KR100485090B1 - 이온성 액체로 코팅된 효소 - Google Patents

이온성 액체로 코팅된 효소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이온성 액체로 코팅된 효소(여기서, 상기 이온성 액체는 약 150℃ 이하의 온도에서 액상으로 존재하는 유기염임)에 관한 것이다. 본 발명의 이온성 액체로 코팅된 효소는 효소의 기능, 예를 들어 리파아제의 경우 이온성 액체로 코팅되면 입체 선택성과 안정성이 월등히 향상된다. 또한 이온성 액체로 코팅된 효소는 재사용시에도 그 광학순도 특성, 입체 선택성, 활성이 감소되지 않는다. 상기 코팅된 효소는 키랄 농약, 의약, 천연 화합물 등의 합성에 필요한 키랄 중간체의 제조를 위한 촉매로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이온성 액체로 코팅된 효소{ENZYMES COATED WITH IONIC LIQUID}
[산업상 이용 분야]
본 발명은 이온성 액체로 코팅된 효소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 입체 선택성이 높고 재사용이 가능한 이온성 액체로 코팅된 효소에 관한 것이다.
[종래 기술]
오늘날, 효소 촉매를 이용하여 라세믹 기질을 속도론적 광학 분할하는 방법이 유기 합성에서 기본적으로 많이 이용되고 있다. 유기 합성에서 가장 많이 사용되고 있는 효소 촉매는 지질 가수분해 효소이다.
지질 가수분해 효소인 리파아제는 식물, 동물, 그리고 미생물 등에서 분리하고 정제하여 얻는다. 그 중에서 돼지의 췌장에서 얻은 PPL(Porcine pancreatic lipase), 곰팡이에서 얻은 ANL(Aspergillus niger lipase), 효모에서 얻은 CCL(Candida cyclindracea lipase), 그리고 박테리아인 녹농균에서 얻은 LPL(Lipoprotein lipase), LPS(Pseudomonas cepacia lipase), LAK(Pseudomonas fluorecens lipase) 등이 있다. 상기 리파아제는 값이 싸고, 적용 가능한 기질의 범위가 넓고, 입체선택성이 좋으며, 유기용매에서 사용 가능하고, 조효소를 필요로 하지 않아 광학활성을 가지는 화합물의 제조를 위한 촉매로 많이 사용된다. 그러나, 유기 용매에서 사용될 때 활성, 안정성 및 입체 선택성이 떨어지고, 재사용에 어려움이 크다는 문제점이 있다.
따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위한 다양한 기술들이 개발되고 있다. 이러한 기술중 대표적인 방법으로 효소를 코팅시키는 방법이 있다. 예를 들어, 완충 용액에서 지질(Okahata, Y.; Hatano, A.; Ijiro, K. Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 1311)이나 계면 활성제(Huang, S. Y.; Chang, H. L.; Goto, M. Enzyme Microb. Technol., 1998, 22, 552)를 사용하여 효소를 코팅할 수 있다. 그러나, 상기 방법들은 효소를 코팅하는 방법이 복잡할 뿐만 아니라, 효소의 활성이 낮아지거나 코팅되지 않은 효소로 인한 손실이 크다는 문제점이 있다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 입체선택성이 우수하고 재사용이 가능한 코팅(coated) 효소를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 입체선택성이 우수하고 재사용이 가능한 코팅된 효소의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 코팅된 효소를 이용한 광학 이성질체의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이온성 액체로 코팅된 효소(여기서, 상기 이온성 액체는 약 150℃ 이하의 온도에서 액상으로 존재하는 유기염임)를 제공한다.
본 발명은 또한 효소 코팅에 적합한 이온성 액체를 녹는점 이상의 온도로 녹인 후 효소와 혼합하고, 온도를 상온으로 낮추어 이온성 액체를 고체화시키는 공정을 포함하는 이온성 액체로 코팅된 효소의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 이온성 액체로 코팅된 효소를 이용하여 라세믹 화합물중 어느 하나의 에난소머와 선택적으로 반응시키는 공정을 포함하는 광학 순도가 우수한 광학 이성질체를 제조하는 방법을 제공한다. 이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 입체선택성이 우수하고 재사용이 가능한 코팅된 효소를 제조하기 위하여 효소를 이온성 액체로 코팅한다. 상기 이온성 액체는 상온에서는 고체로 존재하나 일반적으로 150℃ 이하의 온도에서 액상으로 존재하는 유기 염들을 의미한다.
