FI118150B - Muunnetun superantigeenin ja kohdetta etsivän yhdisteen välinen konjugaatti ja konjugaatin käyttö - Google Patents

Muunnetun superantigeenin ja kohdetta etsivän yhdisteen välinen konjugaatti ja konjugaatin käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI118150B
FI118150B FI970100A FI970100A FI118150B FI 118150 B FI118150 B FI 118150B FI 970100 A FI970100 A FI 970100A FI 970100 A FI970100 A FI 970100A FI 118150 B FI118150 B FI 118150B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
sea
conjugate
superantigen
binding
cells
Prior art date
Application number
FI970100A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI970100A (fi
FI970100A0 (fi
Inventor
Lars Abrahamsen
Per Bjoerk
Mikael Dohlsten
Terje Kalland
Original Assignee
Active Biotech Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Active Biotech Ab filed Critical Active Biotech Ab
Publication of FI970100A publication Critical patent/FI970100A/fi
Publication of FI970100A0 publication Critical patent/FI970100A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI118150B publication Critical patent/FI118150B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

5 118150
Muunnetun superantigeenin ja kohdetta etsivän yhdisteen välinen konjugaatti ja konjugaatin käyttö - Konjugat mellan en modifierad superantigen och en mälsökan-de förening samt användning av konjugatet ;
Superantigeenit ovat ensisijaisesti virus-tai bakteeriperäisiä proteiineja ja ne kyke- \ i nevät samanaikaisesti sitoutumaan msäkässolujen pinnalla oleviin MHC-class II- '*! antigeeneihin ja T-solureseptorin νβ-ketjuun. Sitoutuminen johtaa T-lymfosyyttien aktivoitumiseen ja MHC-class II-antigeeneja kantavien solujen hajoamiseen. Vp- i, 10 ketjun sitovan osan polymorfian vaatimaton aste aiheuttaa sen, että suhteellisen suuri .
osa T-lymfosyyteistä aktivoituu joutuessaan kosketuksen superantigeenin kanssa (verrattuna aktivoitumiseen normaalin antigeeniprosessin kautta).
Alunperin superantigeenikäsite liitettiin erilaisiin stafylokokkienterotoksiineihin 15 (SEA, SEB, SECi, SEC?, SED ja SEE). Äskettäin on löydetty eräs uusi SEH-nimi-nen stalylokokkienterotoksiini [Keyong et ai, J. Exp. Med. 180 (1994) 1675-1683]. Kiinnostuksen herättyä löydettiin lisää superantigeeneja. Esimerkkejä ovat muun muassa toksisen sokkioireyhtymän toksiini 1 (TSST-1), eksfoliaatiotoksiinit (Exft), ;- jotka liittyvät hilseilevään ihosyndroomaan, streptokokin pyrogeeninen eksotoksiini 20 A, B ja C (SPE A, B ja C), hiiren maitorauhaskasvainvirusproteiinit (MMTV), streptokokin M-proteiinit, Clostridium perfringens -enterotoksiini (CPET). Katsauk- _ sen saamiseksi superantigeeneista ja niiden ominaisuuksista katso Kotzin et ai [Adv. 1, O Immunol. 54(1993)99-166], , • * · · • * * · -λ • · * *:··: 25 Pseudomonas-eksotoksiini A:ta on pidetty funktionaalisena superantigeenina, koska :***: on saatu tuloksia, jotka osoittavat, että lisäsolut voivat prosessoida tätä toksiinia so- ··· lunsisäisesti paloiksi, jotka ilmentyvät solun pinnalla ja kykenevät sitoutumaan Vp-ketjuun ja sen jälkeen aktivoimaan T-soluja. [Pseudomonas exotoxin A. Legaard et ai, Cell Immunol. 135 (1991) 372-382].
30 ;
Superantigeeneja on sellaisenaan ehdotettu käytettäväksi erilaisten sairauksien hoi-.. dossa niiden parantavan vaikutuksen toteutuessa immuunijärjestelmän yleisen akti- voitumisen kautta [Kalland et ai, WO 9104053; Terman et ai, WO 9110680; Ter- r *·| . man et ai, WO 9324136; Newell et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 1074- — : 35 1078], • · · • * • * -> ··*
Rokotteiden yhteydessä on ehdotettu käytettäväksi superantigeeneja, jotka on muta- • * • · · ····»' * * 2 · f 118150 toitu niin, että ne menettävät TCR-sitoutumiskykynsä (Kappler & Marrack, WO 9314634).
Superantigeenien mutaatiota on kuvattu aikaisemmin [Kappler & Marrack, WO 5 9314634; Kappler et ai, J. Exp. Med. 175 (1992) 387-396; Grossman et ai, J. Im munol. 147(1991)3274-3281; Hufnagle et ai, Infect. Immun. 59 (1991) 2126-2134], \
Me itse olemme ehdottaneet aikaisemmin käytettäväksi hoitotarkoituksiin superanti-
10 geenin ja vasta-aineen konjugaatteja sellaisten solujen hajottamiseksi, jotka ilmentä- I
vät rakennetta, jota vastaan vasta-aine suuntautuu (Dohlsten et ai, WO 9201470;
Lando et ai, Cancer Immunol. Immunother. 36 (1993) 223-228; Kalland et ai, Med. *
Oncol. Tumor Pharmacother. 10 (1993) 37-47; Lando et ai, J. Immunol. 150 (8 part 2) (1993) 114A [Joint Meeting of the American Association of Immunologists and 15 the Clinical Immunology Society, Denver, Colorado, USA, toukokuu 21-25 (1993)];
Lando etal, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. Annu. Meet. 33(0) (1992) 339 [Annual
Meeting of the American Association for Cancer Research, San Diego, Kalifornia, USA, toukokuu 20-23 (1992)]; Dohlsten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 9287-9291)}. Sairauksia, joihin hoitoa on ehdotettu, ovat olleet syövät, viru- f 20 sinfektiot, loistartunnat, autoimmuunisairaudet ja muut taudit, jotka liittyvät soluihin, jotka ilmentävät taudille spesifisiä pintarakenteita. Kokeellinen työ on keskittynyt ^ tähän asti konjugaatteihin, jotka sisältävät rekombinantti-SEA:ta ja erilaisia syövän- ... vastaisia vasta-aineita. Konjugaateilla on sellaisenaan ollut jokseenkin vähäinen kyky **;·.* sitoa MHC-class II -antigeenejä verrattuna superantigeenin konjugoimattomaan * * *···] 25 muotoon. Ei ole määritetty, onko heikompi MHC-class TI-antigeenin sitomiskyky : eduksi vai ei optimaalisen hajoamisen ja optimaalisen terapeuttisen vaikutuksen ai- * it» kaansaamiselle.
t · * • ·: :V: Immuunihoitokokeita tuumorispesifiseen anti-idiotyyppivasta-aineeseen kemiallisesti 30 konjugoidulla SEB:llä ovat aikaisemmin kuvanneet Ochi et ai. [J. Immunol. 151 v
(1993) 3180-3186], J
:*,4 Etuoikeushakemuksen käsittelyn aikana Ruotsin patenttivirasto on lisäksi viitannut ]·:* artikkeliin Buelow et ai, [J. Immunol. 148 (1992) 1-6], jossa kuvataan proteiini A:n « · 35 ja SEB-fragmenttien välisiä fuusioita korostamatta MHC-class ll:n sitomista tai fuu- f sion käyttöä solujen tappamiseen; ja artikkeliin Hartwig et ai [Tnt. Immunol. 5 ; • · · (1993) 869-875], jossa kuvataan mutaatioita, jotka vaikuttavat streptokokin crytro- r * · ,··♦. geenisen toksiini A-superantigeenin ei-fuusioituneen muodon kykyyn sitoutua * *·· ·»·· * · 3 118150 ΐ
Ml IC-class II-antigeeniin. -
Keksinnön tavoitteet
Keksinnön ensimmäisenä tavoitteena on parantaa aikaisemmin tunnettuja superanti-5 geeni-vasta-ainekonjugaatteja koskien yleistä immuunijärjestelmän stimulointia ver- 1 sus suunnattu sytotoksisuus. Stimuloinnin tuloksena T-lymfosyytit aktivoituvat ja stimulointi riippuu superantigeenin kyvystä sitoutua sekä T-solureseptoriin että MHC-class II -antigeeniin.
-Ai 10 Keksinnön eräänä toisena tavoitteena on tuoda käyttöön biospesifisen affiniteetin j vastinosien (esimerkiksi vasta-aineiden) ja superantigeenien, joilla on muunnettu affiniteetti MHC-class 11 -antigeeneihin, välisiä konjugaatteja. Tämän on nyt osoitettu parantavan solujen, jotka ilmentävät pinnallaan antigeeniä (jota kohtaan konju-gaatin vasta-aine/biospesifisen affiniteetin vastinosa on suunnattu), selektiivisyyttä 15 superantigeenin vasta-aineesta riippuvaa solun sytolyysin (SADCC) suhteen verrattuna muihin soluihin, jotka ilmentävät MHC-class 11-antigeenia.
Keksinnön kolmantena tavoitteena on tuoda käyttöön konjugaatteja, joita voidaan käyttää tehoaineena nisäkkäiden, jotka sairastavat syöpää, autoimmuunitauteja, lois-20 tartuntoja, virusinfektioita tai muita sairauksia, jotka liittyvät soluihin, jotka pinnallaan ilmentävät rakenteita, jotka ovat spesifisiä kysymyksessä olevalle taudille, hoidossa. ·'&, 1¾1 ·· t - s » 5 ., '*·* Keksintö * · · *···] 25 Keksinnön tärkein aspekti on konjugaatti, joka käsittää a. biospesifisen affiniteetin vastinosan, joka on suunnattu rakennetta kohtaan, jo-• · * ~ hon konjugaatin on määrä sitoutua, f • ’· b. peptidin, joka : Y i. on johdettu jostakin superantigeenista, j 30 ii. jolla on kyky sitoutua T-solureseptorin νβ-ketjuun ja iii. jolla on muunnettu kyky sitoutua MHC-class II-antigeeneihin verrattuna supe-rantigeeniin, josta peptidi on johdettu [superantigeenin villityyppi = SA(wt)].
• · • * 9 · ,·:· Peptidi ja affiniteetin vastinosa ovat kovalenttisesti kytketyt toisiinsa sillan (B) avul- vv 35 la. ] * ·»- « · ·
Edullisilla konjugaateilla on kyky aktivoida ja ohjata T-lymfosyyttejä hajottamaan ^ ·,**’. selektiivisesti soluja, joiden pinnalla esiintyy rakenne, jota kohtaan affiniteetin vasti-
• M
4 ' 118150 nosa on suunnattu. Tämä tarkoittaa, että konjugaatit aikaansaavat sytolyysin SADCC-välitteiscssä menetelmässä (Superantigen Antibody Dependent Cellular Cytotoxity). Katso kokeellinen osa tuonnempana ja aikaisemmat julkaisumme koskien superantigeenien ja vasta-aineiden välisiä konjugaatteja (esimerkiksi Dohlsten et 5 ai, WO 9201470).
. - f'1
Keksinnön mukaisilla konjugaateilla on rakenne, joka on analoginen tunnetussa tekniikassa (Dohlsten et ai, WO 9201470, joka sisällytetään tähän viitejulkaisuna) kuvattujen superantigeeni-vasta-ainekonjugaattien kanssa, so. konjugaatit ovat kaa- .
10 van: T-B-SA(m) mukaisia, jossa kaavassa T on biospesifisen affiniteetin vastinosa, SA(m) on muun- 1 nettu superantigeeni (edellä mainittu peptidi) ja B on kovalenttisilta, joka kytkee T:n ja SA(m):n toisiinsa.
