KR100462287B1

KR100462287B1 - 혈장 중의 비타민 이 검출 방법

Info

Publication number: KR100462287B1
Application number: KR10-2002-0012980A
Authority: KR
Inventors: 정봉철; 정병화
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2002-03-11
Filing date: 2002-03-11
Publication date: 2004-12-17
Also published as: KR20030073428A

Abstract

본 발명은 혈장 중에 함유된 비타민 E(vitamin E)의 검출법에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 검출 방법은, 혈장에 0.075 내지 0.2M의 염을 함유한 pH 4.0 내지 5.5의 완충액을 처리하는 단계; 및 상기 처리된 혈장으로부터 디에틸에테르를 사용하여 비타민 E를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명을 이용하면, 혈장으로부터 비타민 E를 효과적으로 추출할 수 있으며, 고성능 액체 크로마토그래피/자외선 흡광기에 대하여 선택적이고 우수한 감도를 가지는 최적의 분석조건을 제공할 수 있다. 따라서 본 발명을 이용할 경우 분석 감도의 확보, 정확성, 재현성, 분석의 신속성 및 간편성, 저비용 등을 만족시킬 수 있다. 이로 인해 특히 가축의 경우 비타민 E의 결핍시 유발될 수 있는 신경계의 궤양 및 생식계의 이상으로 인한 불임 등을 예방하기 위하여 사료에 첨가되는 필수적인 영양소인 비타민 E의 혈장 내 농도를 지속적으로 모니터링을 함으로써 이러한 질환을 예방할 수 있고, 또한 사료에 비타민 E를 첨가함에 있어서 그 적정량을 결정하는데 혈장의 농도를 지표로 이용하는 등 여러 관점으로 응용될 수 있다.

Description

혈장 중의 비타민 이 검출 방법 {Determination method for vitamin E in plasma}

본 발명은 혈장 중에 존재하는 비타민 E의 검출법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 분석하고자 하는 혈장에 적절한 양의 염을 가하여 유기용매로 추출하는 염석법 (salting out)을 이용하고, 추출시 회수율을 최대한으로 유지시킬 수 있는 완충용액을 선정하여 유기용매로 추출하고 이를 직접 고성능 액체 크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography)/자외선 흡광기 (Ultraviolet absorbance detector)로 분석함으로써, 혈장에 미량으로 존재하는 비타민 E를 모니터링 함에 있어서 우수한 분석감도를 확보하고 분석시간을 단축함과 동시에 간편하고 경제적이고 효과적인 혈장 중의 비타민 E의 검출법에 관한 것이다.

분석하고자 하는 비타민 E는 특히 가축에 있어서 중요한 영양 성분으로서, 많은 경우 사료에 첨가되는데, 이는 자유 라디칼(free radical)을 형성시키는 금속이나 화합물을 방어하여 산화방지제로 작용하며 [Am. J. Clin. Nutr., 34, 289-295 (1981)], 비타민 E가 적절한 양으로 공급되지 못하였을 때에는 신경병리학적 병변, 생식기의 이상으로 인한 비가역적인 불임, 근육의 궤사를 일으키는 물질로 알려져 있어 비타민 E의 혈중 농도가 적절한 범위에 있는지 지속적으로 모니터링하는 것은 가축의 사육에 있어서 매우 중요한 일이다.

지금까지 보고되어 있는 혈장 중 비타민 E의 분석법은 먼저 혈장에 존재하는 단백질을 제거하는 과정인 제단백과정을 거친 후 유기용매로 추출하고 추출된 비타민 E를 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하는 방법이 대부분이었다. 제단백과정을 거치는 이유는 비타민 E를 유기용매로 추출할 경우 유기용매와 혈장 단백질이 서로 작용하여 에멀젼(emulsion)을 형성하게 되므로 이를 방지하여야 하기 때문이다. 그런데, 이 때 주로 아세토나이트릴이나 메탄올과 같은 유기용매를 사용한다. 그러나 아세토나이트릴을 사용하였을 때에는 제단백과정 중에 비타민 E의 회수율이현저하게 낮아지며 [J. Chromatogr. B, 732, 227-231 (1999)], 메탄올을 사용하였을 때에는 비교적 많은 양의 메탄올을 사용하여야 하므로 결과적으로 시료가 희석되어 분석의 감도가 떨어지는 문제점이 있었다 [J. Pharm. Pharmacol. 36, 461-464 (1984)].

