KR100483183B1

KR100483183B1 - 세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물 및 이를포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR100483183B1
Application number: KR10-2002-0016517A
Authority: KR
Inventors: 김철호; 문성권; 차병윤; 정태욱; 송은영; 김종대; 남유호
Original assignee: 김철호; 남유호
Priority date: 2002-03-26
Filing date: 2002-03-26
Publication date: 2005-04-14
Also published as: KR20030077690A

Abstract

본 발명은 번행초로부터 분리한 추출물에 관한 것으로서, 본 발명의 번행초 추출물은 항종양 활성, 간질환 예방, 치료 활성, 면역 증강 활성을 나타내어 종양, 간질환 등의 예방, 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물{Extracts of Herba Tetragoniae inhibiting apoptosis and pharmaceutical preparation including thereof}

본 발명은 세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

최근, 한방약제 중에 포함되어 있는 다당류의 약리활성을 이용한 암의 치료 및 예방이 중요시되고 있다. 예를 들어, 대나무잎에서 추출한 다당류는 사르코마-180(Sarcoma-180)이 이식된 생쥐의 복강암에 효과적인데[Ikekawa, T, et al., 1968. Gann. 59:155-157.], 이러한 종양억제 약리활성은 간접적인 숙주를 매개로 한 면역증강 효과에 기인하며, 특히 담자균류 세포벽에 존재하는 다당류의 활성이 중요한 것으로 알려져 있다[ Hamuro J, Chihara G. 1973. Nature. 1973 245:40-41., Maeda, Y. and Chihara, G., 1971. Nature 229: 634-635., Komatsu N, Egawa K, Megumo N. 1973. Jpn J Antibiot. 26:61-67., Kim HM, et al., 1996. Int J Immunopharmacol. 18:295-303.].

한방약제의 구성성분 중 다당류들이 갖는 또 다른 약리활성에는 면역증강, 항응고활성 및 소화기계 활성이 알려져 있다[Wagner H, 1989. Planta Med. 452-454., Puhlmann J, 1991., Phytochemistry. 30:1141-1145., Kiyohara H, 1996., Planta Med. 62:14-19., Sakurai MH, 1996. Planta Med. 62:341-346.]. 또한, 모자반(Sargassum fulvellum)의 알긴산, 사르가숨 젤미아뮴(Sargassum kjellmiamum)의 황화 갈락토퓨칸(sulfated galactofucan) 등은 숙주를 매개로 한 항종양활성을 가지고 있으며[Shimizu S, et al., 1988. Biochem. Biophys. Res. Comm. 150, 335-341.], 꼬시래기(Gracilaria verrucosa)의 다당류는 생쥐의 탐식활성을 증대시킨다 [Akimoto K, et al. 1990. Anal Biochem. 189:182-185.]. 또한, 약리활성을 나타내는 식물계 다당류 중 황화 다당류의 혈관 내 지방제거 활성과 항응고 (anticoagulant) 활성은 이미 알려진 바 있다[Hatanaka K, et al. 1987. J Med Chem. 30, 810-814.]. 다당류 중 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 펜토산 (pentosan), 폴리설페이트(polysulfate)[Erik De Clercq.1990. Trends Pharmacol Sci. 11:198-205.], 렌티난 설페이트(lentinan sulfate)[Hatanaka K, et al. 1989. Jpn. J. Cancer Res. 80: 95-98], 리보퓨라난 설페이트(ribofuranan sulfate) [Hatanaka K, et al. 1991. Carbohydr Res. 214:147-154.], 퓨칸 설페이트(fucan sulfate)[Nishino T, et al. 1991. Thromb Res Suppl. 62:765-773.], 및 갈락탄 설페이트(galactan sulfate)[Nagumo T, et al., 1988. Kitasato Arch Exp Med.61: 59-67.]는 인체 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus)에 의해 유발된 세포독성에 효과를 나타내며, 특히 리보퓨라난 설페이트(ribofuranan sulfate)의 활성은 황화(sulfation) 정도에 의존한다. 이러한 약리활성을 가지는 식물계 다당류들은 숙주방어활성(host-defense activity)과 탐식세포(macrophage)활성을 촉진하므로써 면역증강(immuno-potentiating)과 항종양활성(antitumoral activity)을 나타내는 것으로 평가된다. 또한, 면역계 활성화와 항종양에 대하여 임상적으로 효과가 인정되는 약물은 소수에 불과하여 현재도 항종양에 유효한 약물 탐색이 많은 연구자에 의해 이루어지고 있다.

