KR100423102B1

KR100423102B1 - 항암활성을 가지는 파이토스핑고신 유도체

Info

Publication number: KR100423102B1
Application number: KR10-2001-0048638A
Authority: KR
Inventors: 남궁성건; 박선이
Original assignee: 주식회사 참 존
Priority date: 2001-08-13
Filing date: 2001-08-13
Publication date: 2004-03-16
Also published as: KR20030014780A

Abstract

본 발명은 항암활성을 가지는 파이토스핑고신 유도체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 다음 화학식 1로 표시되는 것으로, 항암활성을 가지는 파이토스핑고신 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것이다.

상기 화학식 1에서, R¹, R²및 R³는 수소 또는 C₁∼ C₈의 알킬기를 나타내고, 다만 R¹, R²및 R³가 동시에 수소인 경우는 제외하며; X는 할로겐, 수산화기, 알킬 술포네이트기, 아릴 술포네이트기가 포함된 원자 또는 원자단을 나타낸다.

Description

항암활성을 가지는 파이토스핑고신 유도체{Phytosphingosine derivatives with antirumor activity}

본 발명은 항암활성을 나타내는 파이토스핑고신 유도체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 다음 화학식 1로 표시되는 것으로, 항암활성을 나타내는 파이토스핑고신 유도체와 이를 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것이다.

[화학식 1]

일반적으로, 세포막을 구성하는 지질은 인지질(Phospholipid), 당지질(glycolipid), 스핑고리피드(sphingolipid)들로 이루어져 있다. 이러한 분자들은 양친매성(amphipathic) 물질로서 물에 분산되면 자발적으로 세포막과 유사한 폐쇄형 소포체를 형성하는데 이를 리포좀(liposomes)이라 한다. 리포좀은 위에서 언급한 한 종류의 지질이나 다양한 지질로 제조할 수 있는데 이를 의약품에 적용하면, 수용성 물질은 주로 내부 수상에 봉입되고 지용성 물질은 막 사이에 끼여 다양한 의약물질을 전달시키는 매개체로 활용되고 있다. 또한, 리포좀은 치료해야 할 환부에 약물을 정확히 전달하기도 하며 리포좀에 의한 약물송달은 적은 양으로도 가능하므로 다중약제내성을 극복하는데도 도움이 된다. 최근에는 약물, 항원, 유전자의 전달매체로 각광을 받고 있으며 특히 리포좀을 이용한 약물전달매체로써 항암제인 독소루비신(doxorubicin)과 항진균제인 엠포테리신B(amphotericin B) 및 기타 의약품들을 리포좀 제제화하여 상품으로 시판하고 있는 추세이다. 그 외에 리포좀은 화장품에도 널리 이용하고 있다[M. Grunaug et al., Eur. J. Med. Res. 21, 13-19, 1998; D.S. Alberts abd D.J. Garcia, Drugs, 54, 30-35, 1997; F. Braun, et al., Transplant Proc. 30, 1481-1483, 1998; V. Heinemann et al., Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1275-1280, 1997; N. Weiner et al., J. Drug. Target 2, 405-410, 1994].

