KR100377506B1 - 변이된초항원과표적-탐지화합물간의복합체,이복합체를함유하는제약학적조성물및이를이용한치료방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명턱은 (a) 미리결정된 구조에 결합하는 생체특이 친화성 상대물(표적 -탐지 그룹)(b) 초항원으로부터 유도한 아미노산 서열을 함유하고, T 세포 수용체의 Vβ 사슬에 결합하는 능력을 가지며, 펩티드가 유도된 것으로부터의 초항원에 비해 MHC 제 2급 항원에 결합하는 변이된 능력을 갖는 펩티드가 서로 공유결합되어 이루어진 복합체에 관한 것이다.

Description

변이된 초항원과 표적-탐지 화합물 간의 복합체, 이 복합체를 함유하는 제약학적 조성물 및 이를 이용한 치료방법
초항원은 본래 바이러스나 박테리아에서 유래한 단백질이며, 포유동물 세포상의 MHC 제 2급 항원 및 T 세포 수용체 Vβ 사슬에 동시에 결합할 수 있다. 그 결합으로 인해 T-림프구가 활성화되고 MHC 제 2 급 관련 세포가 용균된다. Vβ 사슬 결합 부분의 알맞은 정도의 다형 현상은 초항원과 접촉하였을 때 T-림프구의 상대적으로 넓은 부분을 활성화시킨다(일반적인 항원-프로세싱을 통한 활성화에 비해).
처음에, 초항원이라는 개념은 다양한 포도상구균성 장독소(SEA, SEB, SEC1, SEC2, SED 및 SEE)와 관련지어 생각하였다. 최근에는, SEH 라 명명된 신규한 포도상구균성 장독소가 발견되었다[Keyong 등의 J. Exp. Med, 180 (1994) 1675 - 1683참조]. 관심이 높아진 후에, 더 많은 초항원이 발견되었다. 예로는 특히 독성쇽증후근 독소 1(TSST - 1), 포도상구균성열상양피부증후군과 관련된 박리성 독소(Exft), 연쇄상구균 발열성 외독소 A, B 및 C(SPE A,B 및 C), 마우스유암바이러스 단백질(MMTV), 연쇄상구균성 M단백질, 웰치균성 장독소(CPET)가 있다. 초항원과 그들의 성질에 관한 개관은 Kotzin 등의 [Adv. Immunol. 54 (1993) 99 - 166]에 나타나 있다.
슈도모나스 외독소 A는, 이 독소가 부세포에 의해 Vβ 사슬에 결합하는 능력과 그 직후의 T 세포 활성을 수반하는, 세포 표면에서 발현되는 단편으로 세포내에서 프로세싱됨을 나타낸 결과로 인해 기능성 초항원으로 간주되어 왔다[Pseudomonas exotoxin A. Legaard 등의 Cell, Immunol . 135(1991) 372 - 382 참조].
이같은 초항원은 면역계의 일반적인 활성화를 통해 달성되는 치료효과를 수반하는 다양한 질환 치료법으로 제시되어 왔다[Kalland등의 WO 9104053 ; Terman 등의 WO 9110680 ; Terman 등의 WO 9324136 ; Newell 등의 Proc, Natl Acad, Sci, USA 88 (1991) 1074- 1078 참조].
백신과 관련하여, 초항원의 TCR 결합능이 상실되도록 돌연변이시킨 초항원을 사용하도록 제시되어 있다[Kappler & Marrack, WO 9314634참조].
초항원의 돌연변이는 앞서 [Kappler & Marrack, WO 9314634 ; Kappler 등의 J. Exp. Med. 175 (1992) 387 - 396 ; Grossman 등의 J. Immunol 147 (1991) 3274 - 3281 ; Hufnagle 등의 Infect. Immun. 59 (1991) 2126 - 2134] 문헌에 기술되어 있다.
항체가 향하는 구조를 발현시키는 세포를 용균시키기 위해 초항원과 항체 간의 치료용 복합체를 사용할 것을 앞서 제안하였다[Dohlsten 등의 WO 9201470 ; Lando 등의 Cancer Immunol, Immunother. 36 (1993) 223 - 228 ; Kalland 등의 Med. Oncol. Tumor Pharmacother. 10 (1993) 37 - 47 ; Lando 등의 J. Immunol, 150 (8 part 2) (1993) 114A (Joint Meeting of the American Association of Immunologists and the Clinical Immunology Society, Denver, Colorado, USA, May21 - 25 (1993)) ; Lando 등의 Proc. Am. Assoc. Cancer Res. Annu, Meet. 33(0) (1992) 339 (Annual meeting of the American Association for Cancer Research, San Diego, California, USA, May 20 - 23 (1992)) ; Dohlsten 등의 Proc. Natl. Acad Sci USA 88 (1991) 9287 - 9291 참조] 치료되는 질환으로는 질환 -특이 표면 구조를 발현시키는 세포와 관련된 암, 바이러스 감염증, 기생충 감염, 자가면역 질환 및 그외의 질환이 있다. 이제까지 실시된 실험 연구는 재조합 SEA와 다양한 항암 항체를 함유하는 복합체에 초점을 맞추었다. 이와 같은 복합체는 초항원의 비 - 복합형에 비해 MHC 제 2 급 항원에 결합하는 능력이 다소 감소되었다. 감소된 MHC 제 2 급 항원 결합능이 최적 용균 및 최적 치료 효과에 이르는 데 유리한지의 여부는 결정되지 않았다.
종양 특이적 항 -이디오타이프 항체와 화학적으로 결합하는 SEB를 이용한 면역치료 실험은 Ochi 등에 의해 이미 기술되어 있다[J. Immunol. 151 (1993) 3180 - 3186 참조].
스웨덴 특허청에 우선권 출원이 제출된 상태에서, 특히 MHC 제 2 급 결합없이 SEB 단편과 단백질 A 간의 융합 또는 세포를 죽이기 위한 융합체의 용도를 기술한 Buelow 등의 [J. Immunol. 148 (1992) 1 - 6] 문헌 및 초항원 연쇄상구균 적혈구생성성 독소 A의 비융합형의 MHC 제 2 급 결합에 영향을 미치는 돌연변이를 기술한 Hartwig 등의 [Int. Immunol. 5 (1993) 869 - 875] 문헌을 부가적으로 인용하였다.
발명의 목적
본 발명의 첫 번째 목적은 일반적인 면역 자극 대 유도된 세포독성에 대하여 이미 공지된 초항원 -항체 복합체를 개량하는 것이다 자극은 T -림프구를 활성화시키고, T세포 수용체 및 MHC 제 2 급 항원 둘 다에 결합하는 초항원의 능력에 의존한다.
본 발명의 두 번째 목적은 생체특이적 친화성 상대물(예를 들어, 항체)과 MHC 제 2 급 항원에 대해 변이된 친화성을 갖는 초항원간의 복합체를 제공하는 것이다. 이것은 항원을 노출시키는 세포의 초항원 항체 의존성 세포용해(SADCC)에 대한 선택성(복합체의 항체/생체특이적 친화성 상대물이 향하는 것에 반하여)이 MHC 제 2 급 항원을 노출시키는 다른 세포 이상으로 개선되었음을 보여주는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 각각의 질환에 대해 특이적인 구조를 그들의 표면에 발현시키는 세포와 관련된 암, 자가면역 질환, 기생충 감염, 바이러스 감염증 또는 그외의 질환을 앓고 있는 포유동물 치료에 있어서, 유효성분으로서 이용될 수 있는 복합체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 복합체와 이를 함유한 조성물 및 치료방법에 관한 것이다.
발명
본 발명의 주된 양상은 다음을 함유하는 복합체이다.
a. 복합체에 결합하고자 하는 구조로 향하는 생체특이적 친화성 상대물,
b. i. 초항원으로부터 유도되고,
ii. T 세포 수용체의 Vβ 사슬에 결합하는 능력을 가지며,
iii. 펩티트를 유도한 초항원 [야생형의 초항원 = SA(wt)]과 비교하여 MHC 제 2 급 항원에 결합하는 변이된 능력을 갖는 펩티드.
펩티드와 친화성 상대물은 다리(B)를 통해 서로 공유결합한다.
바람직한 복합체는 친화성 상대물이 향하는 구조를 표면에 나타내는 세포의 선택적인 용균을 위해 T -림프구를 활성화시키고 통제하는 능력을 갖는다. 이것은 복합체가 SADCC(초항원 항체 의존성 세포독성) 매개 방법에 있어 세포용해를 일으킴을 의미한다. 하기 실험 부분 및 초항원과 항체 간의 복합체에 관한 우리의 상기 공고(예를 들어, Dohlsten 등의 WO 9201470)를 참조하라.