따라서 위와 같은 제단백 과정을 거치지 않으면서도, 신속하고 경제적이며 높은 분석감도를 확보할 수 있는 안정적인 검출법의 개발이 요구되고 있었다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에 의한 혈장 중의 비타민 E 검출 방법의 목적은, 제단백과정으로 인한 추출율의 저하를 해결하고 이러한 부적절한 과정을 거침으로서 낭비되는 분석시간을 줄여 분석 시간의 단축, 절차의 간소화, 및 비용 절감이 이루어지도록 함과 동시에, 액체크로마토그래피 상에서 비타민 E의 피크와 분리가 되지 않는 혈장성분을 제거하여 혈장성분과 완전히 분리된 비타민 E의 피크를 얻음으로써 보다 정확하고 고감도인 검출 방법을 제공하고자 하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 검출 방법에서 pH가 다른 여러 완충액을 사용하였을 때의 회수율의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명에 따른 검출 방법에서 완충액에 첨가한 NaCl의 농도변화에 따른 회수율을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 검출방법으로부터 추출된 비타민 E를 고성능 액체 크로마토그래피/자외선흡광기로 분석한 크로마토그램을 나타낸 것이다. A는 블랭크(blank) 혈장이고 B는 비타민 E 함유 사료를 먹인 후 42일째 채취한 돼지의 혈장이다.

도 4는 본 발명에서 얻은 정량을 위한 검량곡선이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 혈장 중의 비타민 E 검출방법은, 혈장에 0.075 내지 0.2M의 NaCl을 함유한 pH 4.0 내지 5.5의 완충액을 처리하는 단계; 및 상기 처리된 혈장으로부터 디에틸에테르를 사용하여 비타민 E를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 혈장 중의 비타민 E 검출방법은, 상기 단계들 이후에, 상기 추출된 비타민 E의 농도를 자외선 흡광기가 구비된 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 혈장 중의 비타민 E 검출방법에 있어서, 상기 혈장은 가축으로부터 유래된 혈장인 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 혈장 중의 비타민 E 검출방법에 있어서, 상기 완충액은 인산완충액 또는 초산완충액인 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 혈장 중의 비타민 E 검출방법에 있어서, 상기 염은 NaCl인 것을 특징으로 한다.

본원 발명에 의한 혈장 중의 비타민 E 검출방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.

비타민 E를 간편하면서도 효과적인 추출하기 위하여 유기용매의 선택이 중요한데, 본원 발명은 기존의 방법에서 채택한 디클로로메탄(dichloromethane) 이나 클로로포름(chloroform) 대신에, 비중이 작아 다루기 쉽고 농축과정에서 제거가 쉬운 디에틸에테르(diethylether)를 사용하여 혈장 중의 비타민 E를 추출한다.

본원 발명자들은 추출 시 목표하는 회수율을 달성하기 위하여 비타민 E가 추출되기 알맞은 pH의 조절이 필요하다는 것을 밝혀내고, 이를 위하여 pH를 4.0∼9.0으로 변화시키면서 회수율을 측정하였다. 이 때 완충액의 pH 변화에 따른 회수율의 변화는 10% 이내로 크지 않았으나 pH 4.0~5.5에서 가장 회수율이 좋았으므로 이 조건에서 추출하는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 pH는 약 pH 5.0이다.

본 발명자들은 pH의 조절만으로는 목적하는 정도의 회수율을 얻지 못하지만, pH 조절 이외에 염석효과 (salting out effect)를 더 이용하면 비타민 E의 회수율을 더 높일 수 있다는 것을 발견하였다. 이를 입증하기 위해, 본 발명자들은 0.05∼1M의 농도로 NaCl을 초산완충액에 가하면서 비타민 E의 회수율을 검토한 결과, 60% 이상의 회수율을 얻기 위해서는 완충액에 0.075 내지 0.2M의 농도로 NaCl을 첨가하여야 한다는 것을 알아내었다. 70%이상의 회수율을 얻기 위해서는 약 0.1M의 농도로 NaCl이 완충액에 첨가되어야 한다.

