이루어지는 알라닌 아미노전이효소 진단용 조성물과 이를 이용한 진단 키트를 제공함으로써, 종래 효소 활성도 측정방식보다 간 질환 진단 효율을 매우 향상시켰다By providing an alanine aminotransferase diagnostic composition comprising a and a diagnostic kit using the same, significantly improved liver disease diagnosis efficiency than the conventional enzyme activity measurement method

알라닌 아미노전이효소, 면역분석법, 진단용 조성물, 진단 키트 Alanine aminotransferases, immunoassays, diagnostic compositions, diagnostic kits

Description

Composition for detecting alanine aminotransferase for diagnosing liver disease, and diagnostic kit using the same {DIAGNOSING AGENT AND KIT FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF ALANINE AMINOTRANSFERASE FOR LIVER DISEASE}

도 1은 재조합 ALT-1과 ALT-2의 효소반응을 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the enzymatic reaction of recombinant ALT-1 and ALT-2.

도 2는 ALT-1(A)과 ALT-2(B)에 대한 단일클론 항체의 특이성을 나타낸 그래프이다.2 is a graph showing the specificity of monoclonal antibodies against ALT-1 (A) and ALT-2 (B).

도 3은 웨스턴 블롯 분석법에 의한 ALT-1의 단일클론항체(A)와 ALT-2 단일클론 항체(B)의 대한 특성을 나타낸 사진으로, M은 마커, 래인 1,2,3은 재조합 ALT시료를 전개한 것이고, 4,5,6,7,8,9,10,11은 간 조직에서 직접 추출한 전체 단백질 시료를 전개한 것이다(CB: 코마시 블루 염색, WB: 웨스턴 블롯).3 is a photograph showing the characteristics of ALT-1 monoclonal antibody (A) and ALT-2 monoclonal antibody (B) by Western blot analysis, M is a marker, lanes 1,2,3 are recombinant ALT samples 4,5,6,7,8,9,10,11 is a whole protein sample extracted directly from liver tissue (CB: Coomassie blue staining, WB: Western blot).

도 4는 재조합 ALT 효소를 사용한 ELISA 표준곡선의 그래프로, ALT-1(A)은 L1-64c5와 d L1-90c1 클론을 쌍으로 사용하여 나타낸 것이고, ALT-2(B)는 L2-6c6와 L2-7c2 클론을 쌍으로 사용하여 나타낸 것이다.Figure 4 is a graph of the ELISA standard curve using recombinant ALT enzyme, ALT-1 (A) is shown using a pair of L1-64c5 and d L1-90c1 clone, ALT-2 (B) is L2-6c6 and L2-7c2 clones are shown in pairs.

도 5는 간 질환 환자별로 혈중 ALT 효소의 분포를 효소 활성도(A), ALT-1의 단일클론 항체의 정량 측정값(B) 및 ALT-2의 단일클론 항체의 정량 측정값(B)으로 니타낸 그래프이다(carrier: 간염 보균자, AH: 급성간염,CH: 만성간염, HCC: 간암, LC: 간경변).FIG. 5 shows the distribution of ALT enzyme in blood by liver disease patients as enzyme activity (A), quantitative measurement of monoclonal antibody of ALT-1 (B) and quantitative measurement of monoclonal antibody of ALT-2 (B). (Carrier: hepatitis carrier, AH: acute hepatitis, CH: chronic hepatitis, HCC: liver cancer, LC: cirrhosis).

도 6은 간 질환별로 간경화(A)와 간암(B) 환자에서 ALT-1의 활성도(activity)와 양(mass)간의 ROC 플롯을 나타낸 그래프이다.6 is a graph showing ROC plots between activity and mass of ALT-1 in liver cirrhosis (A) and liver cancer (B) patients according to liver disease.

도 7은 간 질환별로 간경화(A)와 간암(B) 환자에서 ALT-2의 활성도(activity)와 양(mass)간의 ROC 플롯을 나타낸 그래프이다.FIG. 7 is a graph showing ROC plots between activity and mass of ALT-2 in liver cirrhosis (A) and liver cancer (B) patients.

도 8은 ALT-1에 대한 자가항체의 간 질환 환자별 분포를 IgA(A)와 IgM(B)으로 검출하여 정량적으로 나타낸 그래프이다.8 is a graph quantitatively detecting the distribution of liver disease patients with autologous antibodies to ALT-1 by IgA (A) and IgM (B).

도 9. ALT-2에 대한 자가항체의 간 질환 환자별 분포를 IgA로 검출하여 정량적으로 나타낸 그래프이다.Figure 9 is a graph quantitatively detected by detecting the IgA distribution of liver disease patients with autoantibodies to ALT-2.

본 발명은 면역분석법을 이용한 알라닌 아미노전이효소 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알라닌 아미노전이효소와 이의 동위효소를 각각 구별하여 특이적으로 반응할 수 있는 단일클론 항체를 사용하여 피검체의 시료 내 알라닌 아미노전이효소를 정량적으로 측정할 수 있으면서 알라닌 아미노전이효소와 이의 동위효소를 구별하여 측정함으로써, 간 질환의 판정 효율이 매우 우수하고 간 질환의 진행정도도 진단할 수 있는 진단용 조성물과 이를 이용한 진단 키트에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for diagnosing alanine aminotransferase using an immunoassay method and a diagnostic kit using the same, and more specifically, using a monoclonal antibody capable of specifically reacting with alanine aminotransferase and its isoenzyme, respectively. It is possible to quantitatively measure alanine aminotransferase in a sample of the subject, and to distinguish and measure alanine aminotransferase and its isoenzyme, so that the efficiency of liver disease is excellent and the progression of liver disease can be diagnosed. It relates to a diagnostic composition and a diagnostic kit using the same.

일반적으로 간 질환을 일으키는 주요 원인들로는 알코올과 간염 바이러스를 들 수 있으며, 이로 인한 간경화 변과 간암은 현대인들의 주요 사망 원인 중에의 하나이다. In general, the main causes of liver disease include alcohol and hepatitis virus, cirrhosis of the liver and liver cancer is one of the leading causes of death among modern people.

그러나 간질환은 상당히 진행되기 전까지는 자가 증상이 없기 때문에 정확한 진단 방법의 개발은 간 질환의 조기치료뿐만 아니라 간 질환의 진단, 경과의 관찰 등에 있어서 매우 중요하다고 볼 수 있다. However, since liver disease does not have self-symptom until it progresses considerably, development of accurate diagnosis method is very important not only for early treatment of liver disease but also for diagnosis of liver disease and observation of progress.

간 질환을 진단하는데 있어서 현재 사용되고 있는 혈액 생화학적 검사에는 총 단백, 알부민, 콜레스테롤과 같은 생합성 물질을 비색법으로 정량하거나, 빌리 루빈 등의 분비물질의 흡광도 측정법, 그리고 감마-글루타밀-전이효소(γ-glutamyl transferase; γ-GTP), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP), 아미노전이효소(aminotransferase) 등의 효소활성을 생화학적으로 측정하는 방법이 포함 되어있다. 이중, 혈액의 화학적 검사 방법에서 가장 대표적인 측정항목 중 하나인 아미노전이효소(aminotransferase)는 간세포에 다량으로 포함되어 있다가 세포막 투과력이 항진되거나 간 세포가 손상이 되었을 때, 그 손상된 정도에 비례하여 혈액 내로 방출되기 때문에, 혈액 내에서 이 효소의 활성 변화도를 측정하면 간 세포의 손상 정도를 추정하는데 적합한 지표로 삼을 수 있다. 특히, 그 중에서도 알라닌 전이효소[alanine-aminotransferase(ALT) 또는 glutamate private transaminase (GPT)]는 아스파레이트 아미노전이효소[aspartate aminotransferase(AST 또는 GOT)]와 마찬가지로 간질환 환자에서 그 효소활성이 정상인과 비교하여 매우 높아지며, 또한 대부분의 간질환에서 혈액 내 효소활성이 AST보다도 더 높게 나타나는 경향이 있기 때문에 간질환 진단에 있어서 매우 중요한 인자로 볼 수 있다.Current blood biochemical tests for diagnosing liver disease include colorimetric determination of biosynthetic compounds such as total protein, albumin and cholesterol, or measurement of absorbance of secretory substances such as bilirubin, and gamma-glutamyl-transferase (γ-). Biochemical measurements of enzyme activities such as glutamyl transferase (γ-GTP), alkaline phosphatase (ALP), and aminotransferase are included. Among them, aminotransferase, which is one of the most representative measurement items in the blood chemical test method, is contained in a large amount in liver cells, and when the cell membrane permeability is enhanced or the liver cells are damaged, blood is proportional to the degree of damage. Because it is released into the blood, measuring the activity of the enzyme in the blood can be a good indicator for estimating the extent of damage to liver cells. In particular, alanine-transferase (ALT) or glutamate private transaminase (GPT), like aspartate aminotransferase (AST or GOT), are compared to normal enzymes in patients with liver disease. It is very high, and in most liver diseases, the enzyme activity in the blood tends to be higher than that of AST, which is considered to be a very important factor in diagnosing liver disease.

GPT(glutamate-pyruvate transaminsase)라고 일반적으로 알려진 알라닌 아미 노 전이효소는 1989년에 질병에 있어서의 중요성이 처음으로 소개되었으며(Rej, 1989), 주로 간이나 신장 등의 조직에서 많이 발견되고, 그보다는 덜 하지만 심장이나 골격 근육 조직 등에서도 발견되는 것으로 알려져 있으며, 신체 내에서 세포의 질소 대사와 아미노산 대사, 간에서의 당신생성(gluconeogenesis)에 관계된 효소로서, 생리학적, 병리학적 상태에 따라 골격근으로부터 전구체 형태로 이동되어 그 기능을 수행하기 시작한다.Alanine aminotransferase, commonly known as glutamate-pyruvate transaminsase (GPT), was first introduced in 1989 for its importance in disease (Rej, 1989), and is found primarily in tissues such as the liver and kidneys. Less well known but also found in the heart and skeletal muscle tissue, enzymes involved in cell nitrogen metabolism, amino acid metabolism, and gluconeogenesis in the liver, precursors from skeletal muscle according to physiological and pathological conditions It is moved to form and begins to perform its function.

알라닌 아미노전이효소는 알라닌과 α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)를 L-글루타메이트(L-glutamate)와 피루베이트(pyruvate)로 바꾸는 반응 과정에서알라닌의 아미노기(amino-group)를 L-글루타메이트로 이동시키는 아미노전이 효소 활성을 가지고 있으며, 이는 피루베이트를 L-젖산(L-lactic acid)으로 바꾸는 과정을 잇달아 수행하며, 상기 가역적 반응 외에도 그 반대로 역행하는 반응에서도 알라닌 아미노전이효소는 아미노기를 이동시키는 매개체 역할을 수행한다. 또한, 간에서 일어나는 당신생성(gluconeogenesis) 과정에서 이러한 알라닌 아미노전이효소의 아미노전이 반응이 수반되므로 간에는 ALT의 효소가 매우 많은 양 존재하게 된다. 실제 간에서의 ALT 효소 활성은 혈액 내의 효소활성보다 3000배 정도 더 높게 측정되는 것으로 알려져 있다(Lott and Wolf, 1986). 따라서, 특히 간 조직에 매우 높은 농도로 존재하는 알라닌 아미노전이효소는 간 조직이 독성물질이나 바이러스의 감염, 알코올, 비만 등의 여러 가지 요인 등에 의하여 손상을 받게 되면 앞에서 언급한 바와 같이 혈액 내로 방출되어 순환하기 때문에 혈액의 알라닌 아미노전이효소 활성이 증가하게 된다. 그렇기 때문에 혈액 내의 알라닌 아미노전이효소 활 성을 측정하여 간질환의 진단 여부를 유추할 수 있다.Alanine aminotransferase converts alanine amino-groups into L-glutamate during the reaction of alanine and α-ketoglutarate to L-glutamate and pyruvate. It has an aminotransferase activity that converts to pyruvate, which in turn converts pyruvate to L-lactic acid, and in addition to the reversible reaction, alanine aminotransferase transfers amino groups It acts as a mediator. In addition, the amino acid transfer reaction of alanine aminotransferase is involved in the gluconeogenesis process in the liver, and therefore, a large amount of enzyme of ALT is present in the liver. In fact, ALT enzyme activity in the liver is known to be measured 3000 times higher than enzyme activity in the blood (Lott and Wolf, 1986). Therefore, alanine aminotransferase, which is present in very high concentrations in liver tissue, is released into the blood as mentioned above when liver tissue is damaged by various factors such as toxic substances, virus infection, alcohol, obesity, etc. Because of the circulation, alanine aminotransferase activity in the blood is increased. Therefore, alanine aminotransferase activity in the blood can be measured to deduce the diagnosis of liver disease.

현재 이용되고 있는 기존의 알라닌 아미노전이효소의 검사법은 효소의 농도를 측정하는 것이 아니라 효소의 활성을 측정하는 것으로, 기질을 분해하여 대사 산물을 생성하는 과정에서 발색시약을 첨가하여 발색시약의 색변화에 따라 그 효소의 활성도를 표현시켜 측정하는 방법이다. The existing test method for alanine aminotransferase, which is currently used, is not to measure enzyme concentration but to measure enzyme activity. The color change of the color developing reagent by adding a coloring reagent in the process of decomposing the substrate to produce metabolites According to this method, the activity of the enzyme is expressed and measured.

