KR100416031B1

KR100416031B1 - 칼시토닌 및 글루타르알데히드를 첨가하고, 자외선을 조사하여 가교화된 항석회화 돼지심장판막 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100416031B1
Application number: KR10-2000-0061103A
Authority: KR
Inventors: 활 서
Original assignee: (주)리젠메드
Priority date: 2000-10-17
Filing date: 2000-10-17
Publication date: 2004-01-31
Also published as: KR20020030838A

Abstract

본 발명은 돼지의 심장의 대동맥판막을 그루타르알데히드로 가교화함에 있어서, 자외선을 조사시키거나, 또는 항석회화제인 칼시토닌을 첨가하고 자외선(UV)을 조사시켜서 가교화한 돼지심장판막을 제공하는 것이며, 이렇게 제조된 돼지심장판막은 그루타르알데히드와 같은 화학물질 가교제에 의해 발생하는 부작용을 해결하는 동시에 효과적인 기계적 특성과 내구성을 향상시켜줌은 물론, 특히 항석회화 특성을 가지는 획기적인 가교화된 돼지심장판막을 제공하는 것이다.

Description

칼시토닌 및 글루타르알데히드를 첨가하고, 자외선을 조사하여 가교화된 항석회화 돼지심장판막 및 그 제조방법 {Anticalcification of porcine heart valve by adding calcitonin and glutaraldehyde and by irradiation of ultraviolet ray}

본 발명은 칼시토닌 및 글루타르알데히드를 첨가하고, 자외선을 조사하여 가교화된 항석회화 돼지심장판막 및 그 제조방법에 관한 것이다.

대동맥의 시작부에 위치한 판막은 심장의 좌심실로부터 공급되는 신선한 동맥혈이 역류되는 것을 막아주며, 유전적 혹은 병적 원인에 의해 손상될 경우 사망에 이르게 되므로, 대동맥 판막은 순환기 조직 중에 가장 중요한 위치를 차지하고 있다.

지금까지 손상된 판막은 금속으로 제작된 기계적 판막으로 대체하는 것이 일반적인 방법이며 폴리우레탄과 같은 고분자 재료로 제작하는 경우도 있으나, 이들은 표면에 혈액내에 존재하는 혈장 단백질이 흡착하여 혈전을 형성하는 위험이 있기 때문에 평생 항혈전제를 복용하여야 할 뿐만 아니라, 지속적으로 가해지는 박동성 혈류에 의해 판막을 구성하는 금속과 고분자에 피로가 누적되고 재료의 열화가 일어나므로 10년 이내에 재 수술하는 것이 보통이다.

한편 천연조직의 특성을 유지한 판막으로서 돼지판막을 글루타르알데하이드

(glutaraldehyde)로 처리하여 사용하는 경우도 있으며, 이 경우 동맥혈류에 대한 판막의 운동성을 천연적인 상태로 유지하지만, 화학적 처리에 기인한 석회화 (calcification)가 서서히 일어나므로 역시 10년 이내에 재수술해야 하는 경우가 대부분이다.

일반적으로 글루타르알데하이드로 판막의 구조체인 교원질을 가교화하면 교원질에 존재하는 라이실(lysil)의 ε-아미노산 잔기와 반응하여 분자내 또는 분자간 가교화를 일으키게 되어 교원질섬유체의 물리적 내력을 강화시킬 뿐만 아니라 그 결과 체내에서 교원질분해효소(collagenase)에 의한 조직의 분해를 막아주는 효과를 얻을 수 있다. 또한 글루타르알데하이드는 수용성이고 생리적 수소이온농도(pH 7.4)범위 안에서 반응을 일으킬 수 있다는 장점이 있으나 처리 후 잔류된 알데하이드기에 의해 세포독성을 일으키기 쉽고 또한 알데하이드기는 일단 혈액내에 존재하는 인산과 결합하면 이들 인산과 칼슘이 다시 결합하므로 인산칼슘을 형성하여 석회화를 일으키는 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

