KR100473886B1 - 동충하초로부터 생산되는 적색색소 및 그 제조방법 - Google Patents

동충하초로부터 생산되는 적색색소 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동충하초로부터 생산되는 적색색소 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 이나큐럼 에이지(inoculum age) 3일, 온도 25℃, 초기 pH 6.0, 탄소원으로서 가용성 녹말 1.5%(w/v), 질소원으로서 육류 펩톤 1.5%(w/v)을 조건으로 배양되는 동충하초로부터 생산되는 적색색소 및 그 제조방법에 관한 것으로 음식물, 화장품, 약품제조에 사용될 수 있는 안정성이 우수한 뛰어난 효과가 있다.

Description

동충하초로부터 생산되는 적색색소 및 그 제조방법{Red Pigment by Submerged Culture of Paecilomyces Sinclairii and Method for Preparing the Same}
본 발명은 동충하초로부터 생산되는 적색색소 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 이나큐럼 에이지(inoculum age) 3일, 온도 25℃, 초기 pH 6.0, 탄소원으로서 가용성 녹말 1.5%(w/v), 질소원으로서 육류 펩톤 1.5%(w/v)을 조건으로 배양되는 동충하초로부터 생산되는 적색색소 및 그 제조방법에 관한 것이다.
음식물, 화장품, 약품제조에 널리 사용되는 많은 종류의 인공 합성 색소의 안정성 때문에 자연물로부터의 색소를 생산할 수 있는 방법이 연구되어 오고 있다. 여러종류의 식물, 동물 및 미생물이 색소를 생산하는 것은 이미 알려져 있다. 여러 종류의 자연색소가 있지만, 식물으로부터 추출되기 때문에 공업용으로 유용한 충분한 양은 단지 몇 종류만이 가능하다. 그러므로, 미생물로부터 자연색소를 생산하는 것이 유익하다. 고수율로 색소를 생산할 수 있는 미생물로는 모나스커스(Monascus), 세라티아(Serratia) 및 스트렙토마이스(Streptomyces)과 같은 몇 종류가 있다. 이들 중에서도 모나스커스(Monascus)의 많은 종은 고화학적 안정성을 나타내는 다양한 색소를 생산하는 능력을 갖기 때문에 많은 관심이 기울여지고 있다. 모나스커스(Monascus) 속의 여러 종류에 의한 고체상태 배양체에서 생산되는 적색색소는 전통적으로 다수의 발효음식을 착색하고 보관하기 위하여 여러 아시아 국가에서 사용되어져 왔다. 더군다나, pH와 온도와 관련된 요법특성 및 비교적 높은 안정성은 합성 착색제의 대체물로서 선호되는 관심있는 특성이다. 복합 매개체에 침수되어 고체상태 배양체에 의한 모나스커스(Monascus) 생산이 연구되었다. 마이크로바이알(microbial) 색소, 고수율 색소생산 및 화학적 광학적 안정성을 위해 가능한 공업적 응용에 대한 연구가 요구된다. 생체활성 화합물의 생산을 위한 여러 종류의 식용 버섯의 침수배양 동안에, 본 발명자는 여러 종류의 식용버섯이 비교적 고수율의 색소를 생산할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었다. 특히, 본 발명자의 선행조사에 따르면, 동충하초로부터의 적색 색소 생성은 자연광에서 극히 안정(30 일 이상)하였으며, 이는 자연색소의 단점 중의 하나이다.
침수배양에서 색소 생산은 여러 환경적 인자, 특히 질소원 및 매개체 pH의 본질에 의하여 영향을 받는다는 다수의 보고가 있다. 같은 종의 다른 연구 특히 의약버섯 연구에서 색소에 대한 보고는 없다.
본 발명에서 동충하초에 의한 적색색소의 생산을 위한 적정 배양조건은 진동 플라스크 및 배치(batch) 발효기에서 조사되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 자연물로부터의 색소를 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 동충하초에 의한 적색색소의 생산을 위한 적정 배양조건을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 이나큐럼 에이지(inoculum age) 3일, 온도 25℃, 초기 pH 6.0, 탄소원으로서 가용성 녹말 1.5%(w/v), 질소원으로서 육류 펩톤 1.5%(w/v)을 조건으로 배양되는 동충하초로부터 생산되는 적색색소 및 그 제조방법를 제공함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
본 발명은 동충하초로부터 생산되는 적색색소 및 그 제조방법에 관한 것이다.