그러나 발표된 보고에 의하면, 혈청에는 항원으로서의 활성은 지니고 있으나 효소의 활성은 잃어버린 단백질의 양이 효소활성을 유지하고 있는 단백질 양보다도 훨씬 더 많이 있으며, 이런 현상이 환자뿐만 아니라 정상인에서도 관찰되고(Niblock. et. al. 1986 ), 실제 만성 간염 환자에서 경변이 일어나고 간의 세포가 파괴되는 것이 눈으로는 관찰되나 실제 알라닌 아미노전이효소의 수치는 오히려 낮은 증상이 관찰되는 경우가 발생할 수 있는데, 이것이 간접적으로 이러한 사실을 뒷받침해 주고 있다. 이는 실제 간 손상에 의해 혈액으로 유출된 효소는 순환계를 순환하는 동안 일정 시간이 경과하면, 본래의 구조가 변형되거나 절편으로 조각 나 버리기 때문에 효소활성을 잃게 되기 때문에 실제적으로 발현된 효소의 양에 비하여 효소의 활성은 낮게 측정되는 것이다. However, according to published reports, the amount of lost protein in the serum that has the activity as an antigen but the enzyme activity is much higher than the amount of the protein that maintains the enzyme activity, and this phenomenon is observed in normal people as well as patients (Niblock). et.al. 1986), in some patients with chronic hepatitis, cirrhosis and the destruction of liver cells are observed with the eyes, but the level of alanine aminotransferase may be lower, which is indirect. This is supported by this fact. This is because enzymes leaked into the blood due to the actual liver damage lose their enzymatic activity after a certain period of time during the circulation, because the original structure is deformed or fragmented into fragments. The activity of the enzyme is measured low.

그 밖에 또한 효소의 활성에 영향을 미칠 수 있는 다른 요소는 비효소성 ㄱ글리케이션(non-enzymatic glycation)에 의한 단백질의 변형을 들 수 있는데, 이는 일반 조직이나 혈장 단백질에서 일반적으로 일어나는 번역(post-translation) 후, 일어나는 변형 반응의 하나로, 효소의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이러한 사실로 미루어 보아 간 질환 진단에 있어서 생화학적 효소의 활성측정법은 매우 부정확한 진단결과를 낳는 문제점이 있다.Other factors that may affect the activity of enzymes include modification of proteins by non-enzymatic glycation, which is a common post-translation of normal tissues or plasma proteins. One of the transformation reactions that occurs after translation, is known to affect the function of the enzyme. In view of these facts, there is a problem that the measurement of the activity of biochemical enzymes in the diagnosis of liver disease produces very inaccurate diagnosis results.

상기 문제를 해결하기 위해, 본 출원인은 특허 등록 제502275호에서 면역분석법을 이용한 혈청효소의 정량적 측정방법 및 이 방법을 이용한 간질환 검사 방법을 개시하고 있다.In order to solve the above problem, the applicant discloses a method for quantitative measurement of serum enzyme using immunoassay method and liver disease test method using this method in Patent Registration No. 502275.

하지만, 상기 방법도 알라닌 아미노전이효소의 활성을 나타내는 단백질을 구분없이 모두 동일한 단일클론항체를 사용함으로써, 하나 이상의 동위효소가 혈액 내에 존재하는 경우 효소활성도를 측정하는 방법으로는 이들 동위효소를 구별할 수가 없고, 이들 동위효소들은 대개 서로 다른 조직에서 발현되어서 효소활성도를 측정하여서는 어느 조직에 이상이 일어났는지를 알아내기가 쉽지 않기 때문에 정확한 간 질환의 종류를 판별해 내기에는 어려운 문제점이 있다. 이의 근거로 초기의 생화학적인 세포유전학적 연구에 의하면, 알라닌 아미노전이효소 유전자도 하나 이상이 존재한다고 알려져 왔다(Gubern 등, 1990; Sakagishi, 1995). However, the method also uses the same monoclonal antibody without distinguishing the protein showing the activity of alanine aminotransferase, so that if one or more isoenzymes are present in the blood, the enzyme activity can be distinguished by measuring the enzyme activity. Since these isoenzymes are usually expressed in different tissues, it is difficult to determine the exact type of liver disease because it is difficult to find out which tissues have abnormalities by measuring enzyme activity. On this basis, early biochemical cytogenetic studies have shown that there is more than one alanine aminotransferase gene (Gubern et al., 1990; Sakagishi, 1995).

이는 두 개 이상의 동위효소가 인체에서 만들어지고 이들 동위효소가 동시에 혈액 내로 순환되고 있다는 것을 의미하며, 최근에 와서야 두 번째 ALT 유전자가 알려지고 cDNA가 클로닝됨으로써, 입증되었다. 이 알라닌 아미노전이효소의 동위효소는 아미노산 서열이 약 69% 정도가 기공지된 알라닌 아미노전이효소와 동일하며 유사 아미노산 서열로는 78%가 유사성을 보여 주고 있다(Yang 등, 2002). 즉, 20∼30% 정도의 아미노산 서열의 차이가 있는 것으로 보고되고 있다.This means that more than one isoenzyme is produced in the human body and these isoenzymes are being circulated into the blood at the same time, and only recently have the second ALT gene been known and the cDNA cloned. The isoenzyme of alanine aminotransferase is identical to alanine aminotransferase with about 69% amino acid sequence and 78% similarity with similar amino acid sequence (Yang et al., 2002). That is, it is reported that there is a difference in the amino acid sequence of about 20 to 30%.

이에, 본 출원인은 면역학적 방법을 이용하여 사람의 혈액 내의 알라닌 아미 노전이효소와 이의 동위효소를 구별하는 단일클론항체를 생산하고, 이를 토대로 항원 항체 결합을 이용한 ELISA방법으로 정상인과 구별하여 간질환 환자와 이들의 질병 종류를 정확히 진단함과 동시에 또한 알라닌 아미노전이효소 수치도 정량할 수 있는 새로운 진단 방법을 개발하고자 하였다. Accordingly, the present applicant produces a monoclonal antibody that distinguishes alanine aminotransferase and its isoenzyme in human blood by using immunological methods, and based on this, it is distinguished from normal people by ELISA using antigen antibody binding. We aimed to develop a new diagnostic method that can accurately diagnose patients and their types of disease, as well as quantify alanine aminotransferase levels.

또한, 이들 재조합 단백질을 항원으로 사용하여 혈액 내에 존재하는 알라닌 아미노전이효소와 이의 동위효소에 대한 자가항체를 측정하는 방법을 개발하고 이를 간질환 진단에 활용하고자 하였다.In addition, we have developed a method for measuring autoantibodies to alanine aminotransferases and their isoenzymes present in the blood using these recombinant proteins as antigens and to use them in diagnosing liver disease.

따라서, 본 발명의 목적은 알라닌 아미노전이효소와 이의 동위효소로 이루어지는 항원, 또는 상기 효소를 특이적으로 구별하는 단일클론항체가 포함되어 이루어지는 알라닌 아미노전이효소 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an alanine aminotransferase diagnostic composition comprising an antigen consisting of alanine aminotransferase and an isoenzyme thereof, or a monoclonal antibody that specifically distinguishes the enzyme.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 사용하여 피검체의 시료 내 함유된 알라닌 아미노전이효소를 정량적으로 검출하는 알라닌 아미노전이효소 검출용 진단 키트를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a diagnostic kit for detecting alanine aminotransferase, which quantitatively detects alanine aminotransferase contained in a sample of a subject using the diagnostic composition.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알라닌 아미노전이효소 2 또는 이와 실질적으로 동일한 단백질에 특이적으로 반응하는 단일클론항체, 및 알라닌 아미노전이효소 1 또는 이와 실질적으로 동일한 단백질에 특이적으로 반응하는 단일클론항체로 이루어지는 군에서 선택된 항체가 포함되어 이루어지는 알라닌 아미노전이효소 검출용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention specifically reacts with a monoclonal antibody that specifically reacts to alanine aminotransferase 2 or a protein substantially identical thereto, and alanine aminotransferase 1 or a protein substantially identical thereto. It provides an alanine aminotransferase detection composition comprising an antibody selected from the group consisting of a monoclonal antibody.

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또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물과 피검체의 시료로부터 채취한 알라닌 아미노전이효소 또는 자가항체와 반응시켜 항원-항체 반응을 일으키고, 상기 항원-항체 복합체를 정량적으로 검출하는 알라닌 아미노전이효소 검출용 진단 키트를 제공한다.In addition, in order to achieve another object, the present invention reacts with alanine aminotransferase or autoantibodies taken from the composition and the sample of the subject to cause an antigen-antibody reaction, and alanine for quantitatively detecting the antigen-antibody complex. A diagnostic kit for detecting aminotransferase is provided.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

이때, 여기에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.At this time, if there is no other definitions in the technical terms and scientific terms used herein, those having ordinary skill in the art to which this invention belongs have a meaning that is commonly understood.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.In addition, repeated description of the same technical configuration and operation as in the prior art will be omitted.

본 발명은 인간 유래의 알라닌 아미노전이효소 1(이하, ALT-1이라 함.)과 이의 동위효소인 알라닌 아미노전이효소 2(이하, ALT-2라 함.)를 항원으로 사용하여 각각에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 제조하고, 이 단일클론항체에서 상기 항원과 반응성이 우수한 단일클론 항체를 생산하는 각각의 하이브리도마 세포주를 제작한 뒤, 이 하이브리도마 세포 배양액으로부터 대량으로 수득되는 단일클론 항체와, 상기 아미노전이효소 1(ALT-1)과 이의 동위효소인 알라닌 아미노전이효소 2(ALT-2)를 피검체의 시료와 반응시켜서, 종래 효소활성도 측정법을 이용한 진단 시약이나 키트보다 간편하게 조작하면서 시료 내 알라닌 아미노전이효소를 정량적으로 검출할 수 있는 정확도는 매우 우수한 진단 시약과 이를 이용한 진단 키트를 개발한 것이다.The present invention uses alanine aminotransferase 1 (hereinafter referred to as ALT-1) derived from humans and alanine aminotransferase 2 (hereinafter referred to as ALT-2), which is an isoenzyme thereof, as specific antigens. Monoclonal antibodies were prepared, and each hybridoma cell line producing monoclonal antibodies having high reactivity with the antigens was prepared from the monoclonal antibodies, and then obtained in large quantities from the hybridoma cell culture. The cloned antibody, the aminotransferase 1 (ALT-1) and its isoenzyme alanine aminotransferase 2 (ALT-2) are reacted with a sample of the subject, making it easier than a diagnostic reagent or kit using a conventional enzyme activity assay. It was developed a diagnostic kit with a very good diagnostic reagent and a diagnostic kit using the same to quantitatively detect alanine aminotransferase in the sample during operation.

이때, 본 발명에서는 상술한 바와 같이 ALT-2와 이의 단일클론 항체를 이용한 알라닌 아미노전이효소의 검출 효율이 ALT-1보다는 그 유효성이 매우 높으므로, ALT-2와 이의 단일큰론항체를 이용한 단수형 진단 시약이나 진단 키트를 사용하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 ALT-2와 ALT-1 각각의 진단 결과를 분석하고, 이로부터 최종 알라닌 아미노전이효소의 검출량을 결정할 수 있는 복수형 진단 시약이나 진단 키트를 사용하여, 간 질환의 질병 유무를 판정하는 정확성과 유효성을 향상시킨다. 이는 ALT-2의 경우에 전반적으로 ALT-1의 면역분석법에 의한 것보다 곡선 아래 면적(area under the curve; 이하 AUC라 함.), 민감도 및 특이도의 결과치가 매우 우수하나 만성간염인 경우에는 효소활성도보다 AUC가 낮고, ALT-1의 경우에는 전반적으로 효소활성도보다 AUC가 높아서 검출 유효성이 우수하나 급성 간염인 경우에는 효소활성도의 AUC가 낮기 때문이다.At this time, in the present invention, as described above, the detection efficiency of alanine aminotransferase using ALT-2 and its monoclonal antibody is much higher than that of ALT-1, and thus, the singular diagnosis using ALT-2 and its monoclonal antibody. It is preferable to use a reagent or a diagnostic kit, and more preferably a plurality of diagnostic reagents or diagnostic kits capable of analyzing the diagnostic results of each of ALT-2 and ALT-1, and determining the detected amount of the final alanine aminotransferase. Use to improve the accuracy and effectiveness of determining the presence or absence of liver disease. In the case of ALT-2, the overall results of area under the curve (AUC), sensitivity, and specificity are much better than those of the ALT-1 immunoassay. This is because AUC is lower than enzyme activity, and ALT-1 has higher AUC than enzyme activity as a whole, so the detection efficiency is excellent, but in the case of acute hepatitis, AUC of enzyme activity is low.

그리고, 본 발명에서는 인간 유래의 ALT-1과 ALT-2의 항원에 각각 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 생산하기 위해, 바람직하게는 인간 간암 세포주인 HepG2 세포로부터 총 RNA를 분리하고, 상기 RNA를 주형으로 역전사연쇄 중합반응(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 하여 cDNA를 증폭하고, 상기 증폭된 cDNA를 주형으로 특정 프라이머와 함께 첨가하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 ALT 유전자를 대량으로 증폭시키는 데, ALT-1은 서열번호 1로 표시되는 순방 향 프라이머 5'-ATAGAATTCATGGCCTCGAGCACAGGTGACCGG-3'와 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머 5'-AGTAAGCTTGGAGTACTCGAGGGTGAACTTGGC-3'를 사용하여 증폭하고, ALT-2는 서열번호 3으로 표시되는 순방향 프라이머 5'-AGTCGA ATGCAGCGGGCGGCGGCG-3'와 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머 5'-ATAAGC GCGTACTTCTCCAGGAAGTTG-3'를 사용하여 증폭한다. 그리고, 중합효소연쇄반응은 통상적으로 공지된 조건에서 Tag 움 중합효소를 사용하여 30회(cycle)를 수행하는 것이 바람직한 데, 이때 ALT-1 유전자의 증폭산물은 제한효소 EcoRⅠ과 Hind를 사용하여 발현벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제작하고, ALT-2 유전자의 증폭산물은 제한효소 SalⅠ과 Hind Ⅲ를 사용하여 발현벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제작한 다음, 이를 통상적으로 공지된 대장균 발현 시스템을 이용하여 대량의 ALT-1 과 ALT-2의 단백질을 생산하는 것이 바람직하다.In the present invention, in order to produce monoclonal antibodies that specifically react with antigens of human-derived ALT-1 and ALT-2, preferably, total RNA is isolated from HepG2 cells, which are human liver cancer cell lines, and the RNA To amplify cDNA by reverse transcription-polymerase chain reaction, and add the amplified cDNA with a specific primer as a template to amplify a large amount of ALT gene by polymerase chain reaction (PCR). ALT-1 was amplified using forward primer 5′-ATAGAATTCATGGCCTCGAGCACAGGTGACCGG-3 ′ and reverse primer 5′-AGTAAGCTTGGAGTACTCGAGGGTGAACTTGGC-3 ′, represented by SEQ ID NO: 1, and ALT-2, forward primer represented by 3 5'- AGTCGA ATGCAGCGGGCGGCGGCG-3 'and the reverse primer 5'- ATAAGC GCGTACTTCTCCAGGAAGTTG-3 shown in SEQ ID NO: 4, amplified using The. In addition, the polymerase chain reaction is preferably carried out 30 cycles using Tag polymerase under known conditions, where the amplification product of the ALT-1 gene is expressed using restriction enzymes EcoR I and Hind. The recombinant expression vector was prepared by inserting into the vector, and the amplified product of the ALT-2 gene was inserted into the expression vector using restriction enzymes Sal I and Hind III to produce a recombinant expression vector. It is desirable to produce large amounts of ALT-1 and ALT-2 proteins.