15 T voi olla periaatteessa olla mikä tahansa rakenne, joka sitoutuu biospesifisen affiniteetin kautta. Tärkeimmissä tapauksissa T kykenee sitoutumaan solun pintarakenteeseen, edullisesti jollekin taudille spesifiseen rakenteeseen, kuten edellä mainittiin.
Rakenne, jota vastaan T on suunnattu, on tavallisesti muu kuin (a) νβ-ketjuepitoop-20 pi, johon superantigeenista johdettu peptidi [SA(m)j sitoutuu, ja (b) MHC-class II-antigeeniepitooppi, johon muuntamaton superantigeeni sitoutuu. Biospesifisen affiniteetin vastinosa T voi ensisijaisesti olla valittu interleukiineista (esimerkiksi inte-leukiini-2), hormoneista, vasta-aineista ja vasta-aineiden antigeeniin sitoutuvista fragmenteista, kasvutekijöistä jne. Katso esimerkiksi Woodworth, Preclinical and *:··: 25 Clinical Development of Cytokine Toxins, joka esitettiin konferenssissa "Molecular ;2; Approaches to Cancer Immunotherapy", Ashville, Pohjois-Carolina, marraskuu 7-11, r." 1993. Polypeptidit, jotka sitoutuvat immunoglobuliinien (esimerkiksi proteiinien A ja y G ja L),lektiinien, streptavidiinin, biotiinin jne. vakiodomeeneihin, katsottiin etuoi- $ • · « keuspäivänä vähempiarvoisiksi. „ 30 i :
Etuoikeuspäivän aikoina oli edullista, että T oli jokin vasta-aine tai jonkin vasta- aineen antigeeniin sitoutuva pala (Fab, F(ab)2, Fv, yksiketjuinen vasta-aine jne. mu- '·’2 kaanluettuinajja erityisesti korostettiin vasta-aineiden, jotka oli suunnattu niin kut- • · 1 " suttua C242 epitooppia (Lindholm et ai, WO 9301303) tai muita syöpäspesifisiä : 35 epitooppeja vastaan, vasta-aine-aktiivista palasta (kuten Fab). 1
Kun T on jokin vasta-aine, se on ensisijaisesti monoklonaalinen tai lukumäärältään 1 2 * · 1 '·.1 määriteltyjen (esimerkiksi 2, 3, 4 5 tai useamman) monoklonaalisten vasta-aineiden 118150 .-¾ 5 .
seos. T voi olla polyklonaalinen vasta-aine, mikäli sitä käytetään ei terapeuttisesti.
T:llä ei välttämättä tarvitse olla polypeptidirakennetta. > 5 Muunnettu superantigeeni SA(m) on ensisijaisesti jokin mutatoitu superantigeeni, mutta se voi olla myös jokin kemiallisesti muunnettu superantigeeni, mukaanluettuina superantigeenipalat, jotka säilyttävät kyvyn sitoutua T-solureseptorin νβ-ketjuun.
Ilmaisu "mutatoitu superantigeeni" tarkoittaa, että superantigeenin natiivi kyky sitou- 10 tua MHC-class IT-antigeeneihin on muunnettu genomin tasolla korvaamalla, inser- - f toimalla tai poistamalla yksi tai useampi aminohappo natiivisuperantigeenissa. ^ *
Keksinnön mukaisissa kemiallisissa konjugaateissa voidaan yhtä hyvin käyttää supe-rantigeenipaloja, jotka on saatu mutaatioilla, joissa poistetaan osia täysimittaisesta 15 aminohapposekvenssistä, ja paloja, jotka on saatu pilkkomalla entsymaattisesti tai 4 kemiallisesti superantigeeneja. 4
Muunnettu superantigeeni SA(m) voi käsittää yhden tai useampia aminohapposekvenssejä, jotka on johdettu eri superantigeeneista ja jotka on voitu mutatoida, esi-20 merkiksi alla mainittujen edullisten superantigeenien yhdistelmiä.
Muunnettu superantigeeni SA(m) voi sellaisenaan olla vähemmän immunogeeninen * · * ja toksinen natiivisuperantigeeniin verrattuna.
• · · - > • · • * . · » *:**: 25 Muitakin ryhmiä/aineita, jotka kykenevät ristireagoimaan T-solureseptorin νβ- ketjun kanssa, voidaan yhtä hyvin käyttää mutatoidun superantigeenin [SA(m)] ’ ·* \. kanssa, kuten edellä mainittiin. Sellaisilla ryhmillä/aineilla ei tarvitse olla polypepti- * dirakennetta.
30 Etuoikeusvuoden lopussa kaikkein mielenkiintoisimmat tuotekandidaatit käsittivät λ superantigeenien mutaatiomuotoja, joissa oli paljon MHC-class II-sitoutumispaikkoja ja/tai joilla oli kyky koordinoida Zn2t-ionia, esimerkiksi SEA-, SED-, SEE- ja SEH-mutantteja.
* · : 35 T samoin kuin SA(m) voidaan valmistaa rekombinaatiomenetelmillä.
a · · • · 4 · ,··. Silta B voidaan valita aikaisemmin kuvatulla tavalla (Dohlsten et ai., WO 9201470), ♦ » '\\\. so. se tulee edullisesti olla hydrofiilinen ja sillä tulee olla yksi tai useampi rakenne, " 6 118150 jotka on valittu amidin, tioeetterin, eetterin, disulfidin jne. joukosta. Mikäli silta käsittää substituoitumattomia katkeamattomia hiilivetyketjuja, niissä ei edullisesti ole . ·.·« aromaattisia renkaita, kuten fenyylirenkaita. Tärkeimpiä siltoja ovat rekombinaatio-menetehnillä valmistetut, so. kun konjugaatio tapahtuu genomitasolla. Sellaisissa 5 tapauksissa edullisimpia ovat oligopeptidisillat, jotka sisältävät hydrofiilisiä amino-happotähteitä, joista Gin, Ser, Gly, Glu ja Arg ovat edullisimpia. Pro ja His voivat nekin sisältyä siltaan. Etuoikeusvuoden aikana on päätetty, että edullisin silta on jo- ; kin peptidi, joka käsittää kolme aminohappotähdettä (GlyGlyPro).
10 Keksinnön mukainen konjugaatti voi käsittää yhden tai useamman muunnetun super-antigeenin biospesifistä affiniteetin vastinosaa kohti ja vice versa. Tämä tarkoittaa, että T voi edellä mainitussa kaavassa sisältää yhden tai useamman muunnetun supe-rantigeenin biospesifisen vastinosan lisäksi. Analogisesti SA(m) voi sisältää yhden tai useamman biospesifisen affiniteetin vastinosan T. Affiniteetin vastinosa T ja 15 SA(m) voivat käsittää myös muita rakenteita. Muunnettujen superantigeenien luku- f määrä affiniteetin vastinosaa kohti on edullisesti yksi tai kaksi.
' .1 f , & Uusienkeksinnöllistenkonjugaattiensynteesivoidaansuorittaaperiaatteessakahdel- la päätavalla: 1. rekombinaatiomenetelmillä ja 2. kytkemällä T kemiallisesti .
20 S A(m):än. Alan ammattilainen tuntee nämä menetelmät ja niistä on olemassa suuri joukko muunnelmia. Siitä seuraa, että keksintö koskee ensisijaisesti keinotekoisia konjugaatteja, so. konjugaatteja, joita ei esiinny luonnossa. ' ··« ·* ·*· » * • · · ,···, Jonkin muunnetun superantigeenin kytkemisessä kemiallisesti biospesifiseen affini- 4· t · 25 teetin vastinosaan T käytetään usein funktionaalisia ryhmiä (esimerkiksi primaarisia • · t | ... aminoryhmiä tai karboksiryhmiä), joita on läsnä monissa asemissa kummassakin f » yhdisteessä. Tästä seuraa, että lopputuote sisältää konjugaattimolekyylien, jotka ero- V’/ avat kytkeytymistapahtuman sijainnin suhteen, seoksen. ; • · · > • * · 30 Rekombinanttikonjugaateissa (fuusioproteiineissa) saatu konjugaattiaine on yhdenmukainen kytkentäkohdan suhteen. Joko muunnetun superantigeenin aminopääte on kytketty biospesifisen affiniteetin vastinosan karboksipäätteeseen tai päinvastoin.
• · • *·· Vasta-aineista, kuten koskemattomista vasta-aineista ja antigeeniin sitoutuvista pa- :T lasista (Fab, Fv jne.) sellaisiin fuusioihin voidaan käyttää joko kevytketjua tai ras- · 35 kasketjua. Tämän hetken käsityksen mukaan rekombinanttikonjugaatit ovat edulli- ... simpia ja etusijalla ovat Fab-palat ja muunnetun superantigeenin aminopäätteen liit- * . täminen vasta-aineen H-ketj un ensimmäiseen konstanttidomeeniin (CH1), sulkemat- :ta pois analogista liittämistä L-ketjuun tai VH- tai VL-domeeniin, mikä saattaa sekin • · *· · 7 118150 tuottaa aivan hyviä tuloksia.
On olemassa kaksi eri menetelmää suurten superantigeenimäärien (muunnetut ja .
fuusioidut muodot mukaanluettuina) valmistamiseksi E. colissa. solunsisäinen tuot-5 taminen tai sekreetio. Viimeksi mainittu menetelmä on edullisempi keksinnön mukaisten konjugaattien kannalta, koska se tarjoaa oikein laskostuneen proteiinin puhdistamisen periplasmasta ja viljelyalustasta. Solunsisäisessä tuotannossa joudutaan monimutkaiseen puhdistusmenettelyyn ja usein proteiini joudutaan laskostamaan uudelleen in vitro (jotta proteiinille saadaan oikea tertiaarirakenne). Edellä sanottu ei S
10 sulje pois sitä, että aktiivisia konjugaatteja voidaan tuottaa myös muissa isäntäsoluis- sa, esimerkiksi eukaryoottisoluissa, kuten hiiva-tai nisäkässoluissa. |
Mutaloitujen superantigeenien tuottaminen ja mutanttien, joilla on muunnettu kyky --J
sitoutua (affiniteetti) MHC-class II-antigeeneihin, valikoiminen voidaan suorittaa , 15 tunnetuilla menetelmillä [katso esimerkiksi Kappler et ai, J. Exp. Med. 165 (1992) 387-396], Katso myös tekstimme kokeellinen osa.
Konjugaatin kyky sitoutua T-solureseptorin νβ-ketjuun, kohderakenteeseen ja ai- 'h kaansaada kohdesolun hajoaminen riippuu muun muassa superantigeenistajohdetus-20 ta peptidistä [SA(m)], biospesifisestä affiniteetin vastinosasta (T) ja sillan (B) raken-teesta ja pituudesta. Alan ammattilainen pystyy optimoimaan keksinnön mukaiset konjugaatit sitoutumiskyvyn ja hajoamisen aikaansaamiskyvyn kannalta tutkimalla 1 ϊ"’ϊ vaikutuksen ja rakenteen suhdetta mallien avulla, joita on kuvattu aikaisemmin tun- nettujen superantigeeni-vasta-ainekonjugaattien yhteydessä (katso edellä mainitut •:*v 25 julkaisut). Katso myös alla oleva kokeellinen osa. :* * · · • t • · *
Muunnetulla kyvyllä sitoa MHC-class TI-antigeeneja tarkoitetaan ensisijaisesti sitä, .¾
*,·.·, että suhde lC5o[SÄ(wt)]:IC5o[SA(m)] on < 0,9 (90 %), kuten < 0,5 (< 50 %) ja mah- J
· dollisesti myös < 0,01 (< 1 %). Vaihtoehtoisesti keksinnön mukaisten konjugaattien »* 30 muunnettu sitoutumiskyky voidaan mitata dissosiaatiovakioiden suhteena ^
Kd[SA(wt)]:Kci[SA(m)], jolloin Kd on mitattu nM:ina ja samoissa rajoissa kuin suhde i lC5o[SA(wt)]:lC5(,[SA(m)]. IC50[SA(wt)]:n, lC50[SA(m)]:n, Kd[SA(wt)]:n ja » " Kd[SA(m)]:n määrittämiseksi katso tuonnempana oleva kokeellinen osa.