인체에 존재하는 스핑고이드 염기(sphingoid base)로는 파이토스핑고신(phytosphingosine, PhytoS), 스핑고신(sphingosine, SPN), 스핑가닌(sphinganine)이 있다. 이들은 구조적으로 18개의 탄소 원자로 구성된 골격을 가진 아미노 알콜(amino alcohol)로 특징지어진다. 이러한 화합물들은 수 개의 입체중심을 가지고 있는데 이들의 3번 위치에 D-배열(D-erythro)이 자연에서 발견되고 있다. SPN과 스핑가닌은 신체의 모든 조직에서 찾아 볼 수 있는 반면, PhytoS는 각질층에서만 한정적으로 존재한다. SPN과 이의 유도체들에 대한 연구는 1990년대 시작되어 PKC(protein kinase C) 활성의 강력한 억제제라는 사실이 밝혀지면서 활발히 진행되었다. 그 후, SPN과 그 유도체들은 낮은 농도에서도 수많은 세포 기능(cellular function)에 관여한다는 사실들이 밝혀졌다[D.J. Bibel et al., Clin. Exper. Dermatol. 20, 395-400, 1995; D.J. Bibel, J. Invest. Dermatol. 98, 269-273, 1992; Y.A. Hannun, Science, 274, 1855-1859, 1996]. 그런데 이러한 활성이 대부분 각질층에서 나타나므로 PhytoS에 대한 관심은 증가하였으나 매우 고가의 상품화된 시약이므로 그 유도체 합성과 이들의 생리활성(biological activity)에 대해 알려진 바가 거의 없었다. 특히, SPN 유도체인 N,N-디메틸스핑고신(N,N-dimethylsphingosine, DMS)과 N,N,N-트리메틸스핑고시늄 할라이드 (N,N,N-trimethylsphingosinium halide, 이하 TMSㆍhal)는 SPN보다 PKC 활성에 대한 더욱 강력한 저해제이고in vitro,in vivo계에서 다양한 암세포의 성장을 억제한다고 알려져 있다. 특히, TMSㆍhal는 난황 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, egg PC) : 콜레스테롤(cholesterol, Chol) : TMSㆍhal = 4.5 : 4.5 : 1 (몰 비)의 리포좀을 이용한 B16/BL6 흑색종 세포주(melanoma cell line)에서 항암(antitumor), 전이억제(antimetastasis) 효과를 확인한 예가 있다. 그런데 TMSㆍhal가 이러한 효과를 나타내기 위해서는 0.1 ∼ 0.3 ㎎/mouse 정도로 상당히 많은 약량이 요구되기 때문에 용혈현상(hemolysis), 혈색소뇨증(hemoglobinuria), 염증반응(inflammatory response)과 같은 부작용이 나타난다. 이와 같은 독성을 줄이기 위해 리포좀 기술을 적용해 보았는데in vivo계에서 리포좀 TMSㆍhal는 독성이 없고 리포좀을 사용하지 않은 TMSㆍhal 보다 암세포의 성장과 전이를 막아주는데 더욱 강력한 억제 효과를 관찰할 수 있었다[Y.S. Park, S. Hakomori, S. Kawa, F. Ruan, and Y. Igarashi. Cancer Res. 54, 2213-2217, 1994].

SPN과 구조가 거의 유사한 PhytoS에 대한 연구는in vitro계에서 KK-1, COS-7 그리고 MSC-1 세포에서의 유전자 전달(DNA transfection) 정도를 살펴보고 보조 지질(helper lipid)의 formulation 차이에 의한 효율성을 비교하여 발표된 예가 있으며[T. paukku et al., Chem. Phys. Lipids, 87, 23-29, 1997], 또한 다양한 미생물(microorganism)에서 강력한 항균활성(anti-microbial activity)을 나타내고 PKC 억제제로서 인터루킨(interleukin) 분비를 증가시켜 피부 자극을 줄여준다고 알려져 있다. phytoS 유도체인 N,N,N-트리메틸파이토스핑고시늄 할라이드(N,N,N-trimethylphytosphingosinium halide, 이하 TMPㆍhal)는 국내, 외에서는 처음으로 피부 보호를 위한 용도에 한정하여 화장품에 첨가되는 조성물 중의 하나로서 특허 출원, 공개[대한민국 특허 공개번호 제 1999-0078610호]되어 있는 상태이나 TMPㆍhal를 항암제로 사용한 사례는 국내ㆍ외적으로 아직 없다.

이에, 본 발명자들은 상기 화학식 1로 표시되는 파이토스핑고신 유도체를 다양한 조성의 리포좀으로 제조하고, 이의 암 전이 및 암 성장 억제 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 항암활성을 나타내는 파이토스핑고신 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 N,N,N-트리메틸파이토스핑고시늄 아이오다이드(이하 TMPㆍI)를 리포좀 제제화하여 TMPㆍI 함량에 따른 흑색종(melanoma cell)의 전이 억제능을 나타낸 그림이다.

도 2는 신생혈관 억제 약물을 함유하는 TMPㆍI 리포좀 및 TMPㆍI 에멀젼의 전이 억제능을 비교한 그림이다.

도 3은 TMPㆍI 리포좀과 항암제인 독소루비신과의 상호작용을 나타내는 그림이다.

도 4는 TMPㆍI를 함유하는 양이온성 리포좀의 세포독성을 나타내는 그래프이다.

도 5는 TMPㆍI 유도체를 함유한 다양한 리포좀과 에멀젼을 4 ℃에서 보관했을 때의 안정성을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 항암활성을 가지며 다음 화학식 1로 표시되는 파이토스핑고신 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암제를 그 특징으로 한다.