또한, 본 발명은 상기 대량 생산된 ALT-1과 ALT-2의 단백질에 특이적으로 반응하는 단일클론항체 생산 방법으로는 당해 기술 분야에서 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 생산한 각각의 ALT-1 단백질과 ALT-2 단백질을 동량의 완전 프로인트와 불완전한 프로인트 보조제를 차례로 혼합하여 각각 BALB/c 마우스 복강에 주사하여 마우스 체내에 항체를 형성시키고, 상기 마우스에서 지라세포를 분리하여 무한증식성 세포 즉, 미엘로마 세포와 융합하고 이의 융합세포를 각각 배양한 다음, 각각의 세포 배양 상등액을 가지고 ALT 항원에 대한 ELISA 실험으로 양성 콜로니를 선별하고, 제한희석법으로 우수한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선발하여 사용한다(Galfre and Milstein, 1981; Choi et al., 1995).In addition, the present invention can be used in the art as a monoclonal antibody production method that specifically reacts to the mass-produced ALT-1 and ALT-2 protein. Specifically, each of the ALT-1 and ALT-2 proteins produced in the present invention was mixed with the same amount of complete Freund and incomplete Freund's adjuvant, and injected into BALB / c mouse abdominal cavity to form antibodies in the mouse body. , The splenocytes are isolated from the mouse and fused with infinite proliferative cells, that is, myeloma cells, and the fused cells thereof are cultured. Then, positive colonies are selected by ELISA experiments for ALT antigen with the respective cell culture supernatants. Restriction dilution is used to select hybridoma cell lines that produce good antibodies (Galfre and Milstein, 1981; Choi et al., 1995).

이때, 본 발명에서 선발된 세포주로 ALT-1은 2005년 10월 31일자로 “미생물에 관한 부다페스트조약”하에서 한국세포주연구재단에 기탁하여 KCLRF-BP-00119와 KCLRF-BP-00121를 부여받았으며, ALT-2는 2005년 10월 31일자로 동일 기관에 기탁하여 KCLRF-BP-00120과 KCLRF-BP-00122를 부여받았다. At this time, ALT-1 as the cell line selected in the present invention was deposited with the Korea Cell Line Research Foundation under the “Budapest Treaty on Microorganisms” on October 31, 2005, and was given KCLRF-BP-00119 and KCLRF-BP-00121. ALT-2 was deposited with the same institution on October 31, 2005 and was granted KCLRF-BP-00120 and KCLRF-BP-00122.

하지만, 본 발명에서 사용되는 단일클론항체는 상술한 단일클론 항체로 국한되는 것이 아니라, ALT-2와 ALT-1에 매우 특이적인 면역학적 반응을 하는 단일클론 항체라면 그 어느 것을 사용해도 무방하다.However, the monoclonal antibody used in the present invention is not limited to the monoclonal antibody described above, and any monoclonal antibody which has a very specific immunological response to ALT-2 and ALT-1 may be used.

이때, 본 발명에서는 상기 ALT-1, ALT-2 단백질 또는 단일클론 항체를 사용하여 시료 내 ALT를 정량적으로 측정하여 진단할 수 있는 검출방법으로, 효소면역항체분석법 또는 방사선면역 분석법을 사용하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 효소 면역항체분석법을 사용한다. At this time, in the present invention, as the detection method that can quantitatively measure and diagnose ALT in the sample using the ALT-1, ALT-2 protein or monoclonal antibody, it is preferable to use an enzyme immunoassay or radioimmunoassay. More preferably, an enzyme immunoantibody assay.

그리고, 상기 효소면역분석법을 보다 구체적으로 설명하자면, 하기의 단계를 포함하여 이루어진 샌드위치 효소매개면역분석법을 사용하는 것이 바람직하다.In addition, to describe the enzyme immunoassay in more detail, it is preferable to use a sandwich enzyme-mediated immunoassay comprising the following steps.

구체적으로 피검체의 시료 내 ALT(ALT-1 또는 ALT-2)를 정량적으로 측정하기 위한 샌드위치 효소매개면역분석법(ELISA)으로는 2중 샌드위치 엘리자(two-site sandwich ELISA) 방식을 선택할 수 있는 데, 이 방식은 96웰 평판 위에 고정시킨 1차 항체(capture antibody)가 시료에 포함된 ALT 단백질과 결합하면, 2차 항체(detector antibody,1차 항체와는 다른 하이브리도마 세포주에서 생산된 단일클론 항체)가 다시 1차 항체와 결합된 단백질에 결합하여 샌드위치 구조를 이루게 되는 것으로서, 이때 2차 항체에는 표지체가 부착되어 있어 표지체가 기질과 반응하여 발생시키는 신호를 측정하는 방식이다. 이때, 상기 피검체의 시료는 바람직하게 피검체의 혈액 시료로 간 질환자로 의심되는 환자에서 채취한 전혈(whole blood) 또는 혈청 등을 사용하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 혈청을 사용한다.Specifically, a sandwich enzyme-mediated immunoassay (ELISA) for quantitatively measuring ALT (ALT-1 or ALT-2) in a sample of a subject may select a two-site sandwich ELISA method. In this method, when a primary antibody (capture antibody) immobilized on a 96-well plate binds to the ALT protein contained in the sample, a monoclonal cell produced by a hybridoma cell line different from the secondary antibody (primary antibody) is detected. The antibody is again bound to the protein bound to the primary antibody to form a sandwich structure, wherein the secondary antibody is attached to the label is a method of measuring the signal generated by the label reacts with the substrate. In this case, it is preferable to use whole blood or serum obtained from a patient suspected of liver disease as the blood sample of the subject, and more preferably, serum is used.

또한, 본 발명은 다른 관점으로서 전술한 바와 같이 선발된 단일클론 항체(1차 항체)를 이용하여 샌드위치 효소매개면역분석법(ELISA)으로 피검체의 시료와 반응시켜 이 시료 중에 존재하는 ALT-자가항체 복합체의 농도를 측정하는 것을 포함하여, 피검체의 혈액내 ALT-항체 복합체를 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention, by using a monoclonal antibody (primary antibody) selected as described above, the ALT-autoantibody present in the sample by reacting with a sample of the subject by sandwich enzyme-mediated immunoassay (ELISA) A method for quantitatively measuring ALT-antibody complexes in the blood of a subject, including measuring the concentration of the complex, is provided.

이때, 상기 1차 항체를 검출하는 2차 항체로는 항인간 IgG, IgM 또는 IgA 염소 항체, 또는 토끼 항체, 또는 마우스 항체를 사용할 수 있다.In this case, as the secondary antibody for detecting the primary antibody, anti-human IgG, IgM or IgA goat antibody, rabbit antibody, or mouse antibody may be used.

또한, 본 발명은 다른 관점으로서 대량 생산한 ALT-1 또는 ALT-2를 각각의 항원으로 이용하여 샌드위치 효소매개면역분석법(ELISA)으로 피검체의 시료와 반응시켜 시료 중의 항-ALT 자가항체의 존재 및 농도를 측정하는 것을 포함하여, 피검체의 혈액내 ALT 또는 AST에 대한 자가항체를 정량적으로 측정하는 방법을 제공ㅎ할 수 있다[Konttinen A. et al., Clin. Chim. Acta. 1978, 84 : 145-147]. 이때, 사용되는 2차 항체로는 항인간 IgG, IgM 또는 IgA 염소 항체, 또는 토끼 항체, 또는 마우스 항체를 포함한다.In another aspect, the present invention is the presence of anti-ALT autoantibodies in the sample by reacting with a sample of the subject by a sandwich enzyme-mediated immunoassay (ELISA) using the mass-produced ALT-1 or ALT-2 as each antigen And measuring the concentration, thereby providing a method for quantitatively measuring autoantibodies to ALT or AST in the blood of a subject [Konttinen A. et al., Clin. Chim. Acta. 1978, 84: 145-147]. At this time, the secondary antibody used includes an anti-human IgG, IgM or IgA goat antibody, or rabbit antibody, or mouse antibody.

그리고, 본 발명에서는 상기 2차 항체에 표지하는 표지체로는 퍼옥시데이스(peroxidase) 또는 알칼라인 포스파테이스(alkaline phosphatase) 계의 발색 효소를 사용할 수 있으며, 상기 효소에 대응되는 기질 반응액((TMB, NBT/BCIP)을 사용 할 수 있다. 하지만, 본 발명은 상술한 방법으로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 2차 항체를 검출할 수 있는 민감성을 가진 것이라면 상술한 것 이외에 그 어떠한 것을 사용해도 무방하다.In the present invention, as a label for labeling the secondary antibody, a peroxidase or alkaline phosphatase-based coloring enzyme may be used, and a substrate reaction solution ((TMB) corresponding to the enzyme may be used. However, the present invention is not limited to the above-described method, and any one other than the above may be used as long as it is sensitive to detect the secondary antibody of the present invention. Do.

이와 같이, 본 발명에 따른 ALT를 검출할 수 있는 진단 시약이나 이를 이용한 진단 키트는 간단한 핼액 시료만으로도 종래의 간단한 효소매개분석법을 통해 대부분의 간질환의 진단이 가능하게 한 것으로, 특히 종래 간 경화나 간암을 판단하기 위해 시행한 조직 검사 방법을 대체할 수 있는 획기적인 것이다.As such, the diagnostic reagent or diagnostic kit using the same according to the present invention enables diagnosis of most liver diseases through a simple enzyme-mediated analysis method using a simple hepatitis sample. It is a revolutionary alternative to the biopsy methods used to determine liver cancer.

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. However, the present invention is not limited to the following examples, and it will be apparent to those skilled in the art that various changes or modifications can be made within the spirit and scope of the present invention.

[실시 예][Example]

본 실시 예에서 사용한 혈액은 한림대학 춘천 성심 병원에 내원한 간 질환 환자의 혈청을 사용하였다. 혈청시료는 25명씩의 급성간염, 만성간염, 간경변, 간암, 간염보균자, 그리고 23명의 정상인으로부터 획득하였다. The blood used in this example was a serum of a liver disease patient who visited Chuncheon Sacred Heart Hospital. Serum samples were obtained from 25 acute hepatitis, chronic hepatitis, cirrhosis, liver cancer, hepatitis carriers, and 23 normal subjects.

이때, 본 실시 예에서 항체 제작 및 복수 획득에 사용한 동물은 BALB/c종의 마우스를 사용 하였으며, 핵산 프라이머(Nucleotide primer)의 제작은 (주)바이오니아에 의뢰하였으며, EcoR I을 비롯한 제한 효소 , 리가제(ligase) 및 역전사 효소는 Boehringer Manheim사의 제품이고, Ex Taq polymerase는 Takara.Co.제품을 사용하였다. 항체 생산을 위한 배지 및 제반 시약과 재료들은 Gibco BRL사의 제품을 사용하였다. 그 외의 모든 시약들은 시그마(SIGMA)에서 구입하였다.At this time, the animal used in the antibody preparation and the plural acquisition in this Example was used a BALB / c type mouse, the production of nucleic acid primer (Nucleotide primer) was commissioned by Bioneer Co., Ltd., restriction enzymes including EcoR I, Riga Ligase and reverse transcriptase were from Boehringer Manheim, and Ex Taq polymerase from Takara.Co. Medium and all reagents and materials for antibody production were manufactured by Gibco BRL. All other reagents were purchased from SIGMA.

또한, 본 실시 예에서 기재하는 ALT 단백질은 ALT-1 과 ALT-2의 단백질을 각각 구분하여 처리하였음을 의미한다.In addition, the ALT protein described in this example means that the proteins of ALT-1 and ALT-2 were separately processed.

1. One. 역전사중합효소연쇄반응을Reverse transcriptase chain reaction 통한 ALT의 cDNA의 합성 Synthesis of ALT cDNA Via

100mm 디쉬(dish)에서 HepG2 세포가 80% 1 X 10⁵개의 밀도로 정도 자랐을 때 세포를 수확하여 인벡사(Invitec)의 "invisorb cell RNA spin Kit"를 사용하여 HepG2 세포의 총 RNA를 분리해 내었다. 분리해낸 HepG2 세포의 RNA를 주형으로 역전사연쇄중합반응(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 통하여 ALT 유전자의 cDNA를 합성하여 증폭하였다. When HepG2 cells were grown to a density of 80% 1 X 10 ⁵ in a 100 mm dish, the cells were harvested and the total RNA of HepG2 cells was isolated using Invitec's "invisorb cell RNA spin Kit". . RNA of the isolated HepG2 cells was synthesized and amplified by cDNA of the ALT gene through reverse transcription-polymerase chain reaction.