그런데, 최근 예정된 세포사(apoptosis)가 간염의 주요 원인으로 알려졌으며 그 기전은 Fas-FasL결합에 의한 간세포(hepatocyte) 파괴로 급성간염과 만성간염을 야기한다고 알려져 있다[Feldmann, G. 1997. J Hepatol. Suppl. J. Hepatol. 36: 1-11.]. 즉, 예정된 세포사멸은 종양괴사인자 수용체계 단백질인 Fas(또는 CD95, APO-1)가 그의 리간드인 FasL과 결합함으로써 전개되며[ Nagata,S. and Golstein, P. 1995. Science 267: 1449-1456.], 이로 인해 간염 또는 당뇨병이 발병한다[Chervonsky, A. V., et al. 1997. Cell 89: 17-24., Griffith, T.S., et al. 1995. Science 270: 1189-1192., Bellgrau D, et al. 1995. Nature 377: 630-632.].

따라서, Fas-FasL 매개에 의한 세포사 억제활성을 나타내는 물질은 간질환 치료제, 종양 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예상된다.

따라서, 본 발명은 천연 물질을 탐색하여 세포사멸 억제 활성을 나타내는 물질을 제공하려는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 간염 예방·치료제 및 당뇨병 예방·치료제로서 유용한, 천연 물질을 이용한 약제 조성물을 제공하려는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 면역증강 활성을 갖는 번행초 추출물을 함유한 건강보조식품의 제공을 목적으로 한다.

본 발명자는 우리나라 해안가에 집단으로 서식하며 한방약재로 사용되어 온 자생식물 번행초로부터 열수 추출물을 얻고, 이를 세분획 및 정제하여 그 활성을 검정함으로써 간세포의 세포사를 억제하는 활성을 나타냄을 확인하였다.

번행초(Herba Tetragoniae), Tetragonia tetragonioides (PALL.) O. KTZE는 청열 해독과 소화기계 종양에 효과적인 약재이다. 번행초는 한방약재로서 다른 약재와의 복합처방으로 청열해독에 주로 사용되어 왔으며 특히, 산부인과 질환과 관련한 염증질환 및 자궁경부암의 치료에 효과적임이 알려져 있다(허준, 동의보감). 그러나 번행초내 성분인 다당류에 간염억제 활성이 있는지에 대한 연구는 알려진 바가 없다.

본 발명자는 전통 천연생약인 번행초 추출물의 성분 및 그 활성을 연구하여 오던 중, 번행초의 추출물에 대한 B-임파구(lymphocyte) 자극활성과 탐식세포 자극활성과 같은 면역증강활성 및 항종양활성을 확인하였으며, 또한 본 발명에서는 번행초 추출 다당류가 간세포 세포사(apoptosis)에 있어서 간세포 염증의 원인인 Fas-FasL의 결합을 저해하고 FasL의 발현을 억제하는 효과를 가지고 있음을 최초로 확인하였다.

좀더 자세히는 첫째, 번행초의 간세포보호 활성은 D-갈락토오즈, D-만노오즈 및 D-아라비노스, 글루코오즈를 성분으로 하는 다당류를 포함하며, 번행초 열수추출물을 활성분획하여 간세포의 세포사 억제활성을 나타내는 분획 Fr.-2를 얻고, 원심분리된 침전물을 알칼리 추출하고, 다시 원심분리하여 그 상등액을 중화시킨 후 증류수로 투석하여 얻은 활성분획은 간세포의 세포사 억제활성이 강하였다(분획 Fr.-3).

둘째, 번행초 열수추출물을 원심분리하여 침전물을 알칼리 추출하고, 다시 원심분리한 다음 그 잔존하는 침전물을 알칼리 추출하고 다시 원심분리하여 그 상등액을 중화시킨 후 증류수로 투석하여 얻은 활성분획은 간세포의 세포사 억제활성이 강하였다(Fr.-5).