한편 일정한 범위의 파장을 가진 자외선을 교원질 분자를 가교화하기 위하여 사용이 시도되고 있다. 자외선은 교원질부자내의 타이로신(tyrosine), 히스티딘 (histidine), 페닐알라닌(phenylalanine)과 같은 방향족 아미노산에 자유 라디칼을 형성하여 불규칙적으로 결합하도로 하여가교화를 일으키는 것으로 알려져 있다. 본 출원의 발명자는 이를 이용하여 "자연골 치환영 인공골과 그 제조방법"(특허번호:122680)과 "진피재생유도용 다공성 교원질 이중구조 창상보호막"(특허번호:0271732) 에 대한 우리나라 특허를 각각 등록한 바 있다. 위 발명은 분산된 분자간의 가교화를 유도하기 위한 것이었으며, 본 발명의 대상인 천연조직의 교원질 구조를 유지하면서 가교화를 유도하기 위해서는 자외선 조사량이 중요하며, 자외선의 조직내 침투 정도가 가교화 총량에 직접적인 영향을 미친다. 그러나 돼지심장판막을 글루타르알데히드로 가교함에 있어서, 칼시토닌을 첨가하고, UV를 조사하여 항석회화된 돼지심장판막을 제조하는 기술은 개발되지 않았다.

따라서, 본 발명의 목적은 사람의 심장판막과 해부학적 형태와 크기가 유사한 돼지의 대동맥 판막을 칼시토닌 및 글루타르알데히드를 첨가하고, 자외선을 조사하여, 조직 구조체인 교원질을 가교화함으로써 기존에 사용하고 있는 화학적 처리 과정중에 잔류된 가교제에 의해 발생하는 세포독성과 석회화를 방지함으로써 안정적인 천연심장판막을 제공하는 것이며, 항칼슘물질의 하나인 칼시토닌을 제조 과정중에 첨가함으로서 교원질로 구성된 판막의 표면에 결합시킴으로써 항석회화 기능을 제고한 천연심장판막을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기의 천연심장판막의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 Hyp assay에 의한 실험결과로부터 leaflet의 가교화 정도가 UV조사에 의해 향상되었음과 UV조사시간에 의해 조절될 수 있음을 나타내는 그래프이다.

도 2는 UV조사에 의해 가교화된 leaflet과 GA처리에 의해 가교화된 leaflet에서의 석회화를 나타내는 그래프이다.

도 3은 석회화 실험 3일 후, GA로 24 시간 동안 가교화한 leaflet과, 어떠한 처리도 하지 않은 leaflet, UV를 24시간동안 조사하여 가교화 시킨 leaflet의 침적된 칼슘의 양을 나타내는 그래프이다.

도 4는 ICP를 이용한 [Ca]/[P] 몰비율의 변화 경향을 나타내는 그래프이다.

도 5는 EDS를 이용한 칼슘침적물의 구성성분에 대한 조사를 나타낸 그래프이다.

도 6a (A1 ∼ A4) 및 도 6b (B1 ∼ B4)는 EDS를 이용한 칼슘침적물의 구성성분에 대한 조사결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 침적된 칼슘의 양을 leaflet의 부피 및 무게 대비로 각각 나타낸 그래프이다.

판막을 포함한 돼지 심장 대동맥을 잘라내었다. 돼지 심장 대동맥을 잘라 얻은 후 24시간 내에 대동맥의 표면에 있는 모든 근육조직과 지질조직, 섬유조직을 제거하고 1 %(V/V) 항생제 (200 mM glutamine, 10,000 U penicillin, 10 mg streptomycin)를 포함한 0.9% (wt/vol) NaCl 용액에 4℃에서 저장하였다. 본 실험에서 사용하는 판막들은 실험전에 대동맥에서 잘라내어 항생제를 포함하는 0.9% (wt/vol) NaCl 용액에 4℃에서 저장하였다.