[화학식 1]

또한, 상기 파이토스핑고신 유도체가 리포좀 또는 에멀젼 형태로 함유된 항암제 및 상기 파이토스핑고신 유도체와 함께 신생혈관 형성 억제제 또는 기존의 세포독성 활성을 갖는 항암제인 독소루비신가 함유된 항암제를 포함한다.

이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 항암활성을 가지는 상기 화학식 1로 표시되는 파이토스핑고신 유도체(이하, TMP)를 리포좀 또는 에멀젼 형태로 제제화한 항암제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 파이토스핑고신 유도체에 있어, N,N,N-트리메틸파이토스핑고시늄(TMPㆍhal)이 바람직하며, N,N,N-트리메틸파이토스핑고시늄 아이오다이드(TMPㆍI)가 특히 바람직하다.

본 발명에서는 다양한 조성의 전이억제 리포좀을 제조하였는데 DPPC/Chol/TMP 또는 DPPC/Chol/PEG-PE/TMP 조성이 암의 전이억제능이 좋은 것으로 판단되었고, 신생혈관 억제제와 같이 사용했을 때, 상승효과가 있음을 알 수 있었다. DPPC/Chol/TMP 리포좀은 암의 전이를 억제할 뿐 아니라 LLC 폐암세포의 성장을 현저히 억제하는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서는 세포독성 활성 약제와 함께 전이억제를 비교했을 때에 독소루비신의 단독으로 사용하는 경우보다 TMP 리포좀과 함께 투여했을 때 그 효능이 더 증가하는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서는 TMP 리포좀의 세포독성 효과를 사람의 간암세포주와 마우스 흑색종 세포주를 이용한 결과 사람의 간암세포주에는 세포독성 효과를 나타내고 있지만 흑색종 세포주에는 세포독성 효과가 없다. 또한, 마우스에서 간이급성 독성을 측정하였을 때에 아무런 독성이 관찰되지 않았다.

본 발명에 따른 항암제는 상기 화학식 1로 표시되는 파이토스핑고신 유도체를 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 분말, 과립, 캡슐 또는 주사제 등으로도 제조가 가능하다. 또한, 경구 투여 및 비경구 투여가 가능하며, 특히 리포좀과 에멀젼 형태로 제제화하여 투여할 경우 생체이용률에서 더욱 효과적이다. 본 발명에 따른 항암제의 투여량은 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 상기 항암제는 체중 1 ㎏당 0.5 내지 1 ㎎ 정도를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 항암제는 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

이하, 본 발명은 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: N,N,N-트리메틸파이토스핑고시늄 아이오다이드(TMPㆍI)의 합성

파이토스핑고신(phytosphingosine, 0.30 g, 0.946 mmol)과 K₂CO₃(0.523 g, 3.79 mmol)를 메탄올 3 mL에 녹여 교반하면서 요오드메탄(iodomethane, 0.298 mL, 4.73 mmol)을 첨가한 후 50 ℃에서 4시간 교반하였다. 용매를 감압 증류하고 반응 혼합물에 증류수 4 mL를 가한 후 에틸아세테이트 8 mL로 추출하여 Na₂SO₄로 건조, 여과하였다. 용매를 감압 건조하여 흰색의 고체 생성물 0.26 g을 얻었다.

수율 : 76 %

mp : 210 ∼ 213 ℃

IR(KBr) υmax : 3309 (OH), 2918, 2850 (C-H) cm^-1

¹H NMR (600MHz, DMSO-d₆) : δ 3.95 (dd, 1H, CH₂O, J = 14.4 Hz), 3.89 (dd, 1H, CH₂O, J = 14.4 Hz), 3.76 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 3.6 (dd, 1H), 3.11 (s, 9H, N⁺CH₃), 1.68 (m, 1H, CH₂), 1.48 (m, 1H, CH₂), 1.23 (s, 24H, CH₂), 0.84 (t, 3H, CH₃) ppm

¹³C NMR (600MHz, DMSO-d₆) : δ 76.80, 71.01, 55.69, 52.18, 33.21, 31.21, 30.60, 29.15, 29.03, 28.99, 28.93, 28.62, 24.87, 22.00, 13.84 ppm

MS (FAB, Glycerol, m/z) : 361 (M⁺).