본 발명은 번행초의 생리활성물질을 탐색하고 한방 제제로서의 응용을 위하여 번행초 열수 추출물과 이 추출물로부터 분리한 8개 분획의 성분분석시, 주로 D-N-아세틸글루코사민, D-갈락토오즈, D-만노오즈, 그리고 D-글루코오즈를 주요성분으로 하는 다당류로 구성되었음을 밝혔다. 또한, 본 발명의 번행초 추출물 및 추출 분획 중 Fr.-2가 가장 높은 간세포사 억제 활성을 나타내었으며, 이를 에탄올에 대한 용해도에 따라 분획 Fr.-2-1 ~ Fr.-2-3으로 세분획화하였다. 본 발명자는 번행초 추출물 및 그의 분획 Fr.-2, Fr.-3, Fr.-5이 Fas-FasL 상호작용을 매개로 하는 간세포의 세포사를 억제함으로써, 간기능 장해, 알콜성 간염, 환경성 간염, 바이러스성 간염, 스트레스성 간염, 지방간 질환 등의 간기능 관련 질환에 효과적인 예방제 및/또는 치료제로 사용될 수 있음을 제시하였다.

따라서, 번행초 열수 추출물 및 번행초 추출 다당류는 간기능 관련 질환 예방 및/또는 치료제의 약학적 조성물로서 기능하며, 뿐만 아니라, Fas-FasL 상호작용을 매개로 하는 종양의 치료제 약학적 조성물로서 이용할 수 있다. 임상투여시에 경구 또는 비경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

번행초 추출 분획 및/또는 번행초 추출 다당류는 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 번행초 추출 다당류에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다. 번행초 추출물, 그 분획 및/또는 번행초 추출 다당류의 유효용량은 350∼600mg/kg이고, 바람직하기로는 200∼500mg/kg 이며, 하루 1~3회 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 번행초 열수 추출물 및 다당류 분획은 세포 사멸 억제 활성을 나타내므로 Fas-FasL 상호작용을 매개로 하는 종양의 치료제 조성물의 유효성분으로서, 건강보조식품으로도 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 세포사 억제 활성을 나타내는 주요 성분인 D-갈락토오즈, D-만노오즈, D-아라비노스 및 D-글루코오즈 등으로 이루어진 다당류는 열수 추출을 통하여 효과적으로 추출해낼 수 있으나, 열수 추출 이외에도 저급 알코올 등의 용매를 이용한 추출이 가능하다.

본 발명은 다당류의 구성당으로서 D-갈락토오즈, D-만노오즈, D-아라비노스 및 D-글루코오즈를 90중량% 이상 함유하며, 간세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 번행초 추출물이 번행초를 분쇄한 용액을 원심분리한 후 얻어진 침전물을 열수 추출하여 얻어진 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 번행초 추출물이 열수 추출 후 얻어진 상등액을 농축한 뒤 에탄올을 첨가하여 얻어지는 분획 Fr.-2인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 번행초 추출물이 열수 추출 후 얻어진 고체 침전물을 알칼리 추출하고, 재 원심분리한 후 얻어지는 상등액을 알칼리 추출하고, 중화한 후 투석하여 얻어지는 분획 Fr.-3인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 번행초 추출물이 열수 추출 후 얻어진 고체 침전물을 알칼리 추출하고, 재원심분리한 후 얻어지는 고체 침전물을 알칼리 추출한 후 원심분리하여 얻은 상등액을 중화하여 얻어지는 분획 Fr.-5인 것을 특징으로 한다.

나아가, 본 발명은 상기 세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물을 유효성분으로 함유하며, Fas-FasL 상호작용을 매개로 하는 간세포사에 의한 염증, 간기능 장해, 알콜성 간염, 환경성 간염, 바이러스성 간염, 스트레스성 간염, 지방간 질환 등의 간기능 관련 질환 예방·치료제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물을 유효성분으로 함유하는, Fas-FasL 관련 종양 치료제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 상기 세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 약학적 조성물에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강보조식품에 관한 것이다.

아래에서는 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 번행초의 열수추출, 유기용매를 이용한 분획, 크로마토그라피에 의한 정제

건조 번행초(동국바이오 건강식품) 500g을 세절하여, 50mM 생리식염수(PBS) (pH 7.2) 용액에서 분쇄한 뒤, 4℃, 15,000×g에서 30분간 원심분리하였다. 상등액을 클로로포름과 메탄올 혼합액(2:1 및 1:1)으로 여러번 탈지한 후 (탈지분획, 수득량 72 g), 15mM CaCl₂를 함유한 50mM 인산완충액(pH 7.2)에 용해시키고 프로테아제 K (Tritirachium album유래, Sigma사)로 37℃에서 48시간동안 효소 처리하여 단백질 부분을 제거하였다. 이를 다시 원심분리(15,000×g, 4℃, 30분)하여 상등액을 취하고, 상등액량의 3배의 에탄올을 첨가하고 침전시켜 다당류 분획 Fr.-1을 얻었다(16.7g).