판막들은 3개의 실험그룹으로 나누어 졌는데, 대조그룹으로 어떠한 처리도 하지 않은 판막과, 0.625% GA로 24 시간 동안 가교화한 판막, UV ray (wavelength: 254 nm)의 조사에 의해 가교화한 판막그룹으로 실험하였다. UV 조사는 투명한 polymethylmethacrylate (PMMA) 상자에 판막을 넣어 UV chamber내에서 수행되었으며, 각 시편들은 4℃에서 1, 2, 4, 24 시간동안 10 W UV 램프에 노출된 상태로 UV를 조사하여 가교화시켰다. UV 램프와 시편의 거리는 5 inch가 되도록 시편을 위치시켰다. GA 용액은 0.05 M phosphate와 0.15 M NaCl, 12.5% GA로 최종 GA농도가 0.625%가 되도록 만들어졌으며 pH를 7.4로 보정하였다. 판막들은 솜을 채워넣어 가교화시 수축을 방지하였으며, 0.625% GA 용액내에 24 시간동안 4℃에서 가교화되었다. 가교화 후 시편들은 0.9% NaCl 용액으로 세척되었으며, 실험에 사용된 leaflet은 전처리된 판막으로부터 취득하였다. 이렇게 제조된 판막은 가교화정도의 평가, 플로우-타잎 방법(Flow-type method)를 이용한 석회화실험, ICP 방법(Inductively Coupled Plasma atomic Emission Spectrophotometer)를 이용한 화학적 분석, 현미경적 특성관찰(Microscopic characterization), 히스토케미칼적 관찰등의 실험을 통하여 평가하였다.

다음에 본 발명의 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

[실시예 1]

자외선 가교화 돼지 심장 판막의 제조 :

1. 돼지의 대동맥 기저부로부터 판막을 채취하고 즉시 통상적인 1 vol/vol %의 조직 보관용 항생제 포함 생리식염수(200mM 글루타민, 10,000U 페니실린, 10mg 스트렙토마이신)에 넣고 4℃에서 보관한다.

2. 24시간 이내에 판막 주위의 근육층, 지방층 및 섬유층을 제거한 다음 증류수로 세척한 다음 즉시 생리식염수에 넣고 4℃에서 보관한다.

3. 판막을 증류수로 완전 세척한다.

4. 투명한 아크릴제 상자속에 판막의 주위조직을 매달아 놓는다.

5. 밀폐된 온도조절가능한 함속에 판막이 들어있는 아크릴제 상자를 넣

고 질소를 주입하여 함내 공기 조건을 90 - 99% 질소상태 조절한다.

6. 4℃에서 파장 250 - 260 nm의 자외선을 1.20 - 1.70 mW/㎠ 의 조사량으로 2 - 12시간동안 조사한다.

7. 함내 질소포함 공기를 배기한 다음 생리 식염수로 세척한다.

8. 15℃ - 25℃로 가열하여 건조시킨다.

9. 생리식염수로 채운 밀폐된 반투명 용기에 놓고 4℃에서 보관한다.

[실시예 2]

항석회화 돼지 심장판막의 제조 :

1. 실시예 1의 1 내지 4의 공정은 동일하게 행한다.

2. 칼시토닌(calcitonin)을 포함한 수용액 (50 I.U/ ml)을 아크릴제 상자속에 넣는다.

3. 다음에 실시예 1의 5 내지 8의 공정은 동일하게 행한다.

4. 생리식염수로 세척한다.

5. 생리식염수로 채워진 밀폐된 반투명 용기에 넣고 4℃에서 보관한다.

[실험예 1]

가교화된 leaflet의 가교화정도 평가 :