최근까지 이러한 이온성 액체들에 대한 많은 연구들이 보고되고 있다 (Wasserscheid, P.; Wilhelm, K. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 3772). 이러한 연구들의 가장 큰 의미는 이온성 액체가 환경 친화적인 물질이라는 점과 값비싼 촉매의 재사용과 반응성의 향상 등 다양한 기능을 가지고 있으며, 기존의 유기 용매를 대체할 수 있는 새로운 용매라는 점이다. 이들 중 이온성 액체 내에서의 생촉매 반응에 대한 연구들이 보고되었으며, 기존의 유기 용매 속에서의 생촉매 반응에 비하여 반응성의 향상, 입체 선택성의 향상 등 다양한 장점들이 나타나고 있다(Kim, K. W.; Song, B.; Choi, M. Y.; Kim, M. -J. Org. Lett. 2001, 3, 1507.; Erbeldinger, M.; Mesiano, A. J.; Russell, A. J. Biotechnol. Prog. 2000, 16, 1131.; Lau, R. M.; Rantwijk, F. van; Seddon, K. R.; Sheldon, R. A. Org. Lett. 2000, 2, 4189.).
본 발명에서 효소 코팅에 사용되는 이온성 액체는 상온에서는 고체로 존재하며 녹는점 이상의 온도로 가열하면 액상으로 존재한다. 상기 이온성 액체는 150℃ 이하의 온도, 바람직하게는 120℃ 내지 150℃의 온도에서 액상으로 존재한다.
상기 이온성 액체의 유기 양이온으로는 헤테로 고리 화합물의 양이온과 이들 양이온과 이온 결합을 형성하는 유기 또는 무기 음이온을 포함한다.
상기 헤테로 고리 화합물은 N, O, S 또는 이들의 조합에서 선택는 헤테로 원자를 포함하고, 헤테로 원자의 수는 1 내지 4개가 바람직하며, 1 내지 2개가 더 바람직하다. 이러한 헤테로 고리 화합물의 양이온에는 이미다졸륨(Imidazolium), 피리디늄(Pyridinium), 피리다지늄(Pyridazinium), 피리미디늄(Pyrimidinium), 피라지늄(Pyrazinium), 피라졸륨(Pyrazolium), 티아졸륨(Thiazolium), 옥사졸륨(Oxazolium), 및 트리아졸륨(Triazolium)으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 이들의 치환된 화합물의 양이온이 있다.
상기 양이온과 결합하는 유기 또는 무기 음이온은 비스(퍼플루오로에틸설포닐)이미드(N(C2F5SO2)2 -), 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드)(N(CF 3SO2)2 -), 트리스(트리플루오로메틸설포닐메타이드(C(CF3SO2)2 -), 트리플루오로메탄설폰이미드, 트리플루오로메틸설폰이미드, 트리플루오로메틸설포네이트, AsF6 -, ClO4 -, PF6 -, BF4 - 중 하나이다.
본 발명에 바람직하게 사용될 수 있는 이온성 액체는 하기 화학식 1을 가진다:
[화학식 1]
상기 식에서 X는 페닐기, 치환된 페닐기, 메타아크릴로일 에스테르(methacryloyl ester), OCOCH3, CO2CH3, 및 CN으로 이루어진 군에서 선택되고, Y는 BF4 또는 PF6이고, n은 2 내지 5의 정수이다. 상기 치환된 페닐기는 탄소수 1 내지 3의 알킬기 또는 알콕시기, 에스테르기, 아미드기, 히드록시기, 시안기, 할로겐 또는 니트로기로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 치환기를 가지는 페닐기를 의미한다.
삭제
본 발명의 이온성 액체로 코팅된 효소의 제조방법은 효소 코팅에 적합한 이온성 액체를 녹는점 이상의 온도로 녹인 후 효소와 혼합하고, 혼합물을 냉각시켜 이온성 액체를 고체화시키는 공정을 포함한다. 본 발명의 효소 코팅 방법은 이온성 액체를 가열시키는 공정과 냉각시키는 공정만으로도 간단히 효소를 코팅할 수 있다.
본 발명에서 효소 코팅에 적합한 이온성 액체는 상업적으로 시판되는 물질을 구입할 수도 있고, 이 분야의 통상의 기술에 의하여 합성하여 사용할 수도 있다. 예를 들어 상기 화학식 1의 화합물중 1-(3-페닐프로필)-3-메틸이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트의 경우에는 먼저 1-메틸이미다졸과 1-클로로-3-페닐 프로판을 반응시켜 1-(3-페닐프로필)-3-메틸이미다졸륨 클로라이드를 합성하고 이를 HPF6와 반응시켜 합성한다.
상기 이온성 액체의 사용량은 효소에 따라 다를 수 있으나 효소 1g 당 5 내지 20g의 양으로 사용하는 것이 바람직하다. 이온성 액체의 양이 5g 미만이면 코팅 효과가 미미하고 20g을 초과하면 코팅된 효소의 단위 무게당 반응 활성이 낮아져 바람직하지 않다.
이온성 액체로 코팅되는 효소로는 특별히 한정되는 것은 아니나 광학활성 화합물의 제조에 많이 사용되는 리파아제가 바람직하게 사용될 수 있다. 이러한 리파아제의 바람직한 예로는 슈도모나스 세파시아 리파아제(Pseudomonas cepacia lipase; LPS), 캔디다 안타크티카 리파아제(Candida antarctica lipase; CAL), 캔디다 루거사 리파아제(Candida rugosa lipase; CRL), 아스퍼질러스 니거 리파아제(Aspergillus niger lipase; ANL), 캔디다 실린드라시아(Candida cylindracea lipase; CCL), 무코 미헤이 리파아제(Mucor miehei lipase), 슈도모나스 플로레센스 리파아제(Pseudomonas fluorecens lipase; LAK), 리조퍼스 아리주스 리파아제(Rhizopus arrhizus lipase), 리조퍼스 니베우스 리파아제(Rhizopus niveus lipase), 허그 판그레스 리파아제(Hog pancreas lipase), 캔디다 리폴리티카 리파아제(Candida lipolytica lipase), 무코 자바니쿠스 리파아제(Mucor javanicus lipase), 페니실리움 로퀘포티 리파아제(Penicillium roqueforti lipase), 또는 리조무코 미헤이 리파아제(Rhizomucor miehei lipase)가 있다.
상기 이온성 액체로 코팅된 효소를 촉매로 사용하여 라세믹 화합물중 어느 하나의 에난소머와 선택적으로 반응시킴으로써 광학 순도가 우수한 광학 이성질체를 제조할 수 있다. 예를 들어 이온성 액체로 코팅된 리파아제를 이용하면 라세믹 알코올중 하나의 에난소머를 선택적으로 아실화(트랜스에스테르화)시켜 광학순도 특성이 우수한 키랄 에스테르를 제조할 수 있다.
코팅된 리파아제를 이용한 라세믹 2차 알코올의 광학 분할에서 2차 알코올의 구조는 특별히 제한되지는 않는다. 이들의 예로는 하기 구조식 2a 내지 2d를 가지는 알코올을 들 수 있다.
본 발명의 이온성 액체로 코팅된 효소와 라세믹 화합물의 반응시 사용되는 반응 용매는 그 종류가 특별히 제한되지는 않으나, 리파아제와 같은 효소 촉매 반응은 생성물의 합성 수율 및 입체 선택성 면에서 용매의 영향을 받는 것이 통상이므로 이온성 액체가 녹지 않는 톨루엔, 에테르, 헥산 등을 사용하는 것이 바람직하다. 반응 용매의 사용양은 반응물의 농도가 0.2 내지 0.4M이 되도록 사용하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
1-(3-페닐프로필)-3-메틸이미다졸륨 클로라이드의 합성
1-메틸이미다졸 0.15 mole과 1-클로로-3-페닐프로판 0.125 mole을 100mL 둥근 플라스크에 넣은 후 70℃에서 하루동안 교반하여 반응시킴으로써 1-(3-페닐프로필)-3-메틸이미다졸륨 클로라이드를 얻었다(99 % 수율).
1H-NMR (CD3CN, δ, 300MHz) 2.18 (m, 2H, CH2), 2.64 (t, 2H, J = 7.4, CH2), 3.90 (s, 1H, NCH3), 4.27 (t, 2H, J = 7.1, CH2), 7.18-7.30 (m, 5H, C6H5), 7.56 (s, 1H, CH), 7.63 (s, 1H, CH), 9.94 (s, 1H, CH).
1-(3-페닐프로필)-3-메틸이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트의 합성
얼음조(ice-bath)내의 1-(3-페닐프로필)-3-메틸이미다졸륨 클로라이드에 HPF6 1.2당량을 서서히 넣어주었다. 30분 정도 교반한 후 메틸렌 클로라이드(MC)로 3회 추출하여 무수 황산나트륨으로 건조하여 1-(3-페닐프로필)-3-메틸이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트를 얻었다(mp 52-53℃, 78 % 수율).
1H-NMR (CD3CN, δ, 300MHz) 2.14 (m, 2H, CH2), 2.65 (t, 2H, J = 7.4, CH2), 3.80 (s, 1H, NCH3), 4.14 (t, 2H, J = 7.2, CH2), 7.19-7.35 (m, 7H), δ8.34 (s, 1H, CH).
(실시예 2)
1-메틸-3-(3-페닐프로필)이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트를 이용한 리파아제의 코팅
1-메틸-3-(3-페닐프로필)이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트 1g을 녹는점 이상의 온도로 녹이고 리파아제(LPS, lipase from Pseudomonas cepacia) 100mg를 가한 후에 10분 동안 교반하였다. 용액을 상온으로 냉각하여 1.1g의 코팅된 리파아제를 얻었다.
(실시예 3)
코팅된 리파아제(LPS)를 이용한 라세믹 알코올의 광학 분할
하기 구조식 2a 내지 2d를 가지는 라세믹 알코올 0.1mmol, 실시예 2에서 얻어진 1-메틸-3-(3-페닐프로필)이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트로 코팅된 리파아제(LPS) 160-400mg, 및 비닐 아세테이트 0.3mmol를 톨루엔 0.5mL에 혼합하여 상온에서 교반하였다. 통상 이온성 액체로 코팅된 효소는 코팅되지 않은 천연 효소에 비하여 5.5 내지 22배의 양으로 사용되어야 반응에 참여하는 효소의 양이 같다.
이를 박막 크로마토그래피(thin layer chromatography)를 통해 아실화 반응이 50% 정도 진행된 것을 확인하고 반응을 종결하였다. 반응 혼합물로부터 리파아제(LPS)를 여과하고 용매를 제거한 다음 키랄 아세테이트와 아실화되지 않은 알코올의 광학순도를 키랄 고분해능 액체 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.
(비교예 1)
천연 리파아제(LPS)를 이용한 라세믹 알코올의 광학 분할
코팅된 리파아제(LPS) 대신 천연 리파아제 16-36mg을 사용한 것을 제외하고 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 3과 비교예 1의 천연 및 코팅된 LPS를 이용한 라세믹 알코올의 광학 분할 결과를 하기 표 1에 기재하였다.
라세믹 알코올 키랄 알코올의광학 순도(%) 키랄 에스테르의광학 순도(%) 입체선택성(Enantio-selectivity)
실시예 3 2a 37.0 99.5 574
2b 29.5 99.5 532
2c 30 98.3 156
2d 27.5 98.9 237
비교예 1 2a 56.3 98.8 293
2b 54.5 98.7 265
2c 45.9 97.1 107
2d 57.5 98.3 161
주) 광학순도: Enantiomeric Excess(ee), (R-S)/(R+S)
상기 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 이온성 액체로 코팅된 실시예 3의 리파아제의 입체선택성이 천연 리파아제와 동등 또는 그 이상 향상되었음을 알 수 있다.
(실시예 4)
천연 LPS 또는 코팅된 LPS의 재사용시 활성
상기 구조식 2b의 라세믹 알코올에 대하여 실시예 3과 동일한 방법으로 4회 반복 사용하여 효소의 재사용시 활성을 측정하여 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.
재사용 횟수 반응 1일 후 라세믹 알코올의 전환율(%) 키랄 에스테르의광학 순도(%) 입체선택성(Enantio-selectivity)
실시예 3 1회 37.5 99.3 524
2회 32.9 99.3 462
3회 34.4 99.5 이상 673 이상
4회 33.0 99.5 이상 651 이상
비교예 1 1회 27.2 98.3 167
2회 25.0 98.6 182
3회 16.4 98.9 219
4회 9.1 99.2 275
주) 광학순도: Enantiomeric Excess(ee), (R-S)/(R+S)
상기 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 천연 LPS(비교예 1)를 재사용하였을 때에는 활성이 크게 감소되었지만, 4회까지 재사용하여도 이온성 액체에 코팅된 LPS(실시예 3)를 재사용 했을 때에는 입체 선택성 및 활성이 감소되지 않았다.
본 발명의 이온성 액체로 코팅된 효소는 효소의 기능, 예를 들어 리파아제의 경우 이온성 액체로 코팅되면 입체 선택성과 안정성이 월등히 향상된다. 또한 이온성 액체로 코팅된 효소는 재사용시에도 그 광학순도 특성, 입체 선택성, 활성이 감소되지 않는다. 상기 코팅된 효소는 키랄 농약, 의약, 천연 화합물 등의 합성에 필요한 키랄 중간체의 제조를 위한 촉매로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 이미다졸륨(Imidazolium), 피리디늄(Pyridinium), 피리다지늄(Pyridazinium), 피리미디늄(Pyrimidinium), 피라지늄(Pyrazinium), 피라졸륨(Pyrazolium), 티아졸륨(Thiazolium), 옥사졸륨(Oxazolium), 및 트리아졸륨(Triazolium)으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 이들의 치환된 화합물의 양이온과 비스(퍼플루오로에틸설포닐)이미드(N(C2F5SO2)2 -, Beti), 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드)(N(CF3SO2)2 -, Im), 트리스(트리플루오로메틸설포닐메타이드(C(CF3SO2)2 -), 트리플루오로메탄설폰이미드, 트리플루오로메틸설폰이미드, 트리플루오로메틸설포네이트, AsF6 -, ClO4 -, PF6 -, 및 BF4 - 으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유기 또는 무기 음이온을 포함하는, 상온에서 고체이고 녹는점보다 높은 온도에서는 액체로 존재하는 이온성 액체로 코팅되고,
    상기 이미다졸륨 양이온을 포함하는 이온성 액체는 하기 화학식 1을 가지는 것인 리파아제:
    [화학식 1]
    상기 식에서 X는 페닐기, 치환된 페닐기, 메타아크릴로일 에스테르(methacryloyl ester), OCOCH3, CO2CH3, 및 CN으로 이루어진 군에서 선택되고, Y는 BF4 또는 PF6이고, n은 2 내지 5의 정수임.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 리파아제는 슈도모나스 세파시아 리파아제(Pseudomonas cepacia lipase; LPS), 캔디다 안타크티카 리파아제(Candida antarctica lipase; CAL), 캔디다 루거사 리파아제(Candida rugosa lipase; CRL), 아스퍼질러스 니거 리파아제(Aspergillus niger lipase; ANL), 캔디다 실린드라시아(Candida cylindracea lipase; CCL), 무코 미헤이 리파아제(Mucor miehei lipase), 슈도모나스 플로레센스 리파아제(Pseudomonas fluorecens lipase; LAK), 리조퍼스 아리주스 리파아제(Rhizopus arrhizus lipase), 리조퍼스 니베우스 리파아제(Rhizopus niveus lipase), 허그 판그레스 리파아제(Hog pancreas lipase), 캔디다 리폴리티카 리파아제(Candida lipolytica lipase), 무코 자바니쿠스 리파아제(Mucor javanicus lipase), 페니실리움 로퀘포티 리파아제(Penicillium roqueforti lipase), 및 리조무코 미헤이 리파아제(Rhizomucor miehei lipase)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 코팅된 리파아제.
  9. 이미다졸륨(Imidazolium), 피리디늄(Pyridinium), 피리다지늄(Pyridazinium), 피리미디늄(Pyrimidinium), 피라지늄(Pyrazinium), 피라졸륨(Pyrazolium), 티아졸륨(Thiazolium), 옥사졸륨(Oxazolium), 및 트리아졸륨(Triazolium)으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 이들의 치환된 화합물의 양이온과 비스(퍼플루오로에틸설포닐)이미드(N(C2F5SO2)2 -, Beti), 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드)(N(CF3SO2)2 -, Im), 트리스(트리플루오로메틸설포닐메타이드(C(CF3SO2)2 -), 트리플루오로메탄설폰이미드, 트리플루오로메틸설폰이미드, 트리플루오로메틸설포네이트, AsF6 -, ClO4 -, PF6 -, 및 BF4 - 으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유기 또는 무기 음이온을 포함하는, 상온에서 고체이고 녹는점보다 높은 온도에서는 액체로 존재하는 이온성 액체를 녹는점보다 높은 온도로 녹인 후 효소와 혼합하고,
    혼합물을 냉각시켜 이온성 액체를 고체화시키는 공정을 포함하고,
    상기 이미다졸륨 양이온을 포함하는 이온성 액체는 하기 화학식 1을 가지는 것인 이온성 액체로 코팅된 효소의 제조방법:
    [화학식 1]
    상기 식에서 X는 페닐기, 치환된 페닐기, 메타아크릴로일 에스테르(methacryloyl ester), OCOCH3, CO2CH3, 및 CN으로 이루어진 군에서 선택되고, Y는 BF4 또는 PF6이고, n은 2 내지 5의 정수임.
  10. 삭제
  11. 제1항 또는 제8항에 따른 이온성 액체로 코팅된 효소를 이용하여 라세믹 화합물중 어느 하나의 에난소머와 선택적으로 반응시키는 공정을 포함하는 광학 순도가 우수한 광학 이성질체의 제조방법.
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