식용버섯의 침지배양을 이용하여 높은 색소 생성 균류 파실로미세스(Paecilomyces) 신클라이리(P. sinclairii)가 선택되어 이의 적정 배양조건을 조사하였다. 적정 배양조건은 이나큐럼 에이지(inoculum age) 3일, 온도 25℃, 초기 pH 6.0, 탄소원 1.5%(w/v) 가용성 녹말, 질소원 1.5%(w/v) 육류 펩톤이다. 비록 배양배지에 10mM CaCl2의 추가는 색소생성을 약간 증가시키지만, 대부분의 검토된 바이오-구성성분은 색소생성에 결정적인 효과가 없다. 플라스크 배양기에서 얻어진 적정조건 하에서, 9배의 색소생성(4.4 g/ℓ)이 5ℓ베치 발효기를 사용하여 달성되었다. 동충하초는 배양배지 내에 수용성 적색색소를 분비하였다. 색소 색상은 pH 3-4 적색, pH 5-9 보라색, pH 10-12 분홍색과 같이 용액의 pH에 강하게 의존한다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 미생물 및 배양 매개체
동충하초는 한국에 산간지역으로부터 채취되어 실험실에서 배양수집하였다. 축적된 배양체는 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar, PDA)에 보관하였다. 슬란트(slants)는 7일 동안 25℃에서 접종, 배양되어 4℃에서 배양되었다. 접종 배양배지는 증류수 1ℓ에 3g 효모 추출물, 3g 맥아 추출물, 5g 펩톤(peptone), 10g 글루코스(glucose)가 함유된 효모 맥아 추출물(YME)이다. 기본배지는 증류수 1ℓ에 20g 글루코스(glucose), 2g 효모 추출물, 2g 펩톤(peptone), 0.5g MgSO4·7H2O, 0.46g KH2PO4, 1g K2HPO4가 함유된 버섯 배양 배지(MCM)이다.
실시예 2: 배양조건
동충하초는 페트리디쉬(petridish)상의 PDA 배지에서 성장되어, 무균처리된 커터로 아가 플레이트(agar plate) 배양을 5mm 로 잘라 종균 배양 배지로 전달되었다. 종균배양은 2일 동안 150 rpm으로 로터리 쉐이커(rotary shaker)에서 25℃에서 종균 배양 배지의 50㎖ 를 포함하는 250㎖ 플라스크에서 성장시켰다. 발효는 3일 동안 150rpm으로 로터리 쉐이커에서 25℃에서 기본배지 50㎖를 포함하는 250㎖ 플라스크, 및 7.5일 동안 온도 25℃, 에어레이션(aeration) 율 2vvm, 교반속도 150 rpm, 초기 pH 6.0 조건 하에서 2%(v/v) 종균배양으로 접종후에 배양배지의 3ℓ를 포함하는 5ℓ발효기에서 실행하였다. 모든 실험은 확실한 반복 재생산성을 학인하기 위하여 적어도 2번 실시하였다.
실시예 3: 적색색소의 분리
적색색소는 2N HCl로 pH 3.0으로 조절한 동충하초 종균 배양 여과액(1ℓ)으로부터 에틸아세테이트(1ℓ)로 성공적으로 추출하고, 상기 에틸아세테이트 추출물을 50℃ 진공상태에서 증발시켰다. 상기 건조된 색소는 증류수(200 ㎖)에 용해시켜 와트맨(Whatman) 여과지로 여과하였다. 상기 여과된 수용성 색소는 50℃에서 건조하여 무수에탄올 200 ㎖로 용해시켜 여과하였다. 적색 색소를 포함하는 상기 여과액을 클로로포름/n-헵탄(1:2, v/v) 600㎖를 첨가하여 결정화시켜 50℃에서 건조시켰다.
