KR100379021B1

KR100379021B1 - 식물종자의 종피로부터 천연 안토시아닌 색소를 고순도로 분리하는 방법

Info

Publication number: KR100379021B1
Application number: KR10-2000-0009915A
Authority: KR
Inventors: 정명근; 백인열; 강성택; 송석보; 신두철; 곽용호; 김순철
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2000-02-28
Publication date: 2003-04-08
Also published as: KR20010084705A

Abstract

본 발명은 식물종자의 종피로 부터 천연 항산화물질이며 식용 가능 천연색소인 안토시아닌(anthocyanin) 성분을 고순도로 안전하게 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 상세하게는, 식물종자의 종피로부터 천연 안토시아닌의 델피니딘-3-o-β-D-글루코사이드(delphinidin-3-o-β-D-glucoside) 성분과 시아니딘-3-o-β-D-글루코사이드(cyanidin-3-o-β-D-glucoside) 성분을 안정하고 고순도로 분리ㆍ정제하는 방법과, 아울러 이들로 부터 각각 안토시아닌의 비당부분(aglycone)인 델피니딘(delphinidin)과 시아니딘(cyanidin)을 고순도로 가공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 식물종자의 종피에 함유된 색소가 적색을 나타내는 수용성 안토시아닌 성분으로서 물에 쉽게 용출된다는 점과, 추출된 안토시아닌의 조성이 서로 다른 극성을 갖는 2개의 성분으로 구성되어 있다는 점에 착안하여, 단순히 안토시아닌 조색소 추출물 중에서 물에 녹지 않는 불용성 물질을 여과지로 여과하고, 단 1회의 실리카겔 역상 컬럼크로마토그래피법으로 분리하여 정제한 점에 특징이 있다. 또한, 본 발명은 정제된 안토시아닌을 산 가수분해한 후 실리카겔 역상 흡착제의 고유 특성을 이용하여 가수분해된 당 성분과 염산을 제거하고 델피니딘과 시아니딘을 고순도로 분리한 점에 특징이 있다.

본 발명은 식물종자의 종피로 부터 안토시아닌 성분을 농축과정 없이 단 1회 실리카겔 역상(RP-18) 컬럼 크로마토그래피법으로 유효성분을 고순도로 안정하게 분리ㆍ정제할 수 있다.

Description

식물종자의 종피로부터 천연 안토시아닌 색소를 고순도로 분리하는 방법 {Method for isolation of high purity natural anthocyanin pigments from a seed coat}

안토시아닌은 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체(glucoside)로서, 천연물 중 가장 불안정한 화합물에 속하여 빛, 온도 및 기타 화합물과의 공존에 의해 쉽게 파괴되는 성질을 가진 물질이다. 흔히 식물체 액포에 존재하며, 세포액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합상태에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타내는 천연 색소이고, 안토시아닌은 각 분자구조 중 하이드록실(hydroxyl)기의 갯수와 특정 하이드록실기의 메칠(methyl)화에 의해 크게 6종의 안토시아니딘으로 구분되고, 안토시아니딘과 결합된 당(sugar)의 종류와 아실(acyl)기의 종류, 결합위치에 따라 수백종으로 구분되어진다.

식물성 천연색소인 안토시아닌은 최근 여러 가지 생리활성이 있는 것으로 알려지고 있다. 예를들면 노화억제작용, 항균작용, 돌연변이성 억제작용, 콜레스테롤저하작용, 시력개선효과, 혈관보호기능, 항궤양기능, 항산화기능 등이 알려지고 있고, 특히 항산화 활성면에서는 천연 항산화제인 토코페롤보다 5∼7배의 강한 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려지고 있다. 그러나, 이러한 생리활성은 모든 종류의 안토시아닌이 기본적으로 가지는 활성이지만, 최근 각 안토시아닌의 종류에 따라 그 활성의 차이가 있는 것으로 알려지고 있다.

현재 안토시아닌은 청량음료, 잼, 시력보호용 음료수 및 사탕 등의 가공식품 생산과 향장공업, 염료공업 및 의약품 개발 등에도 활용되는 것으로 알려져 있다. 한편, 최근에는 발암성 및 간 독성이 우려되는 합성 착색료를 대신할 수 있는 안전한 천연 착색료로서 주목을 받아, 식품영양학적인 면과 더불어, 시각적 신선감 및 즐거움을 줄 수 있는 유용 성분으로 평가되고 있다.

