HU221254B1 - A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate - Google Patents

A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate Download PDF

Info

Publication number
HU221254B1
HU221254B1 HU9700063A HU9700063A HU221254B1 HU 221254 B1 HU221254 B1 HU 221254B1 HU 9700063 A HU9700063 A HU 9700063A HU 9700063 A HU9700063 A HU 9700063A HU 221254 B1 HU221254 B1 HU 221254B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
conjugate
sea
binding
superantigen
cells
Prior art date
Application number
HU9700063A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT77257A (hu
Inventor
Lars Abrahmsen
Per Bjoerk
Mikael Dohlsten
Terje Kalland
Original Assignee
Pharmacia And Upjohn Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmacia And Upjohn Ab filed Critical Pharmacia And Upjohn Ab
Publication of HUT77257A publication Critical patent/HUT77257A/hu
Publication of HU221254B1 publication Critical patent/HU221254B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát olyan konjugátumok képezik, melyek tartalmaznak I)egy biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekulát, amelyképes egy olyan struktúrával reagálni, amely ellen a konjugátumotalkalmazni kívánják, valamint II) egy peptidet, amely peptid i) egyszuperantigénből származik, ii) képes kötődni a T-sejt-receptor V?-láncához, iii) és a II. osztályú MHC-antigénekhez csökkent mértékbenképes kötődni (ahhoz a szuperantigénhez viszonyítva, amelyikből apeptidet előállították). A peptid és az affinitással rendelkezőpartnermolekula kovalensen kapcsolódik egymáshoz egy úgynevezett hídonkeresztül. A találmány szerinti konjugátumok alkalmasakrákbetegségekben, autoimmun-megbetegedésekben, parazitafertő-zésekben, vírusfertőzésekben vagy más olyan betegségben szenvedőemlősök kezelésére, amely betegségekre jellemző valamely betegségrespecifikus struktúrákat expresszáló sejtek jelenléte. ŕ