실시예 4: 분석방법
배양액을 20분 동안 10,000 ×g에서 원심분리하였다. 상층액은 와트맨(Whatman) 여과지(No. 2)로 여과하였다. 미세리얼 생물량 수율은 탈이온수로 세척하여 측정하고, 48시간 동안 50℃에서 건조하였다. 적색색소의 농도는 500nm(Bio-Tek Kontron Uvikon Spectrophotometer, Italy)에서의 배양 여과액의 흡수도를 측정하여 측정하였다. 잔여 당의 농도는 굴절률 검색기(Shimadzu Co., Kyoto, Japan)이 장착된 Aminex HPX-42C column(0.78 ×30㎝, Bio-rad)을 사용한 액체크로마토그래피에 의하여 분석되었다.
실시예 5: 적색색소의 특징
색소의 흡수도는 400, 470, 500 nm에서 측정되었다. 이들 파장은 각각 노랑색, 오렌지색, 적색 색소에 대한 최대 흡수를 나타내는 것이다. 본 발명의 분리된 색소는 적색 색소를 가리키는 500nm에서 유일한 빛흡수 특징을 나타내었다. 더군다나, 분리된 색소의 색은 수용액의 pH의 변화에 따라 변하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
pH 색소 색 최대 흡수파장(nm)
3.0∼4.0 적색 500,507
5.0∼7.0 보라색 522, 526, 529
8.0∼9.0 엷은 보라색 536, 537
10.0∼12.0 엷은 분홍색 540, 541, 542
수용액의 pH가 알카라인 영역으로 이동하는 것과 같이, 최대 흡수파장은 알카라인 용액, 엷은 보라색(537-540nm); 중성용액, 보라색(529-536nm); 산성용액, 적색(500-507nm)과 같은 색의 변화와 연관되어 증가하였다. 비슷한 관찰이 pH 4∼6에서 색이 가장 선명하고, 높은 pH에서는 거의 무색이라는 점에서 음식 착색제로서 널리 사용되는 안토시아닌(anthocyanins)의 색소에서 관찰되었다.
실시예 6: 적색색소 생성에 탄소와 질소원의 영향
적색색소 생성을 위한 적절한 탄소원을 선택하기 위하여, 동충하초는 여러 종류의 탄소원(2%)를 포함하는 기본배지에서 배양되었다. 검토된 11개의 탄소원 중에서, 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 마노스(mannose), 수크로스(sucrose) 및 말토스(maltose)는 비교적 동충하초의 균사성장에 적절하였다. 반면에 색소생성은 낮았다. 최대 균사성장(3.9 g/ℓ)은 수크로스(sucrose) 배지에서 얻었다. 반면에 최대 색소 생산(467 ㎎/ℓ)은 수용성 녹말배지에서 얻었다. 동충하초에서의 균사성장 및 색소생성에 탄소원의 영향에 대하여 표 2에 나타내었다.
탄소원(2%, w/v) 세포건조 무게(g/ℓ) 색소(㎎/ℓ) 최종 pH
글루코스 3.5 334 4.12
프록토스 3.1 315 4.53
갈락토스 2.2 239 5.02
크실로오스 1.6 229 4.86
아라비노스 1.9 280 5.52
마노스 3.2 199 4.24
락토스 1.8 298 5.51
수크로스 3.9 250 4.09
말토스 3.4 155 4.25
수용성 녹말 3.6 467 4.25
글리세롤 2.7 387 4.24
색소형성에서 질소원의 자극효과는 보고되었다. 본 발명에서 유기 질소원은 무기 질소원과 비교하여 보다 높은 균사성장을 나타내었다. 육류 펩톤, 카세인 펩톤, 펩톤-효모 추출 혼합물 및 콘 스팁(corn steep) 분말은 색소생성에 있어서 긍정효과를 갖는 반면에, 간장 펩톤 및 맥아 추출물은 적색색소 합성을 강하게 억제하였다. 검사된 모든 질소원 중에서, 고기 펩톤이 적색색소 생성에서 있어서 가장 높은 수율을 나타었다. 동충하초에서의 균사성장 및 색소생성에 탄소원의 영향에 대하여 표 3에 나타내었다.