최초의 원심분리에 의한 침전물은 120℃에서 20분씩 3회 열수추출하였다. 얻어진 추출물 상등액을 합쳐서 농축한 후 잔량의 4배의 에탄올을 첨가하여 수가용(water-soluble) 다당류 분획 Fr.-2 (17.2g)를 얻었다.

또한, 침전물은 미량의 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride)를 첨가하여 20℃에서 2시간동안 1M NaOH 용액으로 2회 반복추출하였다. 이를 원심분리 (15,000×g, 20℃, 30분)하여 상등액인 알칼리 추출물을 합치고 1M 초산으로 중화시킨 후 증류수로 투석하였다. 투석중 침전물로부터 분획 Fr.-3(3.8g)을 얻고, 수용 분획에 3배의 에탄올을 첨가하고 침전시켜 분획 Fr.-4(2.5g)를 얻었다.

한편 침전물은 2회에 거쳐 55℃에서 3시간동안 1M NaOH로 추출한 후 위와 같은 조건으로 원심분리하였다. 얻어진 상등액은 상기의 분획 Fr.-3과 분획 Fr.-4 처리와 같은 방법의 알칼리 추출과정을 거쳐 분획 Fr.-5와 분획 Fr.-6 (1.4g, 0.6g)을 얻었다.

실시예 2 : 분획 Fr.-2의 유기용매에 의한 세분획

간세포 사멸 억제 활성이 가장 강한 분획 Fr.-2 (17.2 g)로부터 활성 다당류를 더욱 정제하기 위하여 분획 Fr.-2 (17.2 g)를 500 ml의 증류수에 녹여 4배의 에탄올을 첨가하여 2일간 4℃에서 보존한 뒤, 생성된 침전물을 4℃, 5000 xg에서 한 시간동안 원심분리하였다. 얻어진 침전물을 물에 녹인 후, 80 % 에탄올로 3회간 침전반응을 반복하였다. 이렇게 얻은 상등액을 모아 동결건조하여 분획Fr.-2-1 (12.1 g)을 얻었다.

또한, 상기 침전반응에 의한 침전물은 100 ml의 증류수로 녹여 4 ℃에서 2일간 투석하였다. 이때 생성된 미세 침전물은 '와트만 GF/D 필터'로 제거하고 가용물질을 동결건조하여 분획 Fr.-2-2 (4.2 g)를 얻었다.

이를 다시 증류수에 녹인 후 60 % 에탄올을 첨가하여 30분간 4℃에서 10,000 ×g로 원심분리하여 상등액은 분획 Fr.-2-3 (Fr.-2-3, 2.2 g)으로, 침전물은 분획 Fr.-2-4 (2.1 g)로 하였다.

실시예 3 : Fas수용체(CD95, APO-1)-FasL 상호작용에 의한 간세포 세포사에 대한 번행초 추출물의 억제효과

간염억제 활성을 지금까지 간손상 유발방법이 아닌 세포사에 따른 간염유발에 대한 보호효과를 조사하기 위하여 아폽토시스(Apoptosis) 실험을 실시하였다. 즉, 번행초 추출물의 Fas 수용체(receptor)-FasL 매개에 의한 세포사의 억제 및 번행초 추출물의 간염치료효과를 확인하기 위하여, 생쥐의 초대 간세포(primary hepatocyte)를 분리 후 배양하였다(cm²당 2 x 10⁵). 또한 FasL을 발현하거나 발현하지 않는 NIH3T3 선유아세포 (cm²당 5 x 10⁵)를 공배양(coculture)하였다. 대조군으로는 Fas-FasL 결합에 의한 세포사의 핵심효소이자 카스파제(caspase) 저해제인 zVAD.fmk를, 카스파제-/-와 카스파제-3-는 대조 생쥐군으로 사용하였다[Kim CH. 1995. Appl. Environ. Microbiol. 61, 959-965 (1995).]. 간세포의 생존성은 3μM의 프로피디움 아이오다이드(PI)로 10분간 염색하여 현미경으로 관찰하였으며, 이때 정상적인 간세포의 형태는 PI-음성 생존세포로 구분하였다. 번행초 열수 조추출물을 50mg/15ml 농도로 첨가하여 FasL 발현-NIH3T3에 의한 세포사 감소와 간세포 생존능력을 검정하였다.

