KR100411720B1 - 센다이 바이러스 외피 단백질을 이용한 바이로좀 및 그의제조방법 - Google Patents

센다이 바이러스 외피 단백질을 이용한 바이로좀 및 그의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 센다이(Sendai) 바이러스의 외피 단백질을 이용한 바이로좀(virosome) 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이로좀은 센다이 바이러스로부터 외피 단백질을 정제하고, 전기 외피 단백질에 지질, DNA 및 계면활성제를 혼합하여 DNA를 캡슐화(encapsulation)함으로써 바이로좀을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, 바이로좀의 제조시 센다이 바이러스의 외피 단백질을 정제하여 사용함으로써 제조 및 보관이 용이하고, 이에 포함되는 단백질의 양을 정량적으로 조절할 수 있게 되므로 유전자 이입 효율을 극대화 및 일정화시키는 장점이 있다. 아울러, 본 발명의 바이로좀은 기존의 양이온 리포좀보다 트랜스펙션 시간이 짧고, 세포독성이 적으며, 센다이 바이러스 DNA와 내부 단백질을 완전히 제거하고 외피 단백질만을 사용하여 면역반응 유도를 최소화하였으므로, 질병치료의 유전자 요법에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

센다이 바이러스 외피 단백질을 이용한 바이로좀 및 그의 제조방법{Virosomes Containing Envelope Proteins of Sendai Virus and Process for Preparing the Same}
본 발명은 센다이(Sendai) 바이러스의 외피 단백질을 이용한 바이로좀(virosome) 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 유전자의 세포내 이입 및 발현의 매개체로 사용하기 위하여 센다이 바이러스의 외피 단백질을 정량적으로 이용하여 DNA를 캡슐화한 바이로좀 및 전기 바이로좀을 제조하는 방법에 관한 것이다.
유전자를 이용한 질병 치료법에서 가장 중요한 단계는 세포내로 유전자를 효율적으로 이입하여 발현시키는 것이다. 이에, 동물 세포에 유전자를 이입하기 위한 여러가지 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터가 개발되었고, 특히 세포 또는 조직내로 유전자를 이입시킬 때는 바이러스 벡터가 효율적인 것으로 알려져 있다. 그러나, 바이러스 벡터를 임상적으로 적용할 때는, 면역반응 유발 및 종양발생 등의 역효과가 우려되므로 사용이 제한되어 왔다(참조: Salmons, B. and Gunzburg, W.H., Hum. Gene Ther., 4:129-141, 1993).
따라서, 전기 바이러스 벡터의 부작용을 줄이기 위하여, 유전자 요법의 임상 실험 뿐만 아니라, 실험실에서의 유전자 조작에도 지질을 이용한 유전자 이입방법이 널리 이용되어 왔다. 최근에는, 유전자 이입의 효율성도 높히고 유전자의 발현을 오래 지속시킬 수 있는 여러가지 다른 조성의 양이온 리포좀이 개발되었으나(참조: Felgner, J.H. et al., J. Biol. Chem., 269:2550-2561, 1994; Gao, X. and Huang, L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179:280-285, 1991; Gao, X. andHuang, L. Biochemistry, 35:1027-1036, 1996), 질병치료의 유전자 요법에 사용하기에는 미흡한 것으로 나타났다. 실제로, 양이온 리포좀은 체외 유전자 발현에서는 바이러스 벡터와 동등한 유전자 이입률을 보이나, 체내 유전자 발현, 그중에서도 전신적 투여를 통한 유전자 발현은 치료효과를 거두기에는 아직도 부족하다.
이에, 최근에는 '바이로좀'이라 불리우는 새로운 형태의 리포좀이 개발되었는 바, 이는 유전자 전달 및 발현측면에서 효과적이었으나, 순수한 바이러스 지질 및 단백질을 이용하여 제조하므로 대량생산이 불가능하다는 단점이 있었다.