질소원(0.4%, w/v) 세포건조 무게(g/ℓ) 색소(㎎/ℓ) 최종 pH
펩톤-효모 추출물(1:1) 3.8 357 4.27
육류 펩톤 2.8 428 4.30
효모 추출물 3.1 235 4.36
맥아 추출물 1.8 14 4.55
육류 추출물 1.6 244 4.15
박토 펩톤 1.5 157 4.28
간장 펩톤 2.0 20 4.58
카세인 펩톤 2.9 366 4.05
폴리펩톤 2.8 190 4.38
박토 트립톤 3.3 295 4.24
말톤 3.7 273 4.37
콘 스팁 분말 3.4 342 4.20
(NH4)2SO4 1.4 nd* 3.36
NaNO3 1.2 nd 6.09
KNO3 1.2 nd 6.05
NH4NO3 1.4 nd 5.12
여러 종류의 펩톤이 많은 종류의 색소-생산 균류에서 더 많은 색소생산을 공급하였다.
실시예 7: 적색색소 생성에서 C/N 비율의 영향
비록 C/N 비율이 많은 대사산물의 생합성 율에 영향을 미치지만, 균류에서의 균사성장 및 색소생성 상에 영향은 드물게 설명되고 있다. 색소생성에의 C/N 비율의 영향은 수용성 녹말-육류 펩톤배지를 사용하여 조사하였다. 동충하초에서의 균사성장 및 색소생성에 C/N 비율의 영향에 대하여 하기 표 4에 나타내었다. 표 4에 나타난 바와 같이, 균사성장(6.2 g/ℓ) 및 색소생성(1881 ㎎/ℓ)은 C/N 비율 1:1에서 최대수치를 나타내었다. 1:1보다 더 높거나 낮은 C/N 비율의 증가는 적색색소의 감소를 일으켰다. 이 결과는 분홍색 색소 카로티노이드 함량이 C/N 비율 증가에 따라 감소된다는 남과 리(1991)의 보고와 비교된다.
육류펩톤(%, w/v) 수용성 녹말(%, w/v)
0.5 1 1.5 2 2.5
0.5(최종 pH) *735/2.4(4.13) 717/3.9(4.2) 562/2.9(4.44) 632/2.7(4.35) 667/3.3(4.31)
1 1209/5.3(4.59) 1256/4.0(4.37) 1214/4.5(4.63) 1107/3.3(4.45) 923/3.8(4.48)
1.5 1188/2.4(4.69) 1819/4.2(4.40) 1881/6.2(4.42) 1247/2.3(4.64) 1394/2.4(4.55)
2 425/1.7(5.42) 464/2.3(5.55) 827/1.8(5.15) 227/0.8(5.27) 387/2.6(5.51)
2.5 223/0.4(5.33) 233/0.2(5.32) 250/0.9(5.32) 249/0.3(5.27) 250/1(5.17)
실시예 8: 적색색소 생성에서 바이오-구성요소의 영향
바이오-구성요소는 여러 미생물에서의 색소생성에 영향을 주는 중요한 인자 중에 하나이다. 더군다나, 중요한 발견은 색소와 철 이온사이에 상호작용이 존재한다는 것이 보고되었다. 균사성장 및 색소생성에서의 바이오-구성요소의 효과를 조사하기 위하여, 동충하초는 상기 최적화 배양 배지에서 배양되었다. 각 추적자는 1 mM의 농도수치에서 배지를 배양하기 위하여 첨가되었다. 최대 색소생성(1528 ㎎/ℓ)은 염화칼슘이 보충되었을 때 성취되었다. 상기 염화칼슘의 최적 농도는 10 mM이었다. 다른 바이오-구성요소는 균사성장 및 색소생성 둘다에 결정적인 영향은 없는 것으로 나타났다. 동충하초에서의 균사성장 및 색소생성에 바이오-구성요소의 영향에 대하여 하기 표 5에 나타내었다. 바우 및 왕(Bau and Wong)(1979)은 모나스커스(Monascus) 색소생성에서 아연 이온의 결정적 영향을 보고하였다. 적색색소 생성에의 철 이온 및 코발트 이온의 부정적 효과는 세포내에서 에너지 생성에 대하여 대사산물의 간접적 기여에 의하여 설명될 수 있다. 안(An)외(2001) 의 관찰에 따르면, 철은 에스탁산틴 생성 및 피. 로도지마(P. rhodozyma) 내에서의 조성을 감소시켰다.