상기 방법은 혈장으로부터 비타민 E를 추출하는 최적의 조건이 되며 고성능 액체 크로마토그래피/자외선흡광기에 감도 및 선택성이 좋고 목적으로 하는 검출한계를 제공한다.

상기와 같은 조건 하에서 추출된 비타민 E를 고성능 액체 크로마토그래피/자외선흡광기에 주입시키고 물과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 분석한다. 컬럼은 일반적인 역상(reverse phase) C₁₈컬럼을 사용한다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠지만, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 완충액의 종류 및 pH, 및 그 완충액에 첨가되는 NaCl의 농도에 따라 비타민 E의 회수율이 어떻게 달라지는 지 입증하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

<실시예1>

본 실시예는 비타민 E의 회수율이 최대가 되는 완충용액의 선정에 관한 것이다.

비타민 E의 표준품 5㎍과 내부표준 물질인 비타민 E 아세테이트의 표준품 15㎍을 첨가한 돼지 혈장 1ml에 각각 초산완충액(pH 4.0), 초산완충액(pH 4.5), 초산완충액(pH 5.0), 인산완충액(pH 5.5), 인산완충액(pH 7.0), 붕산완충액(pH 9.0)을 1ml씩 가한 후 가볍게 진탕시키고 디에틸에테르(diethylether) 5ml로 15분간 진탕하여 추출하였다. 추출 후 2500rpm에서 1분간 원심분리하여 완충액층과 유기용매층을 분리한 후 유기용매인 디에틸에테르층을 취하고 감압농축기를 사용하여 완전히 증발건고시켰다. 잔사를 메탄올 75㎕로 녹인 후 그 중 50㎕를 고성능 액체 크로마토그래피에 직접 주입하여 분석하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 보여진 바와 같이, 각 pH에서의 회수율의 차이는 크지 않았으나 pH가 증가함에 따라 회수율이 감소하는 경향이 있어 pH 5.5 이상이면 원하는 정도의 회수율을 얻기가 어려웠다. 또한 pH가 4.0이하이면 역시 원하는 정도의 회수율을 얻기가 어려웠으므로, 완충액의 pH는 4.0 내지 5.5인 것이 바람직하고 이 경우 약 43% 정도의 회수율을 얻을 수 있었다. 가장 바람직한 pH는 5이고, 이 경우 약 45% 정도의 회수율을 얻을 수 있었다.

<실시예 2>

본 실시예는 염석효과(salting out effect)를 이용하여 비타민 E의 회수율을 증가시킬 수 있는지 그리고 이 때 첨가하여야 하는 염(본 실험에서는 NaCl)의 농도를 얼마로 최적화하여야 하는 지 알아보기 위한 것이다.

돼지의 혈장 1ml에 비타민 E의 표준품 5㎍과 내부표준 물질인 비타민 E 아세테이트의 표준품 15㎍을 첨가하였다. 여기에 다시 0.05, 0.075, 0.1, 0.2, 0.5, 1의 NaCl을 함유한 pH 5.0의 초산완충액 1ml를 가한 후 가볍게 진탕시키고 디에틸에테르 5ml로 15분간 진탕하여 추출하였다. 추출 후 2500rpm에서 1분간 원심분리하여 완충액층과 유기용매층을 분리한 후 유기용매인 디에틸에테르층을 취하고 감압농축기를 사용하여 완전히 증발건고시켰다. 잔사를 메탄올 75㎕로 녹인 후 그 중 50㎕를 고성능 액체 크로마토그래피/자외선 흡광 분석기에 직접 주입하여 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 60% 이상의 회수율을 얻기 위해서는 NaCl을 0.075 내지 0.2M의 농도로 완충액에 첨가하고, 70% 이상의 회수율을 얻기 위해서는 약 0.1M의 농도로 첨가하여야 한다.

<실시예3>

본 발명자들은 상기 실시예를 통해 가장 바람직한 완충액의 pH는 5이며 가장 바람직한 염의 농도는 0.1M이라는 것을 알아낸 후, 이러한 조건하에서 추출된 비타민 E의 농도를 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다.