가교화 정도는 콜라겐 섬유소에서 가교화에 참여하지 않은 하이드록시프롤린 (hydroxyproline : Hyp)의 양을 측정하는 것으로 평가하였다. 각 시편들(n=5/group)을 4㎖의 콜라지네이스(collagenase) 용액(100U/㎖ in 트리스하이드록시메틸아미노메탄(trishydroxymethylaminomethane), pH 7.4)에 넣어 37℃에서 5시간동안 분해반응을 시켰다. 효소에 분해반응에 의해 나오는 Hyp의 양을 측정하기 위해, 1㎖ 반응액을 유리시험관에 넣은 후, 차례로 1㎖ 0.01 M CuSO4, 2.5 N NaOH, 6% H2O2를 넣고 0℃에서 반응시켰다. 100rpm에서 5분 동안 반응시킨 후, 얼음이 들어있는 비이커에 바로 넣어 냉각(chilling)시켰다. 4㎖ 3.0 N H2SO4와 2㎖ 5% p-디메틸아미노벤즈알데히드 (dimethylaminobenzaldehyde) / 프로판올 (propanol)용액을 넣고 100rpm, 70℃에서 16분 동안 반응시켰다. 반응액을 96 well plate에 넣은 후, ELISA reader를 사용하여 580 nm에서 흡광도를 측정하였다.

콜라지네이스(Collagenase)에 의해 분해되고 남아있는 절편(leaflet)의 콜라겐의 양을 측정하기 위해, 효소반응 후 남아있는 절편들을 증류수로 세척한 후, 6N HCl 용액으로 100℃에서 24시간동안 가수분해 시켰다. 가수분해시킨 용액을 0.45㎛ 셀룰로오스 나이트레이트 막 필터(cellulose nitrate membrane filter)로 여과하여 비콜라젠성(non-collagenous) 잔기들을 제거하고 남은 용액을 -70℃에서 냉동건조하였다. 냉동건조하여 남은 물질들은 효소에 의한 분해 후 절편(leaflet)에 남아있는 콜라젠성(collagenous) 단백질로서 브래드포드(Bradford) 방법을 이용하여 남아있는 콜라젠성(collagenous) 단백질을 정량하였다.

[실험예 2]

Flow-type method를 이용란 in vitro 석회화 실험 :

석회화를 측정하기 위해 flow type method를 고안하여 실험하였다. 실험에서 사용하는 칼슘용액으로는 Na+ 142.0mM, K+ 5.0mM, Mg2+ 1.5mM, Ca2+ 2.5mM, Cl- 148.8mM, HCO3- 4.2mM and PO42- 10mM를 함유하고 있고 트리스하이드록시메틸아미노메탄(trishydroxymethylaminomethane)으로 pH 7.25로 조절된 칼슘용액을 이용하였다. 각 시험그룹에서의 시편들은 시험 용기내에 위치되었고, 연동펌프 (peristaltic pump)를 이용하여 칼슘용액을 50㎖/min의 유속으로 계속적으로 공급하여 주었다. 위의 과정은 37℃의 조건에서 3, 7, 10, 14, 21, 30일 동안 수행되었다.

[실험예 3]

Inductively Coupled Plasma atomic Emission Spectrometer (ICP)를 이용한 화학적분석 :

절편(Leaflet)에 침척된 칼슘과 인의 정량분석은 다음과 같은 과정을 통해 수행되었다. 각 석회화실험 후 각 시편들(n=3/group)을 증류수로 세척한 후, 30℃에서 24시간동안 진공건조시켰다. 건조된 leaflet의 부피를 각 시편들을 증류수가 들어있는 실린더에 넣었을 때 늘어나는 물의 부피로부터 측정하였고, 부피를 측정한 후, 각 시편들을 6N HCl용액에 넣어 100℃에서 24시간동안 가수분해시켰다. 가수분해시킨 용액을 0.45㎛ cellulose nitrate membrane filter로 필터를 하여 가수분해되고 남아있는 잔기들을 제거하고 남은 용액을 ICP를 이용하여 Leaflet에 침척된 칼슘과 인을 정량하였으며, leaflet의 부피에 대한 칼슘의 양으로 분석하였다.

[실험예 4]

Microscopic characterization :

Leaflet의 표면과 칼슘 침척물의 존재 여부, 그리고 칼슘 침척물의 화학적 구성성분을 energy disperse analysis of X-rays (EDS) 와 scanning electronmicroscopy (SEM)로 관찰하였다. 각 시편들을 증류수로 세척한 후 냉동건조 시켰다. 24시간동안의 고정 후에, 각 시편을 에탄올로 탈수시키고 보관하였다. 탈수 후 각 시편들은 ion coater를 이용하여 gold coating을 시키고 20kV의 accelerating voltege의 조건에서 관찰하였다.

[실험예 5]

Histochemical observation :

석회화실험 3일과 14일 후, GA로 가교화한 leaflet과 UV를 24시간동안 조사하여 가교화한 leaflet에 대해 histochemical observation을 하였다. 각 시편들을 증류수로 세척한 후 냉동건조 시켰다. 24시간동안의 고정 후에, 각 시편을 에탄올로 탈수시키고 보관하였다. 탈수 후 각 시편들은 glass knive를 이용하여 2-3㎛의 두께로 잘라낸 후 hematoxylin and eosine (HE) 염색을 하였고, 또한 칼슘과 인에 의해 형성된 석회화된 침척물을 확인하기위해 von Kossa 염색을 한 후, 광학현미경으로 관찰하였다.

[결과 및 고찰]

A. 결과 :

1. UV조사에 의한 leaflet의 가교화 정도 :

Hyp assay에 의한 실험결과로부터 leaflet의 가교화 정도가 UV조사에 의해 향상되었음과 UV조사시간에 의해 조절될 수 있음을 알 수 있었다.그 결과를 제 1도에 나타내었다. (도 1). Collagenase에 의해 분해되어 나온 Hyp의 양으로부터 leaflet의 가교화 정도를 알 수 있다. 어떠한 처리도 하지 않은 leaflet과 0.625% GA로 24 시간 동안 가교화한 leaflet으로부터 나온 Hyp의 양은 62.92± 2.17㎍/ mg과 4.26± 1.47㎍/ mg이었고, UV를 1, 2, 4, 24시간동안 조사하여 가교화 시킨 leaflet으로부터 나온 Hyp의 양은 51.95± 5.13㎍/ mg, 16.91± 2.29㎍/ mg, 11.11± 1.05㎍/ mg, 9.35± 1.05㎍/ mg 이었다. 대체적으로 GA로 24 시간 동안 가교화한 leaflet으로부터 나온 Hyp의 양이 다른 그룹들과 비교하여 가장 낮았으며, UV를 조사하여 가교화 시킨 leaflet의 경우 UV조사시간이 길수록 분해되어 나온 Hyp의 양이 줄어들었고 특히 조사시간이 2시간이상 될 경우 분해되어 나온 Hyp의 양이 통계적으로 큰 차이가 나지 않았다. UV 조사에 의해 가교화한 경우 GA를 이용하여 가교화한 것보다는 효소에 의해 비교적 쉽게 분해되었으나, 어떠한 처리도 하지 않은 그룹보다는 효소에 의한 분해에 큰 저항성을 갖고 있었다.

2. UV조사에 의해 가교화된 leaflet과 GA처리에 의해 가교화된 leaflet에서의 석회화 :

UV조사에 의해 가교화된 leaflet의 석회화의 정도는 UV 조사시간과는 크게 연관성이 없었다. 석회화 실험 14일 후, UV를 1, 2, 4, 24시간동안 조사하여 가교화 시킨 leaflet에 침적된 칼슘의 양은 502.6 ± 12.3 ㎍/㎤, 547.5 ± 34.1 ㎍/㎤, 564.3 ± 26.1 ㎍/㎤, 543.0 ± 55.5 ㎍/㎤ 이었다. . 어떠한 처리도 하지 않은 leaflet에서 침적된 칼슘의 양 470.4 ± 37.0 ㎍/㎤과 비교하면 UV조사에 의해 가교화된 leaflet의 침적된 칼슘의 양은 상대적으로 많은 편이지만, 계학적으로 유의하게 차이가 나지는 않았다. 그 결과를 제 2도에 나타내었다. 반면에, GA로 24 시간 동안 가교화한 leaflet에 침적된 칼슘의 양은 어떠한 처리도 하지 않은 leaflet과 UV조사에 의해 가교화된 leaflet의 침적된 칼슘의 양보다 상대적으로 매우 많았다. 석회화 실험 3일 후, GA로 24 시간 동안 가교화한 leaflet과, 어떠한 처리도 하지 않은 leaflet, UV를 24시간동안 조사하여 가교화 시킨 leaflet의 침적된 칼슘의 양은 257.6 ± 23.5 ㎍/㎤, 57.7 ± 10.2 ㎍/㎤, 108.6 ± 7.6 ㎍/㎤ 이었으며, 그 결과를 제 3도에 나타내었다. 공통적으로 모든 실험그룹에서 침적된 칼슘의 양은 시간에 비례하여 증가하였다.

3. ICP를 이용한 [Ca]/[P] 몰비율의 변화 경향 :

모든 실험그룹에서 침적된 [Ca]/[P] 몰비율은 시간이 지남에 따라 감소하였다. 그 결과를 제 4도에 난타내었다. GA로 24 시간 동안 가교화한 leaflet에서의 [Ca]/[P] 몰비율은 다른 그룹에 비하여 상대적으로 천천히 감소하였다. 석회화 실험 14일 후, GA로 24 시간 동안 가교화한 leaflet과 어떠한 처리도 하지 않은 leaflet에 침적된 칼슘침적물에서의 [Ca]/[P] 몰비율은 2.70 ± 0.31과 1.83 ± 0.13이었으며, UV를 1, 2, 4, 24시간동안 조사하여 가교화 시킨 leaflet의 침적된 칼슘침적물에서의 [Ca]/[P] 몰비율은 1.85 ± 0.11, 1.75 ± 0.07, 1.73 ± 0.05, 1.81 ± 0.08 이었다. 석회화 실험 31일 후에는 GA로 24 시간 동안 가교화한 leaflet과 어떠한 처리도 하지 않은 leaflet에 침적된 칼슘침적물에서의 [Ca]/[P] 몰비율은 1.88 ± 0.08과 1.72 ± 0.04이었으며, UV를 1, 2, 4, 24시간동안 조사하여 가교화 시킨 leaflet의 침적된 칼슘침적물에서의 [Ca]/[P] 몰비율은 1.70 ± 0.03, 1.69 ± 0.02, 1.69 ± 0.04, 1.71 ± 0.05 이었다. 이러한 [Ca]/[P] 몰비율의 감소현상으로부터 칼슘이 인보다 먼저 침적된다는 것을 알 수 있다.

4. EDS를 이용한 칼슘침적물의 구성성분에 대한 조사 :

X-ray 분석을 이용하여 칼슘침적물의 구성성분에 대해 조사해 본 결과, 칼슘침적물은 주로 칼슘과 인으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 또한 적은 양이지만 마그네슘과 나트륨도 칼슘침적물에 소량 포함되어 있음을 알 수 있었다. 그 결과를 제 5도에 나타내었다. 제 5도에서 보이는 상대적으로 매우 높은 Ca와 O peak는 leaflet의 성분에 의한 것으로 해석된다.

5. UV조사에 의해 가교화된 leaflet과 GA처리에 의해 가교화된 leaflet의 조직학적 검사 :

HE 염색 결과로부터 GA처리에 의해 가교화된 leaflet에 석회화 실험 3일과 14일 후 까지도 세포가 leaflet내에 고정되어 있음을 관찰 할 수 있었으며 (도 6a, A2와 A4), von-Kossa 염색결과로부터 고정되어 있는 세포 주변으로 칼슘침적물이 주로 형성되어 있음을 관찰할 수 있었다 (도 6a, A1과 A3). GA처리에 의해 가교화된 leaflet과는 달리, UV를 조사하여 가교화 시킨 leaflet의 내부에서는 세포와 칼슘침적물이 관찰되지 않았다 (도 6b, B1-B4).