한편, 센다이 바이러스는 세포를 융합시켜 이핵체(heterokaryon)를 만드는데 널리 사용되어 왔으며, 바이러스 외피의 F-당단백질은 바이러스가 매개하는 세포막 융합(membrane fusion)을 증진시키고(참조: Hoekstra, D. et al., Biochemistry, 23:5675-5681, 1984; Maeda, T. et al., Biochemistry, 14:3736-3741, 1975), 적혈구응집소-뉴라민분해효소(hemagglutinin-neuraminidase, 이하 'HN'라 함)-당단백질은 세포막의 시알로당단백질(sialoglycoprotein)이나 시알로당지질(sialoglycolipid)에 부착하여 세포를 고정시키는 역할 및 세포막 융합에도 직접 관여하는 것으로 알려져 있다(참조: Hoekstra, D. and Klappe, K., J. Virol., 58:87-95, 1986; Henis, Y.I. et al., Exp. Cell Res., 160:514-526, 1985).
이러한 연구를 바탕으로, 센다이 바이러스와 리포좀을 융합시킨 세포막융합활성 리포좀(fusogenic liposome)을 개발하고자 하는 노력이 행하여져 왔고, 일례로 융합 HVJ(hemagglutinating virus of Japan)-리포좀이 개발되어(참조:Naganishi, M. et al., Exp. Cell Res., 142:95-101, 1982), 동물세포로 유전자를 이입하는 매개체로 사용한 결과, 양이온 리포좀보다는 효율적인 것으로 보고되었다(참조: Mizuguchi, H. et al., Exp. Cell Res., 142:95-101, 1982). 그러나, HVJ-리포좀은 유전자를 포함하는 미리 제조된 리포좀에 불활성화시킨 센다이 바이러스를 혼합하여 배양시키므로써 유전자 이입을 유도하므로, 리포좀 형성조건에 따라 유전자 이입의 효율이 일정하지 않고, 제조 및 보관이 용이하지 않음은 물론, 바이러스 전체를 사용하였으므로 면역반응의 유발 가능성 등의 문제점이 있는 것으로 나타났다.
따라서, 세포융합에 있어서 센다이 바이러스의 장점을 활용하여 보다 효과적이고 일정한 효율로 유전자 이입을 매개하고, 제조공정 및 보관이 용이하며 면역반응을 유도하지 않는 안전한 센다이 바이로좀을 개발하려는 노력이 계속되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 이러한 유전자 이입의 효율을 일정하게 조절할 수 있고 세포독성이 적은 바이로좀과 그를 제조하는 방법을 확립하고자 예의 연구 노력한 결과, 센다이 바이러스의 외피 단백질에 지질, DNA 및 계면 활성제를 혼합하고 투석하여 DNA를 캡슐화함으로써 바이로좀을 제조할 수 있으며, 전기 제조된 바이로좀은 세포내로 DNA이입 효율을 증가시키고, 바이로좀의 제조에 사용되는 단백질 및 DNA양의 조절을 통해 효율적으로 DNA 이입이 이뤄질 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 센다이 바이러스의 외피 단백질을 이용한 바이로좀의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 제조방법에 의하여 제조된 바이로좀을 제공하는 것이다.
도 1a는 F-바이로좀 재구성에 사용된 센다이 바이러스 F-단백질의 농도 변화가 유전자 트랜스펙션에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 1b는 F/HN-바이로좀 재구성에 사용된 센다이 바이러스 F/HN-단백질(F-단백질 및 적혈구응집소-뉴라민분해효소의 혼합물)의 농도 변화가 유전자 트랜스펙션에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 F-바이로좀을 이용한 트랜스펙션에서 DNA의 양에 따른 유전자의 이입/발현의 변화를 측정한 그래프이다.
도 2b는 F/HN-바이로좀을 이용한 트랜스펙션에서 DNA의 양에 따른 유전자의 이입/발현의 변화를 측정한 그래프이다.
도 3은 F-바이로좀, F/HN-바이로좀 및 종래기술의 양이온 리포좀을 이용하여 트랜스펙션 시간에 따른 유전자의 이입/발현을 측정한 그래프이다.
본 발명의 센다이 바이러스의 외피 단백질을 이용하여 정량적으로 재구성한 바이로좀은 센다이 바이러스로부터 외피 단백질을 정제하는 단계; 및, 전기 외피 단백질에 지질, DNA 및 계면활성제를 혼합하고 투석하여 DNA를 캡슐화(encapsulation)함으로써 바이로좀을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된다.