안토시아닌 성분은 흔히 식물체의 꽃, 과실, 줄기, 잎, 뿌리 등에 함유되어 있는 물질로서, 현재 포도, 딸기, 올리브, 적양배추, 가지, 장미 등의 식물체로부터 추출하여 여러 가지 원료로 이용되고 있으나, 거의 조색소 상태로 추출하여 이용되고 있는 실정이다. 따라서, 안토시아닌 외에 다른 성분의 화합물이 공존하는 상태로 이용되는 경우가 많다. 현재로서는, 특정한 안토시아닌 성분만을 선별하여 분리할 수 있는 기술이 미흡하여, 고순도로 단리된 각각의 안토시아닌 성분을 얻기 위한 추출ㆍ 분리ㆍ정제 기술이 실용화되어 있지 않은 실정이다.

안토시아닌의 추출은 흔히 알콜 및 산을 첨가한 알콜류를 이용하여 추출한다. 알콜 및 산을 첨가한 알콜류를 이용하여 추출할 경우, 안토시아닌의 추출효율은 우수하지만, 그와 더불어 알콜 용해성 화합물도 함께 용출되므로, 고순도 분리시 여러차례의 분리작업과 농축과정이 필요하게 되는 단점이 있다. 따라서, 이 방법에 의할 경우, 분리작업 중 많은 양의 안토시아닌 색소가 필연적으로 파괴될 수밖에 없다.

한편, 분리ㆍ정제 방법으로는 이온컬럼크로마토그래피법 [Ion Column Chromatography, Norio 등. 1996. Phytochemistry 43(6): 1365-1370, Norihiko 등. 1996. Phytochemistry 44(1): 199-203], 분취박층크로마토그래피법 [Preparative Thin Layer Chromatography, Eloi 등 1997. J. Agric. Food Chem. 45(9): 3359-3361, Yokihiro 등. 997. Phytochemistry 44(1):183-186], 분취고속액체크로마토그래피법 [ Preparative High Performance Liquid Chromatography, Kumi 등. 1990. Agric. Biol. Chem. 54(7) 1745-1751, Maurizio. 1995. Journal of Chromatography A 692:213-219], 액체분배추출법 [Liquid-Liquid Partition Extraction], 침전법 [Precipitation] 등을 주로 이용한다. 이들 분리법 중에서, 이온컬럼크로마토그래피법은 1회의 분리로 고순도의 색소를 얻을 수 없어 수 차례의 분리가 이루어져야 하므로 작업이 번거롭고, 여러 차례의 농축과정에서 많은 양의 색소가 파괴되는 단점이 있다. 또한, 분취박층크로마토그래피법도 작업이 번거롭고 분취용 박층에 결합된 색소의 회수가 어려우며, 고순도 및 대량분리가 불가능한 단점이 있다. 한편, 분취고속액체크로마토그래피법은 상기 분리방법 중 가장 분리능이 우수한 방법이지만, 고가의 분취용 기기 및 장비가 필요하고, 고도의 전처리 과정이 필요하며, 분리시 고가의 용매를 사용하므로 분리비용이 엄청나고, 분리 용매의 제거시 색소의 파괴가 불가피한 단점이 있다. 또한, 액체분배추출법 및침전법은 추출 후 조색소로서의 가공법으로는 가능하지만, 특정 안토시아닌의 단리는 불가능하고, 액체분배층 분리나 침전을 유도하기 위해서는 여러 차례의 무기 혹은 유기용매를 사용하여야 하므로, 유해성의 문제가 대두되기도 한다.

한편, 안토시아닌의 비당부분인 안토시아니딘의 가공방법에 있어서는, 흔히 분리된 안토시아닌 및 조색소 추출물에 염산을 첨가하여 산 가수분해를 유도한 후, 분리된 당 성분 및 유기산을 제거하기 위해 분취박층크로마토그래피법, 분취고속액체크로마토그래피법, 액체분배추출법 등을 이용하여 왔다. 그러나, 이러한 방법들은 앞에서 언급한 여러 가지의 기술상 단점이 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 안토시아닌 성분이 분리과정에서 쉽게 파괴되는 성질이 있으므로, 가능한 한 분리과정을 극히 단순화시키거나 최소화시켜야 하고, 통상의 장비에 의해서도 손쉽게 추출하고 분리ㆍ정제 할 수 있어야 함을 유념하여 연구를 계속한 결과, 종래의 단점을 극복하여 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명자들은 식물종자의 종피에 함유된 색소가 적색을 나타내는 수용성 안토시아닌 성분으로서 물에 쉽게 용출된다는 점과, 추출된 안토시아닌의 조성이 서로 다른 극성을 갖는 2개의 성분으로 구성되어 있다는 점에 착안하여, 단순히 안토시아닌 조색소 추출물 중에서 물에 녹지 않는 불용성 물질을 여과지로 여과하고, 단 1회의 실리카겔 역상 컬럼 크로마토그라피법으로 고순도의 순수한 단리된 안토시아닌 성분을 분리하여 정제함으로써, 종래의 제반 단점을 일거에 극복하게 된 것이다. 또한, 정제된 안토시아닌 성분을 산 가수분해한 후 실리카겔 역상 카트릿지의 고유특성인 비극성 화합물만의 흡착력을 이용하여 가수분해된 당 성분과 염산을 제거하고 안토시아니딘 성분을 고순도로 분리ㆍ정제함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

도 1은 식물종자(검정콩)의 종피에 함유된 안토시아닌 색소를 분리하는

과정의 구체적인 순서도이고,

도 2는 식물종자(검정콩)의 종피에 함유된 안토시아닌 조색소와, 본 발명에 의해 단리된 [화학식 1]의 델피니딘-3-o-β-D-글루코사이드 성분 및 [화학식 2]의 시아니딘-3-o-β-D-글루코사이드 성분을 액체색층 분석기로 분석한 크로마토그램이며,

도 3은 본 발명에 의해 최종 가공된 [화학식 3]의 델피니딘 성분과 [화학식 4]의 시아니딘을 액체색층분석기로 분석한 크로마토그램이다.

※도면 중 주요부분에 대한 부호의 명칭

A : 검정콩 종피가 함유한 안토시아닌 조색소

B : [화학식 1]의 델피니딘-3-o-β-D-글루코사이드

C : [화학식 2]의 시아니딘-3-o-β-D-글루코사이드

D : [화학식 3]의 델피니딘

E : [화학식 4]의 시아니딘

본 발명은 식물종자의 종피로부터 천연 안토시아닌 색소인〔화학식 1〕의 델피니딘-3-o-??-D-글루코사이드와〔화학식 2〕의 시아니딘-3-o-??-D-글루코사이드를 안정하게 고순도로 추출ㆍ분리ㆍ정제하는 방법을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

또한, 본 발명은 이들의 안토시아니딘인 [화학식 3]의 델피니딘과 [화학식 4]의 시아니딘을 고순도로 가공하는 방법을 제공하는 것이다.

[화학식 3]

[화학식 4]

본 발명은 도 1에 예시적으로 도시된 바와 같이, 식물종자의 종피에 0.1∼1%의 염산 혹은 1∼10%의 유기산을 함유한 물을 첨가한 후 1∼10℃ 조건의 냉암소에서 24시간 내지 72시간씩 2내지 4회 냉침하여 수용성 안토시아닌 조 추출물을 추출하는 단계 : 안토시아닌 조 추출물을 여과지로 여과하여 불용물을 제거하는 단계 : 여과된 조 추출물을 실리카겔 역상 컬럼에 하적하여 부착 및 농축하는 단계 : 부착 및 농축된 안토시아닌 조 추출물로부터 색소 이외의 물질 및 극성물질을 제거하기 위해 증류수로 흘려 세척하는 단계 : 실리카겔 역상 컬럼에 부착ㆍ농축된 안토시아닌 조색소를 0.1∼1% 염산함유 10% 알코올, 20% 알코올 및 30% 알코올로 [화학식1]의 델피니딘-3-o-β-D-글루코사이드와〔화학식 2]의 시아니딘-3-o-β-D-글루코사이드를 순차적으로 분리하여 고순도로 단리된 각각의 천연 안토시아닌 색소를 정제하는 단계로 구성된다.

본 발명은 또한 고순도로 분리ㆍ정제된 각각의 안토시아닌에 산을 가하여 가수분해하는 단계 : 상기 산 가수분해된 용액을 여과지로 여과하여 불용물을 제거하는 단계 : 실리카겔 역상 카트릿지에 여과된 산 가수분해 용액을 흘려 색소용액을 부착ㆍ농축시키는 단계 : 산 가수분해된 색소용액이 부착ㆍ농축된 실리카겔 역상 카트릿지에 증류수를 흘려 안토시아닌으로부터 가수분해 되어 나온 당과 산 용액을 완전히 제거하여 세척하는 단계 : 실리카겔 역상 카트릿지를 세척한 후 0.1∼1%의 염산 혹은 1∼10%의 유기산 함유 알코올을 실리카겔 역상 카트릿지에 흘려 최종 고순도로 단리된 [화학식 3]의 델피니딘, [화학식 4]의 시아니딘과 같은 안토시아니딘을 분리, 가공하는 단계를 포함한다.

본 발명은 식물종자의 종피에 0.1∼10% 산을 함유한 물을 첨가한 후, 일정온도에서 일정시간 동안 냉침한다. 식물종자는 인간이 식용할 수 있는 것이면 족하고, 특별한 제한은 없다. 그 중에서도 콩 종류가 바람직하고, 특히 과거로부터 약콩이라 하여 한방약재로 많이 사용되는 검정콩이 더욱 바람직스럽다. 사용되는 산으로는 0.1∼1.0% 염산을 사용하거나, 1∼10% 유기산을 사용하며, 유기산으로는 개미산, 초산, 능금산, 호박산 및 구연산 중 1 또는 그 이상을 선택적으로 사용하는 것이 바람직하다. 염산이 0.1% 이하일 경우엔 pH가 1.5이상이 되어 추출된 색소의 색도가 낮아 불량함으로 바람직스럽지 못하고, 1.0%이상일 경우엔 pH가 1이하로 너무 강한 산도를 나타내므로 분리ㆍ정제 과정 중에 색소의 파괴가 수반될 수 있으므로 바람직스럽지 못하다. 또한 유기산에 있어서도 마찬가지이다. 냉침은 1∼10℃의 냉암소에서 추출하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기는 2∼5℃ 범위의 냉암소이고, 24시간 내지 72시간씩 1내지 4회를 실시한다. 24시간 미만일 경우 조 색소 추출물의 생성이 약한 반면, 72시간 이상일 경우 효율적이지 못하며, 4회 이상 실시의 경우도 효율적이지 못하다.

본 발명에 있어서, 안토시아닌 조 추출물은 여과지로 여과되어진다. 이는 추출물 용액으로부터 불용성 물질을 제거하기 위함이다.

본 발명에 있어서, 여과된 안토시아닌 조색소 추출용액은 실리카겔 역상 컬럼에 하적하여 부착 및 농축되어진다. 실리카겔 역상 컬럼의 사용은 극성의 차이를 이용해 혼합물을 순수하게 분리ㆍ정제하는 특징이 있으므로 여과된 안토시아닌 조색소 추출용액 중에서 색소이외의 물질 및 극성물질을 제거하고, 서로 다른 극성을 가진 여러 종류의 안토시아닌 중에서 각각의 단리된 고순도의 안토시아닌 색소 성분을 분리ㆍ정제하기 위함이며, 일반적으로 실리카겔 역상 컬럼은 실리카겔의 표면에 탄소를 18개(C18, RP-18, ODS계열) 혹은 8개(C8)를 인위적으로 결합시킨 것이 상용화되고 있는데, 본 발명의 한 바람직한 실시예에서 탄소를 18개 결합시킨 C18, RP-18 계열이 효율적이었으며, 동일 계열이면 제조회사와 관계없이 모두 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 실리카겔 역상 컬럼에 부착 및 농축된 안토시아닌 조 추출물은 0.1∼1% 염산함유 10% 알코올, 20% 알코올 및 30% 알코올을 이용하여 순차적으로 분리ㆍ정제되어 진다. 알코올은 OH-그룹을 함유한 모든 알코올이 사용될 수 있으나, 식품공전상 사용 가능한 에탄올을 사용하는 것이 바람직스럽다.

본 발명은 또한 고순도로 단리된 각각의 천연 안토시아닌에 산을 첨가하여 산 가수분해하는 단계가 포함될 수 있다. 산으로는 염산 및 유기산이 바람직하다. 산이 첨가된 용액은 80∼100℃ 정도의 고온에서 1∼5시간 동안 가수분해 과정을 거친다. 80℃ 이하의 경우엔 가수분해의 효율이 낮아지므로 바람직스럽지 못하다. 통상적으로는 저온일수록 장시간의 가수분해과정이 요구되며, 고온일수록 짧은 가수분해과정이 요구된다. 바람직하기로는 95∼100℃에서 1.5∼3시간의 가수분해가 효율적이다.

본 발명에 있어서, 산 가수분해된 안토시아닌 조색소 추출용액은 다시 여과지에 의한 여과과정을 거친 후, 상기 안토시아닌 색소분리 과정과 동일한 방법으로 실리카겔 역상 카트릿지에 여과된 산 가수분해 용액을 흘려 가수분해된 색소용액의 비당부분을 부착ㆍ농축시키는 단계와 산 가수분해된 색소용액의 비당부분이 부착ㆍ농축된 실리카겔 역상 카트릿지에 증류수를 흘려 당과 산 용액을 완전히 제거하여 세척하는 단계와 실리카겔 역상 카트릿지를 세척한 후 0.1∼1%의 염산 혹은 1∼10%의 유기산 함유 알코올을 실리카겔 역상 카트릿지에 흘려 최종 안토시아니딘을 분리, 가공하는 단계가 포함된다. 여과 과정에서는 가수분해 후 생성되는 불용성 물질을 제거하고, 실리카겔 역상 카트릿지를 활성화시키는 단계에서는 가수분해된 용액 중 비극성 물질인 비당부분의 물질은 완전히 부착 및 농축시키고, 극성 물질인 당과 산용액은 부착이 되지 않고 카트릿지를 통과할 수 있도록 실리카겔에 부착된 충진물을 활성화시킨다. 이후, 상기의 카트릿지에 증류수를 흘려보내어 당과 산용액을 완전히 제거하고, 0.1∼1%의 염산 혹은 1∼10%의 유기산 함유 알코올을 실리카겔 역상 카트릿지에 흘려 최종 안토시아니딘을 분리, 가공한다. 알코올은 모든 알코올이 사용될 수 있으나 바람직하기로는 메탄올 및 에탄올의 사용이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 실시하기 위하여 제시된 하나의 예시일 뿐이며, 하기의 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것이 아니다.

＜실시예 1＞ 검정콩 종피로부터 안토시아닌 성분의 분리ㆍ정제

본 발명에 사용된 식물종자는 검정콩으로서, 농촌진흥청 영남 농업시험장에서 육성된 일품검정콩(Glycine max(L.) Merr. var. Ilpeumgeomjeong

-kong)이었으며, 종피에 함유된 안토시아닌 중 시아니딘-3-o-β-D-글루코사이드가 80%, 델피니딘-3-o-β-D-글루코사이드가 16% 함유되어 있었다.

먼저 검정콩 종피 10g을 0.5% 염산 함유 증류수 500㎖로 48시간씩 2회 5℃조건의 냉암소에서 냉침하여 추출한 다음, 와트만 1번(Whattman No. 1) 여과지로 여과하여, 탈색된 검정콩 종피를 제거하였다. 여과된 안토시아닌 조 추출액을 다시 0.45㎛의 반투성필터(membrane filter, Waters사 제조품)를 이용하여 다시 여과하였다. 여과된 안토시아닌 조 추출액은 농축과정 없이 직경 3㎝ × 높이 40㎝로 충진된 실리카겔 역상(RP-18)크로마토그라피 컬럼에 하적하였으며, 색소 조 추출액의 하적 후 색소 이외의 물질 및 극성 물질을 제거하기 위해 증류수 200㎖를 흘려주었다(도 1). 이때, 상기의 실리카겔 역상 크로마토그라피용 컬럼의 충진제(absorbent)는 Merck사의 Lichroprep RP-18을 사용하였다. 그 후, 0.5% 염산함유 10%에탄올 200㎖, 0.5% 염산함유 20%에탄올 200㎖, 0.5% 염산함유 30%에탄올 200㎖를 순차적으로 흘려주었고, 0.5% 염산함유 10%에탄올 및 20%에탄올로부터〔화합물 1〕을, 0.5% 염산함유 30%에탄올로부터〔화합물 2〕를 순수 분리ㆍ정제하였다. 분리ㆍ정제과정의 구체적 순서는 도 1과 같다.

검정콩 종피에 함유된 안토시아닌 조 추출물과, [화학식 1]과 [화학식 2]의 각 성분으로 분리된 안토시아닌을 각각 고속액체색층분석기로 분석하였으며, 그 조건은 다음과 같았다.

컬럼 : μ-Bondapak C18 (4.6 × 300㎜, Waters사 제조품)

예비컬럼 : μ-Bondapak C18 guard column (Waters사 제조품)

용매 : 초순수 증류수 70 %, 메탄올 25 %, 개미산 5 %의 혼합 용매

검출기 : 가시광선 530㎚, 자외선 280㎚

유속 : 0.6㎖/분

온도 : 30℃

검정콩 원료의 종피에 함유된 안토시아닌의 조성과, 단리된 [화학식 1] 및 [화학식 2]의 안토시아닌 성분을 분석한 결과, 도 2의 크로마토그램(chromatogram)과 같았다. 또한, 단리된 안토시아닌의 순도를 분석한 결과, [화학식 1]과 [화학식 2]는 모두 상대순도 99% 이상을 나타내어 순수하게 분리되었음을 확인하였다. 또한, 실리카겔 역상(RP-18) 컬럼크로마토그래피법에 의해 순수하게 분리ㆍ정제된 양은 각각 [화학식 1]이 18.8㎎이었고, [화학식 2]가 69.2㎎이었다.

＜실시예 2＞ 검정콩 종피 안토시아닌 [화학식 1] 및 [화학식 2]의 화학적 특성

검정콩 종피에서 추출된 안토시아닌 조색소로부터 순수하게 단리된 각각의 안토시아닌인〔화학식 1〕과〔화학식 2〕의 분광학적 특성 및 이화학적 특성은 다음과 같다.

[화학식 1]의 화합물(델피니딘-3-o-β-D-글루코사이드) :

(1) 물질의 성상 : 적색 가루상

(2) 분자량 : 〔M〕⁺= 465

(3) 분자식 : C₂₁H₂₁O₁₂

(4) 자외선-가시광선 분광특성(0.5%염산-50%메탄올) :

λmax(㎚) : 279, 530

Εuv/Εvis(%) : 69

Εacyl/Εvis(%) : 14

Ε440/Εvis(%) : 27

(5) 박층크로마토그래피 이동치(흡착제 : cellulose microcrystalline F)

FHW(HCOOH : HCl : H₂O = 1 : 1 : 2) : 0.21

BAW(n-butanol : HoAc : H₂O = 4 : 1 : 5, upper phase) : 0.28

(6) 수소 핵자기공명 스펙트럼

0.5% 염산함유 - 메탄올(0.5%DCl-CD₃OD, 25℃, 300㎒)을 용매로 하여 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼의 결과는 다음과 같다.

¹H-NMR(0.5%DCl-CD₃OD) δ = 3.48(1H, t, J=9.0㎐, H-4〃), 3.55(1H, t, J= 9.0㎐, H-3〃), 3.62 (1H, ddd, J=8.9, 7.0, 2.3㎐, H-5〃), 3.72(1H, dd, J= 9.0, 7.5㎐, H-2〃), 3.75(1H, dd, J= 12.0, 6.0㎐, H-6〃b), 3.92(1H, dd, J= 12.0, 1.9㎐, H-6〃a), 5.36(1H, d, J=7.7㎐, H-1〃), 6.68(1H, d, J=1.9㎐, H-6), 6.91(1H, d, J=1.9㎐, H-8), 7.77(2H, s, H-2',6'), 8.94(1H, s, H-4)

[화학식 2]의 화합물(시아니딘-3-o-β-D-글루코사이드) :

(1) 물질의 성상 : 적색 가루상

(2) 분자량 : 〔M〕⁺= 449

(3) 분자식 : C₂₁H₂₁O₁₁

(4) 자외선-가시광선 분광특성(0.5%염산-50%메탄올) :

λmax(㎚) : 281, 522

Εuv/Εvis(%) : 73

Εacyl/Εvis(%) : 16

Ε440/Εvis(%) : 32

FHW(HCOOH : HCl : H₂O = 1 : 1 : 2) : 0.35

BAW(n-butanol : HoAc : H₂O = 4 : 1 : 5, upper phase) : 0.38

(6) 수소 핵자기공명 스펙트럼

¹H-NMR(0.5%DCl-CD₃OD) δ = 3.47(1H, t, J=9.0㎐, H-4〃), 3.54(1H, t, J= 9.0㎐, H-3〃), 3.64(1H, ddd, J=9.0, 7.0, 2.5㎐, H-5〃), 3.70(1H, dd, J= 9.0, 7.5㎐, H-2〃), 3.74(1H, dd, J= 12.0, 6.0㎐, H-6〃b), 3.93(1H, dd, J= 12.0, 2.0㎐, H-6〃a), 5.34(1H, d, J=7.6㎐, H-1〃), 6.69(1H, d, J=2.0㎐, H-6), 6.94(1H, d, J=2.0㎐, H-8), 7.03(1H, d, J=8.7㎐, H-5'), 8.04(1H, d, J=2.3㎐, H-2'), 8.26(1H, dd, J=8.8, 2.3㎐, H-6'), 8.99(1H, s, H-4)

＜실시예 3＞ 화학식 1 및 2의 화합물로부터 델피니딘과 시아니딘의 수득

검정콩 종피에서 추출된 안토시아닌 조색소로부터 순수하게 단리된 각각의 안토시아닌인〔화학식 1〕및〔화학식 2〕의 화합물 각 7㎎에 10㎖의 증류수와 동량의 농 염산을 첨가하고, 100㎖ 파이렉스 캡 튜브에 넣은 후 질소가스로 충전한 뒤, 100℃에서 2시간 동안 산 가수분해를 수행하였다. 산 가수분해된 용액은 0.45㎛의 반투성필터(membrane filter, Waters사 제조품)를 이용하여 여과하였다. 여과된 각각의 가수분해 용액은 알코올 및 증류수로 활성화시킨 실리카겔 역상(RP-18) 카트릿지에 하적하여 비당부분만을 상기 카트릿지에 부착ㆍ농축시켰다. 실리카겔 역상(RP-18) 카트릿지는 Waters사의 제조품인 Sep-pak Vac 6cc를 사용하였다.

안토시아닌의 비당부분만이 부착ㆍ농축된 실리카겔 역상(RP-18) 카트릿지에 10㎖의 증류수를 흘려보내어 당과 염산용액을 완전히 제거하고, 다시 2㎖의 0.5%염산 메탄올 용액을 흘려보내어 각각 흡착된 안토시아니딘인〔화학식 3〕및〔화학식 4〕의 화합물을 분리ㆍ정제하였고, 구조적 파괴를 방지하기 위하여 질소기류 하에서 1시간 동안 농축하여 적색 분말을 가공하였다.

＜실시예 4＞ 안토시아니딘 [화학식 3] 및 [화학식 4]의 화학적 특성

상기의 안토시아닌 [화학식 1]과 [화학식 2]를 각각 산 가수분해하고, 실리카겔 역상(RP-18) 카트릿지를 이용하여 수득한 안토시아니딘 [화학식 3] 및 [화학식 4]의 화학적 특성은 다음과 같다.

[화학식 3]의 화합물(델피니딘) :

(1) 물질의 성상 : 적색 가루상

(2) 분자량 : 〔M〕⁺= 303

(3) 분자식 : C₁₅H₁₁O₇

(4) 자외선-가시광선 분광특성(0.5%염산-50%메탄올) : λmax(㎚) : 276, 550

(5) 수소 핵자기공명 스펙트럼 :

¹H-NMR(0.5%DCl-CD₃OD) δ = 6.66(1H, d, J=1.9㎐, H-6), 6.91(1H, d, J=1.3㎐, H-8), 7.81(2H, s, H-2',6'), 8.62(1H, s, H-4)

[화학식 4]의 화합물(시아니딘) :

(1) 물질의 성상 : 적색 가루상

(2) 분자량 : 〔M〕⁺= 287

(3) 분자식 : C₁₅H₁₁O₆

(4) 자외선-가시광선 분광특성(0.5%염산-50%메탄올) : λmax(㎚) : 281, 522

(5) 수소 핵자기공명 스펙트럼

¹H-NMR(0.5%DCl-CD₃OD) δ = 6.59(1H, s, H-6), 6.82(1H, s, H-8), 6.95(1H, d, J=8.7㎐, H-5'), 7.98(1H, d, J=2.1㎐, H-2'), 8.12(1H, dd, J=8.6, 1.9㎐, H-6'), 8.53(1H, s, H-4)

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 식물종자의 종피로 부터 천연 항산화물질이고 식용 가능한 천연색소인 안토시아닌 성분을 농축과정 없이 단 1회 실리카겔 역상(RP-18) 컬럼 크로마토그래피법으로 [화학식 1]의 델피니딘-3-o-β-D-글루코사이드와 [화학식 2]의 시아니딘-3-o-β-D-글루코사이드를 안정하게 고순도로 분리ㆍ정제할 수 있고, 아울러 이들을 산 가수분해 한 후 안토시아닌의 비당부분(aglycone)인 [화학식 3]의 델피니딘과 [화학식 4]의 시아니딘을 쉽게 분리할 수 있다.

또한, 본 발명은 분리ㆍ정제 과정이 타 방법에 비해 매우 단순하여 고순도로 단리된 각각의 안토시아닌 성분을 정제하여 얻을 수 있고, 또한, 제반 과정에 의해서도 유해성이 없으므로 식물종자의 종피에 함유된 안토시아닌을 쉽게 고순도로 분리ㆍ정제하여 이를 각종의 가공식품, 의약품, 착색염료 등으로 활용할 수 있다.

또한, 본 발명은 고순도로 단리된 안토시아닌 색소 제품을 생산할 수 있으므로, 공업용 원료 또는 연구용 표준시약으로 생산할 수 있어 산업적 이용에 활용 가능한 장점이 있다.

또한, 본 발명은 기존 재배작물이 함유하고 있는 천연 항산화성분 또는 생리활성물질을 손상없이 자원화하기 위한 중요 기초기술로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이상에서 본 발명에 의한 천연 안토시아닌 색소의 추출 및 고순도 분리ㆍ정제 방법을 예시 도면 및 실시 예에 의하여 설명하였으나, 이는 본 발명의 가장 바람직한 실시양태를 기재한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되지 아니함은 당연하다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 본 명세서의 기재내용에 의하여 다양한 변형 및 모방을 행할 수 있을 것이나, 이 역시 본 발명의 범위를 벗어난 것이 아님은 명백하다고 할 것이다.

Claims

식물종자의 종피에 0.1∼1%의 염산 혹은 1∼10%의 유기산을 함유한 물을 첨가한 후 1∼10℃ 조건의 냉암소에서 24시간 내지 72시간씩 2내지 4회 냉침 추출하여 수용성 안토시아닌 조 추출물을 추출하는 단계 : 안토시아닌 조 추출물을 여과지로 여과하여 불용물을 제거하는 단계 : 여과된 조 추출물을 실리카겔 역상 크로마토그라피 컬럼에 하적하여 안토시아닌 조 추출물을 실리카겔 역상 컬럼에 부착 및 농축하는 단계 : 부착 및 농축된 안토시아닌 조 추출물로부터 색소 이외의 물질 및 극성물질을 제거하기 위해 증류수로 흘려 세척하는 단계 : 실리카겔 역상 컬럼에 부착ㆍ농축된 안토시아닌 조색소를 0.1∼1% 염산함유 10%알코올, 20%알코올 및 30%알코올로 순차적으로 분리ㆍ정제하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 식물종자의 종피 함유 천연 안토시아닌 색소의 고순도 분리ㆍ정제방법.
제 1항에 있어서,

식물종자는 검정콩 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서,

상기 안토시아닌 색소가 델피니딘-3-o-β-D-글루코사이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서,

상기 안토시아닌 색소가 시아니딘-3-o-β-D-글루코사이드 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

산은 0.1∼1%의 염산인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

유기산은 개미산, 초산, 능금산, 호박산 및 구연산 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 것이며, 그 농도가 1∼10%인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,

상기의 천연 안토시아닌을 고순도로 분리ㆍ정제하는 단계 이후에, 정제된 각각의 안토시아닌에 산을 첨가하여 80∼100℃ 조건에서 1∼5시간 가수분해하는 단계 : 산 가수분해된 용액을 여과지로 여과하여 불용물을 제거하는 단계 : 실리카겔 역상 카트릿지에 여과된 산 가수분해 용액을 흘려 색소용액을 부착ㆍ농축시키는 단계 : 산 가수분해된 색소용액이 부착ㆍ농축된 실리카겔 역상 카트릿지에 증류수를 흘려 당과 산 용액을 완전히 제거하여 세척하는 단계 : 실리카겔 역상 카트릿지를 세척한 후 0.1∼1%의 염산 혹은 1∼10%의 유기산을 함유한 알코올을 실리카겔 역상 카트릿지에 흘려 최종적으로 고순도로 분리된 안토시아니딘을 가공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서,

상기 안토시아닌딘이 델피니딘인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서,

상기 안토시아닌딘이 시아니딘인 것을 특징으로 하는 방법.
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