그 결과, FasL을 발현하는 선유아세포와 간세포를 공배양하였을 때 생쥐의 간세포가 24시간 내에 사멸하였으나, 대조군의 선유아세포와 같이 배양된 간세포는 대부분이 생존하였다. 더우기 간세포를 FasL을 발현하는 선유아세포와 동시에 배양하였을 때 일시적인 블렙(bleb) 형성이 시작되었으며 DNA 절단이 확인되었으나, 카스파제 저해제인 zVAD.fmk를 첨가하였을 때는 간세포의 사멸이 일어나지 않았다(표 1 참조). 이로부터 FasL이 간세포 세포사의 원인이며, zVAD.fmk에 의해서 저해되는 카스파제가 세포사에 관여하고 있음을 알 수 있다.

한편, 번행초 열수 조추출물을 50mg/15ml 농도로 첨가시, FasL 발현-NIH3T3에 의한 세포사를 약 40%이상 감소시켜 간세포 생존능력이 향상되었다. 이러한 결과는 선유아세포가 생성하는 FasL에 의한 간세포의 Fas 수용체 결합을 번행초 추출 다당류가 방해 내지 저해함으로서 Fas 수용체에 세포사의 신호가 전달되는 것이 차단되기 때문으로 보인다(표 1). 또한 번행초 추출물의 보호효과는 야생형 간세포보다는 카스파제-3이 결손된 생쥐에서 분리된 간세포에서 좀더 효과적임이 확인되어 Fas-FasL에 의한 세포사는 주로 카스파제-3를 매개하고 있음을 확인하였다(표 2).

한편, 추출물의 각종 분획들에 대하여 선유아세포와 24시간 공배양시 간세포의 세포사에 대한 억제 효과(PI-음성 세포)를 검정한 결과, 조추출물 이외에 분획 Fr.-2, Fr.-3 및 Fr.-5에서 강한 억제효과를 보였으나, 그 밖의 다른 분획에는 활성이 존재하지 않음을 확인하였다(표 3).

실시예 4 : 번행초 추출물의 분획과 화학적 조성 분석

총당(total sugar)의 정량은 페놀-황산법을 사용하였으며, 환원당은 밀러 방법[Miller, G. L. 1959. Anal. Chem. 31, 426-428.]을 사용하였고 표준물질로는 포도당을 사용하였다.

단백질 정량은 소혈청 알부민(BSA)을 표준으로하여 브래드포드 법[Bradford, M. 1976. Anal. Biochem. 72, 248-254.]으로 하였으며, 다당류의 가수분해는 2M 황산으로 100℃ 에서 6시간동안 스크루캡 바이알에서 수행하였다. 가수분해 후 바륨 카보네이트(BaCO₃)로 중화시키고 엠버라이트 (Amberite) IR-120 (H⁺ form)컬럼에서 분리하였다.

갈락토퓨라노실(galactofuranosyl) 잔기를 제거하기 위한 다당류의 부분 가수분해는 25mM 황산(10㎖)으로 100℃에서 4시간동안 수행하였으며, 이때 0.5M NaOH로 중화하고 증류수로 투석하였다.

당 조성과 정량분석을 위한 가스 크로마토그라피(GC)는 히타치(Hitachi) 가스 크로마토그라피 모델 163을 중성당 분석에 사용하였다.

다당류의 분자량 결정은 0.1 M NaOH 용매에서 세파로우즈(Sepharose) CL-6B 컬럼(3.0 x 100 cm, Bio-Rad Co.)을 사용하여, 유속 12.5 ㎖/h로 하였으며 이때, 분자량 마커로서 풀루란(5×10³-2×10⁵, Hayashibara Biochemicals Lab. Inc., Okayama, Japan)과 덱스트란(2×10⁴-2×10⁶, Sigma Co.)을 분자량 표준물질로써 사용하였다.