이하, 본 발명의 바이로좀의 제조방법을 단계별로 설명하고자 한다.
제 1단계: 센다이 바이러스 외피 단백질의 정제
센다이 바이러스로부터 외피 단백질을 정제하는 단계이다: 이때, 센다이 바이러스 외피 단백질 중, F-단백질 또는 F-단백질 및 적혈구응집소-뉴라민분해효소의 혼합물(이하, 'F/HN-단백질'이라 함)을 공지의 방법을 약간 변형한 단계적 원심분리법(sequential centrifugation)에 의하여 정제할 수 있으며, F-단백질의 경우는 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 포함하는 완충액에 현탁하고, F/HN-단백질은 F-단백질의 경우와 동일한 조성이나 디티오트레이톨을 포함하지 않는 완충액에 현탁하여 역시 단계적 원심분리법에 의하여 정제할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
제 2단계: 바이로좀의 제조
전기 정제된 외피 단백질, 즉 F-단백질 또는 F/HN-단백질에, 지질, DNA 및 계면활성제와 혼합하고 투석하여 DNA를 캡슐화함으로써 바이로좀을 제조한다: 이때, 지질 및 계면활성제를 사용하여 센다이 바이러스 외피 단백질로 DNA를 캡슐화하여 바이로좀이 형성되는 과정은 투석하는 과정에서 계면활성제가 제거되면서 자발적으로 형성된다(참조: Philippot, J. et al., Biochem. Biophys. Acta, 734:137-143, 1983). 외피 단백질의 지질에 대한 비율은 바람직하게는 1:1000 내지 1:50(w/w)이며, 보다 바람직하게는 1:200 내지 1:100(w/w)이다. 바이로좀의 지질성분으로는 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 포스파티딜세린이며, 이들의 가장 바람직한 비율은 4.8:2:1의 몰비율이다. 포스파티딜세린은 트랜스펙션의 효율을 크게 향상시켜 바이로좀내로 캡슐화되는 유전자의 발현 효율을 높이게 된다. 아울러, 계면활성제는 옥틸글루코사이드(octylglucoside, 이하 'OG'라 함)를 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 캡슐화되는 DNA는 질병 치료의 유전자요법을 위한 유전자가 사용될 수 있으며, 그 밖에 유전자 요법을 위한 실험실의 연구를 위한 유전자도 사용가능하다.
본 발명에서는 F-단백질을 이용하여 제조된 바이로좀을 "F-바이로좀", F/HN-단백질을 이용하여 제조된 바이로좀을 "F/HN-바이로좀"이라 명명하였다.
전기 2단계에 의하여 제조된 바이로좀을 실험실적(in virto) 또는 생체내(in vivo)에서 트랜스펙션시켜 바이로좀으로 캡슐화된 DNA의 이입 및 발현 효율을 측정할 수 있는 바, 본 발명의 실시예에서는 형질전환된 사람의 신장 세포(293 세포, ATCC, USA)내로 F-바이로좀 및 F/HN-바이로좀을 트랜스펙션시켜 유전자 이입 및 발현 효율을 측정하였다. 그 결과, F-바이로좀 및 F/HN-바이로좀 성분의 지질에 대한 단백질의 비율이 각각 200:1과 100:1일 때 가장 높게 나타났으며, 이는 같은 조건하에 제조된 양이온 리포좀보다 현저히 증가된 값임을 확인할 수 있었다. 아울러, 전기 사람의 신장 세포를 대상으로 트랜스펙션시켰을 경우, 기존의 양이온 리포좀은 최대효율에 도달하는데 4시간이 걸리는데 반하여, 트랜스펙션 시간이 2시간이 될 때 최대효율을 나타내었으며, 독성 또한 적은 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 바이로좀은 바이로좀의 제조시 센다이 바이러스의 외피 단백질을 정제하여 사용함으로써 제조 및 보관이 용이하고, 이에 포함되는 단백질의 양을 정량적으로 조절할 수 있게 되므로, 유전자 이입 효율을 극대화 및 일정화시키는 장점이 있다. 