B. 고찰 :

석회화는 손상된 조직에서의 칼슘염의 침적현상으로 알려져 있다. 이러한 석회화는 단순히 죽은 세포로부터 유래된 칼슘의 침적만을 말하는 것이 아니라, 생체내 유체의 흐름과 순환으로부터 유래된 세포외적인 칼슘의 침적현상까지 포함하고 있다. 심장판막의 기계적 특성 및 내구성을 향상시키기 위하여 GA를 처리하는 대체판막의 경우, GA가 석회화의 과정을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 이러한 GA에 의한 석회화 현상은 GA를 처리하기 전에 글루타민산(glutamic acid)과 아미노디포스페이트(aminodiphosphate)같은 아미노 화합물(amino compounds)을 전처리한 경우, 이들 화합물이 GA의 활성형태인 알데히드(aldehyde)자유기와 결합하여 GA에 의한 석회화의 과정을 저지시킨다는 보고로부터 GA와 석회화의 연관성을 알 수 있다. 이러한 보고로부터 GA가 칼슘-인으로 구성된 침전물의 핵을 형성시키는 유도물질로서 작용한다는 것을 알 수 있다. 본 발명에서는 판막의 내구성을 향상시키기 위한 방법으로 GA처리와 UV조사를 사용하였으며 이와 관련된 석회화의 현상에 대해 조사하였다. UV조사시간이 증가함에 따라 2시간까지는 가교화 정도가 증가하였으나, 2시간 이상의 조사시간에서는 더 이상 뚜렷하게 가교화 정도가 증가되지 않았다. 이 결과로부터 2시간 이상의 UV 조사는 콜라겐 분자내의 가교화에 더 이상 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있었다. 또한 UV 조사에 의한 가교화 정도가 GA처리에 의한 것보다는 많이 일어나지는 않았지만 어떠한 처리도 하지 않은 leaflet보다는 많이 가교화가 되었다. 이러한 결과로부터 어떠한 처리도 하지 않은 leaflet과 비교하였을 때, UV조사에 의해 조직내의 가교화가 일어나서 효소에 의한 분해에 대해 저항성을 가지며 기계적인 특성과 내구성이 향상되었음을 알 수 있었다. UV 조사에 의한 가교화는 콜라겐 분자 중 티플 헬릭스(tiple helix)의 외부에 존재하는 타이로신(tyrocine), 히스티딘(histidine), 페닐알라닌(phenylalanine)과 같은 방향족 아미노산(aromatic acid) 잔기에 반응성 자유기가 도입되어 가교화가 일어나는 것으로 알려져 있다. 하지만, UV 조사에 의한 가교화에서는 방향족 아미노산 수가 한정되어 있으므로 가교화 정도도 한계를 가지게 된다.

본 발명에서는 침적된 칼슘의 정량과 관련하여 일반적으로 쓰이는 leaflet의 무게에 대한 칼슘의 양으로 나타내지 않고 leaflet의 부피에 대한 칼슘의 양으로 나타내었다. 도 7에서 보듯이 부피에 대한 칼슘의 양으로 결과를 나타내었을 때 시간에 따른 차이가 더 명확하였다. GA나 포름알데하이드 같은 화학물질들은 콜라겐으로 구성된 재료의 내구성과 기계적 특성을 높이기 위한 가교제로서 널리 이용되고 있지만, 이들 화학물질들은 조직의 수축과 같은 외면적인 변형을 수반할 뿐만 아니라 조직의 무게도 증가되기 때문에 석회화에 대한 결과를 나타낼 때 영향을 주게된다.