• · · • · » · · .¾ ... : 35 Aikaisemmin tiedetään, että eräillä superantigeeneilla saattaa olla kaksi tai useampi ,··· kohta, jotka sitoutuvat MHC-class 11-antigeeniin [Fraser et ai, artikkelissa Superan- tigens: A Pathogens View on the Immune System, toim. Huber & Palmer, Current • _
Communications in Cell Molecular Biology 7 (1993) 7-29]. Tämäntyyppisissä super- « · · « · * * j -u 118150 8 antigeeneissä sitoutumiskyky tulee muuntaa vähintään yhdessä sitoutumiskohdassa, ^ esimerkiksi pienentämällä edellä mainittua kokoa. Mahdollisesti saattaa riittää sellainen superantigeenin muuntaminen, joka aikaansaa muuttuneen eron affiniteeteissa - kahteen MHC-class ίΐ-sitoutumiskohtaan, varovaisesti >10 % ja edullisesti vähen-5 tämällä ainakin toisen kohdan affiniteettia. j, t
Superantigeenit sitoutuvat eri alaryhmien TCR νβ-ketjuihin erilaisilla affiniteeteilla. Keksinnön mukaisissa fuusioproteiineissa/konjugaateissa käytetty superantigeeni voi uf olla muunnettu siten, että sillä on muuttunut alaryhmäspesiftsyys tai muuttunut af-10 finiteetti alaryhmän yhteen tai useampaan jäseneen. On hyviä syitä uskoa, että affiniteetin TCR νβ-ketjuun ja TCR:n kautta tapahtuvan stimulaation välillä on paraboli- ; nen suhde, so. kohtuullinen affiniteetti tuottaa maksimaalisen stimulaation. Sen mu- % kaan muunnetun superantigeenin sopiva affiniteetti TCR V$:aan on saavutettu heti | kun superantigeenin käsittävä fuusioproteiini/konjugaatti kykenee merkittävästi sti- \* -i 15 muloimaan lepotilassa olevan T-solupopulaation, joka edustaa olennaisesti kaikkien ,;i ihmisen νβ-alaryhmien jakaumaa, proliferoitumaan. T-solupopulaationa voi olla T- .4 solupooli, joka on koottu satunnaisesti valituista ihmisyksilöistä. Termillä merkittävästi tarkoitetaan, että stimulaatio voidaan mitata. Kokeellisen osan taulukossa 2 ··’ (oikea palsta) esitetyt tulokset osoittavat, että kyky aikaansaada keksinnön mukaisten 20 konjugaattien/luusioproteiinien SADCC on usein olennaisesti sama kuin villityypin superantigeenin käsittävän fuusion.
··· • 9
Keksinnön mukaisten konjugaattien/fuusioproteiinien pääasiallinen käyttö ;f
Keksinnön mukaiset konjugaatit ovat ensisijaisesti tarkoitetut samojen tautien hoi- 4 25 toon kuin tavallisten superantigeenien ja vasta-aineiden konjugaatit. Katso edellä j.
• * *
•mainitut julkaisut. Niinpä keksinnön mukaisia konjugaatteja voidaan antaa potilaalle W
joko päähoitona tai oheishoitona leikkausten yhteydessä tai muiden lääkkeiden yhle-:Y ydessä.
30 Keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus käsittää valmisteita, jotka ovat sinänsä tunnettuja alalla, mutta jotka nyt sisältävät meidän uuden konjugaattimme. Koostumukset voivat siten olla lyofilisoidun hiukkasmaisen aineen muodossa, sterii- • · v *..» linä tai aseptisesti valmistettuna liuoksena, tablettina, ampullina jne. Vehikkeleitä, ^ . kuten vettä (edullisesti puskuroituna fysiologiseen pH-arvoon esimerkiksi PBS.llä) "* 35 tai jotakin muuta inerttiä kiinteää tai nestemäistä ainetta voi olla läsnä. Yleisesti otta- en koostumukset valmistetaan sekoittamalla konjugaatti, liuottamalla se, sitomalla se tai muulla tavalla yhdistämällä se yhteen tai useampaan vesiliukoiseen tai veteenliu- - • kenemattomaan vesipitoiseen tai ei-vesipitoiseen vehikkeliin, tarpeen vaatiessa yh- * 118150 9 ' dessä sopivien lisäaineiden ja apuaineiden kanssa. Välttämätöntä on, että vehikkelit ja olosuhteet eivät vaikuta huonontavasti konjugaatin aktiivisuuteen. Vesi sisältyy > sellaisenaan ekspressiovehikkeleihin. :: 5 Tavallisesti konjugaatit myydään ja annetaan potilaille etukäteen valmistettuina annoksina, joista jokainen sisältää tehokkaan määrän konjugaattia, jonka, nyt esitettyihin tuloksiin perustuen, uskotaan olevan 10 pg - 50 mg. Tarkka annos vaihtelee ta- x|j pauksen mukaan ja se riippuu potilaan painosta ja iästä, antotavasta, tautityypislä, vasta-aineesta, superantigeenista, kytkennästä (-B-) jne.
10
Antotavat ovat alalla yleisesti tunnettuja, so. kohdesolun hajottamiseksi tehokas määrä tai terapeuttisesti tehokas määrä keksinnön mukaista konjugaattia saatetaan kosketukseen kohdesolujen kanssa. Edellä spesifioiduissa indikaatioissa tämä yleensä merkitsee parenteraalista antoa, kuten ruiskeena tai infuusiona (ihon alle, suonensi-15 säisesti, valtimonsisäisesti, lihakseen) antoa nisäkkäälle, kuten ihmiselle. Konjugaatti >! voidaan antaa paikallisesti tai systeemisesti. , "Kohdesolun hajottamiseksi tehokkaalla määrällä" tarkoitetaan, että määrä on teho-kas aktivoimaan ja ohjaamaan T-lymtbsyyttejä tuhoamaan kohdesolun.
20
Etuoikeusvuoden lopussa päätettiin, että edullisin antotapa konjugaateille/iuusio- * proteiineille, jotka käsittävät muuntamattomia superantigeeneja, on 3 tunnin suo- nensisäinen infuusio vuorokaudessa yhdistettynä johonkin kuumetta alentavaan ai- :***, neeseen (parasetamol iin). Anto on määrä toistaa 4 vuorokauden aikana ja lopettaa *:*v 25 ennen kuin potilaassa muodostuu sekundaarisia vasta-aineita fuusioproteiinia/konju- gaattia vastaan. Tämä annostuskaava on todennäköisesti sovellettavissa esillä oleviin ϊ·. keksinnöllisiin konjugaatteihin/fuusioproteiineihin.
• · • « • « ·
Vaihtoehtoisia käyttöaloja 30 Keksinnön mukaisia konjugaatteja voidaan käyttää myös rakenteen, jota vastaan kohdetta etsivä ryhmä (T) on suunnattu, kvantitatiiviseen tai kvalitatiiviseen detek- tointiin. Alaan perehtyneet tuntevat yleensä näitä menetelmiä. Niinpä muunnettu :superantigeeni voi toimia merkkiryhmänä immunologisissa kokeissa, immunohisto-··· v kemia mukaanluettuna, mikä tarkoittaa, että merkkiryhmä vuorostaan ilmaistaan * · ... 35 esimerkiksi vasta-aineella, joka on suunnattu peptidiä |SA(m)] vastaan ja merkitty .·♦· jollakin entsyymillä, isotoopilla, fluoroforilla tai jollakin muulla sinänsä tunnetulla ’;]· merkkiryhmällä. Eräässä toisessa immunologisessa menetelmässä detektoidaan solu- *... populaatiosta soluja, jotka pinnallaan ilmentävät rakennetta, joka kykenee sitoutu- « ··· • a 10 118150 ; maan kohdetta etsivään ryhmään (T). Tämä käyttö tarkoittaa, että solupopulaatiosta ^ otettua näytettä inkuboidaan T-lymfosyyttien kanssa yhdessä esillä olevan keksinnön % mukaisen konjugaatin kanssa kuten SADCC-kokeessa. Mikäli inkubointi johtaa solujen hajoamiseen, on se osoitus siitä, että populaatio sisältää soluja, jotka pinnallaan 7 5 ilmentävät rakennetta.
Kokeellinen osa
Rekombinanttiproteiinien valmistus
Vasta-aineet 10 Kokeellinen työ tämän keksinnön yhteydessä suoritettiin ensisijaisesti monoklonaali-sella vasta-aineella C215 malliaineena. Tämä vasta-aine on suunnattu erästä GA-733 -perheeseen kuuluvaan antigeeniä vastaan [katso esimerkiksi EP 376 746 ja siinä mainitut viitejulkaisut ja Larsson et ai, Int. J. Canc. 32 (1988) 877-82]. C215-epi- t
toopin ei ole katsottu olevan tarpeeksi spesifinen syövän hoidossa ihmisissä. Etuoi- T
15 keuspäivänä mab C242:n (Lindholm et ai, WO 9301303) uskottiin olevan parempi 5 kandidaatti kokeiden perusteella, joita oli tehty sen (uusiotuotteella villityypin SEA:n i kanssa. ' :
Bakteerikannat ja plasmidit J
20 E. coli -kantoja UL635 (xyl-7, ara-14, T4R, AompT) ja BH101 [Boyer ja Roulland- Ä
Dessoix, J. Mol. Biol. 41 (1969) 459-472) käytettiin ilmentämiseen ja kloonaukseen, 5 vastaavassa järjestyksessä. Vektoria pKP889 käytettiin Fab-SEA-fiiusioproteiinien t„, ilmentämiseen (johdettu muriinivasta-aineesta C215) ja vektoreita pKP943 ja y
pKP1055 SEA:n sekreetioon (kuvio 1). Fab-SEA:n ilmentämisvektori pKP889 on S
•i*v 25 identtinen pKP865:n kanssa [Dohlsten et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994) lehdistössä] lukuunottamatta sitä, että välijakso Ch 1 '.n ja SEA.n välissä on GlyGly-AlaAlaHisTyrGly. pKP943:sta ilmentämällä saadaan SEA, jossa on natiivi amino- « ,·,· pääte. pKP1055:n käyttö tuottaa tulokseksi SEA:n, jossa on Gly-jäännös lisänä ami- • · " .
nopäätteessä. Molemmissa vektoreissa käytetään signaaleja stafylokokki proteiini 7 30 A:sta [Uhlen et ai, J. Biol. Chem. 259 (1984) 1695-1702] transskriptioon ja trans- i: laatioon ja synteettistä signaalipeptidiä sekreetioon (L. Abrahmsen, julkaisematon).