분리 추출물의 화학적 특성을 조사하기 위하여 총당 정량과 환원당 정량, 단백질 정량, 다당류의 가수분해, 중성당 분석 및 다당류의 분자량 결정을 수행한 결과 조추출물의 구성성분 중 대부분이 당류(97.3%)이며, 미량의 단백질과 황이 포함되어 있음을 알 수 있었다(표 4, 표 5). 이러한 결과로부터, 번행초 추출물에 존재하는 황에 의한 항HBV제, 항HCV제로서의 기능도 예상된다. 또한, GC로 분석한 중성당은 D-갈락토오즈, D-만노오즈 및 D-아라비노스와 많은 양의 D-글루코오즈로 구성되었다. 또한 펠링용액으로 처리하여도 불용성의 커퍼-하이드록사이드(copper-hydroxide) 복합체를 형성하지 않는 것으로 보아, 번행초 조추출물에는 만노오즈 성분은 많으나 만난(mannan)은 없음을 알 수 있다.

실시예 5 : 약제의 독성 및 간세포의 혈중누출효소에 미치는 영향

상기 번행초 열수 추출물을 임상적으로 사용하려면 독성이 없어야 하므로, 독성검사와 간세포계 효소에 미치는 영향을 검토하였다. 약물의 독성검사와 간세포계 효소(GOP, GPT, ALP)에 미치는 영향은 무처리군의 정상랫트(1군 5마리)에 대한 열수추출 다당류의 복강내 투여시의 치사량을 구하였으며, 5일동안 투여하여 독성을 검사하였다. 또한 복강내 투여 24시간 후의 S-GOT, S-GPT, S-Alp활성을 측정하였다.

무처리군의 정상랫트(1군 5마리)에 대한 열수추출 다당류의 복강내 투여시의 치사량을 구하고자 하였으나, 5일동안 950 mg/kg이하 투여시에 사망을 일으키지 않았다. 또한 950mg/kg을 복강내 투여시, 24시간 후의 S-GOT(표 6), S-GPT(표 7), S-Alp(표 8)에 어떠한 영향도 미치지 않았다.

번행초를 세절, 분쇄한 뒤 열수 추출한 활성 물질은 D-갈락토오즈, D-만노오즈 및 D-아라비노스와 많은 양의 D-글루코오즈로 구성되었으며, 간세포의 세포사 억제활성을 갖는 번행초 추출물 분획 Fr.-2와 분획 Fr.-3은 알칼리추출, 원심분리, 중화, 투석으로 얻었다.

간세포의 세포사 억제활성을 갖는 번행초 분획 Fr.-5는 번행초 열수 추출물을 원심분리, 고체물의 알칼리 추출, 고체물의 알칼리 추출, 고체물의 재원심분리, 상등액의 증류수 투석, 유기용매 침전으로 얻었다.

상기 본 발명의 번행초 추출물 및 각 분획은 Fas-FasL 상호작용을 매개로 하는 간세포사에 의한 염증, 간기능장해, 알콜성 간염, 환경성 간염, 바이러스성 간염, 스트레스성 간염, 지방간 질환에 효과적인 약학적 조성물이다.

도 1은 번행초 추출물의 분획 과정을 나타낸 것이다.

Claims

다당류의 구성당으로서 D-갈락토오즈, D-만노오즈, D-아라비노스 및 D-글루코오즈를 90중량% 이상 함유하며, 간세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물.
제1항에 있어서, 상기 번행초 추출물은 번행초를 분쇄한 용액을 원심분리한 후 얻어진 침전물을 열수 추출하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 간세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물.
제2항에 있어서, 상기 번행초 추출물은 열수 추출 후 얻어진 상등액을 농축한 뒤 에탄올을 첨가하여 얻어지는 것을 특징으로 하는, 간세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물.
제2항에 있어서, 상기 번행초 추출물은 열수 추출 후 얻어진 고체 침전물을 알칼리 추출하고, 재 원심분리한 후 얻어지는 상등액을 알칼리 추출하고, 중화한 후 투석하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 간세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물.
제2항에 있어서, 상기 번행초 추출물은 열수 추출 후 얻어진 고체 침전물을 알칼리 추출하고, 재원심분리한 후 얻어지는 고체 침전물을 알칼리 추출한 후 원심분리하여 얻은 상등액을 중화하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 간세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 열수 추출물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 간세포사멸 억제 활성을 갖는 번행초 추출물을 유효성분으로 함유하는 간염 예방·치료제용 약학적 조성물.
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