실시예 2: N,N,N-트리메틸파이토스핑고시늄 파라톨루엔술포네이트(N,N,N-trimethylphytosphingosinium p -toluenesulfonate)의 합성

파이토스핑고신(phytosphingosine, 0.5 g, 1.575 mmol)과 K₂CO₃(1.612 g, 9.449 mmol)를 메탄올 5 mL에 녹여 교반하면서 메틸 파라톨루엔술포네이트(methyl p-toluenesulfonate, 1.188 mL, 7.874 mmol)를 첨가한 후 50 ℃에서 3 시간 교반하였다. 용매를 감압 증류하고 반응 혼합물에 증류수 5 mL를 가한 후 에틸아세테이트 10 mL로 추출하여 Na₂SO₄로 건조, 여과하였다. 용매를 감압 건조하여 흰색의 고체 생성물 0.460 g을 얻었다.

수율 : 55 %

mp : 185 ∼ 186 ℃

IR (KBr) υmax : 3326 (OH), 2920, 2852 (C-H) cm^-1

¹H NMR (500MHz, CD₃OD) : δ 7.70 (d, 2H, arom H, J = 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H,arom H, J = 8.0 Hz), 4.16 (dd, 1H, CH₂O, J = 14.4 Hz), 4.09 (dd, 1H, CH₂O, J = 14.4 Hz), 3.89 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 3.73 (dd, 1H), 3.44 (t, 1H), 3.21 (s, 9H, N⁺CH₃), 2.37 (s, 3H, Ph-CH₃), 1.81 (m, 1H, CH₂), 1.58 (m, 1H, CH₂), 1.29 (s, 24H, CH₂), 0.90 (t, 3H, CH₃) ppm

¹³C NMR (500MHz, CD3OD) : δ 142.07, 140.16, 128.31, 125.45, 76.73, 71.56, 56.09, 52.21, 33.25, 31.56, 29.28, 29.26, 28.96, 25.03, 22.22, 19.81, 12.93 ppm.

실시예 3: 리포좀의 제조방법

(1) MLV(multilamellar vesicles)와 SUV(small unilamellar vesicles)의 제조

인지질을 유리병(glass vial)에 넣어 유기용매(클로로포름, CHCl₃)에 용해시킨 후 질소가스 또는 감압 증류기(rotary evaporator)를 이용하여 유기용매를 완전히 제거하면서 유리병 내에 얇은 막을 형성시키고, 인산완충용액(PBS)을 첨가하여 상온에서 약하게 흔들어주면서 충분히 수화시킨 다음 강하게 교반하여 인지질의 막을 분산시켜 다층라멜라 리포좀(MLV)을 제조하였다.

이미 만들어진 MLV를 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 단층라멜라 리포좀(SUV)을 제조하였다. 이 외에도 SUV를 만들기 위해 압출기(extruder)를 이용하여 고압으로 적절한 멤브레인 필터(memebrane filter)를 통과시키므로 원하는 크기의 리포좀을 얻어서 실험에 사용하였다.

(2) 전이억제 리포좀의 제조

전이억제 물질인 TMP와 다양한 인지질로 구성된 리포좀을 제조하였다. TMP와 중성지질인 DOPE를 적절하게 혼합(1 : 1 무게비)하여 20 mL 유리병에 넣고 유기용매에 녹인 후, 질소 존재 하에서 감압 증류하였다. 이때 얇은 지질막이 만들어지면 완전히 건조시킨 후 증류수 또는 5% 덱스트로스(dextrose)로 수화시켜 볼텍싱(vortexing), 초음파분쇄(sonication) 등의 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하였다. 계란 유래의 70% 포스파티딜콜린(phosphtidylcholine, PC), 100% 계란 PC와 콜레스테롤(cholesterol, Chol) 1 : 1 몰비, 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine, DPPC)와 Chol 1 : 1 몰비, DPPC : Chol : 폴리에틸렌글리콜이 결합된 포스파티딜에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine-polyethylene glycol, PE-PEG) 5 : 5 : 1 몰비의 조성에다 TMP를 첨가하여 유기용매에 녹인 후 감압증류기를 사용하여 유기용매를 완전히 제거하면서 유리병 내부에 얇은 막을 형성시켰다. PBS 완충용액을 첨가하여 상온에서 충분히 수화시킨 후 인지질의 얇은 막을 분산시킨 다음 강하게 볼텍싱 또는 초음파 분쇄함으로써 전이억제 리포좀을 만들었다.