• · ί * In vitro -mutageneesi • · * :Mutaatiot tehtiin polymeraasiketjureaktioilla, jotka ajettiin Perkin Elmer Thermo-• « ·.. 35 cycler-laitteella. Reaktioseos (100 μΐ) sisälsi: 1 x PCR-puskuria Perkin Elmer Cetuk-
,··*. seita (10 mM Tris/HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,001 % (w/v) gelatiinia, vielä2 mM
*·*/ MgCl2, 0,4 mM dNTPs (Perkin Elmer Cetus), 2,5 yksikköä Ampli Taq DNA poly-
« S
'··· meraasia (Perkin Elmer Cetus, USA) ja 100 ng DNA-templaattia. Alukkeita lisättiin <»·« • 1 118150 11 , lopulliseen konsentraatioon 0,8 μΜ. Alkuperäinen templaatti oli Staphylococcus aureus -enterotoksiini A -geenin sisältävä plasmidi, joka oli identtinen Belleyn et ai julkaiseman kanssa [J. Becteriol. 170 (1988) 34-41 ], lukuunottamatta sitä, että ensimmäinen kodoni (koodaava Ser) vaihdettiin TTC.ksi, jotta saatiin BamHI-kohta 5 geenin 5-päähän. Myöhemmin käytettiin johdosta, joka sisälsi useampia uniikkeja > resktriktioentsyymikohtia, jotka oli tehty hiljaisilla mutaatioilla. Restriktiokohdan viereen sijoitetut mutaatiot tehtiin yhdellä alukesarjalla, jossa yksi aluke ulottui mutaatiosta restriktiokohtaan. Useimmissa mutaatioissa joudutti in käyttämään kahta ^ alukesarjaa ja PCR suoritettiin kahdessa peräkkäisessä vaiheessa. Kunkin mutaation ζ 10 mukana introdusoitiin uusi restriktioentsyymikohta helpon identifioinnin mahdollistamiseksi. Alukkeina käytetyt oligonukleotidit syntetisoitiin Gene Assembler-lait- / teella (Pharmacia Biotech AB, Ruotsi). Kunkin mutaation varmentamiseksi rele-vantti osa nukleotidisekvenssistä määritettiin Applied Biosystemsin DNA-Sequen-serillä käyttäen heidän Taq DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing Kitiään.
15
Proteiinin tuottaminen ja analyysi E. coli -soluja, jotka sisälsivät eri geenikonstruktiot, kasvatettiin yön yli huoneenlämpötilassa (Fab-SEA-vektorit) ja 24 - 34 °C:ssa (sekreetiovektorit, optimi riippuu mutaatiosta). Liemenä oli 2 x YT (16 g/1 Bakto-tryptonia, 10 g/1 Bakto-hiivaeks- i 20 traktia, 5 g/1 NaCl), johon oli lisätty kanamysiiniä (50 mg/l). Fuusioproteimit in- - f dusoitiin lisäämällä isopropyyli-O-D-tiogalaktosidia lopulliseen konsentraatioon | 100 μΜ. (Proteiini A -promoottori, jota käytettiin fuusioimattoman S LA: n ilmentä- ;
• A
: : miseen, on konstitutiivinen). Solut pelletoitiin nopeudella 5000 x g ja periplasmasi- **· il sältö vapautettiin sulattamalla varovaisesti aikaisemmin jäädytetty solupelletti 10 25 mM Tris-HCl:ssä (pH 7,5) jään päällä samalla sekoittamalla 1 tunti. Periplasmauut- ;
.··· - teet kirkastettiin sentrifugoimalla nopeudella 9500 x g 15 minuuttia. Fab-SEA- A
··** proteiinit käytettiin enempää puhdistamatta. SEA ja Gly-SEA puhdistettiin edelleen
• A
affiniteettikromatografialla anti-SEA-vasta-ainepylväässä. Polyklonaalisia kaniinin
• A
* anti-SEA-vasta-aineita oli aikaisemmin koottu kaniineista, jotka oli etukäteen im- 30 munisoitu SEA:lla, ja ne oli puhdistettu affiniteettikromatografialla proteiini G '
Sepharosella® (Pharmacia Biotech).
a « ! ’’ Proteiinianalyysi »·* *'
Proteiinit erotettiin esivaletuissapolyakryyliamidi-SDS-Tris-Glysiini Novex-gee-
• A
... : 35 leissä (gradientti 4 - 20 % tai homogeeninen 12 %, Novexin uusi koemenetelmä) ja .··· joko värjättiin Coomassie-sinellä tai käytettiin Western-blotissa. Polyklonaalisia ♦ kaniinin anti-SEA-vasta-aineita (edellä) käytettiin SEA:n ilmaisemiseen Western blot • * · -analyysissä ja sen jälkeen sian anti-kani in i-lg-vasta-aineita ja kaniinin anti-pipar- « · · · ,2 118150
juuriperoksidaasi vasta-aineita ja peroksidaasia. Fab-SEA-fuusioproteiinien kanssa C
käytettiin myös peroksidaasilla konjugoituja rotan vasta-aineita, jotka tunnistivat kappaketjun (AAC 08P. Serotech Ltd, Englanti). 3,3'-diaminobentsidiiniä (Sigma) ·:ζ, käytettiin peroksidaasin visualisoimiseen.
5
Sirkulaaridikroismispektrejä (CD-spektrejä) koottiin J-720-spektropolarimetrissa (JASCO, Japani) huoneenlämpötilassa (22 - 25 °C) 10 mM fosfaattipuskurissa, pH 8,2, jossa oli 0,02 nM ZnS04 ja 0,005 % (v/v) Tween 20:tä. Skannausnopeus oli 10 nm/min ja kukin spektri oli viiden peräkkäisen skannauksen keskiarvo. Solun 10 liikkumismatka oli l mm ja proteiinikonsentraatio 0,2 - 0,5 mg/ml. Guanidiinivetyk-loridi(Gdn-HCl)denaturaatioita tasapainotilassa mitattiin 23 °C:ssa CD:llä 222 nm:ssä proteiinikonsentraatiolla 0,3 mg/ml ja solun lnkkumismatkalla 1 mm. | Näitä tuloksia käytettiin laskostumattoman proteiinin näennäisfraktion (Fapp) laske- 1 miseen. Tasapainotilan aukilaskostusparametrejä johdettiin sovittamalla tulokset ; 15 kaksikohtaiseen laskostusprosessiin [Hurle et ai, Biochemistry 29 (1990) 4410- 4419]. 1 SITOMINEN JA FUNKTIONAALISET KOKEET in vitro Materiaalit 20 Reagenssit: Käytettiin RPMI1640 elatusliuosta, joka saatiin Gibcolta, Middlesex,
Englanti. Elatusliuoksen pH oli 7,4 ja se sisälsi 2 mM L-glutamiinia (Gibco, Middlesex, Englanti), 0,01 M HEPES (Biological Industries, Israel), 1 mM NaHC03 (Biochrom AG, Saksa), 0,1 mg/ml gentamysiinisulfaattia (Biological Industries, Is- * :**’ rael), 1 mM Na-puryvaattia (JRH Biosciences Industries, USA), 0,05 mM merkap- 25 toetanolia (Sigma Co., USA), 100-kertaisesti konsentroituja ei-essentiaalisia amino- f happoja (Flow Laboratories, Skotlanti) ja siihen lisättiin 10 % fetaaliboviiniseerumia f * * * · . ; :*v (Gibco, Middlesex, Englanti). Rekombinantti-SEA(wt), SEA(m) ja fuusiotuotteet ]·,· C215Fab-SEA(wt) ja C215Fab-SEA(m) saatiin edellä kuvatulla tavalla. Ihmisen re- „ Ψ 9 kombinantti-lL-2 oli Cetus Corporationilta, USA. Mitomysiini C oli Sigma Co.:Itä, 30 USA. Na251Cr04 saatiin Merckiltä, Saksasta. Fosfaattipuskuroitu keittosuolaliuos (PBS) ilman magnesiumia ja kalsiumia saatiin Imperialilta, Englanti.
· • ’ Solut: Ihmisen paksusuolikarsinoomasolulinja Colo205 ja B-solulymfoomasolulinja • · * ' ' *
Raji saatiin American Type Cell Culture Collectionista (Rockville, MD, USA) * ... 35 (ilmentävät HLA-DR3/wl0, -DP7, -DQwl/w2). EBV-transfbrmoitu lymfoblastoidi- .*** B-solulinja BSM oli avokätinen lahjoitus tri van de Griendiltä, Dept of Immunology, *·*· Dr. Daniel den Hoed Cancer Center, Leiden, Alankomaat. Solut testattiin useaan > *·♦♦ kertaan mykoplasmakontaminaation suhteen Gen-Probe Mycoplasma T.C.-testillä, • ♦ »· · » '3 118150
Gen-Probe Inc., San Diego, USA. ί! έ ->ι SEA-aktivoidut T-solulinjat valmistettiin aktivoimalla ääreisverenkierrosta peräisin h olevia yksitumaisia soluja. Veri saatiin plasmana verenluovuttajilta Lundin yliopis- ψ 5 tollisesta sairaalasta. PBM:iä stimuloitiin konsentraationa 2x106 solua/ml mitomy-
siini C:llä käsitellyllä SEA:lla päällystetyillä BSM-soluilla (esi-inkuboitiin C
100 ng:lla/ml SEA) elatusliuoksessa, jossa oli 10 % FCS. T-solulinjoja stimuloitiin uudelleen kahden viikon välein 20 U:lla/ml ihmisen rekombinaatio-IL-2:ta ja vnkoit- ΐ tain mitomysiiniC:llä käsitellyllä SEA:lla päällystetyillä BSM-soluilla. Solulinjoja ; 10 viljeltiin 4 - 12 viikkoa ennen kuin niitä käytettiin kokeissa.
Effektorisolujen elinvoimaisuus trypaanisiniekskluusiolla määritettynä oli yli 50 %.
Villityypin ja mutantti-SEA:n MHC-class II-sitontumisominaisuuksien määrit-15 täminen
Radiojodinaatiomenetelmä. Sopivia määriä villityypin ja mutantti-SEA:ta radio-leimattiin 10 - 20 mCi Na Lila käyttäen entsyymihelmiä laktoperoksidaasimenetel-mällä (NEN, Boston, MA). Reaktio pysäytettiin jäähdyttämällä natriumatsidilla ja proteiiniin sitoutunut radioaktiivisuus erotettiin vapaasta jodista suodattamalla PD- a 20 10 -pylvään läpi (Pharmacia Biotech AB, Ruotsi) käyttäen R10-kasvatusliuosta >.
eluutiopuskurina. Olosuhteet valittiin siten, että jodi-125:n ja proteiinin stoikiometri-seksi suhteeksi saatiin < 2:1. Radiokemiallinen puhtaus tarkistettiin kokoekskluusio- ; kromatografialla TSK SW 3000 HPLC-pylväässä, Radiojodinaation vaikutus sitou-tumis-aktiivisuuteen testattiin ainoastaan villityypin SEA:sta eikä sen havaittu vai- .1··. 25 kutiavan siihen (tuloksiaei esitetty). .
• · 1 '/.i #1«·1' .···. Suora sitoutumiskoe. Raji-soluja, 6xl04/100 pljoita oli viljelty R10-viljelyalustas- ] * 1 1 sa, lisättiin kartiomaisiin polypropeeniputkiin ja inkuboitiin (22 °C/45 min) tripli- ? kaartina 100 μΐ kanssa sarjalaimennettua I-merkittyä villityypin tai mutantti-SEA:a • · « ’·’ 30 koeputkea kohti. Solut pestiin 2 mklla 1 % (w/v) naudan seerumialbumiinia (BSA) > 10 mM :ssa fosfaattipuskuroitua keittosuolaliuosta (PBS), pH 7,4, sentrifugoitiin no- % peudella 300 x g 5 minuuttia ja aspiroitiin. Tämä menettely toistettiin kahdesti. Lo- i puksi solut analysoitiin soluun sitoutuneen radioaktiivisuuden suhteen gammalaski- τ • % • 1·· messa (Packard Instruments Co., Downers Grove, IL, USA). Näennäisdissosiaatio- :T1 35 vakio. Ka, ja sitoutumiskohtien lukumäärä, N, saturaatiotilassa laskettiin Scatchardin ] mukaan [Ann. N. Y. Acad. Sei. 51 (1949) 660-72], kun siitä oli vähennetty ei-spesifi- ... nen sitoutuminen (so. sitoutuminen pelkästään R10-viljelyalustan kanssa inkuboin- *:\ nin jälkeen).