Description

A találmány tárgyát olyan konjugátumok képezik, melyek tartalmaznak
I) egy biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekulát, amely képes egy olyan struktúrával reagálni, amely ellen a konjugátumot alkalmazni kívánjuk, valamint
II) egy pepiidet, amely peptid
i) egy szuperantigénből származik, ii) képes kötődni a T-sejt-receptor νβ-láncához, iii) és a II. osztályú MHC-antigénekhez módosultán képes kötődni (ahhoz a szuperantigénhez viszonyítva, amelyikből a pepiidet előállítottuk).
A peptid és az affinitással rendelkező partnermolekula kovalensen kapcsolódik egymáshoz egy úgynevezett hídon (B) keresztül.
A találmány szerinti konjugátumok alkalmasak rákbetegségekben, autoimmun-megbetegedésekben, parazitafertőzésekben, vírusfertőzésekben vagy más olyan betegségben szenvedő emlősök kezelésére, amely betegségekre jellemző valamely betegségre specifikus struktúrákat expresszáló sejtek jelenléte.
A szuperantigének eredetileg víruseredetű vagy bakteriális fehérjék, amelyek szimultán képesek kötődni emlőssejtek MHC-fehérjéinek (fő hisztokompatibilitási) II. osztályú antigénjeihez és a T-sejt receptorának νβ-láncához (rövidítése TCR). A kötődés a T-limfociták aktiválásához és a II. osztályú MHC-fehérjét hordozó sejtek líziséhez vezet. A νβ-lánc kötőhelyének mérsékelt polimorfizmusa a T-limfociták viszonylag nagy részének teszi lehetővé az aktiválódást, ha egy szuperantigénnel kerül érintkezésbe (a normál antigénaktiváláshoz hasonlítva).
Eredetileg a szuperantigén fogalma különböző staphylococcus-eredetű enterotoxinnal (SEA, SEB, SECb SEC2, SÉD és SEE) volt összefüggésben. Nemrégiben egy új Staphylococcus-eredetíí enterotoxint (a neve SEH) fedeztek fel [Keyong és munkatársai, J. Exp. Med. 180, 1675-1683 (1994)]. Az érdeklődés növekedésével további szuperantigéneket fedeztek fel. Például a toxikussokk-szindrómát kiváltó toxin-l-et (TSST-1), exfoliatív toxinokat (Exft), amelyek a leforrázott bőr szindrómájához kapcsolhatók, Sfrepíococcus-eredetű pirogén exotoxin A-t, B-t és C-t (SPE A, B és C), egéreredetű tumor-vírusfehérjéket (MMTV), Streptococcuseredetű M-fehérjéket, Clostridium-eredetíí perfringens enterotoxint (CPET). A szuperantigének összefoglaló ismertetését és tulajdonságaikat lásd Kotzin és munkatársai, Adv. Immunoi. 54, 99-166 (1993).
A Pseudomonas-eredetű exotoxin-A-t funkcionális szuperantigénnek tekintjük, mert az eredmények azt mutatják, hogy a toxint valószínűleg intracellulárisan dolgozza fel a szervezet a járulékos sejtek felszínén expresszálódott olyan fragmensei által, amelyek képesek kötődni a νβ-lánchoz és azt követően a T-sejteket aktiválni [Pseudomonas exotoxin-A, Legaard és munkatársai, Cell. Immunoi. 135, 372-382 (1991)].
A szuperantigéneket különböző betegségek terápiájához is javasolják, mivel gyógyító hatása van az immunrendszerre kifejtett általános aktiváló hatása miatt [Kalland és munkatársai, WO 910453; Termán és munkatársai, WO 9110680; Termán és munkatársai, WO 9324136; Newell és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1074-1078 (1991)].
Védőoltásokhoz való alkalmazásuk esetén addig mutáltatták azokat, amíg elvesztették TCR-t kötő képességüket [Kappler & Marrack, WO 9314634].
Szuperantigének mutációjáról már vannak publikációk [Kappler & Marrack, WO 9314634; Kappler és munkatársai, J. Exp. Med. 175, 387-396 (1992); Grossman és munkatársai, J. Immunoi. 147, 3274-3281 (1991); Hufnagle és munkatársai, Infect. Immun. 59, 2126-2134(1991)].
Korábban már javasoltuk, hogy terápiás célra szuperantigének és ellenanyagok konjugátumát használjuk azért, hogy kiváltsuk az ellenanyag által felismert struktúrát termelő sejt lízisét [Dohlstein és munkatársai, WO 9201470; Lando és munkatársai, Cancer Immunoi. Immunother. 36, 223-228 (1993); Kalland és munkatársai, Med. Oncol. Tumor Pharmacother. 10, 37-47 (1993); Lando és munkatársai, J. Immunoi. 150, 8, 2. rész, 114A „Joint Meeting of the American Association of Immunologists and Clinical Immunology Society”, Denver, Colorado, USA, 1993. május 21-25.; Lando és munkatársai, Proc. Am. Assoc. Cancer Rés. Annu. Meet. 33(0), 339, „Annual meeting of the American Association fór Cancer Research”, San Diego, California, USA, 1992. május 20-23.; Dohlstein és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9287-9291 (1991)]. A kezelésre javasolt megbetegedések: rákos megbetegedések, vírusfertőzések, parazitafertőzések, autoimmun-betegségek és más olyan betegségek, amelyekhez a megbetegedésre specifikus felszíni struktúrákat expresszáló sejtek rendelhetők. Az eddig végzett kísérleti munka rekombináns SEA és különböző rákellenes ellenanyagokat tartalmazó konjugátumokra koncentrálódott. Ezek a konjugátumok valamivel rosszabbul kötődtek a II. osztályú MHC-antigénekhez a szuperantigének nem konjugált formájához viszonyítva. Nem határozta meg senki, hogy ez a csökkent II. osztályú MHC-antigént kötő képesség előnyös vagy hátrányos az optimális lízis és terápiás hatás eléréséhez.
Immunterápiás kísérleteket publikáltak SEB tumorspecifikus anti-idiotipikus ellenanyaghoz kémiailag kapcsolt konjugátumával [Ochi és munkatársai, J. Immunoi. 151, 3180-3186 (1993)].
Az elsőségért folytatott per során a Svéd Szabadalmi Hivatal kiegészítésképpen idézte Buelow és munkatársai publikációját [J. Immunoi. 148, 1-6 (1992)], amely protein-A és SEB-fragmensekből álló fúziót ír le, anélkül, hogy hangsúlyozná a II. osztályú MHC-antigének kötését vagy a fúzió alkalmazását sejtek elpusztítására; valamint Hartwig és munkatársai publikációját [Int. Immunoi. 5, 869-875 (1993)], akik Streptococcwí-eredetű eritrogén toxin-A-szuperantigén nem füzionált formájának II. osztályú MHC-kötőképességét befolyásoló mutánsait írják le.
A találmány kidolgozásakor első célkitűzésünk a már ismert szuperantigén-ellenanyag konjugátumok feljavítása volt, az általános immunstimuláló hatás és irányított citotoxicitás viszonylatában. A stimuláció ered2
HU 221 254 Β1 ménye a T-limfociták aktiválásában nyilvánul meg, és függ a szuperantigén mind a T-sejt receptorához mind a II. osztályú MHC-antigénhez való kötődési képességétől.
Második célkitűzésünk biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekulákat (például ellenanyagokat) és II. osztályú MHC-antigénekkel szembeni affinitásukban módosított szuperantigéneket tartalmazó konjugátumok előállítása volt. A módosított affinitás abban nyilvánul meg, hogy megjavul a célantigént (amit az ellenanyag/biospecfikus partnermolekula konjugátum megcéloz) felszínükön hordozó sejtek szuperantigén elleni ellenanyagtól függő sejtcitolízisének (a továbbiakban SADCC) szelektivitása, más II. osztályú MHC-antigéneket hordozó sejtekhez képest.
Harmadik célkitűzésünk olyan konjugátumok előállítása volt, amelyek rákbetegségekben, autoimmunmegbetegedésekben, parazitafertőzésekben, vírusfertőzésekben vagy más olyan betegségben szenvedő emlősök kezelésének aktív hatóanyagaként alkalmazhatók, amely betegségekre jellemző valamely betegségre specifikus struktúrákat expresszáló sejtek jelenléte.
A találmány tárgyát olyan konjugátumok képezik, melyek tartalmaznak
I) egy biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekulát, amely olyan struktúrával képes reagálni, amely ellen a konjugátumot alkalmazni kívánjuk, valamint
II) egy pepiidet, amely peptid
i) egy szuperantigénből származik, ii) képes kötődni a T-sejt-receptor νβ-láncához, iii) és a II. osztályú MHC-antigénekhez módosultán képes kötődni, ahhoz a szuperantigénhez viszonyítva, amelyikből a pepiidet előállítottuk [a szuperantigén vad típusának jelölése: SA(wt)].
A peptid és az affinitással rendelkező partnermolekula kovalensen kapcsolódik egymáshoz egy úgynevezett hídon (B) keresztül.
Az előnyös konjugátumok képesek a T-limfocitákat aktiválni és azokat olyan sejtek szelektív lízisére késztetni, amelyeknek felszínén lévő struktúrákat a biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekula megcélozza. Ez azt jelenti, hogy a konjugátumoknak citolízist okoznak egy SADCC (azaz szuperantigénellenanyagfiiggő celluláris citotoxicitásj-közvetített folyamatban. Lásd az alábbi kísérleti részt és korábbi publikációinkat a szuperantigének és ellenanyagok közötti konjugátumokról (például Dohisten és munkatársai, WO 9201470).
A találmány szerinti konjugátumok szerkezete analóg a szakirodalomban már korábban leírt szuperantigén-ellenanyag konjugátumokkal [Dohlstein és munkatársai, WO 9201470, ami a referenciajegyzékben megtalálható], például a következő formula szerinti konjugátum:
T-B-SA(m) ahol a „T” a biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekula, ,,SA(m)” a módosított szuperantigén (az előbbiekben említett peptid), és a „B” a T-t és az S(m)-t összekapcsoló kovalens híd.
A „T”-rész elvileg bármilyen olyan struktúra lehet, ami biospecifikus affinitással képes kötődni. A legfontosabb esetekben a „T”-rész sejtfelszíni struktúrákhoz képes kötődni, az előnyös alkalmazás esetén a fentebb említett megbetegedésekre specifikus struktúrákhoz. A „T”-rész által megcélzott struktúra rendszerint különbözik (a) a νβ-lánctól mint epitóptól, amelyhez a módosított szuperantigén-peptid [SA(m)] kötődik, és (b) különbözik a II. osztályú MHC-antigéntől mint epitóptól, amelyhez a módosítás nélküli szuperantigén kötődik. A biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekulát („T”) elsősorban az interleukinek (például interleukin-2), hormonok, ellenanyagok, az ellenanyagok antigént kötő fragmensei és a növekedési faktorok közül választjuk ki. Lásd például „Preclinical and Clinical Development of Cytokine Toxins” [„Molecular Approaches to cancer Immunotherapy” című konferencián, Ashville, North Carolina, 1993. november 7-11.]. Az immunoglobulinok konstans doménjéhez kötődő polipeptideknek (például protein-A, -G és -L, lektinek, sztreptavidin, biotin stb.) az elsőbbség időpontjában kisebb jelentőséget tulajdonítottunk.
Az elsőbbség időpontjában a „T”-rész előnyösen ellenanyag vagy az ellenanyag antigént kötő ffagmense [például Fab, F(ab)2, Fv, egyláncú ellenanyag stb.] volt, különös hangsúllyal az úgynevezett C242-epitóp ellen termelődött ellenanyagok aktív ffagmensére (mint például az Fab) [Lindholm és munkatársai, WO 9301303], vagy más rákspecifikus epitópra.
Ha a „T”-rész ellenanyag, akkor az elsősorban monoklonális vagy monoklonálisok definiált számú (például 2, 3,4, 5 vagy több) keveréke. A „T” lehet poliklonális ellenanyag is, ebben az esetben alkalmazása nem terápiás célt szolgál.
Nem szükségszerű, hogy a „T”-rész polipeptidszerkezetű legyen.
Az „SA(m)”-módosított szuperantigén elsősorban annak mutánsa, de potenciálisan lehet kémiailag módosított szuperantigén is, a szuperantigén ffagmenseit is beleértve, amelyek megőrizték a T-sejt-receptor νβláncához való kötődőképességüket.
A „mutáns szuperantigén” kifejezése azt jelenti, hogy a szuperantigén II. osztályú MHC-antigénekhez való kötődőképességét génszinten módosítottuk úgy, hogy kicseréltünk, inszertáltunk vagy eltávolítottunk egy vagy több aminosavat a natív szuperantigénhez képest.
A mutációval előállított szuperantigén-fragmenseket a teljes aminosavszekvencia részeinek vagy fragmenseinek enzimatikus vagy kémiai hasításával kaptuk, és a találmány szerinti konjugátumban a szuperantigénnel ekvivalens mennyiséget használtunk belőle.
Az „SA(m)”-módosított szuperantigén tartalmazhat egy vagy több aminosavszekvenciát, amelyek különböző szuperantigénekből származnak, és olyanokat, amelyek mutánsok, például ilyenek a továbbiakban említésre kerülő találmány szerint előnyös szuperantigén-kombinációk.