먼저 세포의 HepG2 세포의 RNA 5㎍에 oligo dT 프라이머를 섞은 후, RNA의 2차 구조를 풀어 주기 위하여 전 처리 과정으로 70℃에서, 15 분간 반응시켰다. 그런 다음, 거기에 다시 역전사효소(Invitrogen)를 넣어주고 25℃에서 10분, 42℃에서 90분, 72℃에서 10분 동안 반응시킨 후 역전사효소를 변성시키는 마지막 단계를 거쳐서 ALT의 cDNA를 합성 하였다. First, oligo dT primers were mixed with 5 μg of RNA of HepG2 cells, and then reacted for 15 minutes at 70 ° C. as a pretreatment to release the secondary structure of RNA. Then, the reverse transcriptase (Invitrogen) was put there again and reacted for 10 minutes at 25 ℃, 90 minutes at 42 ℃, 10 minutes at 72 ℃ and then the final step of denaturing reverse transcriptase was synthesized ALT cDNA .

이후 이렇게 합성된 ALT의 cDNA를 증폭하기 위해, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 위의 역전사 반응 산물인 ALT의 cDNA와 ALT의 프라이머, Ex taq 중합효소(Takara Co.)를 섞은 후, 94℃에서 1분(변성), 52℃에서 1분(annealing), 그리고 72℃에서 1분(extention)동안 반응시키는 과정을 30번 반복하여 ALT의 cDNA를 증폭하였다. 이때, 온도를 올리고 내리고 하는 반응은 PCR 기계를 사용하였고, 이 때, ALT-1과 ALT-2의 프라이머 염기서열은 다음과 같았다.Then, to amplify the cDNA of the ALT thus synthesized, polymerase chain reaction (PCR) was performed. After mixing the above reverse transcription reaction product cDNA of ALT and ALT primer, Ex taq polymerase (Takara Co.), 1 minute (denatured) at 94 ℃, 1 minute (annealing) at 52 ℃, and 1 at 72 ℃ The reaction was repeated for 30 minutes to amplify the cDNA of ALT. At this time, the reaction to raise and lower the temperature using a PCR machine, at this time, the primer sequences of ALT-1 and ALT-2 were as follows.

ALT-1 : 순방향 프라이머 5'-ATA GAATTC ATGGCCTCGAGCACAGGTGACCGG-3'ALT-1: Forward Primer 5'-ATA GAATTC ATGGCCTCGAGCACAGGTGACCGG-3 '

EcoR I EcoR I

역방향 프라이머 5'-AGT AAGCTT GGAGTACTCGAGGGTGAACTTGGC-3'Reverse Primer 5'-AGT AAGCTT GGAGTACTCGAGGGTGAACTTGGC-3 '

Hind III (Melanie et al, 1997) Hind III (Melanie et al, 1997)

ALT-2: 순방향 프라이머 5'- AGTCGA ATGCAGCGGGCGGCGGCG-3'ALT-2: Forward primer 5'- AGTCGA ATGCAGCGGGCGGCGGCG-3 '

SalⅠ SalⅠ

역방향 프라이머 5'- ATAAGC GCGTACTTCTCCAGGAAGTTG-3'Reverse Primer 5'- ATAAGC GCGTACTTCTCCAGGAAGTTG-3 '

Hind III (Rong-Ze Yang, 2002) Hind III (Rong-Ze Yang, 2002)

2. 2. PCRPCR 산물을 단백질 발현 벡터로 Products into protein expression vectors 클로닝Cloning 및 발현 And expression

상기 PCR 산물(증폭한 ALT cDNA)을 단백질 발현 벡터에 클로닝하여 박테리아 세포 BL21으로 형질 전환(transformation)하였다. 형질 전환한(ALT cDNA: pET21a+벡터를 포함하고 있는) 박테리아 BL21을 배양액 LB broth(100㎍/ml의 ampicilin 항생제 포함한)에서 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양한 박테리아 세포 BL21을 새 배양액으로 1/10희석하여 OD₆₀₀=0.7정도의 탁도로 배양하였다. 그런 다음 여기에 단백질 발현 유도체인 IPTG를 1mM 되게 넣은 후, 37℃에서 250rpm정도의 세기로 흔들어 주면서 3시간 동안 배양하였다. 그리고, ALT 단백질이 발현되도록 유도(induction)하여 배양 시킨 세포를 원심 분리를 통하여 침전시켰다. 이 침전물에 분해 완충용액(lysis buffer; 10mm NaH₂PO₄, 10mM Tris-Cl, 5M urea, pH8.0)와 단백 질 분해효소 억제제(protease inhibitor; 1㎍/l aprotinin, 100mM PMSF)를 첨가하여 초음파 파괴(sonication)를 하였다. 그리고, 파괴시킨 세포는 원심분리를 통하여 파괴 잔여물을 제거한 다음, 이 세포추출액을 니켈 비드(Nikel bead)가 들어있는 컬럼(column)에 통과시켰다. 다음에 컬럼에 워싱 완충용액(washing buffer; lysis buffer에 pH가 6.3인 용액)을 첨가하여 3번 씻어주었다. 마지막으로 용출 완충용액(elution buffer; lysis buffe에 pH가 5.9인 용액)를 흘려주어 니켈-비드에 붙어있는 ALT 단백질을 떼어내어 ALT를 수득하였다.The PCR product (amplified ALT cDNA) was cloned into a protein expression vector and transformed into bacterial cell BL21. Bacteria transformed (ALT cDNA: containing pET21a + vector) was cultured for 12 hours at 37 ° C. in culture LB broth (containing 100 μg / ml of ampicilin antibiotics). The cultured bacterial cells BL21 were diluted 1/10 with fresh culture and incubated with turbidity of OD ₆₀₀ = 0.7. Then, put the protein expression derivative IPTG to 1mM, and incubated for 3 hours while shaking at a intensity of 250rpm at 37 ℃. In addition, cells cultured by induction to induce ALT protein expression were precipitated by centrifugation. To this precipitate was added lysis buffer (10 mm NaH ₂ PO ₄ , 10 mM Tris-Cl, 5 M urea, pH 8.0) and protein inhibitor (1 μg / l aprotinin, 100 mM PMSF). Ultrasonic destruction was performed. The destroyed cells were then centrifuged to remove the debris residues, and then the cell extract was passed through a column containing nickel beads. Next, a washing buffer (washing buffer; pH 6.3 in lysis buffer) was added to the column and washed three times. Finally, an elution buffer (solution of pH 5.9 in lysis buffe) was flowed to remove ALT protein attached to nickel-beads to obtain ALT.

수득된 제조합 ALT 단백질에서, ALT-1 단백질은 분자량이 58kDa이었고, ALT-2 단백질은 60kDa이었다. 이렇게 얻은 수용성 ALT-1과 ALT-2 단백질을 정제 한 후, 효소 활성을 측정하여 재조합 단백질이 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase)임을 확인하였다(도 1 참조).In the obtained synthetic ALT protein, the ALT-1 protein had a molecular weight of 58 kDa and the ALT-2 protein was 60 kDa. After purifying the water-soluble ALT-1 and ALT-2 proteins thus obtained, the enzyme activity was measured to confirm that the recombinant protein is an alanine aminotransferase (see FIG. 1).

이때, 알라닌 아미노전이효소의 활성 측정은 다음과 같이 수행하였다.At this time, the activity measurement of alanine aminotransferase was performed as follows.

[실험 예 1]Experimental Example 1 ALT의 효소 활성 측정Determination of Enzyme Activity of ALT

재조합 ALT 단백질의 효소 활성은 시그마사의 "diagnostics-transaminase Kit"를 사용하여 측정하였다. 먼저 유리 튜브에 알라닌-α-케토글루타레이트(alanine-α-ketoglutarate) 기질 1ml를 넣었다. 그 다음에 이를 37℃에서 물 중탕 하여 따뜻하게 해주었다, 그리고, 정제한 ALT 재조합 단백질(1mg/ml)을 1/20로 희석하여 0.2ml 첨가한 후 균일하게 섞이도록 흔들어주었다. 37℃의 물에 정확히 30분 동안 둔 후, 시그마 색 변화 물질(color reagent)를 1ml를 넣어 주었다. 그리고, 색 변화 물질을 넣은 다음, 20분 후에 0.4N 수산화 나트륨 용액(sodium hydroxide)을 넣어 반응을 멈추었다. 그런 다음 500nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Enzymatic activity of the recombinant ALT protein was measured using Sigma's "diagnostics-transaminase Kit". First, 1 ml of alanine-α-ketoglutarate substrate was placed in a glass tube. Then, it was warmed by water-bathing at 37 ° C, and purified ALT recombinant protein (1mg / ml) was diluted to 1/20, added 0.2ml, and shaken to mix uniformly. After exactly 30 minutes in water at 37 ℃ was added 1ml of sigma color reagent (color reagent). Then, after adding the color change material, after 20 minutes, 0.4N sodium hydroxide solution (sodium hydroxide) was added to stop the reaction. Then absorbance was measured at a wavelength of 500 nm.

그리고, 본 발명에서 제조한 재조합 ALT 단백질의 특이도(specific activity)는 약 0.5 IU/mg로, 이는 정상인 ALT-1과 ALT-2의 질량(mass) 측정값의 합을 효소 활성 수치 평균값 40.7IU/L으로 나누어서 산출하였다.In addition, the specific activity of the recombinant ALT protein prepared in the present invention was about 0.5 IU / mg, which is the sum of the mass measurements of normal ALT-1 and ALT-2, and the average value of enzyme activity was 40.7 IU. It was calculated by dividing by / L.

3. ALT의 단일 클론 항체 생산3. Monoclonal Antibody Production of ALT

3-1. 면역3-1. immune

마우스의 면역 반응을 일으키기 위하여 준비된 항원 재조합 ALT 단백질을 쥐의 복강에 주사한다. 처음 주사할 경우 인간 재조합 ALT단백질(250μg)에 같은 부피(주로 0.3ml)의 완전 프로인트 보조제(Complete Freund's Adjuvant)를 넣고 30초 동안 초음파 파쇄한 후, 이 용액을 BALB/c 생쥐 복강에 주사하였다. 첫 번째 주사 후 10일 후부터는 단백질 용액을 불완전한 프로인트 보조제와 섞은 후 주사하는데 이 부스터 주사(booster injection)을 2∼3차례 반복하고 최종 면역 시에는 세포 융합 3일 내지 4일 전에 보조제 없이 재조합 ALT 단백질만을 주사하였다. 실험에 사용되는 생쥐는 암컷을 사용하고 생 후 6∼8주 정도 되는 BALB/c를 사용하였다. Antigen recombinant ALT protein prepared to elicit an immune response in mice is injected into the abdominal cavity of mice. For the first injection, the same volume (mainly 0.3 ml) of Complete Freund's Adjuvant was added to human recombinant ALT protein (250 μg), sonicated for 30 seconds, and the solution was injected into the abdominal cavity of BALB / c mice. . 10 days after the first injection, the protein solution is mixed with incomplete Freund's adjuvant and injected. This booster injection is repeated 2-3 times and at final immunization, the recombinant ALT protein without adjuvant 3-4 days before cell fusion. Bay was injected. Mice used for the experiment were females and BALB / c for 6 to 8 weeks of age .

3-2. 세포융합(하이브리도마 세포주 제조)3-2. Cell fusion (produced hybridoma cell line)

상기 면역시킨 쥐의 준비된 지라세포와 미엘로마 세포(SP2/o-Ag-14 골수종)를 섞고 원심분리(1500rpm, 3분)하였다. 이렇게 하여 얻은 세포에 20ml의 불완전 DME(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 첨가하여 한번 씻고 상등액을 완전히 제거하였다. 이후의 세포융합 반응은 손으로 감싸 37℃로 유지해주면서 실시하는데 밑부분에 가라앉은 세포들은 손가락으로 튜브(tube)를 치면서 완전히 현탁하고, 상기 현탁액에 1ml의 50% PEG용액을 한 방울씩 천천히 1분 동안 가하고 90초 동안 흔들어 세포융합 과정을 실시하였다. 정확하게 첫 PEG 용액 방울을 넣기 시작한 후, 2분30초 후에 불완전 DME를 첨가하면서 정지시키는 데 PEG용액에 의해 세포막이 입을 수 있는 삼투압 충격을 막기 위해서, 처음 1ml의 불완전 DME는 1분 동안에, 다음 2ml을 1분 그리고 다음 3ml을 1분 동안에 넣는 방법 등으로 전체 20ml의 불완전 DME를 서서히 튜브에 첨가하였다. 이런 방식으로 융합된 세포들을 원심 분리시키고 20ml의 HAT 배양액을 가해 남아있는 PEG를 씻어준 후 얻은 세포들을 75ml의 HAT 배양액에 녹여 두 방울씩 피더 세포(feeder cell)가 들어있는 96 웰 플레이트에 분주하여 37℃의 7% 이산화탄소(CO₂)배양기에서 배양하였다. Of the immunized mice The prepared splenocytes and myeloma cells (SP2 / o-Ag-14 myeloma) were mixed and centrifuged (1500 rpm, 3 minutes). 20 ml of incomplete DME (Dulbecco's modified Eagle's medium) was added to the cells thus obtained, and the supernatant was completely removed. Subsequent cell fusion reactions are carried out while wrapping and holding at 37 ° C by hand, and the cells that have sunk at the bottom are completely suspended by tapping the tube with a finger and slowly dropping 1 ml of 50% PEG solution into the suspension. Minutes were added and shaken for 90 seconds to carry out the cell fusion process. After exactly starting the first drop of PEG solution, stop the addition of incomplete DME after 2 minutes and 30 seconds to stop the osmotic shock that the cell membrane could cause by the PEG solution.The first 1ml of incomplete DME was applied for 1 minute, then 2ml. 20 ml of incomplete DME was slowly added to the tube by adding 1 minute and then 3 ml for 1 minute. In this manner, the fused cells were centrifuged, 20 ml of HAT culture was added to wash the remaining PEG, and the cells obtained were dissolved in 75 ml of HAT culture, and two drops were dispensed into a 96 well plate containing feeder cells. The cells were cultured in a 7% carbon dioxide (CO ₂ ) incubator at 37 ° C.