상기 실시예2와 같이 하여 0.1M의 NaCl을 함유한 pH 5.0의 초산완충액으로 처리된 혈장으로부터 디에틸에테르를 이용하여 비타민 E를 추출한 후 그 디에틸에테르를 감압증발 건고시킨 다음, 얻어진 잔사를 메탄올로 용해시켜 얻은 용액 50㎕를 고성능 액체 크로마토그래피/자외선 흡광 분석기에 주입한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 비타민 E (피크 1)와 내부표준물질 (피크 2)의 크로마토그램을 얻었다. 비타민 E의 농도를 결정하기 위하여 사용된 기기로는 휴렛팩커드 (Hewlett-packard)사의 HP 1100 series 고성능 액체 크로마토그래피와 이 기기에 내장된 자외선 흡광기이다. 길이가 25cm, 내경이 5mm이고, 입자크기가 5㎛인 시세이도사의 Capcell Pak UG 120 컬럼을 사용하였고 전개용매는 물과 메탄올의 혼합용액이었으며 유속은 1.5ml/min이었다. 전개용매의 조성은 분석 시작시에는 물과 메탄올의 비율이 30 : 70이었다가 분석 후 10분이 지나면 메탄올이 100%가 되는 조건이었다. 분석시 사용한 자외선 흡광기의 파장은 220 nm이었다.

<실시예4>

본 발명자들은 상기 실시예3과 같이 비타민 E를 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 정량하기 위한 검량곡선을 제시하였고 이를 이용하여 추출된 비타민 E의 농도를 정량하였다. 그 곡선은 도 4에 나타난 바와 같고 1∼15㎍/ml 농도범위에서 R=0.999의 좋은 직선성을 나타내었다. 또한 변동 계수(Coefficient Variation) 값도 1.6∼12.3 %를 나타내어 좋은 반복성을 나타내었으며, 정확성도 최저 농도에서는 14% 이내, 그 외의 농도에서는 10% 이내로 좋은 결과를 나타내었다.

상기 곡선을 이용하여 돼지의 혈장에서 실제 검출한 비타민 E의 양을 정량한 결과는 다음 표 1과 같으며, 그 농도는 1.2∼4.6㎍/ml 범위였다.

돼지개체사료투여 경과일수	A(㎍/ml)	B(㎍/ml)	C(㎍/ml)	D(㎍/ml)	E(㎍/ml)
1일	1.2	1.5	1.7	1.2	1.5
3일	2.9	3.3	4.3	1.6	2.8
5일	2.0	4.2	4.6	3.5	1.9

상기 설명한 바와 같이, 본 발명은 혈장으로부터 비타민 E를 효과적으로 추출할 수 있도록 하며, 고성능 액체 크로마토그래피/자외선 흡광기에 대하여 선택적이고 우수한 감도를 가지는 최적의 분석조건을 제공한다. 따라서 본 발명을 이용할 경우 분석 감도의 확보, 정확성, 재현성, 분석의 신속성 및 간편성, 저비용 등을 만족시킬 수 있다. 이로 인해 특히 가축의 경우 비타민 E의 결핍시 유발될 수 있는 신경계의 궤양 및 생식계의 이상으로 인한 불임 등을 예방하기 위하여 사료에 첨가되는 필수적인 영양소인 비타민 E의 혈장 내 농도를 지속적으로 모니터링을 함으로써 이러한 질환을 예방할 수 있고, 또한 사료에 비타민 E를 첨가함에 있어서 그 적정량을 결정하는데 혈장의 농도를 지표로 이용하는 등 여러 관점으로 응용될 수 있다.

Claims

혈장 중의 비타민 E를 검출하는 방법에 있어서,

혈장에 0.075 내지 0.2M의 염을 함유한 pH 4.0 내지 5.5의 완충액을 처리하는 단계; 및

상기 처리된 혈장으로부터 디에틸에테르를 사용하여 비타민 E를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈장 중의 비타민 E 검출 방법.
제1항에 있어서,

상기 검출 방법은,

상기 단계들 이후에,

상기 추출된 비타민 E의 농도를 자외선 흡광기가 구비된 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 혈장 중의 비타민 E 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 혈장은 가축으로부터 유래된 혈장인 것을 특징으로 하는 혈장 중의 비타민 E 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 완충액은 인산완충액 또는 초산완충액인 것을 특징으로 하는 혈장 중의 비타민 E 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 염은 NaCl인 것을 특징으로 하는 혈장 중의 비타민 E 검출 방법.