Az „SA(m)”-módosított szuperantigén mutathat kisebb immunogenitást és toxicitást, mint a natív szuperantigén.
HU 221 254 Β1
Más csoportok/anyagok, amelyek képesek keresztreagálni a T-sejt receptorának νβ-láncával, potenciálisan szintén alkalmazhatók az előbb említett mutáns szuperantigénekkel [SA(m)] azonos módon. Az ilyen csoportoknak/anyagoknak polipeptidtől különböző struktúrája is lehet.
Az elsőbbség évének végén a találmány legérdekesebb termékjelöltje egy mutáns szuperantigén volt, amelynek több II. osztályú MHC-kötőhelye volt és/vagy a Zn2+ koordinatív megkötésére volt képes, mint például SEA, SÉD, SEE és SEH.
A „T”- és az „SA(m)”-rész rekombináns technikákkal is előállítható.
A „Β’’-hidat korábbi publikációk alapján választottuk ki [Dohlstein és munkatársai, WO 9201470], amely előnyösen hidrofil sajátságú, és az amid-, tioéter-, éter-, diszulfid- vagy egyéb csoportok közül tartalmaz egyet vagy többet. Ha a híd szubsztituálatlan, ép szénhidrogénláncot tartalmaz, akkor lehetőleg nincs bennük aromás gyűrű, például fenilcsoport. A találmány szempontjából legfontosabb hidakat rekombináns technikával állítjuk elő, azaz a konjugálás genomi szinten történik. Ebben az esetben a híd hidrofil aminosavakból álló oligopeptidből áll, például előnyös a Gin, Ser, Gly, Glu és Arg. Pro-t és His-t is tartalmazhat. Az elsőbbség évében elhatároztuk, hogy a találmány szempontjából előnyös híd egy három aminosavat tartalmazó csoport lesz (GlyGlyPro).
A találmány szerinti konjugátumban egy vagy több módosított szuperantigén is juthat egy biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekulára, és fordítva is igaz. Ez azt jelenti, hogy a fenti formula „T”-részéhez egy vagy több módosított szuperantigén is kapcsolódhat a biospecifikus partnermolekulán kívül. Ennek analógiájára az „SA(m)”-részhez egy vagy több biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekula is kapcsolódhat. Az affinitással rendelkező „T”-rész és az „SA(m)”-rész más szerkezeteket is tartalmazhat. A találmány előnyös megvalósítási formájában egy affinitással rendelkező partnermolekulára jutó módosított szuperantigének száma egy vagy kettő.
A találmány szerinti új konjugátumok szintézise kétféleképpen történhet: 1. rekombináns technikával és 2. A „T”-rész „SA(m)”-hez való kémiai kapcsolásával. Az említett eljárások szakember számára jól ismertek és sok variációra adnak lehetőséget. Ebből az következik, hogy a találmány szerinti konjugátumok elsősorban mesterségesek, vagyis a természetben nem találhatók meg.
A módosított szuperantigén kémiai kapcsolása a „Τ’’-biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekulához gyakran alkalmaz funkciós csoportokat (például primer amino- vagy karboxilcsoportokat), amelyek mindegyik komponens többféle pozíciójában előfordulhatnak. Ebből az következik, hogy a végtermék konjugátummolekulák keverékét fogja tartalmazni, amelyek abban különböznek egymástól, hogy melyik pozícióban történt a kapcsolódás.
A rekombináns konjugátumok (fúziós fehérjék) esetében a keletkezett konjugátum a kapcsolódás helyének tekintetében egységes lesz. Vagy a módosított szuperantigén aminoterminálisa kapcsolódik a biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekula karboxil-terminálisához vagy fordítva. Az ellenanyagok (egész molekula vagy az antigént kötő fragmens, például Fab, Fv stb.) esetében, akár a könnyű lánc, akár a nehéz lánc felhasználható ilyen fúziók létrehozására. Jelenleg a rekombináns konjugátumok az előnyösek, főleg az Fab-fragmensnek van kitüntetett szerepe, a módosított szuperantigén aminoterminálisát kötve az ellenanyag nehéz láncának első konstans doménjéhez (CH1), úgy, hogy nem záijuk ki az analóg kapcsolódás lehetőségét a könnyű lánchoz vagy a VH- és VL-doménhez (variábilis régiók), ami így szintén egész jó eredményeket adhat.
Két különböző eljárás létezik nagy mennyiségű szuperantigén (beleértve a módosított és a fúziós formát is) előállítására E. coli-ima: az intracelluláris termelés és a szekretálás. Ez utóbbi eljárás előnyös a találmány szerinti konjugátumok előállítására, mert megfelelően kialakult térszerkezetű fehérje tisztítását teszi lehetővé a periplazmából vagy a tápközegból. Az intracelluláris termelés következménye nehézkes tisztítási eljárás, és gyakran van szükség a fehérje térszerkezetének in vitro helyreállítására (hogy megkapjuk a fehérje hibátlan harmadlagos szerkezetét). A fentiek nem zárják ki, hogy aktív konjugátumokat lehet előállítani más gazdasejtekben is, például eukarióta sejtekben, közelebbről élesztőben vagy emlős sejtekben.
A mutáns szuperantigének termelése és a II. osztályú MHC-antigéneket módosultán kötni képes (affinitású) mutánsok szelekciója ismert technikák szerint hajtható végre [lásd Kappler és munkatársai, J. Exp. Med. 165, 387-396 (1992)]. Lásd kísérleti részünket is.
A konjugátum kötődési képessége a T-sejt receptorának νβ-láncához, a megcélzott szerkezethez és a célsejt lízisének előidézése függ az SA(m)-peptidtől, amelyből a szuperantigén származik, a biospecifikus affinitással rendelkező partnermolekulától (T) és a híd (B) szerkezetétől és hosszától. Szakember képes optimalizálni a találmány szerinti konjugátumokat a kötődési és a lizálási képesség alapján, a szerkezet és hatás összefüggését vizsgálva a szuperantigén-ellenanyag konjugátumokként korábban már publikált modellek segítségével (lásd a fenti publikációkat). Lásd a kísérleti részünket is.
A II. osztályú MHC-antigénekhez módosult kötődési képességgel elsősorban azt kívánjuk elérni, hogy az IC5o[SA(wt)]:IC5O[SA(m)]<0,9 (90%), ahol az IC50 az 50%-os gátlási koncentrációt jelenti, például <0,5 (<50%), és lehetőleg <0,01 (<1%). A találmány szerinti konjugátumok módosult kötődési képessége alternatív módon mérhető a disszociációs konstansok arányával : Kd[SA(wt)]: Kd[SA(m)], ahol a IQ egysége nM, és az arány ugyanolyan határok között mozog, mint az IC50[SA(wt)]: IC50[SA(m)] esetében. Az IC50[SA(wt)], IC5o[SA(m)], K,|[SA(wt)] és a Kd(SA(m)) meghatározását lásd a kísérleti részben.
Már ismert volt, hogy bizonyos szuperantigéneknek két vagy több II. osztályú MHC-antigént kötő csoportjuk is lehet [Fraser és munkatársai, „Superantigens:
HU 221 254 Bl
A pathogens view on the immuné system”, szerk.: Huber és Palmer, Current Communications in Cell Molecular Biology 7, 7-29 (1993)]. Az ilyen típusú szuperantigének kötődési képessége legalább az egyik kötőhelynél módosítva van, például az említett méret csökkentése útján. Lehet, hogy elegendő a szuperantigén olyan módosítása, amely két II. osztályú MHC-antigénkötőhely affinitásának különbségét változtatja meg, például > 10%-osan úgy, hogy legalább az egyik kötőhely affinitását csökkenti.
A szuperantigének a különböző alcsoportokhoz tartozó TCR-Vp-láncokat különféle affinitással kötik. A találmány szerinti fehéije/konjugátum-fuziókban a szuperantigéneket úgy módosítottuk, hogy megváltozott az alcsoport specificitása vagy az alcsoport egy vagy több tagjához mutatott megváltoztatott affinitást. Alapos okunk van feltételezni, hogy parabolikus kapcsolat van a TCR-Vp-lánc iránti affinitás és a TCR-en keresztüli stimulálás között, például egy mérsékelt affinitás is képes maximális aktivitást adni. Egy módosított szuperantigén megfelelő TCR-VP-lánc felé mutatott affinitását megkaphatjuk, ha a szuperantigént tartalmazó fehérje/konjugátum-füzió képes egy olyan T-sejt-populáció proliferációját szignifikánsan stimulálni, amely minden emberi eredetű νβ-alcsoportot természetes megoszlása szerint képvisel. A T-sejtpopuláció random szelektált egyénekből gyűjthető össze. A „szignifikánsan” kifejezés azt jelenti, hogy a stimuláció mérhető volt. A kísérleti részben található II. táblázatban (jobb oldali oszlop) bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti konjugátumok/fuziós fehérjék által létrehozott SADCC sokszor lényegében ugyanakkora, mint a vad típusú szuperantigént tartalmazó fúzió által létrehozott SADCC.
A találmány szerinti konjugátumok/fúziós fehérjék fő alkalmazása
A találmány szerinti konjugátumokat elsődlegesen ugyanolyan megbetegedések kezelésére kívánjuk alkalmazni, mint a normál szuperantigének és ellenanyagok közötti konjugátumokat. Lásd a fent említett publikációkat. Tehát a találmány szerinti konjugátumok beadhatók vagy fő terápiaként, vagy adjuváns terápiaként alkalmazva más gyógyszerrel vagy sebészeti eljárással kiegészítve.
A találmány szerinti gyógyszerészeti készítmény kiszerelése a szokásos forma lehet, de tartalmazza az új konjugátumunkat. Tehát a hatóanyag lehet liofilizált anyag formájában, steril vagy oldatban, tablettában, ampullában stb. Hordozók, például víz (előnyös a fiziológiás pH-ra puffereit, például PBS-el) vagy más inért szilárd vagy folyékony anyagok is jelen lehetnek. Általában a készítmények készülhetnek a konjugátum összekeverése, feloldása, hozzákötése, vagy más kombinálása által egy vagy több vízoldékony vagy vízben nem oldható hordozóval, ha szükséges, a megfelelő adalékanyagokkal és adjuvánsokkal. Nyilvánvaló, hogy a hordozóanyagok és a körülmények nem lehetnek káros hatással a konjugátum aktivitására. A víz, mint olyan, megtalálható az expressziós hordozókban is.
Szokásosan a konjugátumot előre kimért dózisokban áruljuk és adagoljuk, mindegyik dózis a most bemutatott eredmények alapján számított hatásos mennyiségű konjugátumot tartalmaz, ami a 10 pg-50 mg tartományban van. A dózis pontos mennyisége esetről esetre változik, függ a páciens súlyától és korától, a bevétel módjától, a betegség típusától, az ellenanyagtól, a szuperantigéntől, a kapcsolás módjától (-B-) stb.
A beadás a szokásos módokon történhet úgy, hogy a találmány szerinti konjugátum célsejt lízisét kiváltó hatásos mennyisége vagy terápiásán hatásos mennyisége érintkezzék a célsejtekkel. Ez a fent említett indikációk esetén leginkább parenterális beadást jelent, például injekciót vagy infúziót (szubkután, intravénás, intraartériás, intramuszkuláris) emlős állatnak vagy embernek. A konjugátum beadható lokálisan vagy szisztémásán.
A „célsejt lízisét kiváltó hatásos mennyiség”-en értjük azt a mennyiséget, amely hatásos a T-limfociták aktiválásához és a célsejtre irányításához annak megsemmisítése céljából.
Az elsőbbség évének a végén elhatároztuk, hogy a (módosítás nélküli szuperantigéneket is tartalmazó) konjugátumok/fúziós fehérjék előnyös beadási módja napi 3 órás intravénás infúzió lesz, lázcsillapítóval (paracetamol) együtt kombinálva. Ezt ismételjük 4 napig, és befejezzük, mielőtt másodlagos ellenanyagok keletkeznének a fúziós fehérje/konjugátum ellen a páciensben. Ez a dózisbeosztás alkalmazható a találmány szerinti konjugátumokra/fuziós fehérjékre is.
Az alternatív felhasználás területei
A találmány szerinti konjugátumok felhasználhatók a célzócsoport (T) által felismert szerkezet kvantitatív vagy kvalitatív detektálására is. Általában ezek a módszerek közismertek szakember számára. Tehát a módosított szuperantigének markercsoportokként működhetnek immunológiai vizsgálati eljárásokban, immunohisztokémiai értelemben is, ami azt jelenti, hogy a markercsoport például egy ellenanyag segítségével detektálható, amely a peptidet (SA(m)) felismeri, és enzimmel, izotóppal, floreszcens anyaggal vagy más önmagában ismert markercsoporttal van megjelölve. Másfajta immunológiai vizsgálati eljárás olyan sejtpopuláció sejtjeinek detektálása, amelyek felszínükön a célzócsoporthoz (T) kötődni képes struktúrát expresszálnak. Ez azt jelenti, hogy a sejtpopulációból vett mintát a T-limfocitákkal és a találmány szerinti konjugátummal inkubáljuk együtt, az SADCC-mérési eljáráshoz hasonlóan. Ha az inkubáció a sejt líziséhez vezet, ez azt jelenti, hogy a populáció tartalmazott olyan sejteket, amelyek felszínén volt expresszált cél-struktúra.