아울러, 통상적으로 이용되는 양이온 리포좀과 비교할 때,체내 유전자 이입에 저해요인으로 작용하는 리포좀 표면의 양이온성을 제거할 수 있는 장점을 가진다. 게다가, 본 발명의 바이로좀은 기존의 양이온 리포좀보다 트랜스펙션 시간이 짧고, 세포독성이 적으므로 실험실에서 세포내 DNA 이입에 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 센다이 바이러스 DNA와 내부 단백질을 완전히 제거하고 외피 단백질만을 사용하여 면역반응 유도를 최소화하였는 바, 질병치료의 유전자 요법에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 센다이 바이러스 외피 단백질의 정제
센다이 바이러스는 다음과 같은 방법으로 수득하였다: 센다이 바이러스 원종(stock, ATCC, U.S.A.)을 4 적혈구응집 단위(hemagglutinating unit)가 들어 있는 인산염 완충 액(phosphate buffered saline, pH 7.4 이하 'PBS'라 함)으로 희석한 후, 10일된 배아가 들어 있는 계란의 요막낭(allantoic sac)에 접종하여 증식시켰다(참조: Bagai, S. et al., J. Virol., 67:3312-3318, 1993). 그런 다음, 전기 요막낭을 37℃에서 72시간 배양하고, 요낭액(allantoic fluid)을 채취하여 4℃에서 3,000g로 30분간 원심분리하여 부유물을 침전시킨 후, 상등액을 4℃에서 100,000g로 1시간 원심분리하여 바이러스 펠렛을 수득하였다. 바이러스 펠렛은 소량의 PBS에 현탁하여 -70℃에서 보관하였다.
전기 수득한 센다이 바이러스로부터 센다이 F-단백질 또는 F/HN-단백질은 공지의 방법(참조: Tomasi, M. and Lotyter, A., FEBS lett., 131:381-385, 1981)을 일부 변형하여 다음과 같이 순수 분리되었다. 즉, 우선 F-단백질만을 정제하기 위하여, 먼저 바이러스 펠렛을 3mM 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT, Sigma Chemical Co., U.S.A.)을 포함하는 4 ml 완충액 A(150mM NaCl, 20mM Tris, pH 8.4)에 현탁하였다. 이어, 바이러스 현탁액을 37℃에서 2시간 방치한 후, 4℃에서 16시간 동안 완충액 B(150mM NaCl, 10mM Tris, 2mM Ca2+, 2mM Mg2+, pH 7.4)에 대하여 투석하였다. 바이러스 용액은 4℃에서 100,000g로 1시간 원심분리한 후, 펠렛은 옥틸글루코사이드(OG)를 포함하는(1:4, 단백질:OG, w/w) 완충액 B에 재현탁하고, 20℃에서 1시간 방치하였다. 이어, 현탁액을 4℃에서 100,000g로 1시간 원심분리하여 계면활성제에 녹지 않는 물질을 제거하였다. 한편, F/HN-단백질을 정제하는 방법은 DTT 처리단계를 제외하고는, F-단백질을 정제하는 방법과 동일하게 수행되었다.
전기 분리된 단백질의 정량은 브래드포드(Bradford) 단백질 분석법(참조: Bradford, M., Anal. Biochem., 72:248-254, 1976)을 이용하여 실시하였다. 아울러, 전기 정제된 바이러스 외피 단백질을 확인하기 위하여, 10% SDS-PAGE를 수행한결과, F-단백질 밴드는 45kD, HN-단백질 밴드는 66kD 위치에서 각각 비교적 순수하게 분리되었음을 알 수 있었다. F/HN-단백질에서 F-단백질과 HN-단백질의 혼합비율은 대략 1:1(w/w)이었다.
실시예 2: DNA를 캡슐화(encapsulation)한 센다이 바이로좀의 제조
녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, 이하 'GFP'라 함)을 발현하는 pEGFP-N1(참조: Chalfie, M. et al., Science, 263:802-805, 1984)을 리포터 플라스미드로 사용하여, 전기 DNA를 포함하는 센다이 F- 또는 F/HN-바이로좀을 계면활성제 투석법(detergent dialysis method, 참조: Sechoy, O. et al., Biochem. Biophys. Acta, 857:1-12, 1986)으로 제조하였다: 바이로좀의 지질 성분으로는 계란 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, 이하 'EPC'라 함, Avanti Polar Lipids Co., U.S.A.), 포스파티딜세린(phosphatidylserine, 이하 'PS'라 함, Avanti Polar Lipids Co., U.S.A.) 및 콜레스테롤(cholesterol, 이하 'Chol'라 함, Sigma Chemical Co., U.S.A.)을 사용하였다. 이때, PS의 첨가는 트랜스펙션의 효율을 크게 향상시키는 것으로 나타났다. 즉, 지질의 구성물로 PS를 포함한 F- 및 F/HN-바이로좀은 PS가 없이 같은 방법으로 제조된 바이로좀보다 높은 유전자 발현을 나타냈다. 몰비율 4.8:2:1의 EPC/Chol/PS 지질 혼합물, 전기 정제한 센다이 바이러스 외피 단백질(F-단백질 또는 F/HN-단백질) 및 DNA를 50mM 옥틸글루코사이드(OG)가 첨가된 0.5ml PBS에 용해시키고, 혼합액을 PBS에서 24시간 이상 투석하였으며, 투석하는 동안 투석액을 바이오 비드(Bio-Beads)를 이용하여 두번 교환하였다(참조: Vainstein, A. et al., Biochem. Biophys. Acta, 773:184-188, 1984). DNA를 캡슐화한 센다이 바이로좀은 유리 DNA를 제거하지 않고, 그대로 다음 실시예에 사용하였다.
실시예 3: 센다이 바이로좀의 유전자 이입 효율 분석
전기 제조된 바이로좀의 유전자 이입 효율은 형질전환된 사람의 신장세포(이하 '293 세포'라 함, ATCC, U.S.A.)를 사용하여 실험실 조건에서 측정하였다. 여러 가지 조건에 따른 유전자 이입 및 발현의 효율을 측정하기 위하여, 293 세포의 유지 및 배양, 트랜스펙션, 발현된 단백질의 측정은 다음과 같은 방법으로 실시하였다: 즉, 293 세포는 24-웰 플레이트에 웰당 1 x 105개씩 분주하고, 10%의 송아지 태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2조건하에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포는 세척한 후, 혈청을 제외하고, 10mM CaCl2및 DNA를 캡슐화한 센다이 바이로좀을 첨가한 배지에서 일정시간 트랜스펙션시킨 후, 혈청을 포함하지 않는 배지를 제거하고 혈청을 포함하는 배지를 첨가한 후 37℃, 5% CO2조건하에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 트랜스펙션된 세포는 회수하여 2mM EGTA를 포함하는 PBS 500㎕에 재현탁하고, 초음파파쇄법(ultrasonication)으로 분쇄시켰다. 리포터 유전자의 발현 산물인 GFP의 농도는 형광 분광광도계(Hitachi, Japan)를 사용하여 λex488, λem507에서 세포 분쇄물의 형광강도를 측정함으로써 결정하였다(참조: Miller, C.R. et al., Biochemistry, 37:12875-12883, 1998). 세포 분쇄물의 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 단백질 분석법으로 측정하였고, 각 세포 분쇄물의 발현된 형광강도는 단백질 단위당 강도(intensity per protein unit)로 보정하여 계산하였다.
센다이 바이로좀과 종래기술의 양이온 리포좀의 트랜스펙션 효율을 비교하기 위하여 디올레오일옥시프로필-트리메틸암모니움 메틸설페이트(dioleoyloxypropyl-trimethylammonium methyl sulfate, 이하 'DOTAP'라 함, Avanti Polar Lipids Co., U.S.A.)와 콜레스테롤로 이루어진 양이온 리포좀을 제조하였다(참조: McLachan,G. et al., Biochemica, 11:19-21, 1994). 혈청을 포함하지 않는 배지 500 ㎕에 12㎍의 DOTAP/Chol(1:1, 몰비율)당 pEGFP-N1 DNA 1㎍을 캡슐화한 리포좀을 첨가하여, 설정된 최적 조건에서 유전자 이입을 측정하였다.
실시예 3-1: 바이로좀 제조에 사용된 센다이 외피 단백질 양에 따른 유전자
이입 효율의 변화
바이로좀의 지질/단백질 비율에 따른 DNA 이입 효율을 측정하기 위하여, 전기 정제한 센다이 바이러스 외피 단백질의 농도를 변화시키며 5㎍의 pEGFP-N1 플라스미드 DNA(20:1, 지질:DNA, w/w)를 이용하여 바이로좀을 제조하였고, 293 세포에 4시간동안 트랜스펙션시켰다. 도 1a는 바이로좀을 재구성할 때, 센다이 바이러스 외피 단백질의 농도 변화가 생체외에서 유전자 트랜스펙션에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 이때, 통계분석은 스튜던트 t 테스트(Student'st-test)를 이용하여 실시하였다: (*),(**):p<0.01. 도 1a에서, F0은 F-단백질 무첨가, F1, F5 및 F10에서의 숫자는 리포좀내의 F-단백질의 농도(㎍ F-단백질/㎎ 지질)를 나타내고, 이들 F-단백질의 양에 따른 유전자 이입 효율을 ㎎ 단백질당 GFP 형광강도로 표현하였다. 도 1a에서 보듯이, 지질에 대한 F-단백질의 중량비가 200:1일 때 유전자 발현이 가장 높게 나타났다. 도 1b는 도 1a와 같은 방법으로 F/HN-단백질의 농도를 달리하였을 때 얻은 결과인데, FHN0은 F/HN-단백질 무첨가, FHN1, FHN5, FHN10에서 숫자는 F-단백질의 농도(㎍ F-단백질/㎎ 지질)를 나타낸다. 도 1b에서 보듯이, 지질에 대한 F/HN-단백질의 중량비가 100:1일때 유전자 발현이 가장 높게 나타났다. F-단백질 또는 F/HN-단백질을 포함하는 바이로좀의 유전자 트랜스펙션 효율이 유전자 이입 매개체로 가장 널리 쓰이는 DOPAT/Chol 양이온 리포좀보다 약 2 내지 2.5배 높게 나타났다.
실시예 3-2: 바이로좀에 캡슐화된 DNA 양에 따른 유전자 이입 효율의 변화
트랜스펙션에 사용되는 DNA의 농도에 따른 리포터 유전자의 이입 및 발현 효율을 측정하기 위하여, 다음과 같은 조건에서 바이로좀을 제조하였다: 지질에 대한 단백질의 중량비는 최대 유전자 이입 효율을 보인 조건(참조: 도 1a 및 도 1b)에 따라, F-바이로좀은 200:1로, F/HN-바이로좀은 100:1로 하였다. 지질에 대한 DNA의 중량비(w/w)는 모두 20:1로 고정하였고, 지질에 대한 DNA의 양을 0.5 내지 20㎍의 범위내에서 변화시키면서 유전자 발현을 조사하였다. 도 2a 및 도 2b는 각각 다른양의 DNA를 캡슐화한 F-바이로좀 및 F/HN-바이로좀을 293 세포에 트랜스펙션시켜 유전자의 이입/발현 효율을 측정한 그래프이다. 도 2a에서 보듯이, F-바이로좀의 경우 DNA의 양이 2.5㎍에 달할 때까지 GFP의 발현이 증가하다가, 그 이상에서는 포화 상태 또는 오히려 감소하는 현상을 보였다. 도 2b에서 보듯이, F/HN-바이로좀의 경우도 F-바이로좀의 경우와 마찬가지로 DNA의 양이 2.5㎍에 달할 때까지 GFP의 발현이 증가하다가, 그 이상에서는 포화 상태 또는 오히려 감소하는 현상을 보였다.