철이온(1mM) 세포건조 무게(g/ℓ) 색소(mg/ℓ) 최종 pH
- 2.2 1498 4.45
Ca2+ 3.9 1528 4.42
Mg2+ 2.0 1378 4.49
Fe2+ 0.02 279 5.05
Cu2+ 1.4 806 5.36
Zn2+ 2.8 312 4.73
Mn2+ 2.4 806 4.41
Co2+ 1.0 188 5.39
K+ 2.4 1287 4.53
Na+ 3.0 1483 4.49
실시예 9: 적색색소 생성에서 pH 및 온도의 영향
균사성장 및 색소생성에서의 pH의 영향을 조사하기 위하여, 동충하초는 플라스크 배양기에서 다른 초기 pH 3.0 ∼10.0로 배양하였다. 균사성장 및 색소생성 둘 다를 위한 적정 초기 pH는 6.0에서 관찰되었다. 여러 종류의 균류는 색소생성을 위한 침지 배양 동안에 최적의 pH를 갖는다. 균사성장 및 색소생성을 위한 적정 온도를 찾기 위하여, 동충하초는 여러 온도(15∼35℃) 하에서 배양되었다. 결과적으로 균사성장 및 색소생성 둘 다를 위한 적정온도는 25℃ 이었다. 균사는 항상 감염위험에 노출되는 침수배양을 위해 장기간이 요구되기 때문에, 적정온도는 동충하초의 적절한 생리학적 특성으로 간주된다.
실시예 10: 적색색소 생성에서 이나큐럼 에이지(inoculum age)의 영향
여러 균류의 생리학적 특성중에서 이나큐럼 에이지는 균류 개발에 중요한 역할을 한다. 색소생성에서 이나큐럼 에이지의 영향을 조사하기 위하여, 동충하초는 플라스크 배양기에서 25℃에서 2 내지 6일 동안 다른 이나큐럼 에이지를 사용하여 최적 배지를 배양하였다. 색소생성을 위한 적정 이나큐럼 에이지는 3일이고, 이나큐럼 에이지의 증가는 균사성장의 감소시켰다. 유사한 결과가 본 발명자의 바이오 고분자 생성을 위한 페실로미세스 자포니카의 침수배양에서 관찰되었다.
실시예 11: 베치 바이오반응기에서 적색색소 생성
적색색소는 발효를 통하여 생성되었고, 7일 째에 4.4 g/ℓ의 농도에 도달하였고, 반면에 균사성장은 최대 17.2 g/ℓ에 도달하였다. 미생물 성장은 당 농도의 고갈에서 처음 6일 동안 급속히 증가하였고, 천천히 정체기에 도달하였다. 발효가 진행됨에 따라, 발효 브로스(broth)의 초기 pH는 천천히 6에서 4로 떨어지고, 그 후에 pH 6으로 회복된다. 잔여 당 농도는 5일 까지 급격히 감소되었고, 초기 탄소원은 거의 소비되었다. 색소의 향상된 생성은 훼드-베치(fed-batch) 배양 모드를 이용하여 탄소원의 고갈을 극복함으로써 가능한듯이 보인다. 관찰결과는 동충하초에서의 색소생성은 성장과 관련됨을 보여준다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 음식물, 화장품, 약품제조에 사용될 수 있는 자연색소를 미생물로부터 생산할 수 있는 방법을 제공함으로써 인공 합성 색소에서 문제시 되는 안정성을 획기적으로 개선한 염료 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 2N HCl을 이용하여 pH 3.0으로 조절한 동충하초 종균 배양 여과액(1ℓ)을 에틸아세테이트(1ℓ)로 추출하고, 상기 에틸아세테이트 추출물을 50℃ 진공상태에서 증발시킨 후 그 건조물을 증류수(200 ㎖)에 용해시켜 와트맨(Whatman) 여과지로 여과하고, 상기 여과물을 50℃에서 건조하여 무수에탄올 200 ㎖로 용해시켜 여과하여, 상기 적색 색소를 포함하는 여과액을 클로로포름/n-헵탄(1:2, v/v) 600㎖를 첨가하여 결정화시켜 50℃에서 건조시키는 것을 특징으로 하는 동충하초로부터 생산되는 적색색소 제조방법.
  2. 제1항의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 적색색소.
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