1. példa
A rekombináns fehérjék előállítása
Ellenanyagok
A találmány szerinti kísérleti munkát elsősorban a C215-ellenanyaggal végeztük mint modell-ellenanyaggal. Ez az ellenanyag a GA-733-család egyik antigénje ellen termelődött [lásd például EP 376746-szabadalomban idézett referenciák és Larsson és munkatársai, Int.
HU 221 254 Bl
J. Canc. 32, 877-82 (1988)]. A C215-epitóp nem bizonyult elegendően specifikusnak az emberi rák kezelésére. Az elsőbbség megszerzésének idején a mab-C242 (Lindholm és munkatársai, WO 9301303) jobb lehetőség volt, amit a vad típusú SEA-t tartalmazó fúziós termékkel végzett kísérletek alátámasztottak. Baktériumtörzsek és plazmidok
Az UL635-jelű (xyl-7, ara-14, T4R, AompT) és a HB101 [Boyer és Roulland-Dessoix, J. Mól. Bioi. 41, 459-472 (1969)] E. coli törzseket használtuk az expresszióra és a klónozásra, sorrendben. A pKP889-vektort használtuk az Fab-SEA-fúziós fehérjék (egéreredetű C215-ellenanyagból származott) expresszálására, a pKP943- és pKP1055-vektorokat a SEA szekretálására (1. ábra). A pKP889-jelű, az Fab-SEA expresszálására alkalmazott vektor azonos volt a pKP865-vektorral [Dohlstein és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, közlés alatt (1994)], kivéve a CH1 és a SEA közötti távtartó régiót, ami GlyGlyAlaAlaHisTyrGly volt. A pK.P943-vektor a SEA-t natív amino-terminálissal expresszálja. A pKP1055-vektor alkalmazásával a SEA egy Gly-csoportot kapott az aminoterminálisához. Mindkét vektor esetében a transzkripcióhoz és a transzlációhoz a Staphylococcus-?xotem-A. szignáljait [Uhlén és munkatársai, J. Bioi. Chem. 259, 1695-1702 (1984)] alkalmaztuk, és a szekrécióhoz egy szintetikus szignálpeptidet [L. Abrahmsén, nem publikált eredménye].
In vitro mutagenezis
A mutációkat polimeráz láncreakcióval hajtottuk végre a Perkin Elmer cégtől vásárolt ciklizáló termosztátban. A reakciókeverék (100 μΐ) a következőket tartalmazta : 1 χ PCR-puffer a Perkin Elmer Cetus cégtől származott (10 mM Tris/HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,001% (w/v) zselatin, további 2 mM MgCl2, 0,4 mM dNTPk (Perkin Elmer Cetus cégtől), 2,5 egység „Ampli Taq” DNS-polimeráz (Perkin Elmer Cetus cégtől, USA) és 100 ng DNS-templát. Láncindító oligonukleotidokat 0,8 μΜ végkoncentrációban adtunk. Az eredeti templát egy Staphylococcus aurei/s-eredetű enterotoxin-A-gént tartalmazó plazmid volt, amely megegyezett Betley és munkatársai által közölttel [J. Bacteriol. 170, 34-41 (1988)], kivéve az első kodont (Ser-t kódolt), ami TCC-re volt cserélve, így egy BamHI-hasítóhelyet juttattunk a gén 5’-végéhez. A későbbiekben olyan származékot használtunk, amelybe csendes mutációval még több egyedi restrikciós hasítóhelyet építettünk be. A restrikciós helyek melletti mutációkat egy olyan láncindító oligonukleotid-készlettel juttattuk be, amelynek egyik tagja tartalmazta a mutációt is és a restrikciós helyet is. A legtöbb mutációhoz két láncindító oligonukleotid-készletet kellett használni, és a PCR-t két egymás utáni lépésben hajtottuk végre. Minden egyes mutációval egy új restrikciós hasítóhelyet juttattunk be, a könnyebb azonosítás miatt. A láncindító oligonukleotidokat „Gene Assembler” készüléken (Pharmacia Biotech AB, Sweden) szintetizáltuk. Annak igazolására, hogy a mutáció a megfelelő helyen történt meg, a szekvenciákat „Applied Biosystems DNASequenser’-készüléken határoztuk meg, a cég által forgalmazott „Taq DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing Kit” használatával.
Fehérjetermelés és analízis
A különböző génkonstrukciókat tartalmazó E. coli sejteket egy éjszakán át tenyésztettük szobahőmérsékleten (az Fab-SEA-vektorokat tartalmazó törzseket) vagy 24-34 °C-on (a szekréciós vektorokat tartalmazó törzseket, az optimum a mutációtól függött). A tápközeg 2χ YT (16 g/1 Bacto trypton, 10 g/1 Bacto yeast-extraktum, 5 g/1 NaCl) volt, kanamycinnel (50 mg/1) kiegészítve. A fúziós fehérjéket izopropil-p-D-tiogalaktoziddal indukáltuk, 100 μΜ-os végkoncentrációt alkalmazva. (A protein-A promoterét alkalmazva a nem fúzionált SEA expressziója konstitutív.) A sejteket 5000xg-vel ülepítettük le, és a periplazma tartalmát az előzőleg megfagyasztott sejtek kíméletes felolvasztásával tártuk fel, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) pufferben, jégen, 1 óráig kevergetés közben. A periplazma extraktumát centrifugáltuk 9500 χ g-n, 15 percig. Az Fab-SEA-fehérjéket további tisztítás nélkül használtuk. A SEA- és a GlySEA-fehérjéket az affinitáskromatográfiával tisztítottuk tovább anti-SEA ellenanyag-oszlopon. A poliklonális anti-SEA nyúlellenanyagokat előzőleg SEA-val immunizált nyulakból vettük le, és affinitáskromatográfiával tisztítottuk protein-G-Sepharose® oszlopon (Pharmacia Biotech cégtől).
Fehérjeanalizis
A fehérjéket előre kiöntött poliakrilamidból készült, SDS/Tris-Glicin puffért tartalmazó „Novex”gélen (4-20% gradiens vagy 12% homogén, „Novex” új kísérleti technológia) választottuk el, és vagy megfestettük „Coomassie Blue”-festékkel vagy Western biot kísérlethez használtuk. Poliklonális, anti-SEA nyúlellenanyagokat (fent) használtuk a SEA detektálására a Western biot analízisben, majd antinyúl-Ig disznóellenanyagot, anti-tormaperoxidáz nyúlellenanyagot és peroxidázt. Az Fab-SEA fúziós fehérjékhez peroxidázzal konjugált patkány ellenanyagokat használtunk, amelyek a kappa-láncot ismerik fel (AAC 08P, Serotech LTD, England). A peroxidázt 3,3’diaminobenzidinnel (Sigma cégtől vásároltuk) mutattuk ki.
A cirkuláris dikroizmus (CD) spektrumokat egy J720 típusú spektropolariméterben (JASCO, Japan) vettük fel szobahőmérsékleten (22-25 °C), 10 mM foszfátpufferben, pH-ja 8,2 volt, és amelyhez 0,02 mM ZnSO4-t és 0,005% Tween®20-at adtunk. A spektrumfelvétel sebessége („scanning speed”) 10 nm/perc volt, és minden spektrumot öt, egymást követő felvételből átlagoltunk. A küvettában a fényút hossza 1 mm volt, a fehérje koncentrációja 0,2-0,5 mg/ml. A guanidin-hidrokloriddal végzett (Gdn-HCl) egyensúlyi denaturációs kísérleteket 23 °C-on mértük CD-vel, 222 nm-en, amelyben a fehérjekoncentráció 0,3 mg/ml és a küvettában a fényút hossza 1 mm volt. Ezekből az adatokból számoltuk ki a kialakulatlan térszerkezetű („unfolded”) fehérje látszólagos arányát (Fapp). A kialakulatlan egyensúlyi térszerkezet paramétereit úgy kaptuk meg, hogy az adatokat a natív térszerkezet kialakulásának kétlépéses folyamatának görbéjéhez illesztet6
HU 221 254 Bl tűk [Hurle és munkatársai, Biochemistry 29, 4410-4419 (1990)].
2. példa
Kötési és funkcionális in vitro mérési eljárások Anyagok
Reagensek: Az RPMI 1640 tápközeget a Gibco cégtől vásároltuk, Middlesex, England. A tápközeg pH-ja 7,4 volt és 2 mM L-glutamint (Gibco, Middlesex, England), 0,01 M HEPES-t (Biological Industries, Israel), 1 mM NaHC03-tot (Biochrom AG, Germany), 0,1 mg/ml gentamicin-szulfátot (Biological Industries, Israel), 1 mM Na-piruvátot (JRH Biosciences Industries, USA), 0,05 mM merkaptoetanolt (Sigma Co., USA), 100 χ tömény nem esszenciális aminosavakat (Flow Laboratories, Scotland) tartalmazott és 10% magzati marhaszérummal (Gibco, Middlesex, England) volt kiegészítve. A rekombináns SEA(wt), SEA(m) és a C215Fab-SEA(wt) és a c215Fab-SEA(m)-füziós termékeket a fentiek szerint állítottuk elő. Az emberi eredetű rekombináns IL-2-t a Cetus Corp. cégtől vásároltuk (USA). A mitomycin-C-t a Sigma Co.- cégtől vásároltuk (USA). A Na2 51CrO4-t a Merck cégtől szereztük be (Germany). A sótartalmú foszfátpuffert (PBS) magnézium és kalcium nélkül az Imperial cégtől vásároltuk (England).
Sejtvonalak: A Colo205-jelű emberi vastagbél-eredetű karcinóma-sejtvonalat és a Raji-féle B-sejt lymphomasejtvonalat az „American Type Cell Culture Collection” cégtől szereztük be (Rockville, MD, USA) (a HLA-DR3/wlO,-DP7, -DQwl/w2 kifejezéséhez). Az EBV-vel transzformált BSM-jelű lymphoblastoid-Qsejtvonal Dr. van De Gried nagylelkű ajándéka volt (Department of Immunology, Dr. Dániel den Hoed Cancer Center, Leiden, the Netherlands). A sejteket többször teszteltük /wycop/a.sTwa-szennyezésre „Gen-Probe Mycoplasma T.C. test” alkalmazásával, amelyet a GenProbe Inc. cégtől szereztünk be (San Diego, USA).
A SEA-aktivált T-sejtvonalakat perifériás vérből származó egymagvú (mononukleáris) sejtek aktiválásával kaptuk. A vér „buffy” (álhártyás) donoroktól származott a „University Hospital of Lund”-ból. A PBMek 2 χ 106 sejt/ml koncentrációban, mitomycin-C-vel kezelt, SEA-val burkolt BSM-sejtekkel voltak stimulálva (az előinkubálás 100 ng/ml SEA-val történt), 10% FCS-t tartalmazó tápközegben. A T-sejtvonalak kéthetente voltak újrastimulálva 20 U/ml humán, rekombináns IL-2-vel, és hetente mitomycin-C-vel kezelt, SEA-val burkolt BSM-sejtekkel. A sejtvonalakat 4-12 hétig tenyésztettük a mérési eljárásban történő felhasználásuk előtt.
Az effektorsejtek életképessége meghaladta az 50%-ot, „trypan blue exclusion” módszerrel történt meghatározás alapján.
A vad típusú és a mutáns SEA 11. osztályú MHC-antigént kötő jellemzőinek meghatározása Eljárás radioaktív jóddal történő jelölésre
Elegendő mennyiségű vad típusú vagy mutáns SEA-t jelöltünk 10-25 mCi Nal25I-al, „enzymobeads” felhasználásával, laktoperoxidáz-technikával (NEN,
Boston, MA). A reakciót nátrium-azidos „quench”eléssel állítottuk le és a fehérjéhez kötődött radioaktivitást PD-10-oszlopon (Pharmacia Biotech AB, Sweden) gélszűréssel választottuk el a szabad jódtól, amelynek során az RIO-tápközeg volt az elúciós puffer. A körülményeket úgy választottuk meg, hogy a jód125 és a fehérje közötti sztöchiometrikus arány < vagy = volt, mint 2:1. A radiokémiái tisztaságot méretkizárásos („sizeexclusion”) kromatográfiával határoztuk meg „TSK. SW 3000” típusú HPLC-oszlopot alkalmazva. A radioaktív jóddal való jelölés hatását a kötési aktivitásra csak a vad típusú SEA esetében határoztuk meg, és nem tapasztaltunk változást (az adatokat nem mutatjuk be).
Direkt kötődési mérési eljárás
Raji-féle sejteket 6xl04 sejtet 100 pl térfogatban, előzetesen RIO-tápközegben történt tenyésztés után helyeztünk kúpos aljú polipropilén csövekbe és három párhuzamos mintát inkubáltunk (22 °C-on/45 percig) együtt hígítási sorban hígított 100 pl/cső 125I-vel jelölt vad típusú vagy mutáns SEA-val. A sejteket 2 ml 1%os (w/v) marhaeredetű szérumalbumint (BSA) tartalmazó 10 mM PBS-el (sót tartalmazó foszfátpuffer, pH 7,4) mostuk, 300 χ g-n, 5 percig centrifugáltuk és a felülúszót leszívtuk. Ezt a lépést még kétszer megismételtük. Végül a sejteket „gamma counter”-ben (Packard Instruments Co., Downers Grove, IL, USA) analizáltuk a sejt által megkötött radioaktivitás meghatározása céljából. A látszólagos disszociációs állandót (a Kd-t) és a kötőhelyek számát (az N-t) telítésnél számoltuk Scatchard szerint [Ann. N. Y. Acad. Sci. 51, 660-672 (1949)], miután levontuk a nem specifikus kötésből származó értéket (azaz csak az RIO-tápközegben való inkubálás során kapott értéket).
lnhibíciós mérési eljárás (a 125I-vel jelölt vad típusú SEA gátlása a SEA-mutánsokkal). Ezeket az inhibíciós kísérleteket kis módosítással úgy hajtottuk végre, ahogyan a direkt kötődési mérési eljárásban le van írva. Röviden, 50 pl 125I-vel jelölt vad típusú SEA-t inkubáltunk együtt kompetitíven feleslegben lévő jelöletlen vad típusú vagy mutáns SEA-val (50 pl/cső), 6 χ 104/l 00 pl Raji-féle sejthez való kötés céljából. A direkt kötődési mérési eljárásban kapott körülbelül 40% kötődött radioaktivitást eredményező nyomkövető koncentráció adott maximális érzékenységet az inhibíciós mérési eljárásban. A kompetitor helyettesítő kapacitását a kötött radioaktivitás 50%-os gátlását (IC50) eredményező koncentrációban fejeztük ki. A mutánsok kötési affinitását a vad típusú SEA-hoz viszonyítottuk a következő egyenlet alapján:
ICso[SEA(wt)]: IC50[SEA(m)]
Annak elemzése céljából, hogy a mutánsok kompetícióban vannak-e a Raji-féle sejtek ugyanazon kötőhelyeiért, mint a vad típusú SEA, a SEA-mutánsokkal kapott kötési adatokat log-log függvényként ábrázoltuk, és vizsgáltuk a vad típusú SEA ennek megfelelő adataival való párhuzamot.
lnhibíciós mérési eljárás (a fluoreszcensen jelölt vad típusú SEA kötődésének gátlása a jelöletlen vad típusú SEA-val és SEA mutánsokkal). Raji-féle sejteket
HU 221 254 Β1 (2,5 χ 105) inkubáltunk 37 °C-on 30 percig az inhibitorral (vad típusú vagy mutáns SEA; 0-6000 nM), amelyet 50 pl CO2-független tápközegben (Gibco cégtől szereztük be) hígítottunk, és 10% FCS-vel, glutaminnal és gentamycinnel egészítettük ki. Fluoreszceinel konjugált vad típusú SEA-t adtunk hozzá 30 nM végkoncentrációban, és a mintákat további fél órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on. A mintákat háromszor mostuk jéghideg PBS-el, amely 1% BSA-val volt kiegészítve (PBSBSA) és végül 0,4 ml PBS-BSA-ban, jégen tartottuk a felhasználásig. Mindegyik mintából 10 000 db élő sejtet vizsgáltunk zöld fluoreszcenciára „FACStar®” áramlási citometerben (a Becton Dickinson cég terméke), és az átlagos fluoreszcenciát „LYSIS II” programmal számoltuk ki.
SDCC- és SADCC-mérési eljárások SEA(wt)-re, SEA(m)-re és a C215Fab-vel létesített fúziós fehérjéikre
SDCC-mérési eljárások. A SEA(wt), SEA(m) és C215Fab-vel létesített fúzióinak II+-osztályú MHC-t hordozó Raji-féle sejtekkel szembeni citotoxicitását vizsgáltuk egy standard 4 órás 51Cr3+-felszabadulási mérési eljárásban, in vitro stimulált SEA-specifikus Tsejtvonalakat alkalmazva mint effektor sejtek. Röviden, 51Cr-vel jelölt Raji-féle sejteket inkubáltunk 2,5xlO3 sejt/0,2 ml tápközegben (RPMI, 10% FCS) mikrotiter-mérőtálcában definiált effektor/célsejt aránynál, a további komponensek jelenlétében vagy nélkül (kontroll). A százalékos specifikus citotoxicitást a következőképpen számoltuk:
100x[(cpm kísérleti felszabadulás - cpm háttérfelszabadulás)/(cpm összes felszabadulás - cpm háttér-felszabadulás)]. Az effektor/célsejt arány 30:1 volt a fúzionálatlan SEA-kra és 40:1 volt a fúziós fehérjékre.
Emberi vastagbél-eredetű ráksejtek elleni SADCCmérési eljárás. A C215Fab-SEA(wt), a C215FabSEA(m), a SEA(wt) és a SEA-mutánsok C215+-jelű II. osztályú MHC-t hordozó vastagbél-karcinómasejtek (SW 620) elleni citotoxicitását vizsgáltuk egy standard 4 órás 51Cr3+-felszabadulási mérési eljárásban, in vitro stimulált SEA-specifikus T-sejtvonalakat alkalmazva mint effektor sejtek. Röviden, 51Cr-vel jelölt SW 620sejteket inkubáltunk 2,5 χ 103 sejt/0,2 ml tápközegben (RPMI, 10% FCS) mikrotiter-mérőtálcában 30:1 effektor/célsejt aránynál, a további komponensek jelenlétében vagy nélkül (kontroll). A százalékos specifikus citotoxicitást úgy számoltuk, mint a SDCC-mérési eljárásban.
3. példa
In vivő funkcionális kísérletek
Ráksejtek
B16-F10-jelű melanomasejteket fertőztünk C215humán tumorspecifikus antigént kódoló cDNS-el (B16C215) [Dohisten és munkatársai, „Monoclonal antibody-superantigen fusion proteins: Tumor specific agents fór T cell based tumor therapy”; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, sajtó alatt (1994)], és addig tenyésztettük azokat, amíg a szomszédos sejtek szubkonfluensek lettek. A táptalaj RPMI 1640 volt (GIBCO cégtől szereztük be, Middlesex, UK), 5 χ 10~5 M β-merkaptoetanollal (Sigma cégtől szereztük be, St. Louis, MO, USA), 2 mM L-glutaminnal (GIBCO), 0,01 M HEPESsel (Biological Industries, Israel) és 10% magzati borjúszérummal (GIBCO) kiegészítve. A sejteket 0,02% EDTA-val történő rövid inkubációval választottuk el, és jéghideg sótartalmú foszfátpufferben szuszpendáltuk fel, amely 1% szingenetikus egérszérumot (hordozót) tartalmazott, végül 4χ 105 sejt/ml koncentrációra. Állatok és az állatok kezelése
A C57Bl/6-jelű 12-19 hetes egerek transzgenikusak voltak a T-sejt receptorának \^3-láncára [Dohlstein és munkatársai, Immunology 79, 520-527 (1993)]. Százezer B16-C215-tumorsejtet injektáltunk az állatok farki vénájába intravénásán 0,2 ml hordozóban. Az 1., 2. és a 3. napon C215Fab-SEA(wt)-t vagy C215Fab-SEA(D227A)-t kaptak az egerek intravénásán, 0,2 ml hordozóval az 6A. és 6B. ábrának megfelelő dózisban. A kontroliegerek csak hordozót kaptak ugyanilyen oltási beosztásban. 21 nappal a tumorsejtinjekció után az egereket elpusztítottuk cervikális diszlokációval, a tüdejüket eltávolítottuk, fixáltuk Bouin-féle oldatban és a tüdőmetasztázisok számát számoltuk.
Eredmények
A Staphylococcus-eredetű enterotoxin-A vizsgálata alaninra
Eredetileg a SEA szerkezete nem volt ismert, és csak találgattuk, mely oldalláncok vannak a felszínen. Ezért a mutánsok többségét homológ szuperantigének sorozatából választottuk ki [Marrack és Kepler, Science 248, 705-711 (1990)]. Konzervatív (többnyire poláros) csoportokat választottunk ki azon az alapon, hogy várhatóan bizonyos szuperantigének konzervatív módon kötődnek a HLA-DR-hez [Chitagumpala és munkatársai, J. Immunoi. 147, 3876-3881 (1991)]. Az alanin cseréi publikált stratégia szerint történtek [Cunningham és Wells, Science 244, 1081-1085 (1988)]. A munka során a következő ismeretekkel növekedett a tudásunk: i) bebizonyosodott, hogy a Zn2+ionnak fontos szerepe van a SEA és a II. osztályú MHC (HLA-DR) közötti kölcsönhatásban [Fraser és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5507-5511 (1991)], ii) bemutatásra került a Staphylococcuseredetű enterotoxin-B (SEB) mutációs analízise [Kappler és munkatársai, J. Exp. Med. 175, 387-396 (1992)], és iii) megismertük a SEB szerkezetét [Swaminthan és munkatársai, Natúré 359, 801-806 (1992)].
Első mutánsunknak meglehetősen csökkent affinitása volt a HLA-DR (D227A) felé, a Zn2+-iont nagyon gyengén koordinálta (az adatokat nem mutatjuk be). Feltételezve egy közönséges térszerkezetet az SEA-nak és a SEB-nek, az új adatok arra utaltak, hogy két II. osztályú MHC-kötőrégiójuk van; az egyik tartalmazza a Zn2+-iont, a másik egy SEB-ben található helynek felel meg. A második sorozat mutáció erre a feltevésre épült. A második sorozat mutánst az aminoterminálison egy glicinnel kiegészített SEA formájában expresszáltuk.
HU 221 254 Β1
Először kimutattuk, hogy a kiterjesztésnek nincs hatása a vad típusú SEA kötődési tulajdonságaira (lásd következő rész).
A mutánsok többségét E. coli-b&n expresszáltuk és szekretáltuk funkcionális formájukban, ahogyan ezt monoklonális ellenanyagok kötődésével igazoltuk is (I. táblázat). Az E154A/D156A- és az R160A-jelű mutánsokból nagyon keveset kaptunk. Ezért ezekkel nem dolgoztunk tovább. A 128., 187., 225. és 227. helyen Ala-szubsztitúciót kapott mutánsokat az ΙΕ-jelű monoklonális ellenanyag nem ismerte fel. A két utóbbi mutáns kismértékű expressziót mutatott (ami 34 °C-on még jobban látszódott, mint 24 °C-on) és SDS-PAGEban gyorsabban vándorolt, denaturáló, de nem redukáló körülmények között (az összes többi mutáns úgy vándorolt, mint a vad típusú SEA, ezt nem mutatjuk be). A CD-spektrum analízise alapján, a D227A-mutáns szerkezete kissé különbözhet a natív SEA-tól (2. ábra), de a stabilitása nagyon közel volt a vad típushoz (guanidin-hidrokloriddal előidézett denaturációval szembeni rezisztenciával mérve). A számított AAGérték a mutáns és a natív SEA között (SEA(wt)) 0,16 kcal/mol volt, és körülbelül 4%-a a AG “-értékeknek (az adatokat nem mutatjuk be). Egyszóval a jelek a CD-analízisben alacsonyak voltak, ahogyan azt a jórészt β-szerkezet következményeként vártuk. Friss eredmény, hogy a His225 koordinálja a Zn2+-iont [nem közölt adatok, Fraser és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5507-5511 (1991)]. Mivel az Asp227 is benne van a Zn2+-koordinációs helyben (lásd fent), és feltehetőleg ugyanabban a β-szerkezetben található, mint a His225, ez alátámasztja azt, hogy ez a két csoport alkotja a cink-kötőhelyet a zinket koordináló fehérjékben [Valié és Auld, Biochemistry 29, 5647-5659 (1990)].
Kötődés a II. osztályú MHC-hez és a T-sejt receptorához
AII. osztályú MHC-hez mutatott affinitást abból a mennyiségből számoltuk, amely szükséges volt a fluoreszceinjelölt vad típusú SEA-val való kompetícióra a nagy mennyiségű II. osztályú MHC-t tartalmazó Rajiféle sejtek felé. A mutáns leszorítási kapacitását abból a koncentrációból számoltuk, amely szükséges volt a kötött fluoreszcencia 50%-os inhibíciójához (IC50), a vad típusú SEA - mint kompetitor - ugyanilyen koncentrációjához viszonyítva. A vad típusú és néhány mutáns SEA-ra a fenti analízisben kapott értékeket olyan analízis eredményeihez hasonlítottuk, ahol 125I-radioaktív nyomkövetővel jelöltük a vad típusú SEA-t. Ahogyan a II. táblázatban látható, a kétféle analízisből kapott eredmények jó összhangban vannak.
A hat kiválasztott mutáns II. osztályú MHC-hez való kötődését közvetlenül 125I-vel jelölt mutáns SEA alkalmazásával mértük (II. táblázat). A H50A-jelű mutáns esetében a direkt kötődési mérési eljárásból kapott értékek és az inhibíciós mérési eljárások jól összhangban vannak, de az F47A-jelű mutáns esetében szembeszökő ellentmondást tapasztaltunk: a direkt kötődési mérési eljárás 7-szer gyengébb kötődést mutatott ki, mint a vad típusú SEA, amíg a kompetíciós analízis mindkét anyagra körülbelül 70-szer kisebb kötődést mutatott. A többi mutáns közül további kettő mérési adatai mutattak kétféle kötődési kölcsönhatást. A H225A- és a D227A-mutánsra az affinitás a detekciós limit alatt volt az analízisben.
Korábban már kimutattuk, hogy a karcinómareaktív ellenanyag Fab-fragmensét és a SEA-t tartalmazó fúziós fehérje a citotoxikus T-sejtek mozgósítása által ráksejtek specifikus lízisére alkalmazható, miközben a SEA és a T-sejt receptora (TCR) között olyan gyenge volt a kölcsönhatás, hogy detektálni sem lehetett [Dohisten és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, sajtó alatt]. Tehát az elszigetelt szuperantigénnel végzett analízisek ellenére, az Fab-fúziók lehetővé tesznek fúnkcionális mérési eljárásokat a SEA és a TCR közötti kölcsönhatás vizsgálatára, függetlenül a II. osztályú MHC-t kötő képességüktől. Ezért a különféle konjugátumok hatékonyságát a T-sejtek általi, az Fabrész által felismert sejtek lízisére krómfelszabadulási mérési eljárásban követhettük. Ez az analízis igazolta, hogy az olyan mutációk, amelyek befolyásolták a II. osztályú MHC-kötési képességet, nem befolyásolták a TCR-kötési képességet.
A mutációk biológiai hatása
A proliferatív hatást a perifériás limfocitákat osztódásra stimuláló képesség alapján mértük. Az a három mutáns, amelyik nagyon gyenge kompetíciót mutatott a
II. osztályú MHC-antigének irányában, alig vagy egyáltalán nem indukált proliferációt, a közepes kompetíciót mutató H187A-mutánsnak volt valamekkora proliferatív kapacitása, míg a többi vizsgált mutáns nem volt megkülönböztethető a vad típustól (III. táblázat). Hamis és munkatársai [Infect. Immun. 61, 3175-3183 (1993)] közelmúltban megjelent közleményükben az F47G- és az L48G-jelű SEA-mutánsok által kiváltott, T-sejt-stimulációs aktivitásban szintén jelentős csökkenést kaptak. Világosan látszik, hogy a két feltételezett kötőrégió méretének drasztikus csökkentése jelentős változást okoz a proliferáció indukálásában. Ez arra utal, hogy a SEA keresztköt két molekula II. osztályú MHC-antigént, amely a TCR dimerizációjához vezet, és ez az, ami szükséges a szignáltranszdukció kiváltásához.
Ezzel ellenkezőleg, a különböző mutánsok hatásfoka az in vitro stimulált SEA-T-sejtek általi, II. osztályú MHC-antigéneket hordozó célsejtek lizálására inkább a kötési affinitással van korrelációban, mint a kompetícióval (III. táblázat). Például az F47A- és a D227A-jelű mutáns hatékonysága csak 2,5-ére, illetve 300-adára csökkent, sorrendben. Tehát nyilvánvaló, hogy nincs lényegi szerkezeti követelmény a divalenciára sem. Az aktivált T-sejtek felszínén lévő TCR-ok szignifikánsan nagyobb számából következő multivalencia növekedése részlegesen megszüntetheti az alacsony aviditás hatását a SEA/II. osztályú MHC-kölcsönhatásban. Ez a dimerizáció nem szükséges a T-sejt általi citotoxicitás irányításához, amelyet előzőleg már demonstráltunk karcinómaspecifikus bifünkcionális ellenanyagok alkalmazásával, ahol az ellenanyagok egy CD3-kötőhelyet
HU 221 254 BI (anti-CD3) és egy karcinómaspecifikus kötőhelyet (antikarcinóma) tartalmaztak [Renner és munkatársai, Science 264, 833-835 (1994)].
In vivő funkcionális kísérletek
Az eredményeket a 6A. és a 6B. ábrán mutatjuk be. Egerek C215Fab-SEA(wt)-vel és C215FabSEA(D227A)-val való kezelése mindkét esetben igen hatásos volt a tüdőmetasztázis B16-C215-melanómasejtjeinek csökkentésében. A terápiás hatás lényegében azonos volt a célzó szuperantigén mindkét variációja esetén. A C215Fab-SEA(wt)-vel történő kezelés esetén a letalitás 70%-os volt 5 pg/injekciós dózisnál. Ezzel ellentétben, a C215Fab-SEA(D227A) ugyanilyen dózisban való alkalmazása esetén egy egér sem pusztult el. Összefoglalva, a SEA(D227A)-mutáns egy példa a csökkent toxicitásra és a megőrzött terápiás hatásra, ha Fab-SEA-fiiziós fehérjébe épül.
Diszkusszió
A SEB és a HLA-DR közötti komplex szerkezetét nemrégen publikálták [Jardetzky és munkatársai, Natúré 368, 711-718 (1994)]. A kölcsönhatásban résztvevő beazonosított SEB-csoportok többsége megegyezik a SEA konzervatív csoportjaival. A D227A-mutáns adatai gyenge affinitást mutatnak a SEA-ban lévő kötőhely (az aminoterminális melletti hely) és a II. osztályú MHC-antigén közötti kölcsönhatásban, mivel a Kdértéke nagyobb, mint 8 μΜ. A SEB és a HLA-DR közötti kölcsönhatás Kd-értéke egy nemrégi közlemény alapján 1,7 μΜ [Seth és munkatársai, Natúré 369, 324-327 (1994)]. A SEB, TCR és HLA-DR közötti különböző kölcsönhatásokat vizsgáltuk, és megállapítottuk, hogy a SEB és a HLA-DR közötti komplex nem volt stabil TCR nélkül tartva. Plazmarezonanciakísérletek azt mutatták, hogy ennek oka a nagyon gyors disszociációs sebesség volt. Ha a SEA keresztköt két molekula II. osztályú MHC-t, és a TCR azt követő dimerizációjakor kapott aviditási hatások megmagyarázhatják, hogy a SEA jóval a Kd-érték alatti koncentrációban is indukálhat proliferatív hatásokat. Feltéve, hogy az F47A-ban lévő mutáció az amino-terminálishoz közeli hely affinitását a szignifikáns alá csökkenti, a Zn2+-kötőhely Kd-értéke 95 nM körül van. Ezt a hipotézist nemrégiben erősítette meg az a megfigyelés, hogy az F47R-, F47R7H50A- és F47R/L48A/H50D-jelű mutánsok az F47A-val megegyező affinitást mutattak a II. osztályú MHC-antigének irányában (nem közölt eredmények).
A SEB szerkezete és homológiavizsgálatok alapján jó okunk van azt feltételezni, hogy a His225- és az Asp227-aminosav ugyanabban a β-szerkezetben található, és így az oldalláncok szomszédosak lehetnek. így valószínűleg ez a két csoport alkotja a cinket koordináló fehérjék cinkkötőhelyét [Vallee és Auld, Biochemistry, 29, 5647-5659 (1990)]. Ezekhez a mutánsokhoz hasonlóan, a 128. és a 187. helyen történt aminosavcserét tartalmazó mutánsokat felismeri az összes monoklonális ellenanyag, kivéve az ΙΕ-jelű. Fraser és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5507-5511, (1991)] kimutatták, hogy a Zn2+-ion a SEA-hoz kötődik és szükséges a II. osztályú MHC-antigénekkel szembeni kölcsönhatás nagy affinitásához. A cinkhez való affinitásra nincs hatással a HLA-DR hozzáadása. Erre a megfigyelésre és a Zn2+-ion felé mutatott nagy affinitásra (a Kd-érték körülbelül 1 μΜ) alapozva feltételezhetjük, hogy a koordinációt kizárólag a SEA hozza létre, 4 koordinációs kötéssel. Adataink azt mutatják, hogy a kötésben résztvevő négy csoport: N128, Hl87, H225 és D227. Az első két csoport funkciója még nem világos; egy ligand biztosítása helyett az N128 segíthet a D227 deprotonálásában. Ennek alátámasztásához egy érv lehet, hogy a D227 cseréjének hatása sokkal komolyabb, mint a H225 cseréje volt.
Korábban már közlemény tárgya volt, hogy nincs korreláció a különböző szuperantigének II. osztályú MHC-antigének felé mutatott affinitása és a T-sejteket proliferációra stimuláló kapacitása között [Chintagumpala és munkatársai, J. Immunoi. 147, 3876-3881 (1991)]. Ezek az eredmények részben megmagyarázhatók a szuperantigének különböző TCR νβ-láncok irányában mutatott különböző affinitásával. Mi ugyanígy a korreláció hiányát állapítottuk meg, de a különálló szuperantigénekkel ellentétben, a mutánsoknak egyforma TCR-affinitásuk volt, ahogyan azt az Fab-SEA összefüggésében már megmutattuk (SADCC-ként mérve). A legvalószínűbb magyarázat a korreláció hiányára az, hogy az analízisben azonosított két kötőrégió két elkülönült kötőcsoportnak felel meg, amely nemcsak kooperatív kötést eredményez, hanem két molekula II. osztályú MHC-antigén keresztkötését eredményezi, amely viszont a T-sejt-receptor két molekulájának dimerizációjához vezet. Ez magában foglalhatja azt is, hogy mindkét kötőhely fontos a proliferatív hatás kiváltásában. A nagy aviditás a két molekula SEA-t, TCR-t és II. osztályú MHC-antigént tartalmazó hexamer komplexben lévő kölcsönhatásokból következik, így a SEA II. osztályú MHC-antigének felé kifejtett magas affinitása/aviditása lehetővé teszi a TCR-rel való kölcsönhatás kialakítására az alacsony affinitás ellenére.
Más biospecifikus affinitással rendelkező partnerek
A SEA(D227A) és a Staphylococcus-erzáeőa protein-A IgG-kötő doménjéből álló fúziós fehérjét rekombináns technológiával termeltettük és expresszáltuk E. coliban. Ezt a reagenst sikeresen alkalmaztuk Mot-4 és CCRF-CEM-sejtek (ATCC-től szereztük be) T-limfociták általi megcélzására, amelyek CD7és CD38-pozitívak, de HLA-DP, -DQ és -DR-negatívak voltak. A Mot-4 és CCRF-CEM-sejteket előinkubáltuk anti-CD7-el vagy anti-CD38 egérben termeltetett monoklonális ellenanyaggal (Dianova cégtől származott, Hamburg, Germany). Az egéreredetű monoklonálisok és a fúziós fehérje IgG-kötőrésze közötti kötési erősség megnövelése érdekében nyúlban termeltetett antiegér-Ig -ellenanyagot adtunk még hozzá.
A protein-A-SEA(wt)- és a protein-A-SEA (D227A)-hoz hasonlítva, kisebb a II. osztályú MHCantigént hordozó Daudi-féle sejtekhez kötődő képessége.
HU 221 254 Bl
I. táblázat
A mutánsok strukturális integritásának igazolása. Hat monoklonális ellenanyag kötődését vizsgáltuk.
Mutánsok Monoklonális ellenanyag
1A 2A 3A IE 4E EC-A1
vad típus + + + + 4- 4
D11A/K14A + + + + + +
D45A + + 4- + 4- +
F47A + + + + 4- 4
H50A (+) + (+) + + +
K55A + + + 4- 4- 4
H114A + 4“ + + + +
K123A/D132G + 4- 4- + 4
N128A + + + - 4 4-
K147A/K148A + 4- + + - 4
E154A/D156A ND ND ND 4- ND ND
R160A ND ND ND 4- ND ND
H187A + 4- + - 4- 4
E191A/N195A + + + + + +
D197A + 4- 4- 4 +
H225A + + + - 4 4
D227A + + + - 4 4
Lábjegyzetek: A plusz jel jelzi a kötődést, a zárójel 50-90%-os kötődést jelent, ha a vad típusé a 100%. ND azt jelenti, hogy nem határoztuk meg.
II. táblázat
SEA-mutánsok kötődése a II. osztályú MHC-antigénekhez és a T-sejt receptorához. Ez utóbbit az aktivált citotoxikus T-sejteket a karcinóma sejtek specifikus lizisére irányító hatásaként ábrázoltuk, a különböző mutációk Fab-SEA-fúzióinak alkalmazásával (SADCC).
Mutánsok IC50(nM) IC50(nM) Kd(nM) SADCC
SEA-FITC l25I-SEA 125(. (a vad típus jelölt %-a)
vad típus 50 38 13 1002
Gly-SEA 50 ND ND 1002
D11A/K14A 50 ND ND ND
D45A 53 ND ND ND
F47A 3150 2943 95 100
H50A 150 132 32 100
K55A 44 ND ND ND
H114A 48 ND ND ND
K123A/D132G 188 75 12/237 100
N128A 1150 ND 2,9/76 100
K147A/K148A 58 ND ND ND 1
H187A 1030 602 97 100
E191A/N195A 51 ND ND ND 1
D197A 78 ND ND ND
H225A >9000 9600 ND ND 1
D227A >9000 >10 000 >8000 íoo 1
Lábjegyzetek : 1) ND azt jelenti, hogy nem határoztuk meg.
2) Az Fab-SEA esetében a távtartó a CH1 és a SEA között Gly-re végződik.
HU 221 254 Β1
III. táblázat
A mutánsok biológiai hatása. A nyugvó T-sejtek proliferációra való stimulálását és citotoxikus T-sejteket a II. osztályú MHC-antigéneket tartalmazó sejtek lizisére irányító hatásaként ábrázoltuk (SDCC=szuperantigénfüggő közvetített celluláris toxicitás).
Mutánsok Proliferáció SDCC
(%) EC50
(relatív)
vad típus 100 1
Gly-SEA ND 1
D11A/K14A ND 0,8
D45A 50 L3
F47A <0,2 2,5
H50A 20 1,4
Κ55Λ 100 1,3
H114A ND 1
K123A/D132G 40 2,1
N128A 40 1,2
K147A/K148A ND 0,7
E154A/156A ND ND
R160A ND ND
H187A 15 4
E191A/N195A 100 1,1
D197A ND 1,3
H225A <0,2 3xl02
D227A <0,01 3xl02
Lábjegyzet: ND azt jelenti, hogy nem határoztuk meg.
Az ábrák jelmagyarázata:
Általánosságban: A SEA(D227A) (=SEA(m9) vagy m9-mutáns) volt az elsőbbség évében a legígéretesebb SEA-variáns. Ezért az in vitro és in vivő eredmények bemutatásához ezt a variánst választottuk (3-6. ábrák).
1. ábra
A SEA és a C215Fab-SEA expresszálására alkalmazott plazmid vázlatos rajza. A kódoló régiókat és a termék génjét követő két transzkripciós terminációs kodonokat jelöltük meg a keretezéssel. A kanamycinrezisztenciáért felelős fehérjét kódoló gént Km-el jelöltük. A „lacl” a lac-represszor-gén. A VH és a Cnl az egéreredetű C215-ellenanyag nehéz láncának Fd-ffagmensét kódoló gén. Ehhez hasonlóan a VK és a CK a kappaláncot kódoló gént jelöli. A „rop” a pBR322-plazmidból való replikációs kontrollfehérjét kódoló gén. A termékek génjeinek transzkripcióját vezérlő promotereket nyilakkal jelöltük, a pKP889-plazmidban a „trc”-promoter és a másik két vektorban a Staphylococcuseredetű protein-A promotere („spa”). A replikációs origót tartalmazó régiót „őri”-val jelöltük. Az egyetlen különbség a SEA-t kódoló pKP943- és pKP1055-plazmid között, hogy az utóbbi N-terminálisához egy glicin-csoport van kapcsolva. Az utóbbi vektorban lévő SEA-gén szintén tartalmaz több egyedi restrikciós hasítóhelyet, amely csendes mutációval lett beépítve.
2. ábra
A vad típusú SEA és az F47A- és D227A-mutánsok cirkuláris dikroizmus spektruma, amely a II. osztályú MHC-antigéneket kötő régiójukban leginkább redukált mutánsokat mutatja be. A folytonos vonal a vad típusú SEA görbéje. Az F47A-mutáns görbéje a szaggatott vonal, a D227A-mutáns görbéje a pontvonal.
3. ábra
A szuperantigénfüggő közvetített celluláris citotoxicitás (SDCC) koncentrációfüggését mutatja be SEA(wt) és SEA(D227A) esetén.
4. ábra
A szuperantigénfüggő közvetített celluláris citotoxicítás (SDCC) koncentrációfüggését mutatja be C215FabSEA(wt) és C215Fab-SEA(D227A) esetén.
5. ábra
A szuperantigénfüggő közvetített celluláris citotoxicitás (SDCC) koncentrációfüggését mutatja be C215FabSEA(wt) és C215Fab-SEA(D227A) esetén, a szabad SEA(wt)-hez hasonlítva.
6A. ábra mutatja be a C215Fab-SEA(wt) és C215FabSEA(D227A) terápiás hatásának összehasonlítását a B16-C215-jelű melanómasejteket hordozó C57B1/6jelű egerek tüdőmetasztázisára.
6B. ábra a C215-SEA(wt) és a C215-SEA(D227A) toxieitását mutatja be a 6A. ábrán bemutatott kezelés esetén.

Claims (11)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Konjugátum, amely
    a) egy előre meghatározott, betegséggel asszociált sejtfelszíni struktúrához kötődni képes, biospecifikus affinitással bíró partnermolekulát és
    b) egy peptidet tartalmaz, amely peptid
    i) tartalmaz egy szuperantigénből származó aminosavszekvenciát;
    ii) képes kötődni egy T-sejt-receptor νβ-láncához, és iii) mutáltatva van, miáltal - ahhoz a szuperantigénhez viszonyítva, amelyből a peptid származik - csökkent mértékben képes kötődni a II. osztályú MHC-antigénekhez, és a konjugátum felsorolt alkotórészei kovalensen vannak egymáshoz kapcsolva.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti konjugátum, amely képes T-limfocitákat azon sejtek lizálására aktiválni, melyek felszínén a sejtfelszíni struktúra található.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a biospecifikus affinitással bíró partnermolekula rákbetegséggel, vírusfertőzéssel, autoimmun-megbetegedéssel vagy parazitafertőzéssel asszociált sejtfelszíni struktúrához képes kötődni.
    HU 221 254 Β1
  4. 4. A 3. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a biospecifikus affinitással bíró partnermolekula rákbetegséggel asszociált sejtfelszíni struktúrához képes kötődni.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a biospecifikus affinitással bíró partnermolekula polipeptidszerkezetet tartalmaz.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a biospecifikus affinitással bíró partnermolekula és a peptid össze van fuzionáltatva egymással.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti konjugátum, amely biospecifikus affinitással bíró partnermolekulaként ellenanyagot vagy annak antigénkötő fragmensét tartalmazza.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti konjugátum, ahol a szuperantigén - a II. osztályú MHC-antigénekhez történő kötődéshez - cinkionokat igényelő szuperantigén.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti konjugátum, ahol a szuperantigén a Staphylococcus-vcedetíi enterotoxin-A (SEA).
  10. 10. A 9. igénypont szerinti konjugátum, ahol a szuperantigén - a II. osztályú MHC-antigénekhez történő kötődéskor a cinket koordináló egyik aminosavat kó dőlő kódonban - mutáltatott SEA.
  11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, emlősök olyan kóros állapotának kezelésére történő alkalmazásra, amelyre jellemző az állapottal - betegségspecifikus sejtfelszíni struktúra expressziója útján - asszociált specifikus sejtek jelenléte, és amely konjugátumban a biospecifikus affinitással bíró partnermolekula affinitása a betegségspecifikus sejtfelszíni struktúra ellen irányul.
HU9700063A 1994-07-11 1995-06-07 A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate HU221254B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9402430A SE9402430L (sv) 1994-07-11 1994-07-11 Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
PCT/SE1995/000681 WO1996001650A1 (en) 1994-07-11 1995-06-07 A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT77257A HUT77257A (hu) 1998-03-02
HU221254B1 true HU221254B1 (en) 2002-09-28

Family

ID=20394684

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9700063A HU221254B1 (en) 1994-07-11 1995-06-07 A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate

Country Status (27)

Country Link
US (3) US7226601B1 (hu)
EP (1) EP0766566B1 (hu)
JP (1) JP4175489B2 (hu)
KR (1) KR100377506B1 (hu)
CN (1) CN1089606C (hu)
AT (1) ATE200626T1 (hu)
AU (1) AU699147B2 (hu)
CA (1) CA2194673C (hu)
DE (1) DE69520739T2 (hu)
DK (1) DK0766566T3 (hu)
ES (1) ES2158950T3 (hu)
FI (1) FI118150B (hu)
GR (1) GR3036187T3 (hu)
HK (1) HK1012226A1 (hu)
HU (1) HU221254B1 (hu)
IL (1) IL114445A (hu)
MY (1) MY112916A (hu)
NO (1) NO320151B1 (hu)
NZ (1) NZ289951A (hu)
PL (1) PL180747B1 (hu)
PT (1) PT766566E (hu)
RU (1) RU2183215C2 (hu)
SE (1) SE9402430L (hu)
TW (1) TW413636B (hu)
UA (1) UA73067C2 (hu)
WO (1) WO1996001650A1 (hu)
ZA (1) ZA955746B (hu)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
SE9601245D0 (sv) * 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
TW517061B (en) 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
AU748097B2 (en) * 1997-07-21 2002-05-30 Active Biotech Ab Directed cytolysis of target cells, agents and compositions causing cytolysis, and compounds that can be used to produce the agents
DE19827837A1 (de) * 1998-06-23 1999-12-30 Ernst Gleichmann Universell an Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle der Klasse II bindende Peptide zur prädiktiven Testung, Diagnostik, Prophylaxe und Therapie von Sensibilisierungen gegen Chemikalen
US7491402B2 (en) 1998-12-24 2009-02-17 Auckland Uniservices Limited Superantigens SMEZ-2, SPE-G, SPE-H and SPE-J and uses thereof
SE0102327D0 (sv) * 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
GB0118155D0 (en) * 2001-07-25 2001-09-19 Lorantis Ltd Superantigen
NZ519371A (en) 2002-06-04 2004-11-26 Auckland Uniservices Ltd Immunomodulatory constructs and their uses
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
SE0402025D0 (sv) * 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
US20080274133A1 (en) * 2004-11-18 2008-11-06 Avidex Ltd. Soluble Bifunctional Proteins
KR20130108481A (ko) * 2005-08-19 2013-10-02 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CN102516392B (zh) * 2011-11-25 2014-05-28 孙嘉琳 一种癌靶向超抗原融合蛋白及制备方法及用途
WO2014025199A2 (ko) * 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도
WO2017122098A2 (en) 2016-01-10 2017-07-20 Neotx Therapeutics Ltd. Methods and compositions for enhancing the potency of superantigen mediated cancer immunotherapy.
US11583593B2 (en) 2016-01-14 2023-02-21 Synthis Therapeutics, Inc. Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses
WO2020013803A1 (en) * 2018-07-09 2020-01-16 Synthis, Llc Antibody-alk5 inhibitor conjugates and their uses
KR20220009428A (ko) 2019-05-15 2022-01-24 네오티엑스 테라퓨틱스 엘티디. 암 치료
IL296103A (en) 2020-03-05 2022-11-01 Neotx Therapeutics Ltd Methods and preparations for treating cancer with immune cells
WO2023215560A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Atoosa Corporation Tumor cell/immune cell multivalent receptor engager – bio-nanoparticle (timre-bnp)

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3627644A (en) 1968-03-01 1971-12-14 Hajime Okamoto Process for the cultivation of hemolytic streptococci
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
US4268434A (en) 1979-01-09 1981-05-19 Higerd Thomas B Immunosuppressive extracellular product from oral bacteria
US5091091A (en) 1981-11-06 1992-02-25 Terman David S Protein A perfusion and post perfusion drug infusion
US4699783A (en) 1983-03-11 1987-10-13 Terman David S Products and methods for treatment of cancer
US4681870A (en) 1985-01-11 1987-07-21 Imre Corporation Protein A-silica immunoadsorbent and process for its production
IT1192014B (it) 1986-06-27 1988-03-31 Rubinetterie Mariani Spa Becco di erogazione per lavabo o simile apparecchio idraulico con comando del salterello
US4980160A (en) 1986-10-16 1990-12-25 Biogen, Inc. Combinations of tumor necrosis factors and anti-inflammatory agents and methods for treating malignant and non-malignant diseases
ES2058538T3 (es) 1988-07-22 1994-11-01 Imre Corp Compuestos de proteina a purificados y procedimiento para su preparacion.
SE8903100D0 (sv) 1989-09-20 1989-09-20 Pharmacia Ab New pharmaceutical agent
US6126945A (en) * 1989-10-03 2000-10-03 Pharmacia Ab Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
DE69133484T2 (de) 1990-01-17 2006-05-18 Terman, David S., Pepple Beach Verwendung von Staphylococcus-Enterotoxinen oder verwandte Verbindungen für Krebs-Therapie
JP3334130B2 (ja) * 1990-07-20 2002-10-15 フアルマシア・アクチエボラーグ 抗体接合体
US6197299B1 (en) * 1990-07-20 2001-03-06 Pharmacia & Upjohn Ab Antibody conjugates
US5858363A (en) * 1990-07-20 1999-01-12 Pharmacia & Upjohn Ab Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
WO1993024136A1 (en) * 1991-01-17 1993-12-09 Terman David S Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
JPH08500328A (ja) 1992-01-28 1996-01-16 ナショナル ジューイッシュ センター フォア イミュノロジィ アンド レスパラトリィ メディスン 突然変異したスーパー抗原の保護作用
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
SE9601245D0 (sv) * 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
SE0102327D0 (sv) * 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy

Also Published As

Publication number Publication date
FI118150B (fi) 2007-07-31
NO320151B1 (no) 2005-10-31
ZA955746B (en) 1996-02-20
UA73067C2 (en) 2005-06-15
CA2194673C (en) 2009-08-04
PL318162A1 (en) 1997-05-26
AU2994095A (en) 1996-02-09
PL180747B1 (pl) 2001-04-30
NO970108D0 (no) 1997-01-10
HK1012226A1 (en) 1999-07-30
US7226601B1 (en) 2007-06-05
JPH11500407A (ja) 1999-01-12
KR100377506B1 (ko) 2003-06-11
HUT77257A (hu) 1998-03-02
US20050260215A1 (en) 2005-11-24
JP4175489B2 (ja) 2008-11-05
GR3036187T3 (en) 2001-10-31
ES2158950T3 (es) 2001-09-16
FI970100A (fi) 1997-01-10
US20060062795A1 (en) 2006-03-23
WO1996001650A1 (en) 1996-01-25
DE69520739D1 (de) 2001-05-23
PT766566E (pt) 2001-09-28
AU699147B2 (en) 1998-11-26
IL114445A0 (en) 1995-11-27
EP0766566B1 (en) 2001-04-18
SE9402430D0 (sv) 1994-07-11
CA2194673A1 (en) 1996-01-25
TW413636B (en) 2000-12-01
FI970100A0 (fi) 1997-01-10
NZ289951A (en) 1998-12-23
RU2183215C2 (ru) 2002-06-10
EP0766566A1 (en) 1997-04-09
CN1152877A (zh) 1997-06-25
NO970108L (no) 1997-02-20
DE69520739T2 (de) 2001-09-20
SE9402430L (sv) 1996-01-12
MY112916A (en) 2001-10-31
ATE200626T1 (de) 2001-05-15
CN1089606C (zh) 2002-08-28
IL114445A (en) 1999-09-22
DK0766566T3 (da) 2001-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20050260215A1 (en) Conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate
RU2198895C2 (ru) Конъюгат, обладающий способностью активировать иммунную систему, и фармацевтическая композиция, включающая указанный конъюгат
AU2005270336B2 (en) Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
JP4114951B2 (ja) 改変／キメラスーパー抗原およびその使用
JP4056543B2 (ja) 非抗原性即素複合体およびインターナライジング受容体システムの融合タンパク
JP2005507870A (ja) 低毒性のインターロイキン−２突然変異体
WO2009110944A1 (en) Modified toxins
JP2019501973A (ja) スーパー抗原媒介性癌免疫療法の能力を増強するための方法および組成物
WO1998037178A1 (en) Immunomodulatory polypeptides derived from the invariant chain of mhc class ii
JP2022531978A (ja) 癌治療
Svennerholm et al. Potential of genetically engineered anti-ganglioside GD2 antibodies for cancer immunotheraphy

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: ACTIVE BIOTECH AB, SE

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees