KR100408426B1 - 아데노신 디아미네이즈 저해제 및 이를 생산하는 신규한바실러스 아이에이디에이-7 균주 - Google Patents

아데노신 디아미네이즈 저해제 및 이를 생산하는 신규한바실러스 아이에이디에이-7 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아데노신 디아미네이즈 저해제 및 이를 생산하는 신규한 바실러스속 균주에 관한 것으로 보다 상세하게는 하기 화학식 1로 정의되는 아데노신 디아미네이즈 저해제 및 이를 생산하는 신규한 바실러스 균주 IADA-7에 관한 것이다. 본 발명에 의한 아데노신 디아미네이즈 저해제는 종래의 아데노신 디아미네이즈에 비하여 항균작용 및 항암작용이 우수한 효과가 있다.
[화학식 1]
(상기 식에서 R1, R2, R3는 명세서 상에 정의된 것과 동일하다)

Description

아데노신 디아미네이즈 저해제 및 이를 생산하는 신규한 바실러스 아이에이디에이-7 균주{Adenosine Deaminase Inhibitor and Bacillus sp. IADA-7 Producing the Same}
본 발명은 아데노신 디아미네이즈 저해제 및 이를 생산하는 신규한 바실러스속 균주에 관한 것으로 보다 상세하게는 하기 화학식 1로 정의되는 아데노신 디아미네이즈 저해제 및 이를 생산하는 신규한 바실러스 IDAD-7(KCTC 10446BP) 에 관한 것이다.
퓨린(Purine)대사에 관계하는 효소 중 아데노신 디아미네이즈(adenosine deaminase(adenosine aminohydrolase, EC 3.5.4.4)는 아데노신의 6번 탄소에 결합된 아미노기를 탈아미노시켜 이노신(inosine)과 암모니아를 생성하는 효소로서 자연계에 널리 분포하고 있다.
퓨린의 합성은 저분자 전구체로부터 드 노보경로(de novopathway)를 거치거나 퓨린으로부터 재이용경로(salvage pathway)를 거쳐 합성된다.
재이용경로(salvage pathway)는 불안정한 RNA가 세포내에서 파괴되어 생긴 분해산물, 사멸된 세포의 핵산, 뉴클레오티드 분해산물 등과 같은 외래성 물질을 재사용하는 과정으로 생체내의 에너지와 전구체들의 손실을 방지한다. 드 노보경로(De novopathway)는 모든 생물체에서 동일한 것으로 보이나 재이용경로(salvage pathway)는 생물들의 종류에 따라 아주 다양하게 나타난다.
그런데 동물과 식물 및 미생물에 있어서, 효소반응에는 반드시 이것을 제어하는 저해제가 있다는 것이 알려져 있으며, 이것들은 대부분이 고분자의 펩타이드(peptide)이지만, 아데노신 디아미네이즈에 대한 저해제는 일반적으로 아데노신 유사체(adenosine analogue)로서 분자량이 500Da 이하인 저분자 화합물이 많다. 그리고 미생물의 대사산물로부터 발견된 효소저해제는 매우 독성이 낮은 새로운 구조를 가진 저분자물질이라는 점이 특징이다. 저해제의 구조는 기질과 유사한 구조를 가지고 있는 것도 있지만, 기질과 전혀 관계가 없는 구조를 가진 것도 있다.
효소 저해제의 생합성은 항생물질의 생합성에서 밝혀진 것처럼, 그 생합성의 특징적 과정에는 플라스미드(plasmid)가 관여하고 있는 것도 있다.
지금까지 발표된 미생물 기원의 아데노신 디아미네이즈의 저해제는 스트렙토마이세스 카니하라엔시스(Streptomyces kaniharaensis)SF-557가 생산하는 코포마이신(coformycin; 3-(α-D-ribo-furanosyl)-6,7,8-trihydroimidazol[1,3]diazepin-8(R)-ol))과 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans) Y-176-2가 생산하는 코디셉신(cordycepsin)과 2'-디옥시(deoxy) 코포마이신(coformycin)등이 발표되어 있다.
포르마이신{7-아미노-3-(베타-리보퓨라노실)피라졸로[4,3-디]피리미딘}(Formycin{7-amino-3-(β-ribofuranosyl)pyrazolo[4,3-d]pyrimidine})을 생산하는 스트렙토 마이세스(Streptomyces)에 의해 생산되는 코포마이신은 아데노신 디아미네이즈에 대해 특이적인 저해제이며, 기질과 경쟁적으로 저해를 일으킨다. 또한 코포마이신은 잔토모나스 오리제(Xanthomonas oryzae)를 제외한 세균에서 포르마이신(formycin)과 함께 세균의 성장을 상승적으로 저해하는 효과를 가지고 있으며, 요시다 렛 살코마 세포(Yoshida rat sarcoma cell)의 증식을 상승적으로 저해를 일으키는 것으로 보고되어 있다.
그리고, 아데노신 디아미네이즈의 저해제로서 아데닌 유도체 중에는 9-알파-디-만노피라노실아데닌(9-α-D-mannopyranosyladenine)(1), 9-베타-디-자일로피라노실아데닌)(9-β-D-xylopyranosyladenine)(2), 9-알파-디-아라비노피라노실아데닌 (9-α-D-arabinopyranosyladenine)(3), 9-알파-엘-람노피라노실아데닌(9-α-L-rhamnopyranosyladenine)(4), 9-베타-디-푸코피라노실아데닌(9-β-D-fucopyranosyl adenine)(5), 9-베타-엘-푸코피라노실아데닌(9-β-L-fucopyranosyladenine)(6)등이 있다. 이 중 (1)을 제외하면 모두 경쟁적 저해재로 작용하고, 6개중 가장 저해작용이 좋은 것은 (4)이다.
아데노신 디아미네이즈의 저해제인 에리트로-9-(2-하이드록시-(3-노닐)아데닌(erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine)에 의해 저해를 받는 세포에 아데노신 및 디옥시아데노신(deoxyadenosine)을 작용시킬 때 세포의 세포독성(cytotoxicity)을 나타낸다고 알려져 있다.
아데노신의 유사체(analogue)인 아라비노실아데닌(arabinosyladenine), 코디세핀(codycepin), 포르마이신 (formycin)등을 동물에 주사하면 항암효과가 증대된다는 보고가 있다.
효소저해제는 인체생리기능 및 의학적으로 중요한 병리현상 분석에 유효한 물질로서, 특이한 저해제는 생물학적 기능이나 병인에 대한 생화학적인 분석에 유용하게 이용되고 있다. 또한 효소 저해제의 연구는 효소의 여러가지 성질의 해명, 특히 효소 활성부위의 연구에 유력한 수단이 되며, 생체내에서 효소의 역할, 생리적 기능이라든지 병의 진단을 위한 도구 또는 치료제로서도 응용이 가능하다.
면역계의 필수적인 아데노신 디아미네이즈의 결핍은 T-림프구(T-lymphocyte)와 B-림프구(B-lymphocyte)가 감소되어 면역결핍현상이 일어나서 아데노신 디아미네이즈 저해제는 면역저해제로 예측되어 1980년대에 들어서면서 본격적으로 연구가 되었다.
또한 석유자화성 효모에서 아데노신을 기질로 사용하여 아데노신 디아미네이즈 저해제를 첨가시 ATP생산량을 증가시켰기 때문에 ATP생산에도 응용 가능성이 있다.
효소저해제에 관한 연구는 지금도 많은 연구기관에서 활발하게 행해지고 있다. 그 결과, 종래에는 밝혀지지 않았던 대사계라든지 그 관련 효소계가 해명되어서, 생체기능의 제어관계가 명확하게 되고 있는 점은 큰 의의를 지닌다.
지금까지 보고된 아데노신 디아미네이즈 저해제는 방선균에 의해 생산되는 퓨린 유사체(purine analogue)계통의 저해제가 대부분이지만, 이들을 의료용으로 사용할 때 인간세포에 있어서 독성이 강한 문제점이 있으며, 실제로 임상에 응용가능한 새로운 약제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
또한 아직 세균이 생산하는 아데노신 디아미네이즈 저해제에 대해서는 보고가 없는 실정이다.
이에 본 발명자는 토양에서 아데노신 디아미네이즈 저해제를 생산하는 세균을 분리하고, 이들을 구조분석한 결과 항균력과 항암작용이 있는 신규한 화합물을 발견하게 되어 본 발명에 이르렀다.
즉, 본 발명의 목적은 신규한 아데노신 디아미네이즈 저해제 및 약제학적으로 허용되는 이들의 염을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 아데노신 디아미네이즈 저해제를 생산하는 신규한 바실러스 IADA-7(KCTC 10446BP)균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적 및 기타 목적들은 하기의 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.
도 1은 본 발명의 균주를 광학현미경으로 찍은 사진이다.
도 2는 본 발명의 균주의 배양시간에 따른 균의 생육도, 저해제의 생성, pH변화등을 나타낸 그래프이다.
도 3은 도웩스(Dowex) 이온교환수지를 사용하여 정제한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 젤 여과(gel filtration)을 이용하여 정제한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의 정제과정을 나타낸 공정도이다.
도 6은 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제를 순상 크로마토그래피(Normal phase TLC)에 전개한 그림이다.
도 7은 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제를 역상 크로마토그래피(Reverse phase TLC)에 전개한 그림이다.
도 8은 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제를 고압여지전기영동(HighVoltage paper electrophoresis)한 그림이다.
도 9는 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의 HPLC결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의 HPLC에서 주입량에 따른 각 피크(peak)높이와의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의 분자량 결정시험결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 방선균 유래의 아데노신 디아미네이즈에 대한 비경쟁적 저해를 나타낸 그래프이다.
도 13은 사람유래의 아데노신 디아미네이즈에 대한 비경쟁적 저해를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의 자외선 흡수 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의 적외선 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의1H-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의13C-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의13C-H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의 EI-MASS 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의 구조를 나타낸 화학식이다.
도 21은 본 발명의 아데노신 디아미네이즈 저해제의, 고환으로부터 얻어진 인간 암종 변이세포(Human Transitional-cell carcinoma, bladder)의 세포독성(Cytotoxicity) 시험결과를 나타낸 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 정의되는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 그의 염을 제공한다.
상기 식에서, R1은 H 또는 CH3이며, R2는 H 또는 CH3이다.
또한 본 발명은 아데노신 디아미네이즈 저해활성을 가지고 있는 상기의 화합물을 활성성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항균제조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 아데노신 디아미네이즈 저해활성을 가지고 있는 상기의 화합물을 활성성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 IADA-7 균주(KCTC 10446BP)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 IADA-7(KCTC 10446BP) 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 상기 화합물을 정제하는 것을 특징으로 하는 화합물 1의 생산방법을 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 균주의 배양 및 동정은 하기와 같은 방법에 의하여 수행하였다.
<사용시약 및 기기>
균배양에는 120Rev,x 6㎝ shaker의 진탕배양기를 사용하였고, 균체제거, 조효소액의 조제에는 한일사(Han-il; 대한민국소재)제품의 H50A-6을 사용하였으며, 균의 생육도 및 효소활성 측정에는 레코딩 스펙트로포토미터(Recording Spectrophotometer) U.V.-240 (일본소재 Shimadzu, Co. Ltd.사 제품)을 사용하였다.
효소저해제의 정제에 사용한 수지인 활성탄(Activated charcoal), Dowex 1X1-100(Cl-) Dowex 50W-X4(H+) 는 시그마 화학주식회사(Sigma Chemical Co.; St. Louis. 63178 U.S.A.)의 제품을, 젤 여과(gel filtration)에는 바이오-젤(Bio-gel) P2gel(Bio-Rad사 제품)을 사용하였다. 아데노신 디아미네이즈는 동물기원효소로써 시그마 화학주식회사(Sigma Chemical Co.)제품의 250units 동결건조 효소를 이용하였다.
정제도의 확인을 위해 사용한 박막크로마토그래피 플레이트(TLC plate)로는 실리카 겔(silica gel) G-60과 TLC-RP18F254(Merck사 제품)를 사용하었고 고압여지전기영동에는 멀티포어(Multiphore) II(LKB 2117)를 사용하였으며, HPLC는 워터스(Waters)사의 Model 510(U.S.A.)을 사용하였으며, 이때 사용된 컬럼(column)은 노바 펙(NOVA PAKTM)C18, 검출기(Detector)는 UV 검출기(Detector) 441을 사용하였다.
구조분석에서는 적외선 분광기(IR spectroscopy)는 바이오-레드(Bio-rad) FT-S-60을, NMR 및 GC-MASS 는 휴렛펙커드(Hewlett-Packard; U.S.A)사의 기기를 사용하였다.
이하 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
바실러스 IADA-7(KCTC 10446BP) 균주의 분리 및 동정
I. 아데노신 디아미네이즈의 저해제를 생산하는 균주의 분리
아데노신 디아미네이즈의 저해제를 생산하는 세균을 분리하기 위해 대한민국내의 특정 지역에서 채취된 토양시료를 암소에서 2∼3일간 풍건시킨 후, 토양시료 약 0.5g을 멸균수 5ml에 현탁시켜 정치한 다음, 그 상등액을 하기 표 1의 조성을 가지는 방선균 분리용 배지 A에 도말하여 30℃에서 배양하였다.
방선균 분리용 배지(배지 A)
가용녹말(Soluble starch)KH2PO4NH4Cl한천(Agar)증류수(Distilled Water) 1.0g0.05g0.05g1.7g100ml
저해제 생성용 배지(배지 B)
글루코스(Glucose)효모 추출물(Yeast extract)육류 추출물(Meat extract)펩톤(Peptone)KH2PO4MgCl2·6H2O증류수(Distilled Water) 1.0g0.2g0.2g0.2g0.05g0.01g100ml(pH 7.3)
보존뇽 배지(배지 C)
글루코스(Glucose)펩톤(Peptone)육류 추출물(Meat extract)효모 추출물(Yeast extract)한천(Agar)증류수(Distilled Water) 1.0g0.2g0.1g0.1g1.8g100ml(pH 7.5)
본 배양용 배지(배지 D)
글루코스(Glucose)펩톤(Peptone)효모 추출물(Yeast extract)NH4Cl증류수(Distilled Water) 0.5g0.5g1.0g0.5g100ml(pH 7.0)
세균의 분리용 배지로 방선균 분리용배지를 선택한 것은 분리 조건을 변경시킴으로서 새로운 세균의 효과적인 분리에 그 목적을 두고 있다. 순수분리된 세균들은 효소저해제의 생성유무를 검토하기 위해 상기 표 1의 10ml의 배지 B가 들어 있는 시험관(2.4 × 21cm)에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕배양 하였다.
배양액을 원심분리(10,000×g, 20분)한 다음, 상등액을 취해 저해제의 생성유무를 검토하였다. 분리된 세균은 상기 표 1의 보존용 배지 C에 충분히 생육시켜 냉암소에 보존하여, 다음 단계의 실험에 사용하였다.
II. 배지 및 배양
저해제 생성을 위해 배지 B(표 1)가 3ml들어있는 시험관(1.5 × 15cm)에 분리된 세균을 1백금이 접종하여 30℃의 진탕배양기(120 Rev.×6cm stroke)에서 16시간 동안 전배양하였다. 전배양한 균을 본배양용 배지인 배지 B(표 1) 가 100ml 들어있는 500ml용 진탕플라스크에 100㎕ 접종하여, 30℃에서 24시간 진탕배양한 후 균의 증식과 저해제생성을 측정하였다.
그리고 미생물기원의 아데노신 디아미네이즈의 조효소액을 만들기 위해 배지 D(표 1)가 3ml 들어있는 시험관(1.5×15cm)에 노카디오이데스 종(Nocardioides sp.) J-326TK를 1백금이 접종하여 30℃의 진탕배양기(120 Rev.×6cm stroke)에서 24시간 동안 전배양하였다. 배양한 균을 본배양용 배지인 배지 D(표 1)가 100ml 들어있는 500ml용 진탕플라스크에 100㎕접종하여, 30℃에서 18시간 진탕배양한 후, 배양액을 원심분리(10,000×g, 4℃, 2O분)하여 그 상등액을 조효소액으로 이용하였다.
[시험예 1]
효소액의 조제 및 활성의 측정
I. 효소액의 조제와 활성측정법
본 실험에 사용한 동물기원의 아데노신 디아미네이즈는 소의 췌장으로부터 추출하여 동결건조시킨 효소를 사용하였다. 먼저 동결건조 효소에 포타슘 포스페이트 완충액(potassium phosphate buffer; pH 7.0)를 3ml을 첨가한 다음 여기에서 50㎕를 취하여 이것을 적당량 희석하여 효소반응에 이용하였다. 그리고 미생물 기원의 효소는 노카디오이데스 종(Nocardioides sp.) J-326TK를 배지 D(표 1)에 배양해서 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다.
효소의 활성은 칼커(Kalckar)의 방법에 의해 측정하었다. 즉 5μmole의 아데노신, 50μmole의 포타슘 포스페이트 완충액(Potassium Phosphate buffer; pH 7.0)와 적당량의 효소액을 넣은 반응혼합물(최종용량 1.O ml)을 37℃ 수조(water bath)에서 30분간 반응시킨 후, 100℃에서 4분간 중탕하여 반응을 중지시킨 다음 100배 희석하여 265nm에서 흡광도 차로서 측정하였다.
효소활성의 1 unit는 상기 조건에서 1시간에 1 μmole의 이노신(inosine)을 생성하는 효소의 양으로 나타내었다.
II. 아데노신 디아미네이즈 저해제의 저해활성 측정
저해제의 저해활성은 아데노신 디아미네이즈의 탈아미노작용을 저해하는 저해율로부터 구하였다. 즉 효소의 표준활성치와 저해제를 첨가하였을 때의 효소 활성치의 차로부터 저해율을 계산하였다. 효소의 활성측정에는 약 17∼26 unlts/ml 효소량을 사용하였으며, 저해제의 농도는 아데노신 디아미네이즈 활성의 저해율이 70% 이하가 되게 조절하였다.
저해율 50%를 나타내는 검액 1ml의 저해활성을 1 unit로 정하였다 저해율과 저해활성은 다음 식에 따라서 구하였다.
[실시예 2]
아데노신 디아미네이즈 저해제의 정제
아데노신 디아미네이즈 저해제의 정제 과정은 먼저 배양상등액을 원심분리한 다음, 그 상등액을 활성탄으로 전처리하여 80% 메탄올로 추출한 후 추출액을 감압농축하였다. 감압농축한 액을 메탄올분획, Dowex 1X1-100(Cl-) 컬럼 크로마토그래피(column chromatography), Dowex 50W-X4(H+) 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)등을 거친 후, 저해활성을 나타내는 분획을 모아 바이오 젤(Bio gel) P2 젤 여과(gel filtration)와 순상 크로마토그래피(normal phase TLC)와 역상 크로마토그래피(reverse phase TLC)를 거쳤다.
[시험예 2]
분리균주의 분류 및 동정
선정된 분리균주 IADA-7(KCTC 10446BP)의 분류학적 위치를 검토하기 위하여 형태학적, 배양적, 생화학적 제 특징을 조사 검토하였으며, 이에 따른 분리균주 IADA-7(KCTC 10446BP)의 분류와 동정은 "Bergey's Manual of Bacteriology" 제8판과 "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" Vol. 2에 의해서 실시하였다.
1) 형태학적 특성
세포의 형태적 실험은 "Laboratory Microbiology" 제 3 판과 "미생물의 분류와 동정" 및 "Manual of Methods for General Bacteriology"에 의하여 실시하였다.
분리균주 IADA-7(KCTC 10446BP)를 영양육즙한천(nutrient broth agar) 배지 상에 접종하여 5시간, 10시간, 20시간, 48시간으로 시간별로 배양하면서 형태학적인 특징을 검토하였다. 하기 표 2와 도 1(도 1에서의 바(bar)의 길이는 5㎛이다)에서와 같이 그람 양성의 간균으로서 운동성이 있으며, 포자를 형성하는 세균이었다.
항목 특징
형태 둥근말단을 가진 막대형(rod shape with round end)
운동성(Motility) 운동성 있음(Motile)
그람 염색(Gram stain) Positive
포자(Spore) 포자 형성(Spore forming)
2) 배양적 특성
젤라틴(Gelatin) 천자배지 실험은 영양젤라틴 천자배지(nutrient gelatin stab medium)으로 실시하였으며, 탄수화물 발효실험은 "Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria" 에 준해서 실시하였다.
분리균주 IADA-7(KCTC 10446BP)의 배양적 특성은 하기 표 3에서와 같이 탄소원으로서 글루코스(Glucose), 프락토스(fructose), D-아라미노스(D-arabinose), 말토오스(maltose), 트레할로스(trehalose)등은 이용하였으나 만니톨(mannitol), 자일로오스(xylose), L-아라비노스(L-arabinose), 락토오스(lactose) 등은 이용하지 못하였다.
항목 분리균주(IADA-7)
D-글루코스 +
D-만니톨 -
D-프락토스 +
D-자일로오스 -
D-아라비노스 +
L-아리비노스 -
L-자일로오스 -
락토오스 -
말토오스 +
트레할로스 +
소르비톨 -
이눌린 -
사카로스 -
+ : 이용, -: 비이용
3) 생화학적 특성
분리균주의 생화학적 특징은 "Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria", "Manual of Methods for General Bacteriology"에 준하여 실 시하였다.
분리균주 IADA-7(KCTC 10446BP)의 생화학적 제 특성을 조사한 결과 하기 표 4에서와 같이 카탈레이스 테스트(catalase test), 젤라틴(gelatin) 액화, 우레아제 테스트(urease test)는 양성이었고, 라이신 디카르복실레이스 테스트(lysine decarboxylase test)는 음성이었다.
항목 분리균주(IADA-7)
카탈레이스 테스트 +
혐기성 생장(Anaerobic growth) -
인돌 테스트(Indol test) -
젤라틴 액화 +
라이신 디카르복실레이스 -
오르니틴 디카르복실레이스 -
아르기닌 디카르복실레이스 +
우레아제 테스트 -
H2S 생산(Production) -
4) 분리균주의 분류 및 동정
"Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" Vol. 2에 의하면, 대부분 화학종속영양이며 카탈레이스(catalase) 양성인 세균을 바실러스(Bacillus) 속에 포함하는데, 상기에서 알수 있는 바와 같이 분리균주 IADA-7(KCTC 10446BP)는 그람(Gram) 양성, 호기성, 내생포자를 형성하는 간균으로서, 배양적, 생화학적인 여러가지 특징들을 검토하여 "Bergey's Manual of Bacteriology" 제8판과 "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" Vol. 2와 비교검토한 결과 바실러스(Bacillus)속으로 동정되었다.
따라서 본 분리균주 IADA-7를Bacillussp. IADA-7로 명명하여 대한민국소재 한국유전자은행에 국제기탁하고(KCTC 10446BP) 본 실험에 사용하였다
[실시예 3]
아데노신 디아미네이즈 저해제의 생성조건 검토
1) 통기량 및 초발 pH의 영향
균의 생육도와 저해제의 생성에 미치는 pH와 통기량의 영향을 검토한 결과하기 표 5에서 나타낸 바와 같이 통기가 충분하면 균의 생육과 저해제의 생성을 증가시켰으며, 하기 표 6에서와 같이 pH가 산성보다 알카리 범위에서 균의 생육이 양호하였고 저해제의 생성도 증가되었다.
배지의 양(ml) 활성도(activity)(units/ml)
50 4,600
100 4,800
150 4,300
200 4,000
250 3,600
배지의 조성은 글루코스 1.0g, 효모추출물 0.2g, 육류 추출물 0.2g, 펩톤0.2g, KH2PO40.05g, MgCl2·6H2O 0.01g
초기 pH 활성도(units/ml)
3 400
6 4,300
7 4,900
9 4,600
배지의 조성은 글루코스 1.0g, 효모추출물 0.2g, 육류추출물 0.2g, 펩톤 0.2g, KH2PO40.05g, MgCl2·6H2O 0.01g
2) 균의 생육도 및 저해제의 생성
배양시간에 따른 균의 생육도, 저해제의 생성, pH변화등을 측정한 결과 도 2에서와 같이 배양시간 24시간째 균의 증식은 최고로 높았고. 저해물질의 생성은 24시간 이후로 조금씩 감소하였다(도 2에서 □는 pH, ○는 생장(Growth), 그리고 ●는 저해활성도를 나타낸다).
[실시예 4]
아데노신 디아미네이즈 저해제의 정제
1) 상등액의 조제
본 균을 저해제 생성용 배지를 시험관(1.5 × 15 cm)에 3ml를 분주하여 보존사면 배양관으로부터 1백금이를 접종하여 30℃에서 16시간 진탕배양하였다. 배양한 총배양액을 100ml가 들어있는 500ml용량의 진탕플라스크에 100㎕접종하여 30℃에서 24시간 진탕배양하였다.
그 상등액을 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)하여 균체를 제거한 후 그 상등액을 crude 아데노신 디아미네이즈 저해제액으로 이용하였다. 상등액 1 ml당 5,100 units의 저해활성을 가졌으며, 상등액이 8,820ml 이었으므로 총활성도(total activity)는 45,000,000units 이었다.
2) 활성탄 추출
배양여액 300ml(4,500 units/ml, 1,350,000 units)를 pH를 7.0으로 조정하고, 여기에 메탄올(methanol)로 세정한 건조 활성탄을 6g 첨가하여 교반하였다.
10분간 흡입여과 후, 여지상의 활성탄을 물로써 세정하였다. 이 활성탄을 6등분(225,000 units)하여 각 유기용매로써 흡입여과하여 추출하였다(표 7). 하기 표 7에서 보는 바와 같이 80% 메탄올에서 가장 많이 용출되었기 때문에 농축상등액 200ml(7,740,000 units)를 50ml(1,935,000 units)씩 나누어 각 상등액의 pH를 2, 6, 7, 8로 조정하여 활성탄에 흡착한 후 80% 메탄올에서 용출하였다(표 8).
용매 저해활성(units) 수율(%)
80% 메탄올 126,000 56
100% 에탄올 112,500 50
80% 부탄올 87,000 39
100% 헥사놀 81,000 36
50% 클로로포름 69,750 31
50% 아세톤 74,200 33
용매 pH 저해활성(units) 수율(%)
메탄올(80%) 2 619,000 32
6 1,199,700 62
7 1,393,200 72
8 1,470,000 76
위의 결과로부터 정제시 상등액의 pH를 8로 맞춘뒤 활성탄(Sigma, 100∼400mesh)을 배양액에 대해 2 w/v/%를 가하여, 10분간 교반하였다. 교반 후 흡입기(aspirator)를 사용하여 흡입여과하였다. 여과후 배양액에 대해 1/4배 용량의 3차 증류수로 2회 세정한 후, 배양 여액과 동일량의 80% 메탄올로 4회 나누어서 추출하였다. 추출액을 갑압 농축하여 100ml로 한 다음 원심분리(10,000×g, 30분)하고 2㎛ 멤브레인 필터(membrane filter; Disposable sterile syringe filter)를 사용하여 활성탄을 제거하였다.
활성탄 추출액 1ml당 310,500units의 활성을 가졌으며, 활성탄 추출 농축액이 100ml이였으므로 총활성도(total activity)는 31,050,000units이고 상등액에 대한 수율은 69%였다.
3) 메탄올 분획(fractionation)
활성탄으로 추출하여 모은 시료에 콜드 메탄올(cold methanol)을 50% 되게 첨가하여 -20℃ 냉동실에 24시간 방치한 후, 원심분리(10,000×g, 30분)하여 침전물을 제거하고 로타리 증발기(rotary evaporator; 45℃)에서 메탄올을 증류한 다음, 물을 첨가하고 1N NaOH로 pH를 8.0으로 조정하여 다음 실험을 행하였다.
메탄올 분획 1ml당 558,000units의 활성을 가졌으며, 메탄올 분획 상등액이 50ml 이었으므로 총 활성도(total activity)는 27,900,000units이고 상등액에 대한 수율은 62%이였다.
4) Dowex 1X1-100(Cl-) 이온교환수지 크로마토그래피(ion exc1usive chromatography)
고압여지전기영동으로 (+)전하를 확인한 후 이온배타 크로마토그래피(ion exc1usive chromatography)를 행하였다. 메탄올 분획에서 얻어진 용액을 Dowex 1X1-100(Cl-) 컬럼(3.4×37 cm)에 유속 0.25ml/min으로 여과시킨 후 컬럼을 증류수로 세정하였다. Dowex 1X1 -100(Cl-)에서 얻은 농축액 1ml당 462,000units의 활성을 가졌으며, 농축액이 50ml이었으므로 총 활성도(total activity)는 23,100,000units이고, 상등액에 대한 수율은 51% 이었다.
5) Dowex 50W-X4(H+) 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)
Dowex 1X1-100(Cl-) 컬럼에서 얻어진 시료를 Dowex 50W-X4(H+)의 컬럼(3.4×37 cm)에 유속 0.25ml/min으로 통과시킨 후 컬럼을 3차 증류수로 세정하였다. 흡착된 저해물질은 0.2N NH4OH로서 유속 0.25ml/min으로 용출시켰다(도 3). 용출액은 30ml씩 분취하고 난 뒤 감압농축하여, 그 활성을 측정하였다.
도 3에서와 같이 분획 1번에서 3번까지, 그리고 8번 이후로는테일링(tailing)이 생기고 저해제량이 낮아서 버리고, 분획 4번에서 7번까지의 용출액을 감압농축하여 30ml로 만들었다.
Dowex 50W-X4(H+) 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)의 분획 4번에서 7번까지의 농축액 1ml당 37,000units의 활성을 가졌으며, 농축액이 30ml이였으므로 총 활성도(total activity)는 7,100,000units이고 상등액에 대한 수율은 15%이었다.
6) 바이오-젤(Bio-gel) P2젤 여과(gel filtration)
Dowex 50W-X4(H+) 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)에서 4번에서 7번까지의 분획을 모아 감압농축하여 2ml로 농축하여 바이오-젤(Bio-gel) P2컬럼(1.6×48cm)에 로딩하여 3차 증류수로 0.18ml/min의 유속으로 3ml씩 분획하였다. 이 때의 각 시료의 용리 프로필(elution profile)은 도 4에 나타내었다.
젤 여과(Gel filtration)한 것중 35번에서 39번까지의 농축액 1ml당 225,000units의 활성을 가졌으며, 농축액이 10ml이었으므로 총 활성도(total activity)는 2,250,000units이고 상등액에 대한 수율은 5%이다.
7) 역상 크로마토그래피(Rrverse phase TLC)
박막크로마토그래피(TLC; Thin Layer Chromatography)는 종이 크로마토그래피(paper chromatography)에 비해 시간이 훨씬 절약될 뿐만아니라, 전개가 효과적으로 이루어지며, 그 반점에는 물질이 농축되어 있어서 상당히 작은 농도의 화합물까지도 검출이 가능하다. 순상 크로마토그래피(Normal phase TLC)는 정지상이 극성물질이기 때문에 극성물질을 분리시 테일링(Tailing)이 잘 생기는 단점이 있다. 그래서 정지상이 비극성 물질인 역상 크로마토그래피(reverse phase TLC)를 이용하였다.
바이오-젤(Bio-gel) P2젤 여과(gel filtration)를 거친 분획 중 No. 35에서 39까지를 모아서 2ml로 농축하였다. 농축된 시료를 역방향(reverse phase)-18F254플레이트(plate)(20×20cm)에 점적한 후 용매계(NH4Cl:ethanol:water=6:4:1(v/v/v))에서 전개시켰다.
전개된 저해제를 확인하기 위해 UV하에서 확인하였다. 그리고나서 Pf 0.85에서 아래위로 0.3cm의 실리카 겔(silica gel)을 긁어내어 메탄올(methanol)에 용출시킨 후, 감압농축하여 메탄올을 날려버리고 HPLC용 물 2ml를 첨가하여 시료를 녹여내었다.
8) 순상 크로마토그래피(Normal phase TLC)
역상 크로마토그래피(Reverse phase TLC)를 거친 2ml시료를 실리카겔(silica gel) G-60 플레이트(plate)(20×20cm)에 점적한 후 용매계(클로로포름:메탄올=7:3, v/v)에서 전개하였다. 전개된 저해제를 확인하기 위해 좌우 양 끝 2cm씩 잘라내어 아이오다인(iodine)증기로써 확인하였다. 그리고 나서 Rf값은 0.35에서 아래위로 0.3cm의 실리카 겔(silica gel)을 긁어내어 메탄올에 용출시킨 후, 감압농축하여 메탄올을 날려버리고 HPLC용 물 2ml를 첨가하여 시료를 녹여 내었다.
일반적으로 TLC에서 실리카 겔을 긁어내어 용출시키면 실리카 겔이 남아 있어서 완전정제에 어려운 점이 있다. 그래서 먼저 원심분리(10,000×g, 30min)하고 0.2㎛ 멤브레인 필터(membrane filler)를 거친 뒤 컬럼(1×7cm)에 탈지면을 충분히 채워 넣고 난 뒤 Dowex 1X1-100(Cl-)수지를 채워 넣어서 0.25ml/min 유속으로 용출하고 용출된 시료를 동결건조하였다.
이상의 정제과정을 요약하면 도 5와 같다.Bacillussp. IADA-7(KCTC 10446BP)가 생산하는 저해물질을 배양여액으로부터 약 2%의 수율로서 정제되었으며, 건조중량으로는 9.6mg을 얻을 수 있었다.
[시험예 3]
아데노신 디아미네이즈 저해제의 정제도 확인
1) 순상 크로마토그래피(Normal Phase TLC)
정제한 표품의 순도검정을 위해 실리카 겔 G-60 플레이트(plate)에 점적한 후 용매계(클로로포름:메탄올=7:3, v/v)에서 전개하였다. 스팟(Spot)의 검출은 아이오다인(iodine)증기로써 단일 스팟을 확인하였는데 그 결과는 도 6과 같다. 도 6에서 보는 바와 같이 Rf값은 0.35에서 단일 스팟을 확인하였다.
2) 역상 크로마토그래피(Reverse phase TLC)
정제표품을 역상(reverse phase)-l8F254플레이트(Plate)에 점적한 후 NH4Cl : 에탄올 : 물 = 6 : 4 : 1(v/v/v)의 용매계에서 전개시켰다. 스팟(Spot)은 UV하에서 스팟을 확인한 후 다시 아이오다인(iodine)증기로써 단일 스팟을 확인하였는데,그 결과 도 7에서 보는 바와 같이 Rf값은 0.85에서 단일 스팟을 확인하였다.
3) 고압여지 전기영동(High voltage paper electrophoresis)
저분자 물질을 저압여지 전기영동(low voltage paper electrophrose)로 분리할 때, 확산이 빨리 일어나기 때문에, 이것을 극복하기 위해 고압여지 전기영동(high voltage paper electrophrose)을 행하였다. 그런데 고압하에서 전기영동을 행하기 때문에 열이 발생하는 이유로 반드시 쿨링 시스템(cooling system)이 필요하다.
테인츠(Teintze)등의 방법에 따라 여지 전기영동(paper electrophoresis)을 행하였다.
여지 전기영동키트(Paper electrophoresis kit)에 채워진 포타슘 포스페이트 완충액(potassiun phosphate buffer) pH 7.0(0.02M)에 와트만(Whatman) No. 1 여과지(paper)의 양끝을 담구어 7시간 동안 포화시킨 후 20㎕(90 units/ml)를 출발점에 점적한 후 300V, 40A에서 전기영동하였다. 그 다음 건조시킨 후 아이오다인(iodine)증기로써 단일 스팟(spot)을 확인하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다. 본 실험에서의 대조물질로서 BPB(Bromo Phenol Blue)를 사용하여 그 절대값으로 전하(charge)정도를 나타내었는데 그 Rf값은 0.13이였다.
4) HPLC(High Performance liquid chromatography)
최근의 고분자 화학은 빠른 유속과 높은 압력에 내성을 가지며, 젤(gel)입자의 직경이 10㎛정도 크기의 미세한 폴리비닐(Polyvinyl)계의 친수성 폴리머(polymer), 다공성 실리카(Silica), 다공성 폴리머(polymer) 등의 "경질 젤"형 담체를 개발하여 정제에도 HPLC사용이 가능하게 되었다.
극성물질의 분리에는 역상 컬럼을 이용하면 분리능이 좋기 때문에 워터스(Waters)사 제품의 노바 팩(Nova pakTM) Cl8을 사용하였다.
순상 크로마토그래피(Normal phase TLC), 역상 크로마토그래피(reverse phase TLC), 고압여지 전기영동(high voltage paper electrophoresis)에서 단일 스팟(spot)로 확인된 정제표품을 노바 팩(Nova pakTM)Cl8컬럼(column)을 이용하여 HPLC를 행하였다. 유속은 0.8ml/min, 용매는 HPLC분석용 물. 검출기(detector)는 UV 검출기(Detector) 441을 사용하였다. 그 결과는 도 9에서와 같이 RT 8.5 min에서 날카로운(sharp) 단일 피크(peak)로 나타났다. 정제된 표품의 주입량에 따른 각 피크(peak) 높이와의 관계를 도 10에 나타내었다.
도 10과 같이 주입량과 피크 높이 사이에는 직선관계가 성립하고 피크 높이를 측정함으로써 정량분석이 가능하게 되었다.
앞에서 본 바와 같이 순상 크로마토그래피(normal phase TLC), 역상 크로마토그래피(reverse phase TLC), 고압여지 전기영동(hlgh voltage paper electrophoresis), HPLC에서 단일 스팟, 단일 피크가 확인되었으므로 완전정제가 되었다고 생각하고 그 시료를 동결건조하여 구조분석에 이용하였다.
[시험예 4]
아데노신 디아미네이즈 저해제의 분자량 측정
앞단계에서 얻어진 시료의 분자량을 측정하기 위해 바이오-젤(Bio-gel) P2컬럼(1.6×48cm)에 의해 젤 여과(gel filtration)을 행하였다. 표준물질로써는 비타민 B12(M.W. 1,335), BPB(M.W. 669), 시토신(M.W. 110)을 사용하였으며 그 결과는 도 11과 같았다. 공간용적(Void volume)(Vo)에 대한 용리용적(elution volume)(Ve)의 비(Vo/Ve)를 표준물질 분자량의 대수값에 대하여 플롯(polt)하였다. 공간용적(Void volume)은 헤모글로빈(hemoglobin; 분자량 64,000)의 용리용적(e1ution volume)으로 결정하였다.
각 표준물질의 Vo/Ve은 비타민 B12(M.W. 1,335)가 3.3, BPB(M.W. 669)가 2.6, 시토신(M.W. 110)이 3.3이었으며, 본 저해제는 3.1이었다. 따라서 본 저해제의 분자량은 약 175로 추정되었다.
[실험예 1]
아데노신 디아미네이즈 저해제의 저해양식
소의 췌장에서 분리한 아데노신 디아미네이즈와 노카디오이데스 종(Nocardiodessp.) J-326TK의 세포의 아데노신 디아미네이즈에 대한 아데노신 농도의 영향을 라인웨버-버크 플롯(Lineweaver and Burk plot)로부터 측정한 결과 도 12, 도 13에서와 같이 동물기원 효소, 미생물 기원 효소의 각각 Km치는 0.027mM, 0.2mM 이었다. 그리고 동물기원 효소, 미생물기원 효소에 대한 정제된 저해제0.Olmg, 0.02mg에 대한 Ki값도 라인웨버-버크 플롯(Lineweaver and Burk plot)으로부터 측정한 결과 도 12, 도 13에서와 같이 동물기원 효소, 미생물 기원 효소의 각각 Ki치는 0.027mM, 0.2mM로 측정되었다(도 12 및 도 13에서 -○-은 저해제 0 mg, --●--은 저해제 0.01mg이고, -●-은 저해제 0.02mg이다).
위의 결과와 같이 Km과 Ki값이 일치하고, Vmax값이 저해제 농도가 0.01mg에서 0.02mg으로 증가할 수록 감소하였으므로 전형적인 비경쟁적 저해를 나타내었다.
[시험예 5]
아데노신 디아미네이즈 저해제의 물리화학적인 성질
1) 안정성 검사
배양여액의 pH를 2,7,9로 조정하여 70℃에서 30분간 방치한 후의 잔존활성을 측정한 결과 알카리 영역에서 안정성을 나타내었다(표 9). 또한 배양여액의 농축에 회전 진공 증발기(Rotary vacuum evaporator)를 사용해서 농축방법을 검토한 결과, 45℃에서 장시간 농축을 할 때에도 실활은 되지 않았다.
인큐베이션 잔여활성(units/ml)(Residual activity) 상대활성(%)Relative activity
pH 2 2,900 7
pH 7 19,500 93
pH 9 21,000 100
위의 실험결과로 미루어, 본 저해제는 실온 부근에서는 아주 안정한 물질이라는 것을 알 수 있었다. 따라서 시료는 항상 pH 8로 조정한 후 약 5℃정도의 저온에서 보관하였다.
2) 자외선 흡수 스펙트럼(spectrum)
정제한 표품을 정제수(milipore water)에 녹인 저해제의 자외선 흡수 스펙트럼은 도 14에 나타난 바와 같이 232nm에서 최대 피크(peak)를 나타내고 가시부에서는 흡수 피크(peak)가 나타나지 않았다(도 14에서 가로는 O.D.값을 나타내고, 세로는 흡광도(nm)을 나타낸다).
IR 스펙트럼 1669cm-는 아세타미드(acetamide)의 흡광치를 나타내고,13C-NMR 스펙트럼 192ppm에서는 C=O를 나타내기 때문에 본 저해제에 아세타미드(acetamide)가 있다고 예측하였다. 아세타미드(Acetamide)는 220nm에서 최대 피크(peak)를 나타내는데 여기에 카르보닐함유 화합물(carbonyl-containing compound)이 더 결합이 되면 전환(transition)이 일어나서 최대 피크(peak)가 232에서 나타날 수 있기 때문에 IR 스펙트럼과 NMR 스펙트럼이 일치한다고 판단하였다.
3) IR 스펙트럼
분자는 각각 고유의 진동수를 가지고 있는데 이와 같은 분자에 파장을 연속적으로 변화시켜 적외선을 조사하면, 분자의 고유진동과 같은 주파수의 적외선이 흡수되어 분자의 구조에 따른 스펙트럼이 얻어진다. 이 스펙트럼으로부터 분자의 구조를 분석하는 것이 적외선 흡수 분광법(Infrared absorption spectroscopy)이다.
정제가 확인된 시료 2mg을 KBr 분말 200mg을 1/4량씩 가하여 잘 갈아 준다 .이 때 수분의 흡수를 방지하기 위하여 건조 박스(dry box)에서 행하였다. 이것을 유압 프로세서(processor)에서 압력을 서서히 가하면서 디스크(disk)를 만들어서 FT-IR에서 해상(resolution)은 8cm-로, 스케닝 넘버(scannning number)는 32scans로 한 스펙트럼을 도 15에 나타내었다.
도 15에서와 같이 1669cm-에서는 아세타미드(acetamide)의 피크(peak)를 나타내고 3037cm-에서는 피롤(pyrol)을 나타낸다.
4)1H-NMR 스펙트럼
H의 원자핵에서는 스핀(spin)이 +1/2과 -1/2의 두 상태로 되어 있다. 이와 같은 핵은 자장 안에 놓으면 각각 다른 에너지 준위에 배향한다. 여기에 공명주파수의 전자파를 조사하면 에너지의 흡수가 일어나 +1/2과 -1/2로 된다. 이 주파수를 검지하여 분자구조를 알아내는 것이 NMR 스펙트럼 법이다.
정제표품 2mg을 D2O에 넣어서 시료관에 38mm까지 넣어서 실시한 500MHz NMR 스펙트럼을 도 16에 나타내었다.
5)13C-NMR 스펙트럼
13C핵이 자장중에 놓이면 +1/2과 -1/2의 에너지준위로 나뉘어지며 열평형 상태에서는 저에너지 준위의 +1/2이 다소 많게 되어있다. 여기에 공명주파수의 전자파를 조사하면 에너지의 흡수가 일어나 +1/2의 핵이 -1/2핵으로 된다. 조사가 계속되어 +1/2핵이 감소하여 -1/2핵과 같은 수로 되면 이때에는 흡수가 일어나지 않게되며, -1/2핵과 같은 수로 되면 이때에는 흡수가 일어나지 않게 되며 이러한 상태를 포화라고 한다.
외경 10mm, 길이 180mm의 마이크로셀 모세관(microcell capillary)에 시료 10mg을 D2O에 녹여서 얻은 스펙트럼(spectrum)을 도 17에 나타내었다.
그리고13C-H NMR 스펙트럼은 도 18에 나타내었다.
6) GC-MASS 스펙트럼
고진공 중에서 가열기화된 시료분자에 전자류 등의 큰 에너지를 가하여 주면 분자중의 전자 1개가 밖으로 튀어나오고 분자의 양이온 라디칼(M+, 분자이온)이 생성된다. 이것이 다시 개열이 되어 조각이온(fragment ion)이라고 불리우는 몇개의 이온으로 된다. 이런 이온을 질량(m)과 전하(e)의 비(m/e)의 크기순으로 분리시켜 기록하는 장치를 정량분석계라 하고, 얻은 스펙트럼을 MASS 스펙트럼이라 부른다. MASS에는 EI-MASS와 CI-MASS가 있는데, 본 실험에서는 EI-MASS를 사용하였다.
시료를 D2O에 녹여서 얻은 스펙트럼을 도 19에 나타내었고, 본 저해제의 분자량은 124로 추측하였다.
7) 구조결정
자외선 흡수 스펙트럼, IR 스펙트럼,1H-NMR 스펙트럼,13C-NMR 스펙트럼,13C-1H NMR 스펙트럼, GC-MASS 스펙트럼에 의해 분석해본 결과 도 20에 나타난 바와 같이 3가지 구조로 추측이 가능하다.
IR 스펙트럼 1669cm-에서는 아세타미드(acetamide)기를 나타내고,13C-NMR 스펙트럼 192ppm에서는 C=O이기 때문에 아세타미드(acetamide)기가 있다고 추측하였고, 아세타미드(acetamide)기는 UVmax가 220nm이다. 여기에 다른 분자가 결합되면 UVmax가 232nm가 될 수도 있기 때문에 UV 스펙트럼과 일치한다.
그리고,13C-1H NMR 스펙트럼을 비교해 본 결과는 하기 표 10과 같다.
13C-1H NMR 스펙트럼 분석
12-18(ppm) CH2
23-23 CH2
34-38 CH3
57 CH2
59 -C-
75 impurities
192 C=O
상기 표 10의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 화합물은 헤테로사이클릭 화합물(heterocyclic compound)이 가능함을 알 수 있었다.
[실험예 2]
항균력 시험
항균력 시험을 하기 위해 그람 양성세균인 포도상구균(Staphylococcus aureus)와 그람음성세균인 대장균(Escherichia coli)을 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 18시간 배양하여 LB 한천배지(agar plate)에 각 균주 100㎕를 넣고 백금이로 조밀하게 도말하여 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 18시간 배양하였다.
배양한 플레이트에 디스크(disc)를 놓고 본 발명의 저해제를 100units 접종했을 때 포도상구균과 대장균에서 각각 11mm, 15mm씩 항균테를 형성하였다.
[실험예 3]
인간 암세포에 대한 저해제의 세포독성(1)
세포독성 시험을 모스만(Mosmann)의 MIT를 이용한 방법을 적절히 변형하여 실시하였다. J82(고환으로부터 유래된 인간 암종 변이세포; Human Transitional-cell carcinoma, bladder)세포를 무혈청(serum-free) RPMI 1640 배지와 PBS(phosphate-buffered saline; KCl 0.2g, KH2PO40.2g, NaCl 8.0g, Na2HPO41.15g, MgCl2·6H2O 0.101g/l, pH7.4)을 고르게 현탁시켜서 웰 플레이트(well plate)에 100㎕씩 분주하였다. 여기에 정제된 저해제를 0.1, 1, 10(㎍/ml)농도가 되게 하여 20㎕씩 첨가하고, 대조군은 물을 20㎕를 첨가하여 37℃ 5% CO2상태 하에서 3일간 배양후 650nm에서 흡광치를 가지고 세포독성(cytotoxicity)정도를 측정한 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에서 알 수 있는 바와 같이 대조군, 0.1, 1, 10(㎍/ml)의 저해제를 첨가한 플레이트(plate)의 O.D.값은 1.100, 0.950, 0.919, 0.893이었다. 그러므로 본 저해제는 도 21에서와 같이 10㎍/ml일때 약 19%의 세포독성을 나타내었다.
[실험예 4]
인간 암세포에 대한 저해제의 세포독성(2)
세포독성 시험은 모스만(Mosmann)의 MTT 분석방법(assay)으로 측정하였으며, 세포는 인간의 백혈병(leukemia) 암세포인 jurkat T 세포(cell)을 사용하였다.
본 발명의 저해제는 40㎍/ml의 농도에서 50%의 세포가 사멸하였으므로 IC50은 약 40㎍/ml로 나타남을 알 수 있었다.
이상에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명에 의한 화학식 1의 화합물은 항균작용이 뛰어나고, 항암활성이 있는 아데노신 디아미네이즈 및 이를 생산하는 균주를 제공하는 유용한 발명인 것이다.
상기에서 본 발명은 기재된 구체예를 중심으로 상세히 설명되었지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1로 정의되는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 그의 염.
    [화학식 1]
    상기 식에서, R1은 H 또는 CH3이며, R2는 H 또는 CH3이다.
  2. 아데노신 디아미네이즈 저해활성을 가지고 있는 제 1 항에 따른 화합물을 활성성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항균제조성물.
  3. 아데노신 디아미네이즈 저해활성을 가지고 있는 제 1 항에 따른 화합물을 활성성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제조성물.
  4. 화학식 1의 화합물을 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 IADA-7 균주(KCTC 10446BP).
  5. 제 4 항의 상기 바실러스 IADA-7 균주(KCTC 10446BP)를 배양하여 제 1 항에 따른 화합물을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
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