제 2도와 3도에서 보듯이 석회화 정도는 UV 조사시간과는 연관성이 없었으며, GA를 처리하여 가교화한 leaflet의 석회화는 어떠한 처리도 하지 않은 leaflet과 UV조사에 의해 가교화한 leaflet에서보다 많이 일어났다. 이들 결과는 석회화의 정도는 가교화의 정도와는 연관성이 없음을 나타낸다. GA에 의해 가교화된 leaflet은 다른 시험그룹에 비하여 석회화가 빠르고 많이 진행되었나, 7일 이후에는 UV조사와 GA 처리에 의해 가교화한 leaflet에서의 석회화 정도가 비슷하게 되었다. 이는 GA 처리 후에 남아있는 알데히드(aldehyde)기가 석회화와 밀접한 관련을 가지며 촉진시키는 것으로 생각된다. 석회화는 조직내의 죽은 세포와 그 세포막 절편들에서 시작되는 것으로 알려져 있으며, 이는 GA의 처리에 의해 죽은 세포들에서 인성분의 평형이 깨지면서 세포내외에 인성분들이 과량으로 분포되어 석회화를 유도하는 것으로 알려져오고 있다. 제 6도에서 보듯이 GA의 처리 시 가교화된 조직내에 죽은세포들이 고정되어 이들 죽은 세포 주변으로 석회화가 일어났음을 알 수 있으며, 이는 GA가 석회화에 간접적으로 큰 영향을 미친다는 것을 알려준다. 이러한 GA에 의한 부작용을 해결하기위해 많은 반석회화(anticalcification) 처리방법이 많이 연구되어오고 있으나, 아직까지는 석회화를 완전히 해결할 수 있는 방법이 나오고 있지는 않다. 석화화를 막는 일련의 연구로서 세척제(detergents)의 처리 방법이 적용되오고 있는데, 이는 석회화를 일으키는 한 요소로서의 인지질을 제거함으로써 석화화를 방지하는 원리를 이용하는 것이다. 그러나 세척제(detergent)의 처리는 그 효과가 한시적으로서 혈액(blood)으로부터 인지질이 재흡수되어 다시 석회화가 진행하게 된다. 또 하나의 석화화를 방지하는 바람직한 방법은 가교제로서 GA와 같은 화학물질을 사용하지 않는 것이며, 본 연구에서는 UV조사에 의한 가교화 방법을 도입하였다. GA를 처리한 그룹과 비교했을 때, 본 발명에 의한 UV 조사에 의해 가교화된 leaflet내에서는 GA처리 시 나타난 고정된 세포에 의한 석회화 현상이 나타나지 않았다.

석회화의 초기에는 칼슘을 포함하는 복합체 가 형성되어 석회화의 전구물질인 미네랄상이 형성된다. 이 복합체는 무기질 인과 반응하여 칼슘-인으로 구성된 석회화의 핵으로 발전하게된다. 본 연구에서도 석회화의 초기에 칼슘이 먼저 침적되고 인이 그후에 침적되는 현상을 확인 할 수 있었다. 이는 칼슘이 석회화의 초기에 중요한 역할을 한다는 것을 알려주며, 이들 침적된 칼슘이 인과 결합하여 석회화의 핵으로 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 석회화는 생체재료가 혈액등의 수환계에 삽입되었을 때 주로 일어나며, 이러한 현상은 경조직 뿐만 아니라 뼈와같은 단단한조직내에서도 일어난다. 석회화의 주 미네랄상은 아파타이트로서, 특히 하이드록시아파타이트(Ca10[PO4]6[OH2]2)가 주를 이루며 이 복합체의 칼슘과 인의 몰 비율은 1.67로 알려져 있다. 본 연구에서 수행한 전자현미경을 이용한 분석으로부터 칼슘과 인으로 주로 구성된 침적물의 화학조성이 하이드록시아파타이트와 비슷함을 알 수 있었다.

돼지심장판막과 글루타르알데히드와의 가교에 있어서, 본 발명에 의한 칼시토닌과 글루타르알데히드를 첨가하고, UV 조사에 의한 가교화 방법이 GA와 같은 화학물질 가교제에 의해 발생하는 부작용을 해결하는 동시에 효과적인 기계적 특성과 내구성을 향상시켜줌은 물론 항석회화 기능을 가지는 획기적인 가교화 방법이다.

Claims

돼지의 심장의 대동맥판막을 글루타르알데히드로 가교화함에 있어서, 항석회화제인 칼시토닌을 첨가하고, 자외선(UV)을 조사시켜서 가교화함으로써 얻어진 항석회화 기능을 가지는 돼지심장판막.
(삭제)
돼지의 심장의 대동맥판막을 글루타르알데히드로 가교화함에 있어서, 항석회화제인 칼시토닌을 첨가하고, 자외선(UV)을 조사시켜서 가교화함을 특징으로 하는 항석회화 기능을 가지는 돼지심장판막을 제조하는 방법.