본 발명의 복합체는 선행 기술(본원에서 참고문헌으로 인용한 Dohlsten 등의 WO 9201470)에 기술된 초항원 -항체 복합체와 유사한 구조를 갖는다. 즉, 복합체는 다음 식을 따른다 :
T - B - SA(m)
여기에서, T는 생체특이적 친화성 상대물을, SA(m)는 변이된 초항원(상기 - 언급한 펩티드)을 나타내며 B 는 T 와 SA(m)를 서로 결합시키는 공유결합 다리를 나타낸다.
원칙적으로 T 는 생체특이적 친화성을 통해 결합하는 모든 구조일 수 있다. 가장 중요한 경우에 있어서, T 는 세포 표면 구조, 바람직하게 상기 언급된 질환 특이 구조에 결합하기 쉽다. T 가 향하는 구조는 일반적으로 (a) 초항원 유도 펩티드[SA(m)]가 결합하는 Vβ 사슬 에피토프 및 (b) 비변이 초항원이 결합하는 MHC 제 2 급 항원 에피토프와는 다르다. 생체특이적 친화성 상대물 T는 주로 인터루킨(예를들어, 인터루킨 - 2), 호르몬, 항체와 항체의 항원 결합 단편 및 성장인자 등에서 선택할 수 있다. 예를 들어, Woodworth, Preclinical 및 Clinical Development of Cytokine Toxins presented at the conference "Molecular Approaches to cancer Immumotherapy", Ashville, North Carolina, November 7 - 11, 1993 문헌을 참조하라. 면역글로불린의 불변 도메인에 결합하는 폴리펩티드(예를들어, 단백질 A, G 및 L), 렉틴, 스트렙타비딘, 바이오틴 등은 우선일에는 중요하지 않은 것으로 간주되었다.
우선일에는, T 로는 소위 C242 에피토프[Lindholm 등의 WO 9301303 참조] 또는 그외의 암 특이적 에피토프로 향하는 항체의 항체 활성 단편(Fab 와 같은)에 특별한 중점을 두는, 항체 또는 항체의 항원 결합 단편[Fab, F(ab)2, Fv, 단일 사슬 항체 등을 포함]이 바람직하다.
T 가 항체일 경우에, 그것은 주로 모노클로날 항체이거나 한정된 수의 모노클로날 항체(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상)의 혼합물이다. T는 그 용도가 비 -치료용인 경우에는, 폴리클로날 항체일 것이다.
T 의 경우에 폴리펩티드 구조를 갖는 것은 필요치 않다.
변이된 초항원 SA(m)는 주로 돌연변이된 초항원이지만, T 세포 수용체의 Vβ 사슬에 결합하는 능력을 보유하는 초항원 단편을 포함하는 화학적으로 변이된 초항원일 가능성도 있다.
"돌연변이된 초항원" 이라는 표현은 천연 초항원의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환, 삽입 또는 제거함으로써 MHC 제 2 급 항원에 결합하는 초항원의고유한 능력을 유전자 단계에서 변이시킴을 의미한다.
전체 아미노산 서열의 일부를 제거하는 돌연변이에 의해 수득한 초항원 단편 및 초항원을 효소적 또는 화학적으로 절단하여 수득한 단편은 본 발명의 화학적 복합체와 동등하게 사용할 수 있다.
변이된 초항원 SA(m)는 상이한 초항원으로부터 유도되었고 돌연변이되었을지도 모르는 하나 또는 그 이상의 아데노산 서열을 포함하며, 바람직한 초항원의 조합의 예를 하기에 언급하였다.
이와 같이 변이된 초항원 SA(m)는 천연 초항원에 비해 감소된 면역원성 및 독성을 나타낼 것이다.
T 세포 수용체의 Vβ - 사슬과 교차반응할 수 있는 다른 그룹/물질은 또한 상기한 바와 같은 돌연변이된 초항원[SA(m)]과 동등하게 사용될 수 있다. 그러한 그룹/물질은 비 - 폴리펩티드 구조일 것이다.
우선권 연도의 말에, 본 발명의 가장 관심있는 생산물은 다중의 MHC 제 2 급 결합 부위 및/또는 Zn2+를 조정하는 능력을 갖는 초항원(예를들어 SEA, SED, SEE 및 SEH)의 돌연변이형을 포함하였다.
SA(m) 뿐만 아니라 T 도 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다.
다리(B)는 이미 Dohlsten등의 WO 9201470 에 기술된 바와 같이 선택할 수 있다. 즉, 그것은 친수성이 바람직할 것이며, 아미드, 티오에테르, 에테르, 이황화물 등에서 선택한 하나 또는 그 이상의 구조를 나타낸다. 다리가 파손되지 않은 탄화수소 사슬로 치환되지 않았을 경우, 그것은 페닐과 같은 방향족 고리가 없는 것이 바람직하다.
가장 중요한 다리는 재조합 기술에 의해 수득한 것, 즉 유전자 단계에서 발생한 결합이다. 경우에 따라서는, Gln, Ser, Gly, Glu 및 Arg과 같은 친수성 아미노산 잔기를 함유하는 올리고펩티드 다리가 바람직하다. Pro 및 His 도 포함될 것이다. 우선권 연도 중에, 바람직한 다리는 세 개의 아미노산 잔기(GlyGlyPro)를 함유하는 펩티드인 것으로 결정되었다.
본 발명의 복합체는 생체특이적 친화성 상대물 당 하나 또는 그 이상의 변이된 초항원을 포함하며, 그 역도 성립한다. 이것은 상기 식에 있어서 T 가 생체특이적 상대물 뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 변이된 초항원을 함유할 수 있음을 의미한다. 유사한 SA(m)는 하나 또는 그 이상의 생체특이적 친화성 상대물(T)을 함유할 수 있다. 친화성 상대물(T) 및 SA(m)는 그밖에 다른 구조 또한 함유할 것이다. 친화성 상대물 당 변이된 초항원의 수는 1 또는 2 개가 바람직하다.
본 발명의 신규한 복합체는 원칙적으로 두개의 주요 경로에 따라 합성될 것이다 : 1. 재조합 기술 및 2. SA(m) 에 대한 T의 화학 결합, 이들 방법은 본 분야의 숙련자들에게 자명하며, 다수의 변이체도 포함한다. 본 발명은 주로 인공적인 복합체 즉, 자연 상태에서는 볼수 없는 복합체에 관한 것이다.
생체특이적 친화성 상대물(T)에 대한 변이된, 초항원의 화학 결합은, 각 화합물의 여러 위치에 존재하는 작용기(예를 들어, 일차 아미노기 또는 카르복시기)를 종종 이용한다. 최종 산물은, 결합이 일어나는 위치가 다른 복합체 분자의 혼합을 포함할 것이다.
재조합 복합체(융합 단백질)의 경우, 수득된 복합체 물질은 결합 위치가 일정할 것이다. 변이된 초항원의 아미노 말단은 생체특이적 친화성 상대물의 카르복시 말단과 결합하거나 그 반대이다. 원형 그대로의 항체 및 항원 결합 단편(Fab, Fv 등)과 같은 항체의 경우, 경쇄 또는 중쇄가 그러한 융합에 이용될 것이다. 상당히 좋은 결과를 가져오는 VH 및 VL 도메인 또는 경쇄에 구조유사성 결합을 배제하지 않고, 항체 중쇄(CH1)의 제 1 불변 도메인에 대한 변이된 초항원의 아미노 말단 결합 및 Fab 단편에 대한 선호도를 갖는 재조합 복합체가 현재는 바람직하다.
E. coli에서 초항원(변이형 및 융합형 포함)을 대량 수득하는 방법은 2 가지가 있다 : 세포내 생산 또는 분비, 후자의 방법은 세포형질 및 배양 배지로부터 정제된 정확히 접힌 단백질을 제공하기 때문에 본 발명에 바람직하다. 세포내 생산은 복잡한 정제 과정을 야기시키고, 종종 단백질의 시험관내 되접힘을 필요로 한다(단백질의 정확한 삼차 구조를 얻기 위해). 상기에서, 다른 숙주 세포, 예를 들어 효모나 포유동물 세포와 같은 진핵 세포에서도 활성 복합체를 생산하는 것이 가능함을 배제하지 않았다.
돌연변이된 초항원의 생산 및 MHC 제 2 급 항원에 결합하는(친화성) 변이된 능력을 갖는 돌연변이체의 선택은 공지된 기술에 따라 실시할 수 있다[예를 들어, Kappler 등의 J. Exp. Med. 165 (1992) 387 - 396 참조]. 또한 본원의 실험 부분도 참조하라.