그리고, 세포융합 후 3일째에 기존의 배지를 제거 한 후, 세 방울의 HT 배양액을 각 웰에 새로 첨가하고 다시 3일 간격으로 새로운 HT 배양액으로 갈아주면서 세포의 성장을 현미경으로 확인하였다. 대개 융합 4일 후면 하이브리도마 콜로니(hybridoma colony)가 보이기 시작하고 7 일경부터 하이브라도마 스크리닝(hybridoma screening)을 시작하였다. 배양 상등액 200㎕를 400㎕의 PBS가 담긴 24-웰 플레이트로 옮긴 다음 ELISA 방법에서 양성 반응을 보이는 웰의 세포를 1ml의 HT 배양액이 들어있는 새로운 24-웰 플레이트로 옮겨 3-4일 더 배양하였다. 이 배양액 500㎕를 2ml의 PBS가 들어 있는 15ml 튜브에 넣어 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 다시 분석하고 세포를 5ml의 HT배양액이 담긴 6-웰 플레이트로 옮겨 키운 후 빠르게 얼리고 하이브리도마 세포주를 클로닝하는 방법으로 제한희석(limiting dilution)을 실시하여 우수한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다(Galfre and Milstein, 1981; Choi et al, 1995).And, after removing the existing medium on the third day after cell fusion, three drops of HT culture solution was added to each well, and the growth of the cells was checked under a microscope while changing to new HT culture medium every three days. Usually 4 days after fusion, hybridoma colonies began to appear and hybridoma screening began around 7 days. 200 μl of the culture supernatant was transferred to a 24-well plate containing 400 μl of PBS, and the cells of the wells, which were positive in the ELISA method, were transferred to a new 24-well plate containing 1 ml of HT culture and incubated for another 3-4 days. . 500 μl of this culture solution was placed in a 15 ml tube containing 2 ml of PBS and analyzed again by Western blot. Cells were transferred to 6-well plates containing 5 ml of HT culture, grown quickly and cloned into hybridoma cell lines. Limiting dilution was performed to select hybridoma cell lines producing excellent antibodies (Galfre and Milstein, 1981; Choi et al, 1995).

이때, 웨스턴 블랏은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.At this time, Western blot was performed in the following manner.

[실험 예 2] Experimental Example 2 웨스턴Weston 블롯Blot (Western blots)(Western blots)

먼저, SDS-PAGE를 통해 분리된 인간 재조합 ALT 단백질과 인간 전체 단백질(human total Protein)을 염색하지 않고 니트로셀룰로스막(nitrocellurose membrane)으로 옮기는데 3장의 3MM 페이퍼(3MM paper)를 전이 완충용액(transfer buffer; Tris 1.6g, Glycine 26.25g, 1L당)에 충분히 적신 후 전이 키트(transfer kit, BioRad사)에 깔아 놓았다. 그 다음 전이 완충용액 상에서 SDS 겔과 니트로셀룰로스막을 겹치게 한 후, 3MM 페이퍼 위로 옮겼다. 이때 전극을 고려하여 양극 쪽으로 니트로셀룰로스막가 위치하게 하였다. 그리고, 다시 전이 완충용액에 충분히 적신 4장의 3MM 페이퍼를 덮은 후 덮개를 얹고 약 240 mA에서 전이(transfer)하였다. 약 1시간 후 겔은 염색하여 단백질이 옮겨 졌는지를 확인하고 니트로셀룰로스막은 블락킹(blocking) 용액(5% non-fat dry milk, 0.02% sodium azide in TBST)을 1시간 동안 처리하여 블락킹을 하였다. 이를 TBST(10mM Tris, 150mM NaCl, 0.3% Tween 20,pH 8.0)로 10분씩 3번 씻은 일차 항체(ALT의 단일 클론 항체)을 1시간 동안 처리한 후, 다시 10분씩 3번 씻어준 다음 한 시간 동안 2차 항체(AP-conjugated goat anti-mouse IgG; AP는 alkaline phosphatase)를 처리하였다. 그리고, TBST로 10분씩 3번 씻은 후 AP 완충용액(100mM NaCl, 5mM MgCl2, 100mM Tris, pH 9.5)로 10분 동안 처리하고, 10ml의 AP 완충용액에 60㎕의 NBT(50mg/ml in 70% DMF)와 30㎕의 BCIP(50mg/ml in 100% DMF)를 첨가하여 발색 시켰다. 발색이 끝난 결과물은 물로 씻어서 막을 말려 보관하였다.First, three 3MM papers are transferred to a nitrocellurose membrane without staining human recombinant ALT protein and human total protein separated through SDS-PAGE. 1.6 g of Tris, 26.25 g of Glycine, per 1 L), and then placed in a transfer kit (BioRad). The SDS gel and nitrocellulose membrane were then overlaid on transfer buffer and then transferred onto 3MM paper. At this time, the nitrocellulose film was positioned toward the anode in consideration of the electrode. Then, 4 sheets of 3MM paper sufficiently wetted with the transfer buffer solution were covered, and then the lid was placed and transferred at about 240 mA. After about 1 hour, the gel was stained to confirm that the protein was transferred, and the nitrocellulose membrane was blocked by blocking the blocking solution (5% non-fat dry milk, 0.02% sodium azide in TBST) for 1 hour. . After treatment with the primary antibody (monoclonal antibody of ALT) washed three times for 10 minutes with TBST (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.3% Tween 20, pH 8.0) for 1 hour, washed again 3 times for 10 minutes and then for 1 hour While secondary antibody (AP-conjugated goat anti-mouse IgG; AP is alkaline phosphatase). After washing 3 times with TBST for 10 minutes, it was treated with AP buffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 100 mM Tris, pH 9.5) for 10 minutes, and 60 μl of NBT (10 mg / ml in 70%) in 10 ml of AP buffer. DMF) and 30 μl of BCIP (50 mg / ml in 100% DMF) were added for color development. The finished product was washed with water and dried in a membrane.

5. ALT 동위효소 특이적인 단일클론항체의 선별 및 이의 특성 규명 5. Screening and Characterization of ALT Isozyme-Specific Monoclonal Antibodies

상술한 바와 같이, 효소활성이 살아있는 재조합 단백질 ALT-1, ALT-2를 마우스에 주사하여 면역반응을 유도한 후, 마우스 지라세포와 마우스 미엘로마 세포를 융합하여 하이브리도마 세포주를 만들었다. 여러 번의 세포융합으로 20∼30개의 하이브리도마 세포주를 얻었으나, 배양 과정에서 항체 생산 능력을 잃거나, 제한희석 과정에서 항원에 대한 반응성이 약화되어 몇 개의 클론은 폐기하고 ALT-1은 11개, ALT-2는 10개의 클론을 다시 선별하였다. 이때, 선별은 방법은 아래의 실험예와 같은 간접 효소매개 면역분석법(indirect Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; indirect ELISA)를 이용하여 선별하였다. As described above, after inducing an immune response by injecting mice with recombinant proteins ALT-1 and ALT-2 with enzymatic activity, hybridoma cell lines were prepared by fusing mouse splenocytes and mouse myeloma cells. Several cell fusions yielded 20 to 30 hybridoma cell lines, but the ability to produce antibodies in culture or loss of reactivity to antigens in limited dilution caused some clones to be discarded and 11 for ALT-1. , ALT-2 reselected 10 clones. At this time, the screening method was selected using an indirect Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (indirect ELISA) as in the following experimental example.

[실험 예 3]Experimental Example 3 간접법Indirect law 효소매개면역분석법 Enzyme-Mediated Immunoassay

96 웰의 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 각각의 웰에 2㎍/ml의 재조합 ALT 단백질을 50㎕씩 분주하였다. 그리고 4℃에서 12시간 동안 놓아 두었다. 그런 다음 워싱 완충용액(washing buffer; PBS-Tween 20)로 3번 닦아준 후, 또다시 각각의 웰에 블락킹 용액(1% gelatine, 5% sucrose in PBS) 300㎕를 분주하고 37℃에서 60분간 놓아두었다. 그런 다음 웰을 PBST(플네임 기재)로 3번 낚아주고, 플레이트에 하이브리도마의 배양액을 각각 50㎕를 분주하고 37℃에서 30분간 두었다. 그리고 다시 플레이트를 PBST로 3번 닦아 준 후, HRP-결합 염소 항- akdntmIgG(HRP-conjugated goat anti-mouse IgG)를 희석 완충용액(dilution buffer; 1% gelatine, ose in PBS)에 500:1로 희석하여 각 well에 50㎕씩 넣어 주었다. 마지막으로 PBST로 다시 3번을 닦아 준 후 거기에 HRP의 기질 용액 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘(3,3,5,5-tetramethylbenzidine; TMB 기질, KEM EN TEC, Copenhagane, Denmark)을 50㎕씩 첨가하여 15분 정도 두고 색 변화를 관찰한 후, 10mM H₂SO₄ 50㎕씩 첨가하여 반응을 멈추었다. 그런 다음, ELISA 판독기(reader)로 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 단일클론항체의 동형(iso typing) 검사 시에는 위와 같은 방법으로 플레이트에 ALT 항원을 코팅하고, 분석하려는 단일 콜론항체를 붙인 다음 항-토까 마우스(anti-rabit mouse) IgG1, G2a, G2b, G3, A등을 반응시키고, HRP가 결합된 토끼 항체(rabbit Ab)로 탐지하였다.50 μl of 2 μg / ml recombinant ALT protein was dispensed into each well of a 96 well microtiter plate. And it was left for 12 hours at 4 ℃. Then, wash three times with washing buffer (PBS-Tween 20), and then again 300 μl of blocking solution (1% gelatine, 5% sucrose in PBS) into each well and 60 ° C. at 37 ° C. Leave on for a minute. Then, the wells were fished three times with PBST (plane name), and 50 μl of each cultured hybridoma was plated on a plate and placed at 37 ° C. for 30 minutes. After washing the plate three times with PBST, HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG) was diluted to 500: 1 in dilution buffer (1% gelatine, ose in PBS). Diluted and put 50 ㎖ in each well. Finally wipe again 3 times with PBST and then add 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (3,3,5,5-tetramethylbenzidine; TMB substrate, KEM EN TEC, Copenhagane, Denmark) Add 50µl each and leave for 15 minutes and observe the color change.10mM H ₂ SO ₄ The reaction was stopped by adding 50 µl. The absorbance was then measured at a wavelength of 450 nm with an ELISA reader. At this time, when isotyping the monoclonal antibody, the ALT antigen is coated on the plate in the same manner as above, the single colon antibody to be analyzed is attached, and then the anti-rabit mouse IgG1, G2a, G2b, G3, A and the like were reacted and detected with a rabbit antibody (rabbit Ab) to which HRP was bound.

5-1.ALT 동위효소 특이적인 단일클론항체의 1차 선별5-1. Primary Screening of ALT Isozyme-Specific Monoclonal Antibodies

먼저, 일차 선별된 세포주가 각각의 동위효소의 특이도를 알아보기 위하여 이들 항체를 ALT-1과 ALT-2 단백질과 교차 반응을 시켜 보았다. 이의 결과, 도 2- A에 도시된 바와 같이, ALT-1을 동물 주사하여 생산된 하이브리도마 클론의 대다수는 ALT-1과 높은 반응성을 보여 주었지만 그 중에서 몇몇 클론은 ALT-2 단백질과도 교차 반응을 보였다. 그래서, 이 교차 반응을 보여 주는 클론은 제거하였다. 마찬가지 방법을 통하여 ALT-2 특이적인 단일클론 항체를 골라내었다. 또한, 선발될 단일클론 항체의 항원에 대한 반응친화도의 선별기준은 OD값 1.2 이상이며, 교차 반응 측정 OD값을 0.2이하로 하였다. 이렇게 최종 선별된 ALT-1에 대한 6개의 클론은 L1-21c3, L1-31c5, L1-21c3, L1-45c3, L1-64c4, L1-90c1 및 L1-92c2로 명명하였으며, ALT-2에 대한 클론 4개는 L2-6c6, L1-7c2, L1-25c3, L1-27c1로 명명하였다.First, the first selected cell lines were cross-reacted with these antibodies to ALT-1 and ALT-2 proteins to determine the specificity of their respective isoenzymes. As a result, as shown in FIG. 2-A, the majority of hybridoma clones produced by animal injection of ALT-1 showed high reactivity with ALT-1, but some clones also had There was a cross reaction. Thus, clones showing this crossover reaction were removed. Through the same method, ALT-2 specific monoclonal antibodies were selected. In addition, the selection criterion of the reaction affinity for the antigen of the monoclonal antibody to be selected was OD value 1.2 or more, cross-reaction measurement OD value was 0.2 or less. The six clones for this final screened ALT-1 were named L1-21c3, L1-31c5, L1-21c3, L1-45c3, L1-64c4, L1-90c1 and L1-92c2, and clones for ALT-2. Four were named L2-6c6, L1-7c2, L1-25c3, and L1-27c1.

다음으로, 이 하이브리도마 세포를 다시 마우스 복강에 주사하여 복강 내에 항체를 분비하여 농축시켰다. 그런 다음 마우스의 복수를 채취하여 그 안의 항체를 단백질 G 어피너티 컬럼(protein G affinity column)방법으로 정제하여 단일클론 항체를 준비하였다. Next, the hybridoma cells were injected into the mouse abdominal cavity again to secrete and concentrate the antibodies in the abdominal cavity. Then, ascites of the mice was collected, and the antibodies therein were purified by a protein G affinity column method to prepare monoclonal antibodies.

5-2. 1차 선별된 단일클론 항체의 특성5-2. Characteristics of Primary Screened Monoclonal Antibodies

이렇게 준비된 각각의 클론 항체는 상술한 웨스턴 블롯 방법을 통하여 항체의 특성을 분석하였다. 이때, 웨스턴 블롯은 재조합 단백질과 총 간 단백질 두 가지로 수행하였다. Each cloned antibody thus prepared was characterized by the Western blot method described above. At this time, Western blot was performed by recombinant protein and total liver protein.

이의 결과, ALT-1 11개 클론과 ALT-2 6개 클론은 데이타에서는 보여주고 있지 않지만, 재조합 단백질의 웨스턴 블롯 분석결과 모두 특이적인 단백질 크기를 나타내었다. 그리고, 도 3에 도시된 바와 같이, L1-64c4, L1-90c1 항체(래인 표시)는 전체 인간 단백질에서 특이적으로 ALT-1 단백질 크기의 58kDa의 단일 밴드(single band)를 인식 하였으며, L2-6c6, L1-7c2 항체(래인 표시)도 약 60kDa의 단일밴드를 특이적으로 인식 하였다. 그리고, L1-64c4, L1-90c1항체는 수용성 프랙션(sokube fraction)과 불용성 프랙션(pellet fraction) 모두에서 밴드를 인식하였으나 L2-6c6, L1-7c2 항체는 수용성 프랙션에서만 특이적으로 인식하는 밴드가 관찰되었다.As a result, 11 ALT-1 clones and 6 ALT-2 clones were not shown in the data, but Western blot analysis of the recombinant protein showed specific protein sizes. As shown in FIG. 3, the L1-64c4 and L1-90c1 antibodies (lanes) recognize a single band of 58 kDa of ALT-1 protein size, specifically L2-64c4 in all human proteins. The 6c6 and L1-7c2 antibodies (lanes) also specifically recognized a single band of about 60 kDa. The L1-64c4 and L1-90c1 antibodies recognized bands in both the soluble fraction and the insoluble fraction, but the L2-6c6 and L1-7c2 antibodies specifically recognized only the aqueous fraction. A band was observed.

그리고, 상기 결과에 따라, ALT 1에 대한 L1-64c4와 L1-90c1항체를 생산하는 세포주는 2005년 10월 31일자로 “미생물에 관한 부다페스트조약”하에서 한국세포주연구재단에 기탁하여 KCLRF-BP-00119와 KCLRF-BP-00121를 각각 부여받았으며, ALT 2에 대한 L2-6c6와 L1-7c2 항체를 생산하는 세포주는 2005년 10월 31일자로 동일 기관에 기탁하여 KCLRF-BP-00120과 KCLRF-BP-00122를 부여받았다.According to the above results, the cell lines producing L1-64c4 and L1-90c1 antibodies against ALT 1 were deposited with KCLRF-BP- on October 31, 2005 under the “Budapest Treaty on Microorganisms”. 00119 and KCLRF-BP-00121 were given, respectively, and the cell lines producing L2-6c6 and L1-7c2 antibodies against ALT 2 were deposited with the same institution on October 31, 2005, to be KCLRF-BP-00120 and KCLRF-BP. -00122 was given.

5-3. 선별된 단일클론항체의 최종 선별5-3. Final screening of selected monoclonal antibodies

하이브리도마 클론 선별의 마지막 단계로 ALT 단백질에 대한 항체 짝(pair)을 찾기 위하여 샌드위치 ELISA를 수행하였다. 항원의 농도는 100ng/ml로 하여 ALT-1은 6개의 클론을 가지고 실험을 수행한 결과 중에서 같은 클론의 조합은 같은 에피토프(epitope)를 인지하는 것이기 때문에 특이도(specificity)를 높이기 위하여 제외시키고, 나머지 중에서 가장 감도가 높으며 10개의 급성 간염 환자 혈청과 5개의 정상인 혈청을 가지고 test한결과 환자 혈청에 더욱 민감한 조합인 LC1-64c4(capture Ab)와 LC1-90c1(detector Ab)를 선별하였다. As a final step in hybridoma clone selection, a sandwich ELISA was performed to find an antibody pair against the ALT protein. The antigen concentration was 100 ng / ml, and the result of experiments with ALT-1 having 6 clones was excluded to increase specificity because the combination of the same clones recognizes the same epitope. Among them, the most sensitive and tested samples of 10 acute hepatitis patients and 5 normal sera were selected as LC1-64c4 (capture Ab) and LC1-90c1 (detector Ab).

ALT2도 마찬가지 방법으로 짝찾기를 하여 가장 감도가 높은 조합인 LC2-6c6(capture Ab))와 LC2-7c2(detector Ab)를 선별하였다. ALT2 was also paired in the same way to select LC2-6c6 (capture Ab) and LC2-7c2 (detector Ab).

본 실시 예에서는 최종 선별된 상기 ALT-1 항체 쌍과 ALT-2 항체 쌍을 가지고 각종 정량 분석 실험에 사용하였다.In this example, the final selected ALT-1 antibody pair and ALT-2 antibody pair were used in various quantitative assays.

한편, 본 실시 예에서 샌드위치 ELISA는 다음의 방법으로 수행하였다.On the other hand, sandwich ELISA in the present embodiment was performed by the following method.

[실험 예 4]Experimental Example 4 샌드위치 Sandwich 엘리사Elisha Sandwich ELISA Sandwich ELISA

96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 10μg/ml 농도의 ALT에 대한 1차 항체를 50㎕씩 분주하였다. 그리고 4℃에서 12시간 동안 놓아 두어 항체가 플레이 트의 바닥에 골고루 코팅되게 한다. 그 다음 워싱 완충용액(PBS-Tween 20)로 3번 닦아준 후, 다시 각각의 웰에 블락킹 용액(1% gelatine, 5% sucrose in PBS) 300㎕를 넣고 37℃에서 60분간 놓아 둔 후 웰을 다시 PBST로 3번 닦아주었다. 그리고 여기에 시료 50㎕를 첨가하고, 37℃에서 두었다가 30분 후에 다시 플레이트를 PBST로 3번 닦아 주고, 바이오틴(biotin)이 표지된 2차 항체를 어세이(assay)에서 확인된 적당한 비율로 희석하여 처리해주었다. 마지막으로 AP-결합 스테렙트아비딘을 희석 완충용액에 10000:1로 희석하여 각 웰에 50㎕씩 넣고 PBST로 다시 플레이트의 웰을 3번을 닦아 주고 거기에 HRP의 기질 용액 TMB 기질을 50㎕씩 첨가하여 15분 정도 두고 색 변화를 관찰하였다. 색변화 반응이 끝나면 10mM 황산(H₂SO₄)을50㎕씩 첨가하여 반응을 멈추었다. 그런 다음, ELISA 판독기로 AP(alkaline phosphatase)의 측정 범위인 630nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.Each well of a 96-well microtiter plate was dispensed with 50 μl of primary antibody against ALT at a concentration of 10 μg / ml. It is then left at 4 ° C. for 12 hours so that the antibody is evenly coated on the bottom of the plate. Then, wash three times with washing buffer (PBS-Tween 20), and then add 300 µl of blocking solution (1% gelatine, 5% sucrose in PBS) to each well, and leave at 37 ° C for 60 minutes. Was wiped again 3 times with PBST. Then, 50 μl of the sample was added thereto, placed at 37 ° C., and after 30 minutes, the plate was wiped again three times with PBST, and the biotin-labeled secondary antibody was diluted in an appropriate ratio as identified in the assay. Processed it. Finally, AP-binding stereptavidin was diluted to 10000: 1 in dilution buffer solution, and 50 μl of each well was added to each well, and the plate well was washed three times with 50 μl of HRP substrate solution TMB substrate. 15 minutes after the addition, the color change was observed. After the color change reaction, 10 mM sulfuric acid (H ₂ SO ₄ ) The reaction was stopped by adding 50 µl. Then, the absorbance was measured at a wavelength of 630 nm, which is a measurement range of alkaline phosphatase (AP), using an ELISA reader.

6. ALT-1과 ALT-2 동위효소의 표준 정량곡선을 이용한 시료 내 ALT의 면역학적6. Immunological Study of ALT in Samples Using Standard Quantitative Curves of ALT-1 and ALT-2 Isozymes 정량분석 Quantitative Analysis

6-1. 표준 정량 곡선6-1. Standard quantitative curve

상기 5-3에서 최종 선별된 항체 쌍으로 ALT-1의 LC1-64c4와 LC1-90c1과, ALT-2의 LC2-6c6과 LC2-7c2를 가지고 실제 환자군에서 항원의 양을 측정하기 위하여 상술한 샌드위치 ELISA를 이용하여 제일 먼저 표준 정량 곡선을 완성하였다. 이때, 표준 정량 곡선을 위한 시료는 농도별로 PBS에 희석한 재조합 ALT 단백질을 50㎕씩 넣어 주었다.The sandwich described above for measuring the amount of antigen in the actual patient group with LC1-64c4 and LC1-90c1 of ALT-1, LC2-6c6 and LC2-7c2 of ALT-2 as the antibody pair finally selected in 5-3. First, standard quantification curves were completed using ELISA. At this time, 50 μl of the recombinant ALT protein diluted in PBS was added to the sample for the standard quantitative curve.

그런 다음, 실제 환자 혈청을 검사하는 조건에 가장 가까운 표준 곡선을 완성하기 위하여 정상인의 혈청을 1/5로 희석하고, 역시 농도를 알고 있는 재조합 단백질 첨가하여(spiking)하여 표준 곡선을 그렸다. 이때, 여기서 사용한 정상인 혈청은 ALT 효소 활성도 측정 수치가 9 IU/L로 매우 낮은데다가 이를 다시 희석하여 사용하였으므로 기존의 혈청 ALT 수치는 무시하였다. The standard curve was then drawn by diluting the normal human serum by 1/5 and spiked with a recombinant protein of known concentration to complete the standard curve closest to the conditions for testing the actual patient serum. In this case, the normal serum used here was very low as 9 IU / L of ALT enzyme activity measurement value and was diluted again and used to ignore the existing serum ALT level.

이의 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 표준곡선의 검출 한계는 ALT-1의 경우 49.23ug/ml이고, ALT-2는 63.9ug/ml이었다. 이때, 검출 한계는 10개의 ALT 농도 제로 값의 ELISA OD값을 표준곡선의 2차 방정식에 대입하여 얻은 값에 표준편차*2를 더하여 산출하였다.As a result, as shown in FIG. 4, the detection limit of the standard curve was 49.23 ug / ml for ALT-1 and 63.9 ug / ml for ALT-2. At this time, the detection limit was calculated by adding the standard deviation * 2 to the value obtained by substituting the ELISA OD values of the ten ALT concentration zero values into the quadratic equation of the standard curve.

6-2. 시료 내 ALT-1 과 ALT-2의 정량 분석6-2. Quantitative Analysis of ALT-1 and ALT-2 in Samples

상기 방법으로 얻은 표준곡선을 기준으로 실제 환자의 혈청에 있는 AL-T1과 ALT-2의 농도를 측정하고자 하였다. Based on the standard curve obtained by the above method, the concentrations of AL-T1 and ALT-2 in the serum of real patients were measured.

먼저, 환자는 급성 간염, 만성 간염, 간암, 간경화환자로 총 4개의 종류의 간질화 환자의 혈청을 검사하였으며, 여기에 간염 바이러스 보균자와 정상인 혈청을 같이 검사하였다. 이때, 환자의 나이와 성별 및 특징은 하기 표 1에 나타내었다. 이의 결과, 표준곡선을 기준으로 봤을 때 ALT-1 측정 범위는 49.23~500ug/ml이고, ALT2는 63.9ug/ml~ 400ug/ml이다.First, the patient was tested for serum of four types of epilepsy patients with acute hepatitis, chronic hepatitis, liver cancer, and cirrhosis patients, and hepatitis virus carriers and normal serum were tested together. In this case, the age, sex and characteristics of the patient is shown in Table 1 below. As a result, ALT-1 measurement range was 49.23 ~ 500ug / ml and ALT2 was 63.9ug / ml ~ 400ug / ml based on the standard curve.

그리고, 측정실험의 정밀도(precision)를 확인하고자, 6명의 환자 혈청에서 Sandwich ELISA으로 ALT의 농도를 측정하였으며, 이의 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 변이계수(CV) 값이 인트라 어세이(intra assay)에서는 1.7%이하, 인터 어세이(inter assay)에서는 9.1%이하로 확인하였다. 이때, 각 혈청의 측정치는 상기 실험을 3번씩 반복하여 얻은 평균값을 나타내었다. And, in order to confirm the precision (precision) of the measurement experiments, the concentration of ALT was measured by Sandwich ELISA in the serum of six patients, as a result, as shown in Table 2, the coefficient of variation (CV) is the intra assay ( Intra assay) was less than 1.7%, and in the inter assay (9.1%) was confirmed. At this time, the measured value of each serum represents the average value obtained by repeating the experiment three times.

다음으로 이 ELISA 분석 시스템의 회수율을 측정하고자, 기존의 ALT-1과 ALT-2를 가진 혈청에 알고 있는 농도의 ALT-1, ALT-2의 일정 양을 첨가하여 회수율 정도를 비교 분석하고 실험의 처리과정상의 분석물질 손실 정도를 확인하였다. 이의 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, ALT-1의 회수율은 91.5%에서 98.4%이며, ALT2는 88.5%에서 96.8%로 비교적 높은 회수율을 보였다.Next, in order to measure the recovery rate of the ELISA assay system, a predetermined amount of ALT-1 and ALT-2 at known concentrations was added to the serum having the existing ALT-1 and ALT-2 to compare and analyze the degree of recovery. The extent of analyte loss in the treatment process was confirmed. As a result, as shown in Table 3, the recovery of ALT-1 was 91.5% to 98.4%, ALT2 showed a relatively high recovery from 88.5% to 96.8%.

상기의 결과로, 본 발명에 따른 면역학적 질량 분석방법은 매우 유의하고 유효적임을 알 수 있었다.As a result, the immunological mass spectrometry method according to the present invention was found to be very significant and effective.

그리고, 상기의 결과를 근거로 실제 시료에 대한 ALT의 면역학적 정량측정방법을 수행하였다.Based on the above results, an immunological quantitative measurement method of ALT was performed on the actual sample.

먼저, 건강한 정상군과 간질환 환자의 혈청에서 면역학적인 측정방법인 두 사이트 샌드위치 ELISA 방법(two-site sandwich ELISA)으로 ALT-1을 양을 측정하였다. 이의 결과, 도 5-(A)에 도시된 바와 같이, 정상인의 ALT-1 질량 측정값은 65.9±35.6㎍/㎖, 간염 바이러스 보균자는 189.4±318.3㎍/㎖, 급성간염(AH)환자는 106.9±114.5㎍/㎖, 만성간염환자(CH)는 123.4±111.1㎍/㎖, 간암(HCC)환자는 153±144.2㎍/㎖, 간경화(LC) 환자는 314.9±352.8 ㎍/㎖로 정상인 집단에 비하여 간질환 집단의 양 (mass)측정치가 2배에서 5배까지 비교적 높은 수치로 관찰되어 환자와 정상인을 확연히 구분할 수 있었으며, 특히, 간경변환자의 경우 ALT-1의 평균값이 정상인의 5배나 높게 나타나 간경변환자를 진단하는데 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.First, the amount of ALT-1 was measured by two-site sandwich ELISA method, which is an immunological measurement method in serum of healthy normal group and liver disease patients. As a result, as shown in Fig. 5- (A), the ALT-1 mass measurement of the normal person was 65.9 ± 35.6 μg / ml, hepatitis virus carrier was 189.4 ± 318.3 μg / ml, and acute hepatitis (AH) patient was 106.9. ± 114.5µg / ml, Chronic Hepatitis Patients (CH) 123.4 ± 111.1µg / ml, Liver Cancer (HCC) Patients, 153 ± 144.2µg / ml, Liver Cirrhosis (LC) Patients: 314.9 ± 352.8 µg / ml The mass measurement of liver disease group was observed to be 2 to 5 times relatively high, which clearly distinguished patients from normal people. Especially, the mean value of ALT-1 was 5 times higher than that of normal people. It can be seen that it can be useful to diagnose the patient.

다음으로 ALT-1의 동위효소인 ALT-2에 특이한 단일클론항체를 사용하여 면역학적인 방법으로 혈액 내의 ALT-2 효소의 양(mass)을 측정하였다. 이의 측정결과, 도 5-(B)에 도시된 바와 같이, 효소의 절대 농도는 ALT-1에 비하여 1/3가량 낮지만 환자와 정상인의 구별은 오히려 더욱 두드러지게 나타났다. 또한, ALT-2 양의 측정 평균값은 정상인은 24.9±35.2㎍/㎖, 간염바이러스 보균자는 67.7±45.9㎍/㎖, 급성간염(AH)환자는 53.3±58.3㎍/㎖, 만성간염환자(CH)는 71.6±71.7㎍/㎖, 간암(HCC)환자는 128±50.3㎍/㎖, 간경화(LC) 환자는 111.1±64.1㎍/㎖이었다. 이는 ALT-1 농도 측정치 보다도 훨씬 유의성 있는 결과로 만성간염 환자는 정상인 평균치보다 3 배가량, 간암 환자나 간경화 환자는 5 배가량 더 높은 양 측정값의 차이를 나타내었다.Next, a monoclonal antibody specific for ALT-2, an isoenzyme of ALT-1, was used to measure the mass of ALT-2 enzyme in blood by immunological method. As a result of the measurement, as shown in Fig. 5- (B), the absolute concentration of the enzyme is about one third lower than ALT-1, but the distinction between the patient and the normal person was more prominent. In addition, the mean value of ALT-2 levels was 24.9 ± 35.2µg / ml for normal persons, 67.7 ± 45.9µg / ml for hepatitis virus carriers, 53.3 ± 58.3µg / ml for patients with acute hepatitis (AH), and chronic hepatitis patients (CH). Was 71.6 ± 71.7 μg / ml, liver cancer (HCC) was 128 ± 50.3 μg / ml, and liver cirrhosis (LC) patients were 111.1 ± 64.1 μg / ml. This was much more significant than the ALT-1 concentration measurement, which was 3 times higher than the mean for chronic hepatitis patients and 5 times higher for patients with liver cancer or cirrhosis.

간경화 환자의 기존의 임상에서 검사하는 효소활성 측정 결과를 보면 정상인 ALT효소 측정 평균값이 40.7 IU/L, 간염바이러스 보균자 25.87 IU/L, 급성간염 환자는 305.57 IU/L, 만성 간염 환자 54.57 IU/L, 간암 환자 42.77 IU/L, 간경화 환자 24.67 IU/L이었다 (도 5-A 참조). 이 결과에서 나타나듯이 기존의 효소 활성 방법으로는 급성 간염 환자를 제외하고는 정상인과 비교했을 때 간암이나 만성 간염, 간경화 환자를 전혀 구분하지 못한다. 그러나 본 연구의 측정방법인 면역학적 방법으로 ALT-1의 질량을 측정한 결과를 보면, 정상인 집단과 간질환 환자 간의 차이가 2배 이상 확연하게 남을 확인 할 수 있다. 특히, 간경화 환자는 정상인 집단과 비교하여 단백질양 측정치 평균값이 5 배가량 높은 것을 알 수 있었다.In the existing clinical trials of cirrhosis patients, the average ALT enzyme measurement averaged 40.7 IU / L, hepatitis virus carrier 25.87 IU / L, acute hepatitis patients 305.57 IU / L, chronic hepatitis patients 54.57 IU / L , 42.77 IU / L for liver cancer patients, 24.67 IU / L for cirrhosis patients (see FIGS. 5-A). As shown in the results, the existing enzyme activity method does not distinguish between liver cancer, chronic hepatitis, and cirrhosis patients at all compared to normal people except acute hepatitis patients. However, the results of measuring the mass of ALT-1 by the immunological method, which is the method of this study, can confirm that the difference between the normal group and the liver disease patients is more than doubled. In particular, cirrhosis patients were found to have a five times higher mean value of protein measurements compared to the normal population.

7. 동위효소 특이적 면역측정법의 ROC 곡선 분석 7. ROC curve analysis of isoenzyme-specific immunoassay

본 실시 예는 ALT-1의 생화학적 효소활성 측정법과 면역학적 정량 측정법 사이의 연관성을 도표를 통하여 분석하고자 하였다. This example attempts to analyze the relationship between the biochemical enzymatic activity assay and immunological quantitative assay of ALT-1 through a chart.

이의 분석결과, 효소활성 측정법과 면력학적 정량측정법에서는 어떠한 연관성을 나타내고 있지는 않으나, ALT-1과 ALT-2에 대한 간경화 환자나 간암 환자군을 비롯한 간 질환 환자군에서는 효소활성 측정값은 낮으나 실제 이의 질량 측정값은 높은 수치를 가지는 같은 현상을 보이고 있다. 따라서 본 발명에 따른 ALT의 면역학적 검출 방법은 기존의 효소활성 측정 검사의 이러한 단점을 보완하여 좀더 분별력 높은 간질화 환자의 임상 검사 법을 확립하는데 큰 역할을 할 수 있을 것으로 판단된다.As a result of the analysis, there was no correlation between the enzyme activity assay and the modal quantitative assay, but the enzyme activity was low in the liver disease patients including liver cirrhosis patients or liver cancer patients for ALT-1 and ALT-2, but its mass measurement was not performed. The value shows the same phenomenon with a high value. Therefore, the immunological detection method of ALT according to the present invention may be able to play a significant role in establishing a clinical test method for more discriminating epilepsy patients by supplementing these disadvantages of the existing enzyme activity assay.

또한, 특이도(specificity)와 민감도(sensitivity)를 기준으로 ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선을 플롯팅(plotting)하여 실제 임상검사에서의 활용도를 분석하고자 하였다. In addition, we plotted the receiver operating characteristic (ROC) curve based on the specificity and sensitivity to analyze the utilization in actual clinical tests.

먼저, 하기 표 4와 같이, 전체 88명, 정상인 15명의 ALT-1 질량 측정값과 효소활성 측정값의 ROC 곡선을 비교하여 나타내었다. 통상적으로 ROC 곡선은 진단 방법의 타당성을 검증할 수 있는 통계학적 그래프로서 곡선아래 면적(area under the curve(AUC))의 비율로 진단법의 효율을 나타낸다.First, as shown in Table 4 below, the total ALT-1 mass measurement value of 88 people and 15 normal people and the ROC curve of the enzyme activity measurement value were compared. Typically, the ROC curve is a statistical graph that can verify the validity of the diagnostic method, indicating the efficiency of the diagnostic method in the ratio of the area under the curve (AUC).

이의 결과, 환자 전체의 ALT-1 질량과 효소활성 측정의 ROC 곡선에서 AUC는 0.734이며, 95% 신뢰구간(confidence interval;CI)은 0.638~0.816을 나타내었다. 이는 질량의 측정 데이터가 효소 활성 측정 데이터(AUC: 0.55, CI: 0.449~0.649)와 비교하였을 때 더 높은 진단효율성을 나타내고 있다는 것을 보여 주는 것이다. 또한, 이 질량 측정 진단법의 환자와 정상인의 구분하는 기준치(cut off) 측정값은 88.4㎍/㎖이고, 이의 기준치는 56.8%의 민감도와 86.7%의 특이도를 나타내었다.As a result, the AUC was 0.734 and the 95% confidence interval (CI) was 0.638 to 0.816 in the ROC curves of the ALT-1 mass and enzyme activity measurements. This shows that the measurement data of mass shows higher diagnostic efficiency compared to the enzyme activity measurement data (AUC: 0.55, CI: 0.449 ~ 0.649). In addition, the cut-off measurement value for distinguishing the patient from the mass spectrometry diagnostic method was 88.4 µg / ml, and the threshold value showed sensitivity of 56.8% and specificity of 86.7%.

그리고, 이 환자 집단을 간질환 종류별 ROC 곡선으로 다시 분석하여 보면 질환 종류별로 다른 임상적 특징을 보이는 데, 급성 간염 환자의 질량측정 값은 AUC은 0.581, CI값은 0.405~0.743였으며, 이의 값은 기존의 효소활성도 진단방법(AUC: 0.706, CI: 0.531~0.846)에 비해 낮은 진단 타당성을 나타낸다. 그러나 만성 간염환자에서는 질량측정 진단법은(AUC: 0.703, CI: 0.528~0.843) 효소활성 측정진단법 (AUC: 0.535, CI: 0.363~0.702)보다 타당성이 더 높다는 것을 알 수 있다. 마찬가지로 간경화 환자에서도 질량측정법(AUC: 0.847, CI: 0.696~0.942)이 효소활성 측정법(AUC: 0.667, CI: 0.495~0.811)보다 훨씬 높은 진단 효율을 보였다. 특히, 간암 환자에서는 이러한 특징이 더욱 두드러졌다(질량 측정법 AUC: 0.788, CI: 0.626~0.903, 효소활성 측정법 AUC: 0.667, CI: 0.495~0.811). 이는 이 질량진단 방법이 간경변과 간암환자를 효과적으로 진단할 수 있다는 것을 나타내 주는 것이다.(도 6 참조).In addition, the analysis of this patient group by ROC curve for each type of liver disease showed different clinical characteristics according to the type of disease. The mass measurement values of patients with acute hepatitis were AUC of 0.581 and CI of 0.405 ~ 0.743. The diagnostic validity is lower than that of the existing diagnostic methods for enzyme activity (AUC: 0.706, CI: 0.531 ~ 0.846). However, in patients with chronic hepatitis, the mass spectrometry (AUC: 0.703, CI: 0.528 ~ 0.843) is more valid than the enzyme assay (AUC: 0.535, CI: 0.363 ~ 0.702). Similarly, in patients with cirrhosis, mass spectrometry (AUC: 0.847, CI: 0.696 ~ 0.942) showed significantly higher diagnostic efficiency than enzyme activity (AUC: 0.667, CI: 0.495 ~ 0.811). In particular, these characteristics were more prominent in patients with liver cancer (mass spectrometry AUC: 0.788, CI: 0.626 to 0.903, enzyme activity assay AUC: 0.667, CI: 0.495 to 0.811). This indicates that this mass diagnostic method can effectively diagnose liver cirrhosis and liver cancer patients (see FIG. 6).

한편, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, ALT-2 동위효소 면역진단법의 ROC 곡선을 통한 분석 결과에서는 더욱 큰 차이로 질량측정 진단법의 효율이 더 높게 나타나는데, 특히 ALT-2에서는 간암 환자의 AUC가 0.9이상의 매우 유의성이 높은 값을 나타내었다. 역시 간 질환 종류별로 살펴보면 환자 전체의 질량측정 ROC 곡선의 AUC는 0.907로, 질량 측정값의 기준치는 70.7ug/ml이며 이때의 민감도와 특이도는 75.4%, 92.9%였다. 그리고, ALT-2 동위효소 진단의 데이터에서는 ALT-1과 달리 급성간염 환자에서도 질량의 측정(AUC: 0.854, CI: 0.661~0.960)진단법이 기존의 효소활성 측정 진단법보다 더 나은 진단 타당성을 나타내었다. 그러나 만성 간염환자 질량 진단은 기존의 효소활성 측정법보다 오히려 더 낮은 효율을 나타내었다. 특히 주목할 만한 점은 간암 환자에서 가장 높은 진단 효율을 보여 AUC 0.966, 민감도 88%와 특이도 100%를 갖는다는 것이나, 이와 마찬가지로 간경화 환자에서도 그 보다는 낮지만 AUC 0.922, 민감도 81%와 특이도 92.9%를 나타내었다(도 7 참조). On the other hand, as shown in Table 4, the analysis results through the ROC curve of the ALT-2 isozyme immunodiagnosis method shows a greater difference in the efficiency of the mass measurement diagnostic method, especially in ALT-2 AUC of liver cancer patients 0.9 The above highly significant value was shown. In terms of liver disease, the AUC of the mass measurement ROC curve of all patients was 0.907, and the reference value of the mass measurement was 70.7 ug / ml, and the sensitivity and specificity were 75.4% and 92.9%. In addition, ALT-2 isozyme diagnostic data showed that, unlike ALT-1, mass measurement (AUC: 0.854, CI: 0.661 ~ 0.960) diagnostic method showed better diagnostic validity than that of ALT-2. . However, chronic hepatitis mass diagnosis showed lower efficiency than the conventional enzyme activity assay. Especially noteworthy is that AUC 0.966, 88% sensitivity and 100% specificity is the highest diagnostic efficiency in liver cancer patients, but similarly in patients with cirrhosis, AUC 0.922, 81% sensitivity and 92.9% specificity. (See FIG. 7).

따라서, ALT-2는 ALT-1의 ROC 분석결과에서보다도 훨씬 더 좋은 임상학적 가치를 나타내었으며, 질환 종류별 환자 전체를 통합하여 플롯팅한 결과에서도 전반적으로 모든 종류의 간질환 환자에서 기존의 진단법보다 더 나은 진단 효율을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 특히 ALT-2의 농도를 측정하는 것은 간암 환자와 간경변 환자를 진단하는데 있어서 매우 좋은 진단 마커(marker)로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.Therefore, ALT-2 showed much better clinical value than the result of ROLT analysis of ALT-1, and the overall result of plotting the whole patient by disease type compared to the conventional diagnosis method in all types of liver disease patients. It was confirmed that the diagnostic efficiency is better. In particular, measuring the concentration of ALT-2 can be used as a very good diagnostic marker for diagnosing liver cancer patients and cirrhosis patients.

이와 같이, 본 발명에서 ALT-2는 ALT-1보다도 혈액 속에서 더 낮은 농도로 존재하고 있지만, 간 질환 환자에서는 정상인과 비교하여 더 의미수치로 판별할 수 있는 것으로 확인할 수 있었으며, 상호 보완적인 측면에서 ALT-1의 면역학적 측정값과 함께 사용하면 기존 효소측정법과 비교하여 유효성이 매우 우수한 간 질환 진단 시약과 진단 키트로 이용할 수 있다.As such, although ALT-2 is present in the blood at a lower concentration than ALT-1 in the present invention, it was confirmed that the liver disease patients can be discriminated more meaningfully compared to normal people. When used in combination with immunological measurements of ALT-1, it can be used as a diagnostic reagent and diagnostic kit for liver disease, which is highly effective compared to conventional enzyme assay.

8. ALT 동위효소에 대한 혈액 내 자가항체의 확인8. Identification of autoantibodies in blood for ALT isoenzymes

상기 결과, 간경변이나 간암 환자의 ALT 효소활성도가 단백질의 양에 비하여 현저하게 낮게 나타나는 데, 이의 원인 중에 하나는 효소활성도를 저해하는 물질이 혈액 내에 있을 것으로 예측할 수 있으며, 이들 저해물질의 하나로 효소와 결합하여 활성도를 저해하는 자가항체를 들 수 있다. 이는 다른 간질환 표지 인자인 AST(aspartate aminotransferase)와 면역글로불린과의 복합체 형태의 자가항체가 존재한다고 밝혀졌으며, 이 밖의 다른 연구에서도 여러 가지 다른 혈액내 효소들의 면역글로불린 복합체의 존재와 탐지 방법 등의 연구가 밝혀진바 있기 때문이다.As a result, ALT enzyme activity in liver cirrhosis or liver cancer patients is markedly lower than the amount of protein, one of the causes of this can be predicted that a substance that inhibits enzyme activity is present in the blood. Autoantibodies that bind to inhibit activity. It has been shown that autoantibodies in the form of complexes of other liver disease markers, AST (aspartate aminotransferase) and immunoglobulins, have been found in other studies, including the presence and detection of immunoglobulin complexes of various enzymes in the blood. Because research has been found.

이에, 본 실시 예에서는 환자 및 정상인의 혈액 내의 자가항체를 측정하여 그 양상을 비교하여 분석하고자 하였다. 측정방법으로는 간접 효소매개면역측정법을 사용하였으며, 효소-면역글로불린 복합체와 복합체를 만들지 않은 자가항체를 측정하였다. 자가항체만을 측정하기 위해서는 ALT-1/ALT-2 단백질을 ELISA 플레이트 바닥에 부착한 후, 시료 혈청을 처리하고, 세척한 후 염소 항 인간 이차항체를 달리하여 IgA와 IgM 별로 각각 측정하였다. 효소-자가항체 복합체를 측정하기 위해서는 플레이트 바닥에 항원대신 항체를 고정한 후, 시료 혈청을 처리하고, 세척한 후, IgA와 IgM 특이적인 염소 항 인간 항체를 처리하여 측정하였다. Therefore, in the present embodiment, autoantibodies in blood of patients and normal people were measured, and their aspects were compared and analyzed. Indirect enzyme-mediated immunoassay was used as a measuring method, and autoantibodies without complexes with enzyme-immunoglobulin complexes were measured. In order to measure only autoantibodies, ALT-1 / ALT-2 protein was attached to the bottom of the ELISA plate, sample serum was treated, washed, and goat anti-human secondary antibodies were measured for each IgA and IgM. In order to measure the enzyme-autoantibody complex, the antibody was immobilized on the bottom of the plate, and the sample serum was treated, washed, and then treated with IgA and IgM specific goat anti human antibodies.

이의 결과, 도 8-A에 도시된 바와 같이 ALT-1에 대한 IgA 자가 항체의 측정값을 보면, 간질화 환자 집단별로 서로 다른 측정값을 보여 주고 있는데, 급성 간염 환자나 만성 간염환자보다 간암 환자나 간경변 환자의 자가항체가 혈액 내에 많이 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 효소-항체 복합체의 양을 측정해 본 경우에서도 자가 항체와 마찬가지로 간암과 간경변 환자에서 더 많은 복합체를 확인할 수 있었다. 그리고, ALT-1에 대한 IgM 자가항체를 측정한 것을 도 8-B에 도시한 결과, IgA의 경우와 유사하게 간암과 간경화 환자의 경우 자가항체와 복합체의 양이 더 많이 분포함을 알 수 있었다. As a result, as shown in Fig. 8-A, the measured values of IgA autoantibodies against ALT-1 show different measurements by the group of patients with epilepsy, hepatic cancer patients than patients with acute hepatitis or chronic hepatitis. B, autoantibodies in cirrhosis patients were found to be high in blood. In addition, when the amount of enzyme-antibody complexes was measured, more complexes were identified in patients with liver cancer and cirrhosis as well as autoantibodies. As shown in FIG. 8-B, the measurement of IgM autoantibodies against ALT-1 showed that the amounts of autoantibodies and complexes were more distributed in liver cancer and cirrhosis patients than in IgA. .

또한, 도 9에 도시한 바와 같이, ALT-2에 대한 IgA 자가항체 측정값은 정상인의 자가항체 측정치보다 간질환 환자의 측정치가 모든 간질환에서 높게 나타남을 알 수 있었다. 특히, 간암의 경우 정상인의 값과는 아주 현저하게 차이가 확인되었다. 특히, 효소-자가항체 복합체의 분포를 측정해 본 결과 자가항체와 비슷하게 간질환자에서 모두 높게 나타났으며 특히 간암에서 정상인 보다 아주 높게 나타났다.In addition, as shown in Figure 9, the IgA autoantibodies measured for ALT-2 was found to be higher in all liver diseases than those of normal patients in the liver disease patients. In particular, liver cancer was found to be remarkably different from that of normal people. In particular, when the distribution of enzyme-autoantibody complex was measured, it was high in all patients with epilepsy similar to autoantibodies, especially in liver cancer.

9. 동위효소에 대한 자가항체 측정법의 ROC 곡선 분석 9. ROC curve analysis of autoantibody assay for isoenzymes

상기 자가항체에 대한 질량 측정 결과를 바탕으로, ALT 동위효소의 질량 측정법에 대한 ROC 곡선 분석과 마찬가지로 자가항체와 효소-자가항체 복합체를 측정하는 방법이 간암과 강경변 등의 간질환자를 정상인 집단과 비교하여 얼마나 효과적으로 구분하거나 골라낼 수 있는가를 알아보고자 ROC 곡선 분석을 실시하였다.Based on the mass spectrometry results of the autoantibodies, the method of measuring autoantibodies and enzyme-autoantibody complexes, similar to the ROC curve analysis of the ALT isoenzyme mass spectrometry, was performed in the normal population of liver cancers and liver cirrhosis patients. ROC curve analysis was conducted to find out how effective the classification and selection can be.

이의 결과, 하기 표 5에 나타난 바와 같이, ALT-1에 대한 자가항체 분석에서 먼저 IgA의 AUC값은 간염의 경우 0.6 부근인 반면, 간암과 간경변은 0.83과 0.89 값이 측정되었고, 마찬가지로 특이도와 민감도에서 감염환자에 비하여 높게 나타났다. 특히, 민감도가 60∼70% 수준일 때 특이도는 100%를 보여 주었다.As a result, as shown in Table 5, in the autoantibody analysis for ALT-1, the AUC value of IgA was first around 0.6 for hepatitis, while the values of 0.83 and 0.89 were measured for liver cancer and cirrhosis. Was higher than in infected patients. In particular, the specificity was 100% when the sensitivity level was 60-70%.

그리고, 효소-자가항체 복합체 IgA 분석에서도 간암과 간경변은 AUC값이 모두 0.8 이상으로 높게 나타났으며, 특이도와 민감도도 간염과는 현격한 차이를 보여 주었으며, 상술한 ALT 효소의 질량 측정 결과와 마찬가지로 특이도와 민감도 모두 높게 나왔다. 이중, IgM 자가항체의 경우 간질환 모두에서 AUC값이 높게 나왔으며 간염과 간암에서 민감도는 94% 이상 특이도는 공히 100%로 관찰되었다. IgM 효소-자가항체 복합체의 경우에서도 간질환자 모두에서 AUC 값이 0.9 이상의 높은 수치로 관찰되었고 민감도에서 80% 이상 특이도에서는 90% 이상으로 아주 높은 수치로 측정되었다. 이상의 결과, ALT-1 효소에 대한 자가항체와 자가항체 복합체의 혈중 농도를 알면 간질환, 특히 간암과 간경변을 진단할 수 있음을 알 수 있는 것이다. In the enzyme-autoantibody complex IgA analysis, hepatic cancer and cirrhosis showed high AUC values of 0.8 or more, and the specificity and sensitivity were markedly different from hepatitis, and similar to the mass measurement results of the ALT enzyme described above. Both specificity and sensitivity were high. In the case of IgM autoantibodies, AUC was high in both liver diseases, and the sensitivity was more than 94% in both hepatitis and liver cancer. In the case of IgM enzyme-autoantibody complex, the AUC value was found to be higher than 0.9 in all patients with liver disease, and it was very high as 80% in sensitivity and 90% in specificity. As a result, knowing blood levels of autoantibodies and autoantibody complexes to ALT-1 enzyme can be seen to diagnose liver disease, especially liver cancer and cirrhosis.

그리고, ALT-2 효소에 대한 자가항체 분석에서는 IgA 자가항체의 양이 급성 및 만성 간염에 비하여 간암과 간경변에서 훨씬 높게 나타났고, 간염의 경우 AUC값이 0.5 부근인데 반하여 간암과 간경에서는 0.85 이상이었으며, IgA 효소-자가항체 복합체에서도 마찬가지로 간염에 비하여 높은 AUC 값과 민감도/특이도 값이 나타났고, 간암과 간경변의 경우 민감도에서 80% 이상, 특이도에서는 85% 이상의 높은 값으로 나타났다.In the analysis of autoantibodies for ALT-2 enzyme, the amount of IgA autoantibodies was much higher in liver cancer and cirrhosis than in acute and chronic hepatitis. The hepatitis AUC was near 0.5, whereas liver cancer and cirrhosis were above 0.85. , IgA enzyme-autoantibody complexes also showed higher AUC and sensitivity / specificity values than hepatitis, and more than 80% in sensitivity and 85% in specificity in liver cancer and cirrhosis.

이상의 결과로 ALT-1와 ALT-2에 대한 자가항체와 효소-자가항체 복합체의 측정으로도 간질환을 진단할 수 있다는 것을 알 수 있었다.As a result, hepatic disease can be diagnosed by measuring autoantibodies and enzyme-autoantibody complexes against ALT-1 and ALT-2.

이상과 같이, 본 발명은 면역분석법을 이용하여 알라닌 아미노전이효소와 이의 동위효소를 항원으로 구별하고, 상기 항원을 각각 특이적으로 반응할 수 있는 단일클론항체를 진단용 조성물과 진단 키트로 사용함으로써, 종래 효소 활성도 측정방식보다 간 질환 진단 효율을 매우 향상시켰다.As described above, the present invention distinguishes alanine aminotransferase and its isoenzymes into antigens by using an immunoassay method, and uses monoclonal antibodies capable of specifically reacting the antigens as diagnostic compositions and diagnostic kits. The liver disease diagnosis efficiency is significantly improved compared to the conventional enzyme activity measurement method.

또한, 종래 알라닌 아미노전이효소에 대한 공통된 단일클론 항체만을 사용한 면역분석법과 비교하여 간 질환에 대한 보다 정확한 판단율과 간 질환의 종류별 진행 정도를 더 명확하게 예측할 수 있을 것으로 판단된다.In addition, compared to the immunoassay method using only a common monoclonal antibody against alanine aminotransferase, it is judged that a more accurate judgment rate of liver disease and the progression of liver disease by type can be predicted more clearly.

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Claims

Composition for detecting alanine aminotransferase for diagnosing liver disease of acute hepatitis, chronic hepatitis, liver cirrhosis or liver cancer containing a monoclonal antibody produced in the hybridoma cell line of Accession No. KCLRF-BP-00120 or KCLRF-BP-00122.

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The composition of claim 1; or

A plurality of compositions each comprising a composition for detecting alanine aminotransferase comprising a composition according to claim 1 and a monoclonal antibody produced in a hybridoma cell line of Accession No. KCLRF-BP-00119 or KCLRF-BP-00121;

Diagnostic kit for detecting alanine aminotransferase for diagnosing liver disease of acute hepatitis, chronic hepatitis, liver cirrhosis or liver cancer.

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