실시예 3-3: 트랜스펙션 시간에 따른 유전자 발현의 변화
전기에서 결정한 바와 같이, F-바이로좀과 F/HN-바이로좀의 최적조성 성분으로 제조된 바이로좀으로 트랜스펙션하고, 트랜스펙션 시간에 따른 유전자 발현의 변화를 분석하였다. 도 3은 pEGFP-N1 DNA를 포함하는 F-바이로좀, F/HN-바이로좀 및 기존의 DOTAP/Chol 양이온 리포좀을 293 세포에 트랜스펙션시키고, 시간에 따른 GFP의 발현을 ㎎ 단백질당 GFP 형광강도로서 표현한 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 양이온 리포좀보다 F- 또는 F/HN-바이로좀으로 트랜스펙션하였을 때 짧은 시간 내에 더욱 강한 형광강도를 나타내었다. F-바이로좀으로 30분 처리했을 때의 GFP 발현강도는 양이온 리포좀으로 4시간 처리했을 때의 강도와 비슷하게 나타났다. F- 또는 F/HN-바이로좀의 경우 2시간 처리했을 때 GFP 발현이 최대치에 달하였고, 양이온 리포좀의 경우 4시간 처리했을 때 최대치에 달하였으며, 바이로좀의 최대치는 양이온 리포좀 최대치의 약 3배에 달하는 것으로 나타났다. 이는, 바이로좀의 단백질이 세포막과 능동적으로(actively) 결합하여 융합하기 때문으로 추측되었으며, 본 발명의 센다이 바이러스 외피 단백질을 이용한 바이로좀이 유전자의 세포내 이입 및 발현에 매우 효율적인 매개체임을 알 수 있었다.
전기 실시예에서 나타난 결과와 같이, 기존의 DOTAP/Chol 리포좀은 5㎍이상의 지질 농도에서 세포독성을 나타냈으나, 센다이 바이로좀의 경우에는 50㎍의 지질 농도까지는 세포독성이 나타나지 않았다. 이러한 세포와의 양립성(compatibility)으로 인하여 본 발명의 센다이 바이로좀이 기존의 양이온 리포좀에 비해 높은 유전자 이입 효율을 나타내며, 질병 치료의 유전자 요법에 사용될 수 있는 가능성이 높음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 센다이 바이러스의 외피 단백질을 이용하여 정량적으로 재구성한 바이로좀 및 그의 제조방법을 제공한다.본 발명의 바이로좀은 센다이 바이러스 외피 단백질로부터 F-단백질 또는 F/HN-단백질을 정제하는 단계; 및, 전기 정제한 단백질을 지질, DNA 및 계면활성제와 혼합하고 DNA를 캡슐화함으로써 바이로좀을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 본 발명에 의하면, 바이로좀의 제조시 센다이 바이러스의 외피 단백질을 정제하여 사용함으로써, 제조 및 보관이 용이하고, 이에 포함되는 단백질의 양을 정량적으로 조절할 수 있게 되므로 유전자 이입 효율을 극대화 및 일정화시키는 장점이 있다. 아울러, 본 발명의 바이로좀은 기존의 양이온 리포좀보다 트랜스펙션 시간이 짧고, 세포독성이 적으며, 센다이 바이러스 DNA와 내부 단백질을 완전히 제거하고 외피 단백질만을 사용하여 면역반응 유도를 최소화하였으므로, 질병치료의 유전자 요법에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (6)

  1. 센다이(Sendai) 바이러스로부터 F-단백질 및 적혈구응집소-뉴라민분해효소 (hemagglutinin-neuramindase)의 혼합물인 외피 단백질을 정제하는 단계; 및, 전기 외피 단백질과 지질을 1:50 내지 1:1000(w/w)의 비율로 혼합하고, DNA 및 계면활성제를 첨가한 다음, 투석하여 DNA를 캡슐화(encapsulation)함으로써 바이로좀을 수득하는 단계를 포함하는 바이로좀의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    지질은 계란 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine),
    포스파티딜세린(phosphatidylserine) 또는 콜레스테롤
    (cholesterol)인 것을 특징으로 하는
    바이로좀의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 외피 단백질은 F-단백질 및 적혈구응집소-뉴라민분해효소(HN)의 혼합물이고, 지질은 계란 포스파티딜콜린:콜레스테롤:포스파티딜세린의 몰비율이 4.8:2:1인 혼합물이며, 외피 단백질:지질:DNA를 1:100:5(w/w)로 사용하여 제 1항의 방법에 의해 제조한 F-단백질 및 적혈구응집소-뉴라민분해효소(HN)-바이로좀(F/HN-바이로좀).
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