T 세포 수용체 Vβ 사슬과 표적 구조에 결합하여 표적 세포를 용균시키는 복합체의 능력은 초항원으로부터 유도된 펩티드[SA(m)], 생체특이적 친화성 상대물(T) 및 다리(B)의 구조와 길이에 의존한다. 본 분야의 숙련자들은 앞서 공지된 초항원 항체 복합체(상기 언급한 공고 참조)와 관련하여 기술된 이들 모델의 원조로 효과와 구조 간의 관계를 연구함으로써 용균을 야기하는 능력과 결합 능력에 대하여 본 발명의 복합체를 최적화할 수 있을 것이다. 하기 실험 부분도 참조하라.
MHC 제 2 급 항원에 결합하는 변이된 능력에 의해 주로 IC50[SA(wt)] : IC50[SA(m)] 의 비율은 〈 0.5(〈50 %)와 같이 〈 0.9 (90 %)이며 어쩌면 〈0.01 (〈 1 %)가 되도록 한다. 다른 방법으로, 본 발명의 복합체의 변이된 결합 능력은 IC50[SA(Wt)] · IC50[SA(m)]의 비율을 동일하게 한정시켜 놓고 nM로 측정된 Kd로 표시한 해리 상수 kd[SA(wt)] : Kd[SA(m)]의 비로서 측정할 수 있다. IC50[SA(Wt)], IC50[SA(m)], Kd[SA(Wt)] 및 Kd[SA(m)] 의 측정은 하기 실험 부분을 참조하라.
특정 초항원이 MHC 제 2 급 항원에 결합하는 부위를 둘 또는 그 이상 갖는다는 것은 이미 공지되었다[Fraser 등의 In : Superantigens : A pathogens view on the immune system. Eds. Huber & Palmer, Current Communications in Cell Molecular Biology 7 (1993) 7 - 29 참조]. 초항원의 이러한 유형의 경우, 결합 능력은 상기 - 언급된 크기의 감소와 같이 적어도 하나의 결합 부위에서 변형시킬 것이다. 아마도 초항원은 두 MHC 제 2 급 결합 부위의 친화성에 있어서 시험적으로 〉 10 %의 차이로. 변화시키며 바람직하게는 적어도 한 부위의 친화성을 감소시키는 초항원의 변이로 충분할 것이다.
초항원은 다양한 친화성으로 상이한 서브그룹의 TCR Vβ 사슬에 결합한다. 본 발명의 융합 단백질/복합체에 있어서, 사용된 초항원은 하나 또는 그 이상의 서브그룹에 대한 변화된 서브그룹 특이성 또는 변화된 친화성을 나타내기 위해 변이시켰다. TCR Vβ 에 대한 친화성 및 TCR을 통한 자극 간에 포물형 관계가 존재한다고 믿는 중대한 이유가 있다. 즉, 적당한 친화성으로 인해 최대 자극이 일어날 것이다. 변이된 초항원을 포함하는 융합 단백질/복합체가 증식하는 모든 인체 Vβ 서브그룹의 분포를 실질적으로 나타내는 휴지 T 세포 집단을 상당히 자극시키자 마자 TCR Vβ 에 대한 변이된 초항원의 적당한 친화성이 준비될 것이다. T세포 집단은 무작위로 선택한 인체 각각으로부터 T 세포를 모을 수 있다. "상당히"라는 것은 자극을 측정하는 것이 가능함을 의미한다. 실험 부분의 표 II 에 나타난 결과(오른쪽 세로행)는, 흔히 본 발명의 복합체/융합 단백질의 SADCC를 일으키는 능력이 야생형 초항원을 포함하는 융합체와 실질적으로 동일함을 시사하는 것이다.
본 발명의 복합체/융합 단백질의 주된 용도
본 발명에 의한 복합체는 주로 정상적인 초항원 및 항체 간의 복합체로서, 동일한 질환 치료를 위해 이용하고자 한다. 상기 - 언급한 공고를 참조하라. 따라서 본 발명의 복합체는 주치료든 보조치료든 간에 외과 또는 다른 약물과 관련하여 투여할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 신규한 본 발명의 복합체를 함유하는 것을 제외하고는 본 분야에서 공지되어 있는 제제형이다. 따라서 조성물은 동결건조된 미립자 물질, 멸균 또는 무균적으로 생산한 용액, 정제, 앰풀주사액 등의 형태일 것이다. 물과 같은 부형제(예를 들어 PBS 에 의해 생리학적 pH값으로 완충시킨 것이 바람직함) 또는 다른 불활성 고체나 액체 물질이 존재할 것이다. 일반적 용어인 조성물은, 필요하다면 적당한 첨가제 및 보조제와 함께 하나 또는 그 이상의 수용성 또는 불용성 수성 또는 비 - 수용성 부형제와 복합체를 혼합하거나, 용해시키거나, 결합시키거나 또는 다른 방법으로 결합시켜 제조한다. 부형제와 조건은 복합체의 활성도에 역영향을 끼치지 않아야 한다. 그러한 것으로서 물은 압착 부형체내에 포함된다.
통상적으로 복합체는 판매되고, 나타나는 결과에 따라 10 ㎍ - 50 mg의 범위 내로 여겨지는 복합체의 유효량을 각각 함유하도록 미리 처방된 투여량으로 투여될 것이다. 정확한 투여량은 경우에 따라 다르며, 환자의 체중 및 연령, 투여 경로, 질병의 유형, 항체, 초항원, 결합(- B-)등에 의존한다.
투여 경로는 본 분야에서 일반적으로 공지되어 있다, 즉, 본 발명에 의한 복합체의 치료학적 유효량 또는 표적 세포 용균 유효량을 표적 세포와 접촉시킨다. 상기 상술한 내용에서 이것은 주로 인체와 같은 포유동물에게 주사 또는 주입(피하, 정맥내, 동맥내, 근육내)하는 것과 같은 비경구 투여를 의미한다. 복합체는 국소적 또는 전신 투여될 것이다.
"표적 세포 용균 유효량" 은 표적 세포를 파괴하는 T -림프구를 활성화시키고 통제하는 데 유효한 양을 의미한다.
우선권 연도 말에, 비변이 초항원을 함유하는 복합체/융합 단백질의 바람직한 투여 경로는 해열제(파라세타몰)와 함께 1 일 당 3시간 동안 정맥내로 주입하도록 결정되었다. 4일 동안 투여를 반복하고, 환자에게서 융합 단백질/복합체에 대해 2 차 항체가 생성되기 전에 투여를 중단하였다. 이러한 투여 계획은 본 발명의 복합체/융합 단백질에도 적용될 것 같다.
사용목적의 선택적 범위
본 발명의 복합체는 표적 - 탐지 그룹(T)이 향하는 구조를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 데 사용할 수 있다. 이러한 일반적인 방법은 본 분야의 사람들에게 잘 알려져 있다. 따라서 변이된 초항원은, 예를 들어 펩티드[SA(m)] 쪽으로 향하고 효소, 동위원소, 형광단 또는 그 자체가 공지된 그외의 마커 그룹으로 표지된 항체에 의해 마커 그룹이 차례로 검출됨을 의미하는 면역조직화학을 포함한 면역검정에서 마커 그룹으로서 작용할 것이다. 또다른 면역검정법은 표적 - 탐지 그룹(T)에 결합할 수 있는 구조를 그 표면에 발현시키는 세포 군집세포에서 검출하는 것이다. 이러한 사용목적은 SADCC 검정에서와 같이 세포 군집 시료를 T - 림프구와 본 발명의 복합체와 함께 배양함을 의미한다. 배양으로 인해 세포 용균이 일어날 경우에, 이것은 그 군집이 표면에 그 구조를 발현시키는 세포를 포함하고 있음을 나타내는 것이다.
일반 : 돌연변이체 SEA (D227A)[=SEA (m9) 또는 돌연변이체 m9]는 선출원에서 가장 가능성 있는 SEA 변이체였다. 따라서 이 변이체를 수반한 시험관내 및 생체내 결과를 나타내는 것을 선택하였다(도 3 - 6).
도 1 은 SEA 및 C215Fab-SEA 를 발현시키는 데 사용한 플라스미드의 대략도이다. 산물 유전자 다음의 두 개의 전사 종결 유전자와 암호화 부위는 상자 모양으로 표시하였다. 카나마이신 내성 단백질을 암호하는 유전자는 Km으로 표식하였다. lacI는 lac 억제 유전자이다. VH및 CH1 은 마우스 항체 C215 중쇄의 Fd단편을 암호하는 유전자를 나타낸다. 또한 VK및 CK는 카파 사슬을 암호하는 유전과를 나타낸다. rop 은 pBR322 로부터 복제 조절 단백질을 암호하는 유전자이다. 산물 유전자의 전사를 유도하는 프로모터는 화살표로 나타나 있는데, pKP889 에서는 trc 프로모터이고 다른 두 벡터는 포도상구균성 단백질 A (spa) 로부터의 프로모터이다. 복제의 기원을 함유하는 부위는 ori 라고 표시하였다. pKP943 및 pKP1055에 의해 암호되는 SEA 의 유일한 차이는 후자의 N-말단에 부가되는 글리신 잔기이다. 후자 벡터에 포함된 SEA 유전자는 침묵 돌연변이에 의해 도입된, 좀 더 독특한 제한 효소 부위도 포함한다.
도 2 는 야생형 SEA 와 돌연변이체 F47A 및 D227A에 대한 원편광 이색성 스펙트럼이며, 각 MHC 제 2 급 결합 부위에서 가장 심하게 감소되는 돌연변이를 나타낸다. 연속선은 야생형 SEA에 대한 곡선이다. 각각의 돌연변이체, F47A 와 D227A 에 대한 곡선은 점선이나 일점 쇄선으로 나타내었다.
도 3 은 SEA (wt) 와 SEA (D227A)에 대한 초항원 의존성 세포의 세포독성 (SDCC)의 농도 의존 상태를 보여주는 것이다.
도 4 는 C215Fab-SEA (wt) 및 C215Fab-SEA (D227A) 에 대한 초항원 의존성세포의 세포독성(SDCC)의 농도 의존 상태를 보여주는 것이다.
도 5 는 유리 SEA (wt)와 비교하여 C215Fab-SEA (wt) 및 C215Fab-SEA(D227A)에 대한 초항원 mAb 의존성 세포의 세포독성(SADCC)의 농도 의존 상태를 보여주는 것이다.
도 6A 는 C215Fab-SEA (wt) 및 C215Fab-SEA (D227A)로 B16-C215 흑색종 세포의 폐 전이가 나타나는 C57B1/6마우스를 치료함으로써 수득한 치료 효과를 비교한 것이다.
도 6B 는 도 6A 에 나타나 있는 치료에 대한 C215-SEA (wt) 및 C215-SEA (D227A)의 독성을 보여주는 것이다.
재조한 단백질 제조
항체
본 발명에 관한 실험은 모델 물질로서 주로 모노클로날 항체 C215를 가지고 수행하였다. 이 항체는 GA-733 군(family)(예를 들어 제 EP 376,746 호 참조) 항원으로 향한다[Larsson 등의 Int. J. Canc. 32 (1988) 877 - 82 참조]. C215 에피토프는 인체의 암치료에 충분히 특이적이지 않다고 판단되어 왔다. 선출원에서 mab C242 (Lindholm등의 제 WO 9301303 호 참조)가, 야생형 SEA 를 수반한 그의 융합 생성물 실험에서 판단된 바와 같이 보다 우수한 후보물로서 여겨졌다.
박테리아 균주 및 플라스미드
E. coli 균주 UL635(xyl-7, ara-14, T4R,△ompT)와 HB101 을 각각 발현 및 클로닝에 사용하였다[Boyer 및 Roulland - Dessoix 의 J. Mol. Biol. 41(1969) 459 - 472 참조]. 벡터 pKP889는 Fab-SEA 융합 단백질(마우스 항체 C215에서 유도)을 발현시키는데 사용하였고 벡터 pKP943과 pkP1055는 SEA를 분비시키는데 사용하였다(도 1). Fab-SEA 발현벡터 pKP889는 CH1과 SEA 사이의 스페이서(spacer)가 GlyGlyAlaAlaHisTyrGly 인 것을 제외하고는 pKP865 와 동일하다[Dohlsten 등의 Proc. Natl . Acad. Sci. USA (1994) 참조]. pKP943 발현으로 인해 천연 아미노 말단을 갖는 SEA를 수득하였다. pKP1055를 사용하여 아미노 말단에 Gly 잔기가 부가된 SEA 가 생성되었다. 이 두 벡터에서 전사 및 번역을 위해 포도상구균성 단백질 A의 시그날[Uhlen 등의 J. Biol. Chem. 259 (1984) 1695 - 1702 참조]이 사용되며 분비용으로는 합성 시그날 펩티드가 사용된다(비공개된 L. Abrahmsen 참조).
시험관내 돌연변이유발
퍼킨 엘머 서모사이클러(Perkin Elmer Thermocycler)상에서 수행하는 폴리메라제 연쇄반응법을 이용하여 돌연변이를 제조하였다. 반응 혼합물(100 μl)은 다음을 포함하였다 : 미국의 퍼킨 엘머 시터스에서 구입한 1 × PCR 완충용액(10 mM 트리스/HCl, pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 0.001 % (w/v) 젤라틴, 부가적으로 2 mM MgCl2, 0.4 mM dNTPs(퍼킨 엘머 시터스에서 입수), 2.5 유닛의 Ampli Taq DNA 폴리머라제(퍼킨 엘머 시터스에서 입수) 및 100 ng DNA 주형. 0.8 μM의 최종 농도까지 프라이머를 첨가하였다. 최초 주형은, 황색포도상구균성 장독소 A 유전자의 5' 말단에Bam HI 부위를 제공하도록 제 1 코돈(Ser 을 암호화함)들 TCC로 바꾼 것을 제외하고는, Betley 등의 문헌[J. Bacteriol. 170 (1988) 34 - 41 참조]에서 공개된 플라스미드와 동일한 황색포도상구균성 장독소 A 유전자를 항유하는 플라스미드이다. 이후에 잠재성 돌연변이체에 의해 도입된 보다 더 독특한 제한 효소 부위를 포함하는 유도체를 사용하였다. 제한부위에 접하여 도입시킨 돌연변이체는, 한 세트의 프라이머, 즉 돌연변이체와 제한부위를 연결시키는 프라이머를 가지고 제조하였다. 대부분의 돌연변이에는 두 세트의 프라이머를 사용해야 하며 연속적인 두 단계로 PCR을 수행하였다. 쉽게 확인할 수 있도록 새로운 제한 효소 부위를 각 돌연변이체와 함께 도입시켰다. 프라이머로서 사용한 올리고뉴클레오티드는 진 어셈블러(Gene Assembler, 스웨덴에 소재하는 파마시아 바이오테크 에이비에서 구입)를 이용하여 합성하였다. 각 돌연변이체를 확인하기 위해 관련된 뉴클레오티드 서열의 관련 부분을, 그들의 택 다이데옥시 터미네이션 사이클 시퀀싱 키트(Taq DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing Kit)를 사용하여 어플라이드 바이오시스템스 DNA-시퀀서로 결정하였다.
단백질 생성 및 분석
상이한 유전자 구성물을 함유하는 E. coli 세포를 실온(Fab-SEA 벡터) 및 24 - 34 ℃ (분비 벡터, 최적온도는 돌연변이체에 좌우됨)에서 밤새 성장시켰다 . 육즙은 카나마이신(50 mg/l)을 보충한 2 × YT(16 g/l 박토트립토판, 10 g/l 박토 효모 추출물, 5 g/l NaCl)였다. 100 μM의 최종 농도까지 이소프로필-β -D-티오갈락토시드를 첨가함으로써 융합단백질을 유도하였다(비융합된 SEA를 발현시키는데 사용된 단백질 A 프로모터는 구성성분이다). 세포를 5000 × g에서 펠릿화시키고, 미리 냉동시킨 이 세포 펠릿을 얼음 상의 10 mM 트리스-HCl (pH 7.5) 에서 1 시간 동안 교반하는 동안 서서히 녹이므로써 세포형질의 함유물을 방출시켰다. 이 세포형질의 추출물을 9500 × g에서 15 분간 원심분리하여 맑게하였다. Fab-SEA 단백질을 더 이상 정제하지 않고 사용하였다. SEA 와 Gly-SEA 는 항-SEA 항체 컬럼상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 더 정제하였다. SEA 로 예비면역시킨 토끼로부터 폴리클로날 토끼 항-SEA 항체를 미리 모으고, 단백질 G Sepharose?(파마시아 바이오테크에서 입수)상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
단백질 분석
미리 만든 폴리아크릴아미드 SDS 트리스-글리신 노벡스 겔(기울기 4 - 20 % 또는 상동성 12 %, 노벡스의 새로운 실험 기술)에서 단백질을 분리하여 쿠마시 블루로 염색하거나 아니면 웨스턴 블롯에 사용하였다. 웨스턴 블롯 분석으로 SEA 를 검출하기 위해 폴리클로날 토끼 항-SEA 항체(상기함)를 사용하였으며, 이후에 돼지 항-토끼 lg 항체 및 토끼 항-서양 고추냉이(horseradish) 과산화효소 항체 및 과산화효소를 사용하였다. 카파 사슬을 인지하는 토끼 항체와 결합된 Fab-SEA 융합 단백질 과산화효소 역시 사용하였다(AAC 08P, 영국에 소재하는 세로테크 리미티드에서 입수), 3,3'-디아미노벤지딘(시그마에서 입수)은 과산화효소를 가시화하는데 사용하였다.
0.02 mM ZnSO4및 0.005 % (v/v) Tween?20과 함께 10 mM 인산염완충용액(pH 8.2) 내 실온(22 - 25 ℃)에서 J-720 분광편광기[일본에 소재하는 자스코(JASCO)에서 입수]로 원편광 이색성(CD) 스펙트럼을 모았다. 스캐닝 속도는 10 nm/분이었고 연속적인 5개의 스캔으로부터 각 스펙트럼을 평균내었다. 세포의 경로 길이는 1 mm 였고 단백질 농도는 0.2 - 0.5 mg/ml 였다. 평형상태에서 염화수소산 구아니딘(Gdn-HCl) 변성은, 0.3 mg/ml 의 단백질 농도와 1 mm의 세포 경로 길이를 수반하여 222 nm에서 CD 에 의해 23 ℃에서 측정하였다. 이들 데이터는 접히지 않은 단백질의 겉보기 분획(Fapp)을 계산하는데 사용하였다. 평형상태에서의 비접힘 파라미터는, 이 데이터를 2-부위의 접힘 과정에 적용시킴으로써 유도하였다[Hurle 등의 Biochemistry 29 (1990) 4410 - 4419 참조].
시험관내의 결합 및 작용 검정
재료
시약: 영국 미들섹스에 소재하는 집코(Gibco)로부터 구입한 RPMI 1640 배지를 사용하였다. 배지의 pH는 7.4 였고, 2 mM L-글루타민(영국 미들섹스에 소재하는 집코에서 입수), 0.01 M HEPES (이스라엘에 소재하는 바이올로지컬 인더스트리스에서 입수), 1 mM NaHCO3(독일에 소재하는 바이오크롬 아크티엔게젤샤프트에서 입수), 0.1 mg/ml 황산젠타마이신(이스라엘에 소재하는 바이올로지컬 인더스트리스에서 입수), 1 mM Na-피루베이트(미국에 소재하는 제이알에이치 바이오사이언스 인더스트리스에서 입수), 0.05 mM 머캅토에탄올(미국에 소재하는 시그마 캄파니에서 입수), 100 배 농축한 비필수 아미노산(스코틀랜드에 소재하는 플로우 라보라토리스에서 입수)을 함유하며 10 %우태아혈청(영국 미들섹스에 소재하는 집코에서 입수)을 보충하였다. 재조합 SEA(wt), SEA(m) 및 융합산물 C215Fab-SEA(wt)와 C215Fab-SEA(m)을 상기 기술한 바와 같이 수득하였다. 인체 재조합 IL-2 는 미국에 소재하는 시터스 코포레이션에서 수득하였다. 마이토마이신 C 는 미국에 소재하는 시그마 캄파니에서 수득하였다. Na2 51CrO4는 독일에 소재하는 머크(Merck)에서 수득하였다. 마그네슘과 칼슘이 없는 인산완충식염수(PBS)는 영국에 소재하는 임페리얼에서 수득하였다.
세포: 인체 결장 암종 세포주 Colo 205 와 B 세포 림프종 세포주 Raji 는 아메리칸 타입 셀 컬쳐 콜렉션(미국 매릴랜드 록빌에 소재, 각각 ATCC 제 CCL 222 호 및 ATCC 제 CCL 86 호)에서 수득하였다(HLA-DR3/w10, -DP7, -DQw1/w2 발현). EBV-형질전환된 림프아구양(lymphoblastoid) B세포주 BSM은 네덜란드 라이덴에 소재하는 닥터 다니엘 덴 호에드 캔서센터 면역학부[담당자 ; 닥터 반 데 그리엔드(Dr van De Griend) 씨]로부터 관대히 기증받았다. 이 세포들을, 미국 샌디에고에 소재하는 겐-프로브 인코레이티드의 겐-프로브 마이코플라스마 티.시. 테스트로 마이코플라스마 오염에 대해 반복적으로 시험하였다.
SEA-활성화 T 세포주는 말초 혈액으로부터 단핵세포를 활성화시킴으로써 생성하였다. 이 혈액은 유니버시티 하스피틀 오브 룬드(University Hospital of Lund)의 혈액 공급자로부터 담황막 형태로 공급받았다. PBMs는, 10 % FCS 를 함유하는 배지내에서 마이토마이신 C 로 처리한 SEA 를 피복시킨 BSM 세포(100 ng/mlSEA 로 예비항온함)로 2 × 106세포/ml 의 농도에서 자극시켰다. 이 T 세포주는 20 U/ml 의 인체 재조합 IL-2 로 격주로 재자극시켰고 마이토마이신 C 로 처리한 SEA 를 피복시킨 BSM 세포로 매주 재자극시켰다. 이 세포주를 검정에 사용하기 전 4 - 12 주 동안 배양하였다.
트리판청 배제(exclusion)에 의해 측정된 바와 같이 효과세포의 생존능력은 50 % 를 초과하였다.
야생형 및 돌연변이체 SEA 에 특징적인 MHC 클래스 II 결합 측정
방사성요오드화 과정. 야생형 또는 돌연변이체 SEA 의 적당량을, 락토페록시다제 기술(미국 메사츄세츠 보스톤에 소재하는 NEN 에서 입수)과 함께 효소비드(enzymobead)를 사용하여 10 - 25 mCi Na125I 로 방사성표지하였다. 아지드화나트륨에 담금질하며 반응을 중단시키고, 용리 완충용액으로 R10 배지가 포함된 PD-10 컬럼(스웨덴에 소재하는 파마시아 바이오테크 에이비에서 입수)에 통과시켜 여과시킴으로써 단백질 - 결합 방사능을 유리 요오드로부터 분리하였다. 요오드-125와 단백질 사이의 화학량론적 비율이 ≤ 2 : 1이 되기 위한 조건을 선택하였다. TSK SW 3000 HPLS 컬럼상에서 크기 - 배제 크로마토그래피로 방사화학적 순도를 확증하였다. 결합 활성도에 대한 방사성요오드화 효과는 야생형 SEA 에 대해서만 시험하였으며 이에 악영향을 미치지 않는다고 밝혀졌다(데이타는 제시되어 있게 않음).
직접 결합측정법. R10 배지에서 미리 배양시킨 6 × 104/100 μl 의 Raji 세포를 코니칼(conical) 폴리프로필렌 튜브에 가하고, 계열희석한125I-표지 야생형 또는 돌연변이체 SEA의 100 μl/튜브와 함께 3중으로 항온하였다(22 ℃/45분). 이 세포를 2 ml 의 1 %(w/v) 우혈청 알부민(BSA)이 함유되어 있는 10 mM 인산 -완충식염수(PBS), pH 7.4로 세척하고, 300 × g에서 5분간 원심분리한 다음 흡인시켰다. 이 과정을 2회 반복하였다. 최종적으로 이 세포를 감마 계수기(미국 일리노이 다우너스 그로브에 소재하는 팩카드 인스트루먼츠 캄파니에서 구입)를 사용하여 세포-결합 방사능을 측정하였다. 포화상태에서의 겉보기 해리상수 Kd와 결합 부위 수 N 은 비특이 결합(즉, R10 배지만으로 항온시킨 후의 결합)을 공제한 후에 스캐차드의 문헌[Ann. N.Y. Acad, Sci. 51 (1949) 660 - 72 참조]에 따라 계산하였다.
저해 분석(돌연변이체 SEA 에 의한125I-표지 야생형 SEA 결합의 저해). 이 저해 실험은 직접 결합 측정법을 약간 변형시켜서 기술한 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 6 × 104/100 μl Raji 세포에 결합시키기 위해 50 μl 의125I-표지 야생형 SEA를 과량의 비표지 야생형 SEA 또는 돌연변이체 SEA (50 μl/튜브)와 경쟁시켰다. 이 저해 분석에서 최대의 감수성을 수득하기 위해, 직접 측정법에서 ∼ 40 % 결합 방사능을 산출하는 추적 농도를 이용하였다. 경쟁상대의 치환 능력은 결힙 방사능의 50 % 저해(IC50)를 산출하는 농도로서 나타냈다. 야생형 SEA 에 비례하는 돌연변이체의 결힙 친화성은 다음 방정식을 이용하여 계산하였다 :
Figure pct00001
야생형 SEA 와 같이 돌연변이체가 Raji 세포상의 동일 부위에 결합하기 위해 경쟁하는지를 측정하고자 SEA 돌연변이체에 관해 수득한 결합 데이터를 로그-로짓(log-logit) 함수로서 곡선으로 나타내어 야생형 SEA에 상응하는 데이터와 병행하여 시험하였다.
저해 분석(비표지 야생형 SEA 와 SEA 돌연변이체에 의한 형광-표지 야생형 SEA 결합의 저해). Raji 세포(2.5 × 105)를, 37 ℃에서 30 분간 10 % FCS, 글루타민 및 젠타마이신을 보충한 50 μl CO2-비의존 배지(집코에서 입수)에서 희석시킨 저해제(야생형 SEA 또는 돌연변이체 SEA ; 0 - 6000 nM)와 배양하였다. 플루오레스세인 결합 야생형 SEA를 30 nM의 최종 농도까지 가한 다음 이 시료를 37 ℃에서 30분간 더 배양하였다. 1 % BSA를 보충한 얼음같이 차가운 PBS (PBS-BSA)로 이 시료를 3회 세척하고 최종적으로, 그것들을 분석할 때까지 얼음상의 0.4 ml PBS-BSA 에 유지시켰다. 각 시료로부터 10,000 개의 생존세포를 FACStar?(벡톤 딕킨슨에서 입수) 유량 세포계산기(flow cytometer)를 사용하여 녹색 형광을 측정하고, 평균 형광 값은 LYSIS II 프로그램을 사용하여 계산하였다.
SEA(wt), SEA(m) 및 이들과 C215Fab 와의 융합 단백질의 SDCC 및 SADCC 측정
SDCC - 측정. MHC 클래스 II+Raji 세포에 대항하는 SEA(wt), SEA(m) 및 이들과 C215Fab 와의 융합물의 세포독성을, 효과세포로서 시험관내에서 자극화시킨SEA 특이 T 세포주를 사용하여 표준 4 시간51Cr3+- 방출검정으로 측정하였다. 간단히 설명하면, 첨가물의 존재나 부재(대조)시에 표적세포에 대한 특정 효과세포의 비율로 미량역가 웰에서 0.2 ml 배지(RPMI, 10 % FCS) 당 2.5 × 103세포로51Cr 표지 Raji 세포를 배양하였다. 특이 세포독성 백분율은 100 × [(cpm 실험 방출치 - cpm 배후방사량 방출치)/(cpm 총 방출치 - cpm 배후방사량 방출치)]로서 계산하였다. 표적세포에 대한 효과세포의 비율은 비융합 SEAs 에 대해서는 30 : 1 이었고 융합 단백질에 대해서는 40 : 1이었다.
인체 결장암 세포에 대항하는 SADCC, C215+MHC 클래스 II-결장 암종 세포 SW 620 (ATCC 로부터 입수가능 : ATCC 제 CCL 227호)에 대항하는 C215Fab-SEA (wt), C215Fab-SEA (m), SEA (wt) 및 SEA 돌연변이체의 세포독성을, 효과세포로서 시험관내에서 자극화시킨 SEA 특이 T 세포주를 사용하여 표준 4 시간51Cr3+- 방출 검정으로 측정하였다. 간단히 설명하면, 부가물의 존재나 부재(대조)시에 표적세포에 대한 효과세포의 비율이 30 : 1로서 미량역가 웰에서 0.2 ml 배지(RPMI, 10 % FCS)당 2.5 × 103세포로51Cr3+- 표지 SW 620 세포를 배양하였다. 특이 세포독성 백분율은 SDCC 측정에서와 같이 계산하였다.
생체내 작용 실험
종양 세포. 인체 종양과 관련된 항원 C215를 암호화하는 cDNA 로 형질감염시킨 B16-F10 흑색종 세포(B16-C215, Dohlsten 등의 Monoclonal antibody -superantigen fusion proteins : Tumor specific agents for T cell based tumor therapy ; Proc, Natl, Acad. Sci USA, In press, 1994 참조)를 아전면(subconfluency)에 대한 부착세포로서 성장시켰다. 이 배지는 5 × 10-5베타-머캅토에탄올(데국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마에서 구입), 2 mM L-글루타민(집코에서 입수), 0.01 M 헤페스(Hepes, 이스라엘에 소재하는 바이올로지컬 인더스트리스에서 입수) 및 10 % 우태아 혈청(집코에서 입수)을 보충한 RPMI 1640(영국 미들섹스에 소재하는 집코에서 구입)로 구성되어 있다. 0.02 % EDTA에서 간단히 항온하여 세포를 탈리시키고 1 % 동유전자형(syngeneic) 마우스 혈청을 함유하는 얼음같이 차가운 인산완충식염수(부형제)에서 4 × 105세포/ml 까지 현탁하였다.
동물들 및 동물 처리. 이 마우스는 T세포 수용체 Vβ 3 사슬에 대해 형질전환된 12-19 주된 C57Bl/6 마우스이다[Dohlsten 등의 Immunology 79 (1993) 520 - 527 참조]. 100,000 개의 B16 - C215 종양세포를 0.2 ml 부형제에 함유시켜 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내 주사하였다. 1, 2 및 3 일째에, 상기 마우스들에게 C215Fab-SEA(wt) 또는 C215Fab-SEA(D227A)를 함유한 0.2 ml 부형제를 도 5a 및 5b 에 나타낸 투여량으로 정맥내 주사하였다. 대조 마우스에게는 상기와 동일한 계획에 따라 부형제만을 공급하였다. 종양 세포를 주입한 후 21 일째에 마우스를 경부탈구(cervical dislocation)시켜 죽였으며, 이들의 폐를 수득하여 보우인 용액(Bouin's solution)에 고정시킨 다음 폐의 전이수를 세었다.
결과
포도상구균성 장독소 A의" 알라닌 스캐닝"
처음에 SEA 의 구조는 알려지지 않았으며 단지 곁사을이 접근할 수 있는 표면에 대해서만 추측할 수 있었다. 따라서, 상동성 초항원 배열로부터 다수의 돌연변이체를 선택하였다[Marrack 및 Kappler 의 Science 248 (1990) 705 - 711 참조]. 다소의 이들 초항원이 보존 형태에서 HLA-DR 에 결합될 것이라고 예상하는 이론을 근거로 보존(주로 극성) 잔기를 선택하였다[Chitagumpala 등의 J. Immunol, 147 (1991) 3876 - 3881 참조]. 공개된 전략에 따라 알라닌 치환을 이용하였다[Cunnningham 및 Wells 의 Science 244 (1988) 1081 - 1085 참조]. 이 실험을 진행하는 동안 다음과 같이 유용한 정보가 증가하였다 : i) SEA와 MHC 클래스 II (HLA-DR) 사이의 상호작용을 위해 Zn2+이온이 중요하다[Fraser 등의 Proc, Natl, Acad, Sci USA 89 (1991) 5507 - 5511 참조], ii ) 포도상구균성 장독소 B (SEB)의 돌연변이가 측정되었다[Kappler 등의 J. Exp. Med. 175 (1992) 387 - 396 참조] 및 iii) SEB 의 구조가 나타났다[Swaminathan 등의 Nature 359 (1992) 801 - 806 참조].
HLA-DR, D227A 에 대하여 심하게 감소된 친화성을 나타내는 첫 번째 돌연변이체는 Zn2+이온을 매우 불완전하게 공조한다고 밝혀졌다(데이터는 나타나 있지 않음). SEA 와 SEB 에서의 공통의 접힘(fold)을 가정할 경우, 새로운 데이터로서 두 개의 MHC 클래스 II 결합 부위가 제안되었다 : 하나는 Zn2+이온과 관련되고 다른 하나는 SEB 에서 특정 부위와 상응한다. 돌연변이의 두 번째 세트는 이와 같은 가정을 근거로 제조하였다. 이 두 번째 세트의 돌연변이체는 아미노 말단에 글리신이 부가된 SEA 의 형태로 나타난다. 첫째, 이 신장(extension)은 야생형 SEA 의 결합 특성에 영향을 미치지 않았다(다음 단락 참조).
대부분의 돌연변이체는 모노클로날 항체 결합 분석(표 1)에 의해 판단된 바와 같이 기능성 형태로서 E. coli 에 의해 발현되고 분비되었다. 돌연변이체 E154A/D156A 및 R160A는 매우 소량으로 수득되었다. 이 결과에 따라 이들을 본 실험에서 제외시켰다. 잔기 128, 187, 225 또는 227에서 Ala 치환을 가지는 돌연변이체는 모노클로날 항체 1E 에 의해 인지되지 않았다. 후자의 두 돌연변이체는 감소된 발현 수준을 나타냈으며(24 ℃ 보다 34 ℃에서 더 뚜렷함), 환원 조건이 아닌 변성조건하에서 SDS-PAGE 동안에 더 빨리 이동하였다(다른 모든 돌연변이체는 야생형 SEA 와 같이 이동하였다. 데이터는 나타나 있지 않음). CD 스펙트럼 분석법에서 판단된 바와 같이 D227A 구조는 천연 SEA 와 약간 다를 수 있지만(도 2), 그 안정성은 야생형 SEA와 매우 밀접하였다(염화수소산 구아니딘 변성에 대한 내성으로서 측정), 돌연변이체와 천연 SEA [SEA (wt)] 사이에서 계산한 △△G는 0.16 Kcal/mol 이었고 이는 단지 △G° 값의 약 4 %이다(데이타는 나타나 있지 않음). CD 분석법에서 전체 시그날은, 대부분의 베타-병풍 구조로부터 예상한 바와 같이 낮았다. His 225 가 Zn2+를 동조한다고 최근에 보고되었다[Fraser 등의 문헌(Proc, Natl. Acad, Sci , USA 89 (1991) 5507 - 5511)의 비공개 데이터]. Asp 227이 Zn2+동조와관련되고(상기 참조) 아마도 His 225와 동일한 베타-병풍 구조에 위치되어 있으므로, 이들 두 잔기가 아연-동조 단백질에서 발견되는 아연-결합 핵을 구성한다고 제안되었다[Vallee 및 Auld 의 Biochemistry 29 (1990) 5647 - 5659 참조].
MHC 클래스 II 및 T 세포 수용체에 대한 결합
다량의 MHC 클래스 II 를 노출시키는 Raji 세포에 대해 플루오레스세인-표지 야생형 SEA 와 경쟁하는데 필요한 양으로부터 MHC 클래스 II 친화성을 계산하였다. 돌연변이체의 치환 능력은 경쟁자로서 야생형 SEA 에 대해 요구되는 농도와 비교하여, 결합된 형광의 50 % 저해(IC50)를 산출하는 농도로부터 계산하였다. 야생형 SEA 및 일부 돌연변이체에 대하여, 이 분석 결과를, 추적자로서125I-표지 야생형 SEA를 사용하였던 분석 결과와 비교하였다. 표 II 에서 알 수 있는 바와 같이, 이 두 저해 분석으로 부터 수득한 값은 상당히 상호관련되어 있다.
6 개의 선택 돌연변이체에 있어서, MHC 클래스 II 에 대한 결합은125I-표지 돌연변이체 SEA 를 사용하여 직접 측정하였다(표 II ). 돌연변이체 H50A 에 대하여, 직접 결합 측정법과 저해 분석에서 수득한 값은 상당히 상호관련되어 있으나 돌연변이체 F47A 에 대하여는 상당한 차이가 발견되었다 : 직접 결합은 야생형 SEA 보다 단지 7 배 더 약한 결합을 나타냈으나 경쟁 분석 둘 다는 약 70배 감소된 결합임이 입증되었다. 다른 두 돌연변이체에 관한 분석 데이터는 두 개의 개별 결합 상호작용을 나타냈다. 돌연변이체 H225A와 D227A 에 대한 친화성은 이 분석에서의 검출 한계 이하였다.
암종 반응성 항체의 Fab 단편과 SEA 로 구성된 융합 단백질은 특히 암 세포를 용균시키는 세포특성 T 세포를 유도하는데 사용될 수 있는 반면, SEA와 T 세포 수용체(TCR) 사이의 상호작용이 너무 약하여 단독으로 검출될 수 없음이 이미 제시되었다(Dohlsten 등의 Proc. Natl , Acad. Sci, USA, in press). 따라서, 분리된 초항원을 포함하는 분석과 대조적으로 Fab 융합 환경은, MHC 클래스 II 결합과 관계없이 SEA와 TCR 사이의 상호작용에 대한 작용 검정을 할 수 있게 한다. 따라서, Fab 성분에 의해 인지된 세포를 용균시키는 T 세포를 유도하는 것에 대한 다른 복합체의 효율은 크롬 방출 측정법으로 모니터링하였다. 이 측정은 MHC 클래스 II 결합에 영향을 미치는 것으로 여겨지는 돌연변이가 TCR 결합에는 영향을 미치지 않음을 입증하였다(표 II ).
돌연변이의 생물학적 효과
증식 효과를 분열하는 말초 림프구를 자극시키는 능력으로 측정하였다. MHC 클래스 II 에 대해 매우 불충분하게 경쟁하는 3개의 돌연변이체 모두는 증식을 거의 유도하지 않거나 전혀 유도하지 않았고 중간 돌연변이체 H187A 가 약간의 증식 능력을 나타낸 반면, 다른 연구된 돌연변이체는 야생형과 구별할 수 없었다(표 III). Harris 등의 문헌[Infect. Immun. 61 (1993) 3175 - 3183 참조]에는 SEA 돌연변이체 F47G 및 L48G 에 대하여 T 세포 자극 활성도가 유사하게 심각한 감소를 나타낸다고 최근 보고되었다. 명백히, 제시한 두 개의 결합 부위 중 어느 부위에서든지 강한 감소는 결과적으로 증식을 유도하는 능력에 심각한 영향을 미친다. 이것은 SEA가 TCR의 이합체화를 유도하는 MHC 클래스 II 의 두 분자와 교차 결합하고또한 이것은 시그날 형질도입을 초래하는데 필요하다는 것을 암시한다.
시험관내에서 자극시킨 SEA를 유도하는 다른 돌연변이체의 효능과는 대조적으로 MHC 클래스 II 를 가지는 표적세포를 용균시키는 T 세포는 경쟁하는 능력 보다는 결합 친화성과 상호관계가 있음을 나타낸다(표 III). 예를 들어, F47A 및 D227A 의 효능은 단지 각각 2.5배 및 300배 감소된다. 따라서, 여기에서 2 가(divalency) 역시 본래 필요하지 않음은 명백하다. 활성화된 T 세포 표면상에 상당히 많은 수의 TCR이 존재함으로써 생긴 다가(multivalency)의 증가로 SEA/MHC 클래스 II 상호작용의 낮은 결합성 효과가 부분적으로 보호될 수 있었다. 이와 같은 이합체화는, 암종 특이적 이기작용성 항체(하나는 항 - CD3 성분이고 하나는 항 - 암종 성분임)를 사용함으로써 이미 설명했던 T세포의 세포독성을 유도할 필요가 없다[Renner 등의 Science 264 (1994) 833 - 35 참조].
생체내 작용 실험: 이 결과는 도 6a 및 6b 에 나타나 있다. 마우스를 C215Fab-SEA(wt) 와 C215Fab-SEA(D227A) 로 처리하였더니 둘 다 B16-C215 흑색종 세포의 폐 전이수를 감소시키는데 매우 효과적이었다. 이 치료학적 효과는 표적 초항원의 두 변이체와 본질적으로 동일하였다. C215Fab-SEA(wt)로 치리한 결과 5 μg/주사의 투여량에서 70 % 치사율을 나타냈다. 대조적으로, 동일 투여량의 C215Fab-SEA (D227A)를 사용했을 때 어떤 마우스도 죽지 않았다. 종합하면, SEA (D227A)는, Fab-SEA 융합 단백질 내에 도입 시킬 때 감소된 독성과 보유된 치료학적 효능을 갖는 돌연변이체의 예이다.
토론
SEB와 HLA-DR 사이의 복합체 구조가 최근에 보고되었다[Jardetzky 등의 Nature 368 (1994) 711 - 718참조]. 이 상호작용에 관여할 것이라고 확인된 대부분의 SEB 잔재는 SEA 내에 유지되어 있다. 돌연변이체 D227A에 대한 본 데이터는 8 μM보다 더 높은 Kd값을 가지는 이와 같은 SEA부위(아미노 근접 부위)와 MHC 클래스 II 사이의 상호작용에 대한 낮은 친화성을 나타낸다. SEB와 HLA-DR 사이의 상호작용에 대한 Kd는 최근에 1.7 μM 일 것이라고 보고되었다[Seth 등의 Nature 369 (1994) 324 - 27참조]. SEB, TCR 과 HLA-DR 사이의 상이한 상호작용을 조사한 결과 SEB와 HLA-DR 사이의 복합체는 TCR 이 존재하지 않을 때 안정하게 유지되지 않았다. 이것은 매우 빠른 종료 속도(off-rate) 때문임이 플라스몬 공명 실험으로 나타났다. 비록 SEA 가 두 분자의 MHC 클래스 II 와 교차-결합한 후 이어서 TCR 과 이합체화 반응을 할지라도 수득한 결합성 효과는, 어떻게 SEA가 Kd이하의 농도에서 증식 효과를 유도할 수 있는지를 설명 할 수 있었다. 돌연변이체 F47A가 아미노 근접부위의 친화성을 유의성 이하로 감소시킨다고 가정하면, Zn2+부위의 Kd는 약 95 nM 이다. 이와 같은 가정은 돌연변이체 F47R, F47R/H50A 및 F47R/L48A/H50D 가 F47A와 같은 MHC 클래스 II 에 대해 동일한 친화성을 나타냄으로써 최근에 강화되었다(비공개).
SEB구조[Kappler 등의 J. Exp. Med. 175 (1992) 387 - 396 참조] 및 상동성 배열[Marrack 및 Kappler 의 Science 248 (1990) 705 - 711 참조]을 근거로 하여,His 225와 Asp 227은 동일한 β -병풍 구조내에 위치하며 이로써 곁사슬이 근접할 수 있었음을 강력히 제안한다. 따라서, 대부분 이들 두 잔기는 아연-동조 단백질에서 발견되는 아연-결합핵을 구성할 것 같다[Vallee 및 Auld의 Biochemistry 29 (1990) 5647 - 5659 참조]. 이들 돌연변이체와 유사하게, 잔기 128 또는 187에서 치환된 돌연변이체 역시 1E 를 제외한 모든 모노클로날에 의해 인지된다. Fraser 등의 문헌[Proc, Natl Acad. Sci. USA 89 (1991) 5507 - 5511 참조]에는 Zn2+이 SEA 에 결합하고, MHC 클래스 II 와 높은 친화성 상호작용하기 위해 필요하다는 것을 제시한다. 아연에 대한 친화성은 HLA-DR 첨가에 의해 영향받지 않았다. 이와 같은 관찰 및 Zn2+에 대한 높은 친화성(약 1 μM의 Kd)을 근거로 하여, SEA 에 의해 주로 제공되고, 4배 동조와 관련되는 동조가 제시되었다. 본 데이터는 4 개의 잔기 N128, H187, H225 및 D227 과 관련됨을 나타낸다. 전자의 2개의 잔기 기능은 아직 분명하지 않다 ; 리간드 N128을 제공하는 대신에 D227의 탈양자로 원조할 수 있었다. 이에 대한 한 가지 논거는 D227 을 치환시킬 대의 효과가 H225 를 치환시킬 때의 효과보다 더 엄격하다는 것이다.
MHC 클래스 II 에 대한 다른 초항원의 친화성과, T 세포를 자극시켜 증식시키는 능력 사이에 상호관계가 없음이 이전에 보고되었다[Chintagumpala 등의 J, Immunol. 147 (1991) 3876 - 3881 참조]. 이러한 결과는 다른 TCR Vβ -사슬을 향한 초항원의 다른 친화성에 의해 부분적으로 설명될 수 있었다. 본원에서, 동일한 상호관계 부족을 관찰하였으나, 개별 초항원과는 대조적으로 돌연변이체는 Fab-SEA환경에서 나타나는 바와 같이 동일한 TCR 친화성을 나타낸다(SADCC 로 측정). 상호관계 부족에 대한 가장 그럴듯한 설명은, 이 분석에서 확인된 두 개의 결합부위가 동조 결합 뿐만 아니라 그 결과로써 MHC 클래스 II 두 분자의 교차결합을 생성하며, 차례로 T세포 수용체 두 분자를 이합체화시키는 두 개의 개별 결합부위를 나타낸다는 것이다. 이것은 두 부위의 친화성이 증식 효과를 수득하는데 중요하다는 것을 의미한다. 높은 결합성은 SEA, TCR 및 MHC 클래스 II 의 두 분자를 포함하는 6 위체(hexameric) 복합체내의 상호작용 결과이다. 따라서 MHC 클래스 II를 향한 SEA 의 강한 친화성/결합성은 낮은 직접 친화성에도 불구하고 SEA 가 TCR 과 상호작용할 수 있게 한다.
다른 생체특이적 친화성 상대물: 포도상구균성 단백질 A 의 IgG-결합 도메인과 SEA(D227A)의 융합 단백질은 재조합 기술에 의해 생성시키고 E. coli 에서 발현시켰다. 이 시약은 CD7 및 CD38 양성이지만 HLA-DP, -DQ 및 -DR 음성인 Mot 4 및 CCRF-CEM 세포(ATCC 로부터 수득 : 각각 ATCC 제 CRL 1582 호 및 ATCC 제 CCL 119호)에 대한 T-림프구를 표적하는데 성공적으로 사용되어 왔다. Mot 4 와 CCRF-CEM 세포를 항-CD7 이나 항-CD38 마우스 모노클로날(독일 함부르크에 소재하는 디아노바에서 구입)과 함께 예비항온하였다. 이 마우스 모노클로날과 융합 단백질의 IgG-결합 부분 사이의 결합을 증가시키기 위해 토끼 항-마우스 lg 항체를 또한 부가하였다.
단백질 A-SEA (wt)와 비교하여, 단백질 A-SEA (D227A)는 MHC 클래스 II 항원을 발현시키는 다우디(Daudi) 세포(ATCC로 부터 수득 : ATCC 제 CCL 213 호)에 결합하는 능력이 감소되었다.
[표 I]
돌연변이체 구조 완전성 확인 6개의 모노클로날 항체의 결합을 모니터링하였다.
Figure pct00002
[표 II]
MHC 클래스 II 및 T 세포 수용체에 SEA 돌연변이체의 결합, 세포독성 T 세포가 활성화되도록 하며 특히, 상이한 돌연변이체의 Fab-SEA 융합을 이용하여 암종 세포를 용균시키는 능력으로서 T 세포 수용체를 모니터링하였다(SADCC).
Figure pct00003
[표 III]
돌연변이의 생물학적 효과 증식되도록 휴지 T 세포를 자극시키는 능력 및 MHC 클래스 II를 노출하는 표적세포를 용균시키는 세포독성 세포를 유도하는 능력을 모니터링하였다(SDCC = 초항원 의존 매개성 세포의 세포독성).
Figure pct00004

Claims (13)

  1. 다음의 부분들이 서로 공유결합되어 이루어진 복합체 :
    a. 미리 결정된 구조에 결합할 수 있는 생체특이적 친화성 상대물(표적-탐지 그룹) 및
    b. 초항원으로字터 유도한 아미노산 서열을 함유하고, T 세포 수용체의 Vβ 사슬에 결합하는 능력을 가지며, 펩티드를 유도한 초항원과 비교하여 MHC 제 2 급 항원에 결합하는 변이된 능력을 갖는 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 생체특이적 친화성 상대물은 세포 표면 구조 쪽으로 향하고, 복합체는 표면에 세포 표면 구조를 나타내는 세포를 용균시키는 T-림프구를 활성화시키는 능력을 가짐을 특징으로 하는 복합체.
  3. 제 1 - 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체특이적 친화성 상대물은 항체 또는 항체의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 복합체.
  4. 제 1 - 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체는 융합 단백질임을 특징으로 하는 복합체.
  5. 제 1 - 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 돌연변이된 초항원 임을 특징으로 하는 복합체.
  6. 제 1 - 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 초항원으로부터 유도한 것이며, MHC 제 2 급 항원에 결합하는 펩티드의 능력이 적어도 10 % 변함을 특징으로 하는 복합체.
  7. 제 1 - 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 초항원은 포도상구균성 장독소 A, B, C1, C2, D 또는 E 임을 특징으로 하는 복합체.
  8. 제 7 항에 있어서, 초항원은 또한 포도상구균성 장독소 H로부터 유도함을 특징으로 하는 복합체.
  9. 제 1 - 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체특이적 친화성 상대물이 향하는 구조는, 암, 바이러스 감염증, 자가면역 질환 또는 기생충 감염과 같은 질환을 앓는 중에 세포 표면에 발현되는 구조임을 특징으로 하는 복합체.
  10. 생체특이적 친화성 상대물이 용균되는 세포의 표면구조로 향하는, 제 2 항의 복합체 및 T-림프구와 세포를 접촉시키되, 상기 세포가 용균되는 조건하에서 배양함을 특징으로 하는 인체를 제외한 포유동물 세포의 용균방법.
  11. 생체특이적 친화성 상대물이 용균되는 세포(I)의 표면 구조로 향하는, 제 2 항의 복합체와 세포(I 및 II)를 동시에 접촉시키되, 상기 접촉은 용균되는 조건하에서 실시함을 특징으로 하는, 용균되는 세포(I)상에서 우선적으로 발생하는 구조를 발현시키며 다른 세포( II )와 함께 존재하는 인체를 제외한 포유동물 세포(I)의 선택적 용균방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 세포(I)는 암, 바이러스 감염증, 기생충 감염, 자가면역 질환 등과 같은 질환 상태와 관련됨을 특징으로 하는 용균방법.
  13. 생체특이적 친화성 상대물이 질환 특이 구조로 향하는, 제 2 항의 복합체의 치료학적 유효량을 포함함을 특징으로 하는, 질환 특이 표면 구조가 발현함으로써 질환과 관련된 특이 세포가 존재하는 포유동물의 암, 바이러스 감염증, 기생충 감염증 및 자가면역 질환 치료용 제약학적 조성물.
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