• » ♦ • · • · ··♦· · · ♦ ♦ • · . /¾ 14 118150 '
Estokoe (125i-merkityn villityypin SEA:n sitoutumisen esto mutantti-SEA:illa). Nämä estokokeet suoritettiin tavalla, joka kuvattiin suoran sitoutumiskokeen yhteydes- i sä, vähäisin muutoksin. Lyhyesti 50 μ1:η 125I-merkittyä villityypin SEA:a annettiin 5 kilpailla ylimäärän merkitsemätöntä villityypin tai mutantti-SEA:a kanssa (50 μΐ/koe-putki) sitoutumisessa 6xl04/100 μΐ Raji-soluja. Mahdollisimman suuren herkkyyden saamiseksi estokokeeseen käytettiin merkkiainekonsentraatiota, joka tuotti % 40 % sitoutuneen radioaktiivisuuden suorassa kokeessa. Kilpailijan syrjäytyskapasiteetti ilmoitettiin konsentraationa, joka tuotti sitoutuneen radioaktiivisuuden 50 % eston - 10 (IC50). Mutanttien sitoutumisaffiniteetti villityypin SEA:han verrattuna laskettiin j käyttäen yhtälöä: IC50[SEA(wt)] : IC50[SEA(m)].
Sen tutkimiseksi, kilpailevatko mutantit sitoutumisesta samaan kohtaan Raji-solujen 15 pinnalla kuin villityypin SEA, SEA-mutanteilla saaduista sitoutumistuloksista laadittiin käyrä log-logit funktiona ja tutkittiin yhdensuuntaisuuden suhteen vastaavien villityypin SEA.lla saatujen tulosten kanssa.
Estokoe (fluoresenssimerkityn villityypin SEA:n sitoutumisen esto merkitsemättä- -f 20 mällä villityypin SBA lla ja SEA-mutanteilla). Raji-soluja (2,5 x 105) inkuboitiin inhibiittorin kanssa (villityypin SEA tai mutantti-SEA; 0-6000 mM) laimennettuna 50 piian C02-riippumatonta viljelyliuosta (Gibco), johon oli lisätty 10% FCS, glu- ΐ ... tamiinia ja gentamysiiniä, 37 °C:ssa 30 minuuttia. Fluoreseiinilla konjugoitua villi- * • * tyypin SEA:a lisättiin 30 nM:n lopulliseen konsentraatioon ja näytteitä inkuboitiin • * ’··** 25 vielä puoli tuntia 37 °C:ssa. Näytteet pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS:llä,johon ^ ’ oli lisätty 1 % BSA:ta (PBS-BSA) ja lopuksi niitä pidettiin 0,4 ml:ssa PBS-BSA:ta | jään päällä, kunnes ne analysoitiin. Kustakin näytteestä analysoitiin 10 000 elävää | • · . ' =$ : *·· solua vihreän fluoresenssin suhteen FACStar®-virtaussytometrilla (Becton Dickin- Λ' • .5 ' son) ja fluoresenssikeskiarvo laskettiin käyttäen LYSIS II-ohjelmaa.
30 SEA(wt):n, SEA(m):n ja niiden C215Fab-fuusioproteiinien SDCC- ja SADCC-analyysit ± :*. SDCC-analyysi. SEA(wt):n, SEA(m):n ja niiden C215Fab-fuusioproteiinien syto- !*:·. toksisuus MHC-classII+-Raji-soluja kohtaan tutkittiin standardin mukaisella 4 tunnin t 35 5 ^r'^-vapautus kokeessa käyttäen in vitro stimuloituja SEA-spesifisiä T-solulinjoja * efektorisoluina. Lyhyesti, 51Cr-merkittyjä Raji-soluja inkuboitiin 2,5 x 10 ’ solua per ; 0,2 ml viljelyliuosta (RPMI, 10 % FCS) mikrotitrauskuopissa määrätyllä efekto- * * « .*··. ri:kohdesolusuhteella apuaineiden läsnäollessa tai ilman niitä (verrokki). Spesifinen • ♦ * * · « · · • · 118150 ί 15 sytotoksisuusprosentti laskettiin lausekkeena 100 χ ([cpm koevapautuminen - cpm taustavapautuminen]/[cpm kokonaisvapautuminen - cpm tausta vapautuminen], Efektori.kohdesolusuhde oh 30:1 fiiusioimattomilla SEA:lla ja 40:1 fuusioproteiineil- 7 la. .
5 i SADCC ihmisen paksusuolisyöpäsoluja kohtaan. C215Fab-SEA(wt):n, C215Fab-SEA(m):n, SEA(wt):n ja SEA-mutanttien sytotoksisuus C215+ MHC-class ΐ '· ‘.'If IF paksusuolensyöpäsoluja SW 620 kohtaan tutkittiin standardin mukaisella 4 tunnin -¾ 51Cr3+-vapautuskokeella käyttäen in vitro stimuloituja SEA-spesifisiä T-solulinjoja 10 efektorisoluina. Lyhyesti, 51Cr3+-merkittyjä SW 620-soluja inkuboitiin konsentraa- 1 tiona 2,5 χ 103 solua per 0,2 ml viljelyliuosta (RPMI, 10 % FCS) mikrotitrauskuopis-sa efektori:kohdesolusuhteella 30:1 apuaineiden läsnäollessa tai ilman niitä (verrokki). Spesifinen sytotoksisuusprosentti laskettiin kuten SDCC-kokeissa.
'•g, 15 In vivo FUNKTIONAALISET KOKEET 1
Kasvainsolut. B16-F10-melanoomasoluja, jotka oli transfektoitu ihmisen tuumoriin liittyvää antigeeniä C215 (B16-C215) koodaavalla cDNA:lla (Dohlsten et ai, Monoclonal antibody-superantigen fusion proteins: Tumor specific agents for T cell ’·: based tumor therapy; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, lehdistössä, 1994), kasvatettiin f» 20 vierekkäisinä soluina subkonfluenssiin saakka. Kasvatusalustana oli RPMI 1640 " (GIBCO, Middlesex, UK), johon oli lisätty 5x10'5 β-merkaptoetanolia (Sigma, St. 4
Louis, MO, USA), 2 mM L-glutamiinia (GIBCO), 0,01 M HEPES:iä (Biological In-... dustries, Israel) ja 10 % vasikansikiöseerumia (GIBCO). Solut irrotettiin lyhyellä .¾
» 1 V
E! inkuboinnilla 0,02 % EDTAissa ja suspendoitiin jääkylmään fosfaattipuskuroituun J
’···’ 25 keittosuolaliuokseen käyttäen 1 % syngeenisen hiiren seerumia (vehikkeli) konsent- raatioon 4x105 solua/ml. j ·«« * 1 * 1 1 1 i 1·· Eläimet ja eläinten käsittely. Hiiret olivat 12 -19 viikon ikäisiä C57Bl/6-hiiriä, : jotka olivat transgeenisiä T-solureseptorin νβ3-ketjun suhteen [Dohlsten et ai, Im- 30 munology 79 (1993) 520-527]. Satatuhatta B16-C215-kasvainsoluaruiskutettiin i.v.
häntälaskimoon 0,2 ml:ssa vehikkeliä. Päivinä 1,2 ja 3 hiirille annettiin i.v. ruiskeina C215Fab-SEA(wt):tä tai C215Fab-SEA(D227A):ta 0,2 mkssa vehikkeliä kuvioissa ·1·,, 5a ja 5b ilmoitettuina annoksina. Verrokkihiirille annettiin vain vehikkeliä saman • ;:ä .·;· kaavan mukaan. Päivänä 21 kasvainsolujen ruiskutuksen jälkeen hiiret tapettiin tait- • ; 35 tamalla niiden niska, keuhkot irrotettiin, kiinnitettiin Bouinin liuokseen ja keuhko- i « · · 1 metastaasien lukumäärä laskettiin.
* · 1 ' • 1 • · 1 • · 1
• O
• »
III
· 1 · · 16 118150 f: tulokset '
Stafylokokkienterotoksiini A:n "alaniiniskannaus” SEA:n rakenne oli alunperin tuntematon ja voitiin vain spekuloida, mitkä olivat sivuketjut, joiden pintaan voitiin päästä käsiksi. Sen vuoksi suurin osa mutanteista 5 valittiin vertaamalla homologisia superantigeenejä [Marrack ja Kappler, Science 248 (1990) 705-711 ]. Säilyneitä (pääasiassa poolisia) jäännöksiä valittiin sillä perusteella, että eräiden näistä superantigeeneistä odotetaan sitoutuvan HLA-DR:ään säilyen [Chitagumpala et ai, J. Immunol. 147 (1991) 3876-3881). Alaniinikorvauksia käytettiin julkaistujen strategioiden mukaan [Cunningham ja Wells, Science 244 (1988) 10 1081-1085]. Tämän työn kuluessa saatavilla oleva informaatio lisääntyi: i) osoitet- # tiin, että Zn2+-ioni on tärkeä SEA:n ja MHC-class II:n (HLA-DR) vuorovaikutuksen kannalta [Fraser et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1991) 5507-5511], ii) stafylo-kokkienterotoksiini A n (SEB) mutaatioanalyysi esitettiin [Kappler et ai., J. Exp.
Med. 175 (1992) 387-396], ja iii) SEB:n rakenne esitettiin [Swaminathan et ai., 15 Nature 359 (1992) 801-806].
Ensimmäisen mutanttimme, jonka affiniteetti HLA-DR:ään, D227A, oli vakavasti heikentynet, todettiin koordinoivan Zn2+-ionia erittäin huonosti (tuloksia ei esitetty). .-.
Olettaen, että SEA ja SEB laskostuva tavallisesti, uudet tulokset viittasivat kahteen 20 MHC-class 11-sitoutumisalueeseen; toisessa niistä oli mukana Zn -ioni ja toinen vastasi SEB:ssä määritettyä kohtaa. Näiden olettamusten perusteella tehtiin toinen mutaatiosarja. Tämä toinen mutanttisarja ilmennettiin SEA:n muodossa, jossa oli lisänä glysiini aminoterminaalissa. Aluksi pidennyksellä ei näyttänyt olevan mitään >·» vaikutusta villityypin SEA:n sitoutumisominaisuuksiin (seuraava kappale). :? >1» r : : 25
Mt
Useimmat mutantit ilmennettiin ja sekretoitiin E. colissa funktionaalisessa muodossa monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumisanalyysin perusteella arvioituna (tauluk- • % 1 s1v ko 1). Mutanteista E154A/D156A ja R160A saatiin hyvin pieniä määriä. Niinpä nä- ψ . mä suljettiin pois tutkimuksesta. Monoklonaalinen vasta-ame 1E ei tunnistanut mu- 30 tantteja, joissa oli Ala-substituutio jäännöksissä 128, 187,225 tai 227. Kahden viimeksi mainitun mutantin ilmentymistaso on heikompi (korostuneempi 34 °C:ssa kuin 24 °C:ssa) ja ne migratoituivat nopeammin SDS-PAGEN aikana, denaturoivissa, i ,. mutta ei pelkistävissä olosuhteissa (kaikki muut mutantit migratoituivat kuten villi- • « \ " tyypin SEA, tuloksia ei esitetty). CD-spektrianalyysin perusteella arvioituna ’ ·1 35 D227A:n rakenne saattoi erota hieman natiivi-SEA:sta (kuvio 2), mutta stabiilius oli • » hyvin lähellä villityypin SEA a (mitattuna resistanssilla guanidiinivetyklorididenatu-raatiota kohtaan), Laskettu ΔΔΟ mutantin ja natiivin SEA:n [SEA(wt)]:n välillä oli - • 1 ♦ 0,16 kcal/mol ja se on vain 4 % AG°-arvoista (tuloksia ei esitetty). Kaikki signaalit • · * · ♦ · « · • 1 17 118150 olivat CD-analyysissä heikkoja, kuten odotetuinkin enimmäkseen β-levyrakenteelta.
Äskettäin raportoitiin, että His 225 koordinoi Zn -ionia [julkaisematon tieto Fraser - et ai, Proc. Natl. Acad. Sei USA 89 (1991) 5507-5511 j. Koska Asp 227 on mukana Zn2+-koordinaatiossa (edellä) ja oletettavasti sijaitsee samassa β-levyssä kuin 5 His 225, voidaan ajatella, että nämä kaksi jäännöstä muodostavat sinkkiä koordinoivissa proteiineissa sinkkiin sitoutuvan ytimen [Vallee ja Auld, Biochemistry 29 (1990)5647-5659], f
Sitoutuminen MHC-class II:teen ja T-solureseptoriin / 10 MHC-class II-affiniteetti laskettiin määristä, jotka tarvittiin kilpailemaan fluorese- ;·; iinillä merkityn villityypin SEA:n kanssa Raji-soluista, joissa esiintyi suuria määriä MHC-class II:ta. Mutantin syrjäyttämiskapasiteetti laskettiin konsentraatiostaJoka :! tuotti sitoutuneen fluoresenssin 50 % eston (IC50) verrattuna konsentraatioonjoka tarvittiin kilpailijana olevalla villityypin SEA .Ila. Villityypin SEA:n ja joidenkin 15 mutanttien osalta tämän tutkimuksen tulosta verrattiin tulokseen, joka saatiin tutki-muksessa, jossa T-merkittyä villityypin SEA:a käytettiin merkkiaineena. Kuten taulukosta 2 voidaan havaita, näistä kahdesta estotutkimuksesta saadut tulokset kor- f reloivat hyvin. 5 /$< 20 Kuuden valikoidun mutantin osalta sitoutuminen MHC-class II-antigeeniin mitattiin suoraan käyttämällä 125I-merkittyä mutantti-SEA:ta (taulukko 2). Mutantin H50A 1 osalta tulokset, jotka saatiin suorasta sitoutumiskokeesta ja estokokeista, korreloivat hyvin keskenään, mutta mutantin F47A kohdalla todettiin laaja poikkeama: suora * ·« . . · ^ sitoutumiskoe osoitti vain 7 kertaa heikompaa sitoutumista kuin villityypin SEA, 25 mutta molemmat kilpailukokeet osoittivat noin 70 kertaa heikompaa sitoutumista.
·:··: Tulokset kahdesta muusta mutantista osoittivat kahta erillistä sitoutumisinteraktiota. i
Mutanttien H225A ja D227A affiniteetti oli detektiorajan alapuolella myös tässä
• · V
analyysissä.
* /"cji • « ti, * · « .
«II.
30 Osoitimme aikaisemmin, että fuusioproteiineja, jotka muodostuivat karsinoomaan reagoivan vasta-aineen Fab-palasta ja SEA:sta, voitiin käyttää ohjaamaan sytotoksi-sia T-soluja spesifisti hajottamaan syöpäsoluja, kun taas SEA:n ja T-solureseptorin (TCR) välinen vuorovaikutus oli liian heikkoa detektoitavaksi itsessään (Dohlsten et f 1 • " ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, lehdistössä). Siten päinvastoin kuin kokeissa, joissa V 35 käytettiin eristettyä superantigeenia, Fab-fuusiokonteksti mahdollistaa lunktionaali-··* : sen kokeen koskien SEA:n ja TCR:n välistä vuorovaikutusta, riippumatta MHC-class .*** · Π -sitoutumisesta. Niinpä tarkkailtiin eri konjugaattien tehokkuutta ohjata T-soluja % hajottamaan Fab-osan tunnistamia soluja krominvapautumiskokeessa. Tämä koe • e *·· · 1 · ' 118150 18 :ί vahvisti, että mutaatiot, joiden osoitettiin vaikuttavan MHC-class Il-sitouiumiseen, ei vaikuttanut TCR-sitoutumiseen (taulukko 2).
Mutaatioiden biologiset vaikutukset 5 Proliferatiivinen vaikutus mitattiin kykynä stimuloida perifeerisiä lymfosyyttejä jakautumaan. Kaikki kolme mutanttia, jotka menestyivät hyvin huonosti kilpailussa MHC-class II-antigeenistä, aikaansaivat vähän tai ei lainkaan proliferaatiota, ja väli-tuotemutantilla H187A oli jonkin verran proliferatiivista kykyä, kun taas muita tutkittuja mutantteja ei voitu erottaa villityypistä (taulukko 3). Harris et at. [Infect. Immun.
10 61 (1993) 3175-3183] raportoivat äskettäin samankaltaisen vakavan heikentymisen T-solujen stimulatorisessa aktiivisuudessa SEA-mutanttien F47G ja L48G kohdalla. Voimakkaan heikentymisen kummassa tahansa ehdotetusta sitoutumisalueesta tulok- l, sena on selvästikin vakava vaikutus kykyyn indusoida prol iferaatiota. Tämä osoittaa, * että SEA ristisitoo kaksi MHC-class Il-molekyyliä, mikä johtaa TCR:n dimeroitumi-15 seen ja että tämä on tarpeen, jotta saadaan signaalitransduktio. .2
Sitä vastoin eri mutanttien tehokkuus in vitro stimuloitujen SEA-T-solujen ohjaamisessa hajottamaan MHC-class II-antigeenejä kantavia kohdesoluja korreloi sitoutu-misaffiniteetin kanssa pikemminkin kuin kilpailukyvyn kanssa (taulukko 3). Esi-20 merkiksi F47A:n ja D227A:n teho on alentunut vain 2,5-kertaisesti ja 300- kertaisesti, vastaavassa järjestyksessä. Tässä ei siis ole myöskään minkäänlaista inhe- renttiä vaatimusta kahdenarvoisuudesta. Moniarvoisuuden lisääntyminen, joka on tulosta merkittävästi suuremmasta määrästä T-solureseptoreita aktivoitujen T-solujen * * ·> *;*; pinnalla, saattaisi osaksi peittää heikomman aviditeetin vaikutusta SEA/MHC-class r . j *···’ 25 11-vuorovaikutuksessa. Että dimeroitumista ei tarvita T-solujen sytotoksisuuden sää- ' * telemiseen, on osoitettu aikaisemmin käyttämällä karsinoomaspesifejä bifunktionaa- • * · ' ,& lisiä vasta-aineita, jotka sisältävät yhden anti-CD3-osan ja yhden anti- ϊ j v karsinoomaosan [Renner et ai. Science 264 (1994) 833-35].
i * > • » 30 Funktionaaliset kokeet in vivo: Tulokset on esitetty kuvioissa 6a ja 6b. Hiirien käsittely C215Fab-SEA(wt):lla ja C215Fab-SEA(D227A):lla vähensivät kummassakin tapauksessa erittäin tehokkaasti B16-C215-melanoomasoluja sisältävien keuh-•\ kometastaasien lukumäärää. Terapeuttinen vaikutus oli olennaisesti samanlainen :'i t t« ]·.. kohteena olevien superantigeenien molempien varianttien osalta. Käsittely C215Fab- * \ . 35 SEA(wt):llä tuotti 70 % kuolleisuuden annoksilla 5 pg/ruiske. Sitävastoin yksikään hiiri ei kuollut, kun käytettiin samaa annosta C215Fab-SEA(D227A):ta. Kaiken * · % • t,m· kaikkiaan SEA(D227A) on esimerkki mutantista, joka vähensi toksisuutta ja säilytti .··· terapeuttisen vaikutuksen, kun se liitettiin Fab-SEA-iuusioproteiiniin.
»·· »»·* "a 118150 19
POHDINTA
SEB:n ja HLA-DR:n välisen kompleksin rakenne raportoitiin äskettäin [Jardetzky et ai, Nature 368 (1994) 711-718], Suurin osa SEB-jäännöksistä, joiden identifioitiin 5 olevan mukana tässä vuorovaikutuksessa, ovat säilyneet SEA:ssa. Meidän tuloksemme mutantista D227A osoittavat heikkoa affiniteettia vuorovaikutukseen SEA:n Jj '^l tämän kohdan (aminoproksimaalikohta) ja MHC-class TI-antigeenien välillä, jonka J, K^-arvo on suurempi kuin 8 μΜ. Kd-arvon vuorovaikutukseen SEB:n ja HLA-DR:n "pj välillä raportoitiin äskettäin olevan 1,7 μΜ [Seth et ai, Nature 369 (1994) 324-27],
10 SEB:n, TCR:n jä HLA-DR:n välisiä eri vuorovaikutuksia tutkittiin ja osoitettiin, että SEB:n ja HLA-DR:n välinen kompleksi ei säilynyt stabiilisti ilman TCR:ä. Plasmon-resonanssikokeet osoittivat, että tämä johtui hyvin nopeasta off-arvosta, Aviditeetti- ;J
vaikutukset Jotka saatiin, jos SFA ristisitoo kaksi MHC-class II-molekyyliä, jonka jälkeen TCR dimeroituu, saattaisivat selittää sen, miten SEA voi indusoida prolife-15 ratiivisia vaikutuksia konsentraatioillaJotka ovat Kd:n alapuolella. Olettaen, että λ
mutaatio F47A vähentää aminoproksimaalikohdan affiniteettia alle merkittävän ar- I
von, Zn2+-kohdan Kd on noin 95 nM. Tämän hypoteesin vahvisti äskettäin se havain- f to, että mutanteilla F47R, F47R/H50A ja F47R/L48A/H50D on samanlainen affini- Jr, teetti MHC-class Π-antigeeniin kuin F47A:lla (julkaisematon). SEB-rakenteen ‘ 20 [Kappler et ai, J. Exp. Med. 175 (1992) 387-396] ja homologiavertailujen perusteella [Marrack ja Kappler, Science 248 (1990) 705-711 j näyttää voimakkaasti siltä, että *
His225 ja Asp227 sijaitsevat samassa β-levyssä ja siten sivuketjut voisivat olla f proksimaalisia. Niinpä nämä kaksi jäännöstä muodostavat mitä todennäköisimmin ··· Σ...: sinkkiä sitovan ytimen Joka todetaan sinkkiä koordinoivissa proteiineissa [Vallee ja *... 25 Auld, Biochemistry 29 (1990) 5647-5659], Samoin kuin nämä mutantit kaikki mo- *:" noklonaaliset vasta-aineet paitsi 1E tunnistavat mutantit, joissa on korvaus jäännök- ί1 j*” sessä 128 tai 187. Fraser et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1991) 5507-5511] | ·*·, osoittivat, että Zn2+ sitoutuu SEA:aan ja se on tarpeen voimakkaan affiniteettivuoro- vaikutuksen kannalta MHC-class 11-antigeenin kanssa. HLA-DR:n lisääminen ei vai-
30 kuttanut affiniteettiin sinkkiä kohtaan. Tämän havainnon ja voimakkaan affiniteetin J
Zn -ioniin perusteella (Kd noin 1 μΜ) esitettiin koordinaatiota Jonka aikaansaisi ainoastaan SEA ja jossa olisi mukana 4-kertainen koordinaatio. Meidän tuloksemme > .. osoittavat neljän jäännöksen N128, Hl 87,11225 ja D227 olevan mukana vaikutta- • · massa. Kahden ensin mainitun jäännöksen funktio ei ole vielä selväjonkin ligandin * · V p 35 käyttämisen sijastaN128 saattaisi auttaa D227:n deprotonoinnissa. Eräs tätä puolta- ·»· va argumentti on, että D227:n korvaamisen vaikutus on voimakkaampi kuin H225:n f" korvaamisen.