실시예 4 : 전이억제 활성을 지닌 에멀젼의 제조 및 물리적 성질 측정

(1) 에멀젼의 제조

70% 계란 PC와 TMP를 올리브기름(olive oil)에 분산시키고, 글리세롤 (glycerol)과 소량의 tween 20을 첨가하고, 증류수를 가한 후 강하게 초음파 분쇄하여 에멀젼을 만들었다. 만들어진 에멀젼을 0.2 ㎛ 막(membrane)을 통과하여 사용하였다.

(2) 리포좀과 에멀젼의 안정성 측정

TMP를 함유하는 다양한 조성의 리포좀과 TMP를 함유하는 에멀젼을 제조하여 4 ℃에서 보관하면서 리포좀 크기 변화를 제타사이저(zetasizer) 기계를 이용하여 측정하여 인지질의 조성에 따른 리포좀의 안정성과 에멀젼의 안정성을 측정하였다.

실시예 5 : In vivo 암 전이 억제 분석

In vivo계에서의 직접적인 폐 전이(direct lung metastasis)를 관찰하기 위해 B16F10 흑색종 세포를 이용하여 C57/BL6 마우스에서 실험하였다. 우선 투여해야 할 흑색종 세포의 농도를 결정하기 위해 다양한 농도(PBS, 2 ×10⁴, 2 ×10⁵, 2 ×10⁶)의 암세포를 꼬리 정맥에 주사하여 15일 후에 마우스를 마취한 상태에서 폐 (lung)를 적출, 폐에 발생한 암세포의 콜로니 수를 관찰하였다.

또한, TMP를 함유한 전이억제 리포좀과 에멀젼의 전이 억제 효과를 살펴보기 위해 위 실험에서 얻어진 적절한 암세포 농도를 C57/BL6 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 60 ∼ 90분 후에 유도체로 만들어진 전이억제 리포좀 250 ㎍씩 투여하고 2번, 3번째 약물의 투여는 암세포를 주사한 지 각각 3일과 6일 후에 시행하였고, 4번째 약물을 투여할 경우 9일 후에 투여하였다. 15일째 마우스의 폐를 적출한 후 콜로니수를 관찰하였다.

실시예 6 : 세포독성 및 In vivo 독성 측정

암세포에 대한 세포독성 효과를 측정하기 위해 암세포주로 간암세포주인 SNU 398과 흑색종 세포주인 B16F10를 사용하였다. 암세포주(SNU 398 또는 B16F10)를 트립신화(trypsinization)한 다음 serum-free media[RPMI-1640]로 세척하였다. 트립판 블루로 염색하여 세포를 카운팅한 후, 1 ×10⁵cell/㎖로 48 웰 플레이트에 플레이팅하고 TMP 만들어진 양이온성 리포좀을 다양한 농도로 암 세포에 처리하였다. 3일 후, 다시 트립판 블루로 염색하고 세포를 카운팅하여 세포 감소 정도를 관찰하였다.

In vivo독성을 관찰하기 위해 TMP 리포좀을 마우스에 정맥 주사 또는 복강 주사하여 마우스의 치사율을 측정함으로써in vivo독성을 측정하였다.

실시예 7 : In vivo 암 성장 억제 분석

In vivo계에서 암의 성장억제를 관찰하기 위해 루이스 폐암세포주(Lewis Lung Carcinoma, LLC)를 이용하여 BDF1 마우스에서 실험하였다. LLC 세포 농도를 마우스 한마리 당 백만 개의 세포를 피하주사하여 암을 형성시켰다. 암세포 투여 후 1일, 3일, 6일, 9일에 TMP 리포좀을 100 ㎕(TMP 100 ㎍)씩 복강 및 정맥 주사하였다. 양성 대조군으로는 MMP-2(matrix metaloproteinase-2) 억제제로 알려진 AG3340(Agouron Pharmaceuticals)을 0.2% tween/0.5% 카르복시메틸셀룰로오스로 현탁시켜 하루에 한번씩 2 mg을 복강 주사하였다. 21일 후에 마우스를 경추탈골하여 죽인 후 암의 부피 변화를 측정하고, 사진 촬영하였다.

실시예 8: 정제의 제조

유효 성분 1 g

락토스 7 g

결정성 셀룰로오스 1.5 g

마그네슘 스테아레이트 0.5 g

총 량 10 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 500 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 50 ㎎이다.

실시예 9: 분말제의 제조

유효 성분 1 g

옥수수 전분 5 g

카르복시 셀룰로오스 4 g

총 량 10 g

상기에 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캡슐에 분말 500 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

실험예 1

in vivo계에서 TMPㆍI의 전이 억제 효과를 살펴보았다. 먼저 전이를 관찰할 수 있는 암 세포수를 결정하기 위해 마우스에 B16F10 흑색종 세포를 2 ×10⁴, 2 ×10⁵, 2 ×10⁶및 PBS(인산완충용액), 네 그룹으로 나누어 암 전이를 측정하였다. 암세포를 꼬리 정맥에 주사한 지 15일 후에 마우스의 폐를 적출시켜 관찰한 결과, 2 ×10⁶농도에서는 폐의 크기가 매우 커져 있었고 셀 수 없을 정도로 많은 콜로니가 형성되었다. 반면 PBS와 2 ×10⁴를 처리한 경우에는 아무런 변화가 나타나지 않았고, 2 ×10⁵의 경우는 적은 양의 콜로니가 관찰되었으며 21일 후까지 그 수가 증가하였다.

따라서, TMPㆍI의 전이억제 실험을 위한 암세포 농도는 2 ×10⁵으로 고정하여 수행하였다. B16F10 흑색종 세포를 접종한 후 1일, 3일 그리고 6일 후에 각각의 유도체를 300 ㎍ 투여하였다. 15일 후에 마우스의 폐를 관찰한 결과, 대조군에 비해 폐의 크기가 줄어있었고 암세포의 콜로니 수도 상당히 감소되었음을 확인할 수 있었다[표 1].

실험예 2

리포좀의 조성을 달리하면서 TMPㆍI의 전이억제 활성을 측정하였다. 70% 계란 PC와 100% 계란 PC/chol(1 : 1 몰비)의 조성에다 TMPㆍI를 첨가하여 리포좀을 제조하여 전이억제 실험을 하였다. C57BL/6 마우스에 B16F10 흑색종 세포를 2 ×10⁵농도를 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 주사한 후 1시간 후에 TMPㆍI 250 ㎍이 함유된 리포좀을 처리하였다. 두 번째로 흑색종 세포를 주사한 후 3일 뒤에 꼬리 정맥으로 다시 250 ㎍ 처리하였다. 마지막으로 7일 뒤에 같은 방법으로 흑색종 세포를 처리한 후 15일 후에 마우스를 경추 탈골한 후에 폐를 채취하여 콜로니 수를 비교하였다[표 2].

실험예 3

TMPㆍI 농도에 따른 전이억제 효과를 살펴보기 위해 70% 계란 PC를 적용한 리포좀을 제조하여 실험에 사용하였다. 리포좀의 안정성을 높이기 위해 70% 계란 PC에다 콜레스테롤을 첨가시켰다. 70% 계란 PC와 CHOL 그리고 TMPㆍI를 적절한 비율로 혼합하여 리포좀을 제조하여 전이억제 실험을 수행하였다. TMPㆍI 50 ㎍정도 함유한 리포좀에서 60% 이상의 암의 전이를 억제하는 것을 알 수 있었다[도 1, 표 3]. 그러나, 기존의 알려진 TMSㆍhal (trimethylsphingosinium halide) 리포좀의 결과와 비교했을 때, 250 ㎍ TMSㆍhal을 투여했을 때, 50% 정도 암의 전이억제를 보인다[Y.S. Park et al., Cancer Res., 54, 2213-2217, 1994]. TMPㆍI 리포좀이 TMSㆍhal 리포좀보다 암의 전이억제 효과가 월등히 뛰어남을 알 수 있었다.

실험예 4

전이억제 리포좀의 조성에 따른 전이억제 활성과 리포좀 내에 신생혈관 형성억제 약물(AG3340, Agouron Pharmaceuticals)을 첨가하여 전이억제 활성을 측정하였다. 다양한 그룹으로 리포좀을 제조하여 실험을 수행하였다. 리포좀을 다양한 조성으로 제조하고, 리포좀 내에 신생혈관 형성억제 약물을 포획하여 리포좀과 약물의 효과를 비교하여 보았다[표 4]. 대조 리포좀(control liposomes)으로는 70% 계란 PC/Chol/파이토스핑고신(4 : 4 : 1 무게비)의 조성으로 제조하였다. 지질과 약물의 비는 20 : 1 무게비로 이루었다. 각각 리포좀의 조성과 효과를 다음 표 4에 나타내었다. 투여하는 TMPㆍI와 약물의 농도는 각각 100 ㎍씩으로 일정하게 하였고, 약물이 있는 경우나 약물이 없는 경우 모두 투여되는 TMPㆍI의 농도는 일정하였다. 상기 실시예 5와 같은 방법으로 실험을 수행하였으나, 리포좀의 투여 횟수를 흑색종 세포를 투여한지 한시간, 3일, 6일, 9일 4회로 하였다. 파이토스핑고신으로 이루어진 대조 리포좀에서 콜로니 수가 조금 감소하는 경향이 보이지만 뚜렷한 효과를 보이지 못했고, 약물과 DPPC 리포좀으로 구성된 경우에는 전이억제 효과가 거의 나타나지 않았다. 그러나, 약물과 TMPㆍI가 함께 함유되어 있는 TMPㆍI 리포좀의 경우에는 15개 미만의 콜로니 수를 관찰할 정도로 전이억제 효과가 매우 뛰어났다. 리포좀의 혈중 잔류시간을 높이기 위해 TMPㆍI 리포좀의 조성에 10% PEG-PE를 첨가한 TMPㆍI+PEG 리포좀에서도 비숫한 효과를 볼 수 있었다[도 2].

실험예 5

전이억제 활성을 지닌 TMPㆍI를 이용하여 오일 에멀젼 제제를 만들어서 전이억제 활성을 측정하였다. 상기 실험예 4와 같은 방법으로 실험을 수행하였으나 전이억제 TMPㆍI 에멀젼의 투여방법을 복강으로 투여하였다. 아무것도 처리하지 않은 그룹과 에멀젼을 투여한 그룹의 폐를 관찰한 결과, 무처리한 대조군에서의 콜로니 수는 250개 정도이었고 TMPㆍI 에멀젼을 복강으로 투여한 그룹에서는 70 ±20개 정도의 콜로니 수가 관찰되었는데, 이 수치는 암의 전이가 70% 이상 억제하는 것을 의미한다[도 2].

실험예 6

BDF1 마우스에 루이스(Lewis Lung Carcinoma, LLC) 폐암 세포를 투여하여 암을 유발시킨 후에 전이억제 활성을 지닌 TMPㆍI 리포좀(DPPC/Chol/TMPㆍI, 5 : 5 : 1 몰비)을 투여하여 암의 성장억제에 관한 효능을 관찰하였다. LLC 암세포의 농도를 한 마우스 당 백만 개로 피하주사하여 종양를 형성시켰다. 암세포를 피하주사한 후 1일 뒤에 TMPㆍI 리포좀을 정맥 주사와 피하주사하였다(TMPㆍI 함량: 100 ㎍). 3일, 6일, 9일 뒤에도 같은 방법으로 투여하고 21일째 마우스를 경추탈골하여 사망시킨 후 암의 부피를 다음 수학식 1로 측정하였고, 그 결과를 다음 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에 보는 바와 같이, 대조군에서는 암의 부피가 매우 크게 자라났고, 암의 주위에 혈관형성이 왕성하게 일어났음을 알 수 있었다. TMPㆍI 리포좀을 복강 주사한 그룹에서는 종양 부피가 현저히 감소하였고, 암의 주위에 신생혈관의 형성이 현저히 줄어들었다. 이에 반하여 MMP-2 억제제인 AG3340을 트윈/카르복시메틸 셀룰로오스에 현탁하여 하루에 한번씩 20일간 2000 ㎍을 투여한 그룹에서는 종양 부피의 변화가 미미하게 줄어들었다. 암의 부피 변화를 측정한 결과 양성대조군인 AG3340을 복강으로 투여한 경우는 30% 정도 부피가 줄어들었고, TMPㆍI 리포좀을 복강으로 투여한 경우는 85%정도 줄어들었고, TMPㆍI 리포좀을 정맥으로 주사한 경우는 60%정도가 줄어들었다.

실험예 7

TMPㆍI 전이억제 리포좀과 기존의 세포독성 활성을 갖는 항암제인 독소루비신과의 효능을 살펴보기 위해 B16F10 흑색종 세포를 이용하여 마우스에서 암의 전이억제를 측정하였다. 마우스당 2 ×10⁵개의 세포수를 정맥주사하였고, 주사한 지 1시간 후와 3일, 6일, 9일에 각각 33 ㎍의 독소루비신을 투여하였고, 또 다른 그룹에서는 TMPㆍI 리포좀에 25 ㎍ 독소루비신을 집어넣어 함께 투여하였다. 그 결과, 독소루비신을 단독으로 투여한 경우보다 TMPㆍI 리포좀을 사용하면 더 적은 양의 독소루비신을 사용해도 전이억제 효과가 더 좋은 것을 알 수 있었다[도 3].

실험예 8

TMPㆍI 리포좀의 세포독성과in vivo독성을 살펴보기 위해 두 종류의 리포좀을 제조하였다. 세포독성을 살펴보기 위해 TMPㆍI를 함유한 양이온성 리포좀을 이용해 암세포에 대한 세포독성 효과를 살펴보았다. 사람의 간암세포주(Hepatoma)인 SNU 398 세포와 마우스 흑색종 세포(Melanoma)주인 B16F10 세포를 배양한 후 TMPㆍI 함유 양이온성 리포좀[TMPㆍI : DOPE = 1 : 1 (무게비)]을 다양한 농도로 처리하여 세포독성 효과를 측정하였다[도 4]. 그 결과, 마우스 흑색종 세포주에서는 전혀 세포독성 효과를 나타내지 않았지만 사람의 간암세포의 경우에는 12.5 ㎍정도에서 세포사멸이 나타났고, 100 ㎍정도에서는 거의 모든 세포가 죽어있는 것을 관찰할 수 있었다. SNU 암 세포의 경우 LD₅₀는 25 ㎍정도였다[도 4].

TMPㆍI 함유 양이온성 리포좀을 마우스 복강에 2000 ㎍을 투여하고, 3일 및 6일 뒤에도 같은 방법으로 투여한 후 15일 후에 마우스를 관찰한 결과 TMPㆍI 리포좀의 투여로 인해 마우스의 사망이 관찰되지 않았고, DPPC/Chol/TMPㆍI 리포좀(5 : 5 : 1 몰비)을 마우스 정맥에 1000 ㎍ 투여하고, 3일 및 6일 뒤에도 같은 방법으로 투여했을 때에도 마우스의 사망이 관찰되지 않았다[표 6].

실험예 9

전이억제 리포좀과 에멀젼의 안정성을 제타사이저 3000 기계를 이용하여 시료를 4 ℃에서 보관하면서 리포좀과 에멀젼의 크기 변화로 안정성을 측정하였다. 그 결과, TMPㆍI 함유 양이온성 리포좀은 안정하였고, 이것은 증류수와 5% 덱스트로스 용액에서도 변화없이 안정하였다. PC based 리포좀의 경우, DPPC와 PEG-PE를 함유한 리포좀이 가장 안정한 상태를 유지하고 있었고, 에멀젼도 2개월 동안 매우 안정한 상태를 유지하고 있었다[도 5].

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 다양한 인지질의 조성 하에 암의 전이 및 성장을 억제하고, 다른 종류의 항암제들과 함께 사용할 경우 그 효과를 극대화시키는 상기 화학식 1로 표시되는 파이토스핑고신 유도체(TMP)를 함유하는 다기능성 리포좀을 제제화하였다. 이러한 전이억제 활성을 지닌 리포좀은 기존의 리포좀과는 달리 그 자체만으로도 전이억제를 나타내므로 항암활성을 나타내는 유전자를 체내에 도입하거나 항암제를 전달하는데 효용성 측면에서 매우 유용하게 활용될 수 있으며, 또한 항암물질의 투여량을 낮춤으로써 기존 항암제들이 나타내는 심각한 독성 및 인체에 대한 부작용을 줄일 수 있는 좋은 모델이 될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 파이토스핑고신 유도체가 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 항암제 :

[화학식 1]

상기 화학식 1에서: R¹, R²및 R³는 수소 또는 C₁∼ C₈의 알킬기를 나타내고, 다만 R¹, R²및 R³가 동시에 수소인 경우는 제외하며; X는 할로겐, 수산화기, 알킬 술포네이트기, 아릴 술포네이트기가 포함된 원자 또는 원자단을 나타낸다.
제 1 항에 있어서, 상기 파이토스핑고신 유도체가 N,N,N-트리메틸파이토스핑고신(N,N,N-trimethylphytosphingosine, TMP)인 것임을 특징으로하는 항암제.
제 1 항에 있어서, 상기 파이토스핑고신 유도체가 리포좀 또는 에멀젼 형태로 함유된 것임을 특징으로 하는 항암제.
제 1 항에 있어서, 상기 파이토스핑고신 유도체에 신생혈관 형성 억제제 또는 세포독성(cytotoxicity)를 나타내는 항암제가 함께 함유된 것임을 특징으로 하는 항암제.