« « « » » • · · • > • · * »Ml « · 20 1 1 81 50 Ϋ
Aikaisemmin raportoitiin, että eri superantigeenien affiniteettien MHC-class Π- ^ antigeeneihin nähden ja niiden kyvyn stimuloida T-soluja proliferoitumaan välillä ei ole korrelaatiota [Chintagumpala et ai, J. Immunol. 147 (1991) 3876-3881], Näitä f tuloksia voisivat osaksi selittää superantigeenien erilaiset affiniteetit eri TCR-νβ- c 5 ketjuja kohtaan. Tutkimuksessamme havaitsimme saman korrelaation puuttumisen, mutta päinvastoin kuin eri superantigeenit, mutanteilla on samanlaista TCR-affmi-teettia, kuten osoitettiin FAb-SEA:n yhteydessä (mitattiin SADCCinä). Todennäköi- f
sin selitys korrelaation puuttumiselle on, että tässä tutkimuksessa identifioidut kaksi sitoutumisaluetta edustavat kahta erillistä sitoutumiskohtaa, mistä on tuloksena ei T
10 ainoastaan kooperatiivinen sitoutuminen, vaan myös MHC-class Π:η kahden mole- f
kyylin dimeroituminen, mikä vuorostaan aikaansaa T-solureseptorin kahden molekyylin dimeroitumisen. Tämä merkitsisi, että molempien kohtien affiniteetti on tär- J
keä proliferatiivisen vaikutuksen aikaansaamiseksi. Voimakas aviditeetti on tulosta vuorovaikutuksesta heksameerisen kompleksin sisällä, jossa ovat mukana SEA:n, \i 15 TCR:n ja MHC-class ll:n kaksi molekyyliä. Siten SEA.n voimakas affiniteet- '
ti/aviditeetti MHC-class 11-antigeenia kohtaan tekee mahdolliseksi SEA:n vuorovaikutuksen TCR:n kanssa heikosta suorasta affiniteetista huolimatta. I
Muita biospesifejä affiniteetin vastinosiar SEA(D227A)-fuusioproteiini ja stafylo- 20 kokki-proteiini A:n TgG:tä sitova domeeni rakennettiin rekombinaatiotekniikkaa käyttäen ja ilmennettiin E. colissa. Tätä reagenssia on käytetty menestyksekkäästi T- ,i lymfosyyttien kohdistamiseen Mot4:ää ja CCRF-CEM -soluja (saatiin ATCC:ltä) j vastaan, jotka ovat CD7- ja CD38-positiivisia, mutta HLA-DP-,-DQ- ja -DR-negatii-
J;; visia. Mot 4-ja CCRF-CEM-soluja esi-inkuboitiin anti-CD7-tai anti-CD38-hiiren J
*... 25 monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa (Dianova, Hampuri, Saksa). Hiiren mo- ***** noklonaalisten vasta-aineiden ja fuusioproteiinin IgG-sitoutuvan osan välisen sitou- ' * 1 1 *,,. tumisen tehostamiseksi lisättiin myös kaniinin anti-hiiri-Ig-vasta-ainetta. :| *# * · > :Y Verrattuna A-SEA(wt)-proteiiniin, A-SEA(D227A)-proteiinilla oli alentunut kyky 30 sitoutua Daudi-soluihin Jotka ilmensivät MHC-class 11-antigeenia. f * · • » • ·' * ··· » 1 k 1 « « · **· » * , .
··1 *·· ·2 2 • «
M
118150 J
Taulukko 1
Mutantin rakenteellisen integriteetin vahvistaminen. Kuuden monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumista tarkkailtiin. ^ : ! λ
Mutaatio Monoklonaalinen vasta-aine IA 2A 3A IE 4E EC-A1
Villityyppi .4- + + + + +
Dl 1A/K14A + + + + + + D45A + . + + + + + F47A + + + + -I- + H50A (+) + (+) + + -l K55A + + + + + +
Hl 14A + + + + + + K123A/D132G + + + + + + i N128 A + + + + + Κ147Λ/Κ148Α + + + + - + E154A/D156A ND ND ND + ND ND ?
R160 A ND ND ND + ND ND J
H187A + + + - + + .4 E191A/N195A + + + + + +
Dl 97 A + + + + + + H225A + + + - + + :··· D227A + + + - + + ·♦· .
• · ·
Alaviitteet: +-merkki tarkoittaa sitoutumista, sulut tarkoittavat 50-90 % sitoutumista .*·* 5 verrattuna villityypin SEA.aan, ND tarkoittaa ei määritettyä.
» · « - • « t · * · ·.«! « . , • · • * ·· • · • · • , • · · . ·-:'#· • · *4 * ♦ ♦ • · -*·· “ ··· * • · · • *
Ml f f ··· « · * · « 118150 j
Taulukko 2 SEA-mutanttien sitoutuminen MHC-dass TT-antigeeniin ja T-solureseptoriin. Viimeksi mainittua tarkkailtiin kykynä ohjata aktivoituja stytotoksisia T-soluja spesifisti hajoittamaan karsinoomasoluja käytettäessä eri mutanttien Fab-SEA-fuusioita 5 (SADCC).
Mutaatio TC50(nM) IC5<> (nM) Kd(nM) SADCC (% f SEA-FITC1 125I-SEA1 125I-merkitty1 villityypistä1) villityyppi 50 38 13 1002
Gly-SEA 50 ND ND 1002
Dl 1A/K14A 50 ND ND ND y
D45A 53 ND ND ND
F47A 3150 2943 95 100 :- H50A 150 132 32 100
K 55 A 44 ND ; ND ND
H114A 48 ND ND ND 1 K123A/D132G 188 75 12/237 100 N128A 1150 ; ND 2,9/76 100
Κ147Λ/Κ148Α 58 ND ND ND
H187A 1030 602 97 100 j E191A/N195A 51 ND ND ND j|
D197A 78 ND ND ND
H225A >9000 9600 nd nd /1 D227A >9000 >10000 >8000 100 ·'
Alaviitteet: 1) ND tarkoittaa ei määritettyä. 2) Fab-SEA:n yhteydessä välijakso . .:i ··♦ Γ. CH1 n ja SEA.n välissä päättyy Gly.iin. > %; i • · * 10 Taulukko 3 j
Mutaatioiden biologiset vaikutukset. Tarkasteltiin kykyä stimuloida lepotilassa olevia - T-soluja proliferoitumaan ja kykyä ohjata sytotoksisia soluja hajoittamaan MHC- ? ,, class ΙΙ-antigeenejä ilmentäviä kohdesoluja(SDCC = Superantigeemriippuvuusvälit- l ^ teinen solujen sytotoksisuus). > » * * ♦ • -
Mutaatio Proliferaatio SDCC
**♦ ... % EC50 (suhteellinen) t » * * ,··· villityyppi 100 1 ' -¾.
9 · · · * « · · 118150 - 23 . %
Gly-SEA ND 1 | D11A/K.14A ND 0,8 D45A 50 1,3 |
F47A <0,2 2,5 I
H50A 20 . 1,4 K55A 100 1,3 H114 A ND 1 K123A/D132G 40 2,1 |
N128A 40 1,2 V
K147A/K148A ND 0,7
E154A/D156A ND ND
R160A ND ND i
11187A 15 4 I
E191A/N195A 100 1,1 4 D197A ND 1,3 ' H225A <0,2 3x102 D227A <0,01 3x102
Alaviitteet: ND tarkoittaa ei määritettyä, KUVATEKSTIT :
Yleistä: Mutantti SEA(D227A) [=SEA(m9) tai mutantti m9] oli etuoikeuspäivänä > 5 lupaavin SEA-variantti. Olemme sen vuoksi valinneet esitettäviksi tällä variantilla '4 ***. in v/ira ja in vivo saadut tulokset (kuviot 3-6).
.**· Kuvio 1. Kaavamainen esitys plasmideista, joita käytettiin SEA:n ja C215Fab- ·*» .... SEA:n ilmentämiseen. Koodaavat alueet ja kaksi tuotegeenejä seuraavaa transskrip- ,*·* tion terminaattoria on osoitettu bokseilla. Kanamysiinille resistenttiä proteiinia koo- 10 daava geeni on merkitty Km:llä. laclon lac-repressorigeeni. Vh ja CH1 tarkoittavat f *, , geeniä, joka koodaa muriinivasta-aineen C215 H-ketjun Fd-palaa. Vk ja Ck tarkoitta- i * vat samoin geeniä, joka koodaa kappaketjua. Rop on geeni, joka koodaa replikaation f? säätelyproteiinia pBR322:sta. Tuotegeenin transskriptiota ohjaavat promoottorit on esitetty nuolin, pKP889:ssä tre-promoottori ja kahdessa muussa vektorissa statylo-15 kokki-proteiini A:sta peräisin oleva promoottori (spa). Alue, joka sisältää replikaati- *» * **· on alkukohdan, on merkitty oriilla. Ainoa eroavuus pKP943:n ja pKP1055:nkoo- tT daaman SEA:n välillä on glysiinijäännös lisänä viimeksi mainitun N-päätteessä.
.,* * Viimeksi mainittuun vektoriin sisältyvä SEA-geeni sisältää enemmän uniikkeja ... restriktioentsyymikohtia, jotka on tuotu siihen hiljaisilla mutaatioilla.
Ί*. 20 Kuvio 2. Sirkulaaridikroismispektrit villityypin SEA:sta ja mutanteista F47A ja
»M
D227A, jotka edustavat voimakkaimmin redusoituja mutaatioita kullakin MHC-class « *· » 118150 24 ΙΪ -sitoutumisalueella. Yhtenäinen viiva on villityypin SEA:a kuvaava käyrä. Mu-
tanttien F47A ja D227A käyrät on esitetty katkoviivalla tai pisteviivalla, vastaavassa J
järjestyksessä.
Kuvio 3 esittää SEA(wt):n ja SEA(D227A):n superantigeeniriippuvaisen soluvälit-5 teisen sytotoksisuuden (SDDC) riippuvuutta konsentraatiosta.
Kuvio 4 esittää C215Fab-SEA(wt):n ja C215Fab-SEA(D227A):n superantigeeni- ^ riippuvaisen soluvälitteisen sytotoksisuuden (SDDC) riippuvuutta konsentraatiosta. *
Kuvio 5 esittää superantigeeni mAb-riippuvaisen soluvälitteisen sytotoksisuuden 4 (SADCC) riippuvuutta konsentraatiosta verrattuna vapaaseen SEA(wt):hen. ΐ 10 Kuviossa 6a verrataan terapeuttisia vaikutuksia Jotka saatiin C57Bl/6-hiirissä, Γ joilla oli B16-C215-melanoomasolukeuhkometastaaseja, kun niitä käsiteltiin C215Fab“SEA(wt):llä ja C215Fab-SEA(D227A):lla. 4
Kuvio 6b esittää C215-SEA(wt):n ja C215-SEA(D227A):n toksisuutta kuviossa 6a esitettyjen käsittelyn osalta. .-.¾ . -i·· * · t 1 * · • * * * * * * * .- » * * # • · • * * * *
* * -I
• · ·" • a · v ·*· ' i • * * m · • » * * * * • · 4 * * * .
··'* *·· 4 4 * * * · · , * · * * * ···*· t *

Claims (11)

25 118150
1. Konjugaatti, tunnettu siitä, että se käsittää a. biospesifisen affiniteetin vastinosan (kohdetta hakevan ryhmän), joka kykenee sitoutumaan johonkin ennalta määrättyyn solun pintarakenteeseen, joka liittyy 5 sairauteen, ja b. peptidin, joka 1. sisältää aminohapposekvenssin, joka on johdettu jostakin superantigeenistä, ii. jolla on kyky sitoutua jonkin T-solureseptorin νβ-ketjuun, ja iii. joka on mutatoitu siten, että sen affiniteetti MHC-class II-antigeeneihin on 10 alentunut verrattuna superantigeeniin, josta peptidi on johdettu, jotka osat ovat kovalenttisesti liittyneet toisiinsa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että konju- .1 gaatilla on kyky aktivoida T-lymfosyyttejä hajottamaan soluja, joiden pinnalla \ esiintyy solun pintarakenne. : ‘f
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen konjugaatti, t u n n e 11 u siitä, että sairaus on valittu joukosta, johon kuuluvat syövät, virusinfektiot, autoimmuunisairaudet ja j loistartunnat. c
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että sairaus ? on syöpä. ; ö ... 20
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen konjugaatti, t u n n e t t u siitä, että bio- I • · ;;; spesifinen affiniteetin vastinosa sisältää polypeptidirakenteen. 4 * * * · · ' j'.
·:*·;' 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että bio- spesifinen affiniteetin vastinosa ja peptidi on fuusioitu yhteen. | * · · · * * - i]
**’ 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että bio- -1 ’ 25 spesifinen affiniteetin vastinosa on jokin vasta-aine tai vasta-aineen antigeeniin sitoutuva osa.
♦ ♦ * · • ·· « .···. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että super- • * antigeeni on valittu superantigeeneistä, jotka tarvitsevat sinkki-ioneja voidakseen sitoutua MHC-class II-antigeeneihin. • ♦ * • · ♦ · • · ♦ \ 30
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että super- • · * . antigeeni on stafylokokki-enterotoksiini A (SEA). .¾ ♦ * * · ♦ · • · · 118150 ' 26 f » I
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että SEA:n kodoni, joka koodaa aminohappotähdettä, joka koordinoi sinkkiä superantigeenin sitoutuessa MHC-cIass II-antigeeneihin, on mutatoitu.
11. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen konjugaatti käytettäväksi 5 nisäkkään tautitilan hoitamiseksi, joka tila tarkoittaa tilaan liittyvien spesifisten solujen läsnäoloa ilmentämällä sairaudelle spesifistä pintarakennetta, tunnettu siitä, että konjugaatissa biospesifinen affiniteetin vastinosa on suunnattu taudille spesifiseen rakenteeseen.
10 Patentkrav
FI970100A 1994-07-11 1997-01-10 Muunnetun superantigeenin ja kohdetta etsivän yhdisteen välinen konjugaatti ja konjugaatin käyttö FI118150B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9402430 1994-07-11
SE9402430A SE9402430L (sv) 1994-07-11 1994-07-11 Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
SE9500681 1995-02-24
PCT/SE1995/000681 WO1996001650A1 (en) 1994-07-11 1995-06-07 A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI970100A FI970100A (fi) 1997-01-10
FI970100A0 FI970100A0 (fi) 1997-01-10
FI118150B true FI118150B (fi) 2007-07-31

Family

ID=20394684

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI970100A FI118150B (fi) 1994-07-11 1997-01-10 Muunnetun superantigeenin ja kohdetta etsivän yhdisteen välinen konjugaatti ja konjugaatin käyttö

Country Status (27)

Country Link
US (3) US7226601B1 (fi)
EP (1) EP0766566B1 (fi)
JP (1) JP4175489B2 (fi)
KR (1) KR100377506B1 (fi)
CN (1) CN1089606C (fi)
AT (1) ATE200626T1 (fi)
AU (1) AU699147B2 (fi)
CA (1) CA2194673C (fi)
DE (1) DE69520739T2 (fi)
DK (1) DK0766566T3 (fi)
ES (1) ES2158950T3 (fi)
FI (1) FI118150B (fi)
GR (1) GR3036187T3 (fi)
HK (1) HK1012226A1 (fi)
HU (1) HU221254B1 (fi)
IL (1) IL114445A (fi)
MY (1) MY112916A (fi)
NO (1) NO320151B1 (fi)
NZ (1) NZ289951A (fi)
PL (1) PL180747B1 (fi)
PT (1) PT766566E (fi)
RU (1) RU2183215C2 (fi)
SE (1) SE9402430L (fi)
TW (1) TW413636B (fi)
UA (1) UA73067C2 (fi)
WO (1) WO1996001650A1 (fi)
ZA (1) ZA955746B (fi)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
SE9601245D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
CN1275085A (zh) * 1997-07-21 2000-11-29 法玛西雅和厄普约翰公司 靶细胞的定向细胞溶解、引起细胞溶解的试剂和组合物以及可用于制备这些试剂的化合物
DE19827837A1 (de) * 1998-06-23 1999-12-30 Ernst Gleichmann Universell an Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle der Klasse II bindende Peptide zur prädiktiven Testung, Diagnostik, Prophylaxe und Therapie von Sensibilisierungen gegen Chemikalen
US7491402B2 (en) 1998-12-24 2009-02-17 Auckland Uniservices Limited Superantigens SMEZ-2, SPE-G, SPE-H and SPE-J and uses thereof
SE0102327D0 (sv) * 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
GB0118155D0 (en) * 2001-07-25 2001-09-19 Lorantis Ltd Superantigen
NZ519371A (en) 2002-06-04 2004-11-26 Auckland Uniservices Ltd Immunomodulatory constructs and their uses
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
SE0402025D0 (sv) * 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
US20080274133A1 (en) * 2004-11-18 2008-11-06 Avidex Ltd. Soluble Bifunctional Proteins
SG2014010029A (en) * 2005-08-19 2014-08-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
CN102516392B (zh) * 2011-11-25 2014-05-28 孙嘉琳 一种癌靶向超抗原融合蛋白及制备方法及用途
WO2014025199A2 (ko) * 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도
CA3010678A1 (en) 2016-01-10 2017-07-20 Neotx Therapeutics Ltd. Methods and compositions for enhancing the potency of superantigen mediated cancer immunotherapy
US11583593B2 (en) 2016-01-14 2023-02-21 Synthis Therapeutics, Inc. Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses
CN112601522A (zh) * 2018-07-09 2021-04-02 辛瑟斯治疗股份有限公司 抗体-alk5抑制剂偶联物及其用途
KR20220009428A (ko) 2019-05-15 2022-01-24 네오티엑스 테라퓨틱스 엘티디. 암 치료
CA3170369A1 (en) 2020-03-05 2022-04-14 Michal Shahar Methods and compositions for treating cancer with immune cells
WO2023215560A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Atoosa Corporation Tumor cell/immune cell multivalent receptor engager – bio-nanoparticle (timre-bnp)

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3627644A (en) 1968-03-01 1971-12-14 Hajime Okamoto Process for the cultivation of hemolytic streptococci
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
US4268434A (en) 1979-01-09 1981-05-19 Higerd Thomas B Immunosuppressive extracellular product from oral bacteria
US5091091A (en) 1981-11-06 1992-02-25 Terman David S Protein A perfusion and post perfusion drug infusion
US4699783A (en) 1983-03-11 1987-10-13 Terman David S Products and methods for treatment of cancer
US4681870A (en) 1985-01-11 1987-07-21 Imre Corporation Protein A-silica immunoadsorbent and process for its production
IT1192014B (it) 1986-06-27 1988-03-31 Rubinetterie Mariani Spa Becco di erogazione per lavabo o simile apparecchio idraulico con comando del salterello
US4980160A (en) 1986-10-16 1990-12-25 Biogen, Inc. Combinations of tumor necrosis factors and anti-inflammatory agents and methods for treating malignant and non-malignant diseases
DE68907388T2 (de) 1988-07-22 1994-01-05 Imre Corp Gereinigte Protein A-Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Herstellung.
SE8903100D0 (sv) 1989-09-20 1989-09-20 Pharmacia Ab New pharmaceutical agent
US6126945A (en) * 1989-10-03 2000-10-03 Pharmacia Ab Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
WO1991010680A1 (en) 1990-01-17 1991-07-25 Terman David S Tumor killing effects of enterotoxins and related compounds
CA2087164C (en) * 1990-07-20 2002-11-26 Terje Kalland Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
US5858363A (en) * 1990-07-20 1999-01-12 Pharmacia & Upjohn Ab Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
US6197299B1 (en) * 1990-07-20 2001-03-06 Pharmacia & Upjohn Ab Antibody conjugates
WO1993024136A1 (en) 1991-01-17 1993-12-09 Terman David S Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
JPH08500328A (ja) 1992-01-28 1996-01-16 ナショナル ジューイッシュ センター フォア イミュノロジィ アンド レスパラトリィ メディスン 突然変異したスーパー抗原の保護作用
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
SE9601245D0 (sv) * 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
SE0102327D0 (sv) * 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy

Also Published As

Publication number Publication date
AU2994095A (en) 1996-02-09
SE9402430L (sv) 1996-01-12
EP0766566A1 (en) 1997-04-09
US7226601B1 (en) 2007-06-05
HUT77257A (hu) 1998-03-02
US20050260215A1 (en) 2005-11-24
CA2194673A1 (en) 1996-01-25
PT766566E (pt) 2001-09-28
FI970100A (fi) 1997-01-10
CN1152877A (zh) 1997-06-25
GR3036187T3 (en) 2001-10-31
ES2158950T3 (es) 2001-09-16
JPH11500407A (ja) 1999-01-12
PL180747B1 (pl) 2001-04-30
UA73067C2 (en) 2005-06-15
AU699147B2 (en) 1998-11-26
ZA955746B (en) 1996-02-20
DE69520739T2 (de) 2001-09-20
FI970100A0 (fi) 1997-01-10
IL114445A0 (en) 1995-11-27
WO1996001650A1 (en) 1996-01-25
KR100377506B1 (ko) 2003-06-11
CA2194673C (en) 2009-08-04
US20060062795A1 (en) 2006-03-23
DK0766566T3 (da) 2001-08-13
NO970108D0 (no) 1997-01-10
HU221254B1 (en) 2002-09-28
EP0766566B1 (en) 2001-04-18
JP4175489B2 (ja) 2008-11-05
ATE200626T1 (de) 2001-05-15
TW413636B (en) 2000-12-01
CN1089606C (zh) 2002-08-28
NZ289951A (en) 1998-12-23
DE69520739D1 (de) 2001-05-23
IL114445A (en) 1999-09-22
SE9402430D0 (sv) 1994-07-11
NO970108L (no) 1997-02-20
NO320151B1 (no) 2005-10-31
MY112916A (en) 2001-10-31
HK1012226A1 (en) 1999-07-30
PL318162A1 (en) 1997-05-26
RU2183215C2 (ru) 2002-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI118150B (fi) Muunnetun superantigeenin ja kohdetta etsivän yhdisteen välinen konjugaatti ja konjugaatin käyttö
RU2198895C2 (ru) Конъюгат, обладающий способностью активировать иммунную систему, и фармацевтическая композиция, включающая указанный конъюгат
JP4114951B2 (ja) 改変／キメラスーパー抗原およびその使用
AU2005270336B2 (en) Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
JP2003524587A (ja) 多発性骨髄腫を処置するための、ｃｄ３８に対する、遺伝子操作した抗体の使用
EP0951475A1 (en) Metastatic colorectal cancer vaccine
WO1996038571A2 (en) Recombinant polypeptide cytotoxins for cancer treatment
Fernsten et al. Characterization of the colorectal carcinoma-associated antigen defined by monoclonal antibody D612

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 118150

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed