KR100369240B1

KR100369240B1 - 미생물 배양용 생물반응기

Info

Publication number: KR100369240B1
Application number: KR1020000018176A
Authority: KR
Inventors: 이계관; 김종래; 권호균; 이동수; 이용욱
Original assignee: 환인제약 주식회사
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2003-01-24
Also published as: KR20010100277A

Abstract

본 발명은 미생물 배양용 생물반응기에 관한 것으로서, 소정지점에서 수직방향에 대하여 내측으로 30 내지 60°테이퍼진 원통형의 배양용기, 상기 배양용기의 밑면에 장착된 공기주입 장치 및 상기 배양용기의 내부에 위치하는 교반기를 포함하는 미생물 배양용 생물반응기에 관한 것이다.

Description

미생물 배양용 생물반응기{Bioreactor for the culture of microorganisms}

본 발명은 미생물 배양용 생물반응기에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 호기성 미생물 배양에 있어서 배양물의 침전이 발생하지 않고, 세포순환이 원활할 뿐만 아니라, 세포엉김이 억제되고 물질순환이 원활히 이루어져 배양 수율이 우수한 생물반응기에 관한 것이다.

미생물을 배양하기 위한 기본적인 생물반응기는, 1932년 세척과 멸균을 위해 물과 스팀(steam)을 공급하기 위하여 제작한 공기 부양식 튜브에서 출발하였다. 그 후 1944년, 이스트 발효를 위해 수직원통형 생물반응기로 발전되었다. 이를 기초로 세포의 고농도 배양을 위해 반응기의 직경 및 높이에 변화를 준 다양한 형태의 생물반응기가 개발되었으나, 기본적인 형태는 모두 수직원통형이다.

그러나, 이러한 수직원통형 반응기는 고농도 배양시 반응기 하부 코너의 사각지대에 침전현상이 나타나 다량의 세포사가 발생한다. 이들 세포사를 회피하기 위한 방법으로 교반 속도를 높이는 방안이 제시되었으나, 이 경우 사각지대의 침전현상은 극복할 수 있지만, 전단응력이 약한 생물에 대해서는 치명적인 결과를 초래하는 한계가 있었다. 도 1은 이러한 종래의 수직원통형 반응기의 일 예를 나타내는 사진이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 수직원통형 반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우에는 상당한 양의 침전이 형성된다.

이러한 침전 현상을 방지하기 위한 방안으로, 유선형의 공기부양식 생물반응기가 개발되었다(공개번호 특1999-012384호). 그러나, 이 반응기는 배양초기에는 세포의 밀도가 낮기 때문에 상대적으로 배지순환이 용이한 장점이 있기는 하나, 배양중기 이후 세포밀도가 높아지기 시작하면 물질순환이 제대로 이루어지지 않고 세포의 엉김현상이 발생하는 단점이 있었다.

한편, 호기성 미생물 배양에서 미생물로의 산소전달능력을 제공하는 공기주입 장치는 배양 수율에 중요한 요소로 작용하는데, 기존의 공기주입 장치에는 스테인레스판, 세라믹판, 유리판 또는 스테인레스 링에 직경이 약 1㎜이상이고 다수의 구멍을 갖는 다공성 스파자(porous spargar), 또는 한 개의 구멍을 가진 오리피스 스파자(orifice spargar)가 구비된 형태가 있다.

이때, 스파자를 통해 공급되는 산소가 배양액으로 쉽게 녹아들어가 생물이 이용할 수 있도록 하기 위해서는 공기방울의 크기를 되도록 작게 하여 표면적을 증가시키는 것이 바람직하다. 공기방울의 표면적을 증가시키기 위해서 보통 교반속도를 증가시키는데, 이를 전단응력이 약한 생물에 적용하는 데에는 한계가 있었다.

이러한 결과는 궁극적으로 세포의 고농도 성장을 저해하는 요인으로 대두되고 있다. 특히 곰팡이 배양시에는 세포의 무게로 인하여 사각지대로의 침전현상이 가속화되어 문제가 더욱 심각해진다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 예의 연구를 한 결과, 반응기의 사각지대로 인한 침전 현상을 방지하고, 또한 공기공급 장치의 산소 전달능력을 증가시킴으로써 배양 수율이 뛰어난 본 발명의 생물반응기를 개발하게 되었다.

즉, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 배양 미생물의 침전 현상이 방지되고, 반응기 내부로의 산소 전달량이 높아서 배양 수율이 뛰어난 미생물 배양용 생물반응기를 제공하는 것이다.

도 1은 종래의 수직원통형 생물반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우 침전이 일어나는 현상을 나타내는 사진이다.

도 2는 본 발명의 생물반응기의 배양 용기의 일 예를 나타내는 사진이다.

도 3은 본 발명의 생물반응기의 일 예를 나타내는 모식도이다.

도 4(a)~(d)는 본 발명의 생물반응기의 공기공급 장치의 일 예를 나타내는 사진 및 도면으로, (a)는 공기공급 장치의 표면의 사진, (b)는 공기공급 장치의 이면의 사진, (c)는 공기공급 장치가 배양 용기에 장착된 경우의 사진, (d)는 공기공급 장치의 단면도이다.

도 5(a)~(b)는 본 발명의 5L급 생물반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우를 나타내는 사진으로, (a)는 배양전 사진이고 (b)는 배양후 사진이다.

도 6은 본 발명의 500L급 생물반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우를 나타내는 사진이다.

도 7은 본 발명의 500L급 생물반응기에서 교반 속도에 따른 산소전달계수를 나타내는 그래프이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

10. 배양 용기 11. 맨홀

13. 테이퍼부

30. 공기주입 장치 31. 스파자(spargar)

33. 메쉬(mesh) 34. O 링

35. 멸균공기 주입부 36. 스파자 조임 나사

37. 배지 수집관

50. 교반기 51. 교반모터

53. 교반축 55. 교반날개

본 발명은 소정지점에서 수직방향에 대하여 내측으로 30 내지 60°테이퍼진 원통형의 배양용기 및 상기 배양용기의 밑면에 장착된 공기주입 장치를 포함하는 미생물 배양용 생물반응기에 관한 것이다.

본 발명의 생물반응기는 바람직하게는, 상기 배양용기의 내부에 교반기를 더 포함한다.

본 발명의 생물반응기에 있어서, 상기 공기주입 장치는 한 개 내지 복수개의 메쉬형 스파자를 구비한 원판 형태로서, 스파자의 구경은 0.05 내지 10㎛이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명을 보다 자세하게 설명하기로 한다.

도 3은 본 발명의 생물반응기의 일 예를 나타내는 모식도이다. 도 3을 참조하면, 본 발명의 생물반응기는 배양 용기(10), 공기주입 장치(30) 및 교반기(50)를 포함한다.

배양용기(10)는 하단부가 수직방향에 대하여 내측으로 30 내지 60°테이퍼 진 테이퍼부(13)로 이루어진 원통형으로서, 종래의 반응기에서와 같이 배양용기 코너의 사각 지대가 없어 배양 중기 이후의 미생물 세포의 침전 현상을 방지할 수 있다. 배양용기(10)의 윗면에는 배지조제 및 세척을 위한 맨홀(11)이 구비되어 있다. 다음으로, 공기주입 장치(30)의 아래쪽에는 멸균공기 주입부(35)가 구비되어 있어 이를 통해 공기가 공기주입 장치(30)을 거쳐 배양 용기(10) 내로 주입된다. 또한, 본 발명의 교반기(50)는 배양 용기(10) 윗면의 교반 모터(51), 교반모터(51)와 축(53)으로 연결되어 배양 용기(10)의 내부에 위치하는 교반날개(55)로 이루어진다.

도 4(a)~(d)는 본 발명의 생물반응기의 공기공급 장치(30)의 일 예를 나타내는 사진 및 도면으로서, 도 4(a)를 참조하면, 공기공급 장치(30)는 한 개 내지 복수개의 스파자(31)가 구비된 원판 형태로서, 각 스파자(31)는 메쉬형으로서 구경이 약 0.05 내지 10㎛이다. 이러한 본 발명의 메쉬형 스파자(31)에 의해 교반 속도를 증가시키지 않고서도 배양용기 내부로 주입되는 공기방울의 크기가 작게 조절되어 반응 용기(10) 내부로의 산소전달능력이 증가되어 고밀도 세포성장을 유도할 수 있다.

도 4(b)는 공기공급 장치(30)의 이면의 사진으로서, 각 스파자(31)는 배지수집관(37)과 연결되어 있다. 도4(c)는 공기공급 장치(30)가 배양 용기에 장착된 경우의 사진이고, 도4(d)는 공기공급 장치의 단면도이다.

도 5(a)~(b)는 본 발명의 5L급 생물반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우를 나타내는 사진으로, (a)는 배양전 사진이고 (b)는 배양후 사진이고, 도 6은 본 발명의 500L급 생물반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우를 나타내는 사진이다. 사진에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 생물반응기를 사용하여 배양한 후에는 침전이 거의 발생하지 않는다.

이하에서, 본 발명의 생물반응기의 성능을 실시예를 통하여 더욱 자세히 설명하기로 하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 균사체 성장속도>

상황버섯(Phellinus linteus) 균사체를 분리하여 생물반응기 형태에 따른 균사체 성장속도를 관찰하였다. 사용된 생물반응기는 유리로 된 5L 용량의 종래의 수직 원통형 생물반응기와 본 발명의 생물반응기로서 교반기는 장착하지 않았다. 상황버섯 균사체는 100ml의 감자 덱스트로즈 브로쓰(Difco. Co.) 복합배지가 함유된 500ml 삼각플라스크에서 5일 내지 10일 배양한 균사체를 다시 200ml 내지 300ml의 CVM 완전배지가 들어있는 1L 삼각플라스크에 종균 10%(v/v)으로 접종한 후, 5일 내지 10일 배양한 배양액을 10%(v/v) 종균으로 사용하였다. 종균으로 사용하는 균사체를 멸균된 믹서기에 넣은 후 균질화시켜 수직 원통형 생물반응기 및 본 발명의 생물반응기에 각각 접종하였다. 상황버섯 균사체의 배양환경은 공기주입속도를 0.1vvm 내지 1vvm으로 조정하여 공급하였다. 공기주입속도 1vvm 이상에서는 다량의 거품발생으로 인하여 균사체가 배양기 벽면에 붙어 자라는 경향이 있어서 공기주입속도는 1vvm 이하로 조정하였다. 배양온도는 배양실내에 온냉방기를 설치하여 실내 온도를 20℃ 내지 35℃로 조정하여 5일 내지 10일간 배양하였다. 생물반응기는 오토클레이브를 이용하여 121℃로 20분에서 1시간 동안 실시하였고, 멸균 후 배양기내의 수분을 제거하기 위하여 건조기에서 1시간 동안 건조하였다. 배양종료 후 배양 균사체는 여과지로 여과하고 증류수로 2-3회 세척한 후 건조기에서 105℃, 8시간 동안 건조한 다음 균사체의 무게를 측정하였다. 이의 결과는 하기 표 1에 기술된 바와 같다.

구분	수직원통형 생물반응기	본 발명의 생물반응기
건조균사체량(g/L)	9	13
배양일 수(일)	7	7

위 결과로부터 알 수 있듯이 본 발명의 생물반응기에서의 건조 균사체 건조무게는 13g/L로 나타났으며, 종래와 같은 균사체 침전현상은 나타나지 않았다. 그러나, 수직원통형 생물반응기에서는 건조균사체 무게는 9g/L로서 균사체 성장이 원활하지 못했으며 또한 배양기 하부에 사각지대로 인한 균사체 침전현상이 발생하였다.

<실시예 2: 배양 용기의 테이퍼 각도에 따른 균사체 생산성>

유리 재질로서 5L들이 용량이고, 배양 용기의 테이퍼 각도가 수직방향에 대하여 각각 90°(즉, 수직원통형), 60°, 45°, 37.5°, 30°, 15°인 생물반응기를제작하여 실험에 사용하였다. 상황버섯 균사체는 100ml의 감자 덱스트로즈 브로쓰(Difco. Co.) 복합 배지가 함유된 500ml 삼각 플라스크에서 5일 내지 10일 배양한 균사체를 다시 200ml 내지 300ml의 CVM 완전 배지가 들어있는 1L 삼각 플라스크에 종균 10%(v/v)으로 접종한 후, 5일 내지 10일 배양한 다음 이 배양액을 10%(v/v) 종균으로 사용하였다. 종균으로 사용하는 균사체를 멸균된 믹서기에 넣은 후 균질화시켜 각각의 생물반응기에 접종하였다. 상황버섯 균사체 배양환경은 공기주입속도를 0.1vvm 내지 1vvm으로 조정하여 공급하였다. 공기주입속도 1vvm 이상에서는 다량의 거품발생으로 인하여 균사체가 배양기 벽면에 붙어 자라는 경향이 있어서 공기주입속도는 1vvm 이하로 조정하였다. 배양온도는 배양실내에 온냉방기를 설치하여 실내 온도를 20℃ 내지 35℃로 조정하여 5일 내지 10일간 배양하였다. 생물반응기는 오토클레이브를 이용하여 121℃로 20분에서 1시간동안 실시하였고, 멸균 후 배양기내의 수분을 제거하기 위하여 건조기에서 1시간동안 건조하였다. 배양종료 후 배양 균사체는 여과지로 여과하고 증류수로 2-3회 세척한 후 건조기에서 105℃로 8시간 동안 건조 후 균사체 무게를 측정하였다. 이 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.

구분	반응 용기의 테이퍼 각도
구분	90°	60°	45°	37.5°	30°	15°
건조균사체량(g/L)	9.6	11.8	12.7	13.1	12.0	11.2
배양일 수(일)	7	7	7	7	7	7

위 결과로부터 알 수 있듯이, 배양 용기의 테이퍼 각도가 60°에서 30°인생물반응기에서의 균사체 성장속도는 양호하였다. 그러나, 각도가 30°이하가 되면 공기의 급격한 상승으로 배양배지의 거품이 과다하게 발생하였고, 똑같은 배양부피를 맞추기 위해서는 배양기 높이가 다른 배양기에 비해 너무 높아져서 향후 배양공정 대형화(scale up)에 문제가 발생할 수 있는 것으로 나타났다.

<실시예 3: 교반 효과>

생물반응기는 유리 재질 및 5L 용량으로 종래의 수직원통형 반응기 및 본 발명의 반응기로 제작하고, 여기에 각각 교반기(IKA, RW-20.n)를 장착하였다. 상황버섯 균사체는 100ml의 감자 덱스트로즈 브로쓰(Difco. Co.) 복합배지가 함유된 500ml 삼각플라스크에서 5일 내지 10일 배양한 균사체를 다시 200ml 내지 300ml의 CVM 완전배지가 함유된 1L 삼각플라스크에 종균 10%(v/v)으로 접종한 후 5일 내지 10일 배양한 다음 이 배양액을 10%(v/v) 종균으로 사용하였다. 종균으로 사용하는 균사체는 멸균된 믹서기에 넣은 후 균질화시켜 각각의 생물반응기에 접종하였다. 상황버섯 균사체 배양환경은 공기주입속도를 0.1vvm 내지 1vvm으로 조정하여 공급하였다. 공기주입속도 1vvm 이상에서는 다량의 거품발생으로 인하여 균사체가 배양기 벽면에 붙어자라는 경향이 있어서 공기주입속도는 1vvm 이하로 조정하였다. 교반속도는 교반모터에 장착되어 있는 교반속도 조절기로 50rpm에서 300rpm으로 조절하였다. 배양온도는 배양실내에 온냉방기를 설치하여 실내 온도를 20℃ 내지 35℃로 조정하여 5일 내지 10일간 배양하였다. 생물반응기는 교반축을 장착한 후 오토클레이브를 이용하여 121℃로 20분에서 1시간동안 실시하였고, 멸균 후 배양기내의 수분을 제거하기 위하여 건조기에서 1시간동안 건조하였다. 멸균 후 교반축을장착한 생물반응기는 외부에서 교반모터와 연결하였다. 배양종료 후 배양 균사체는 여과지로 여과하고 증류수로 2-3회 세척한 후 건조기에서 105℃, 8시간 동안 건조 후 균사체 무게를 측정하였다. 이의 결과는 하기 표 3에 기술되어 있다.

구분	수직원통형생물반응기	본 발명의 생물반응기
건조균사체량(g/L)	17	26
배 양 일 수(일)	7	7

위 결과로부터 수직원통형 생물반응기에서는 건조균사체 무게는 17g/L로서 균사체 성장이 원활하지 못했다. 또한 배양기 하부에 사각지대로 인하여 균사체량이 7g/L이상 되었을 때부터 침전현상이 관찰되었다. 반면에, 본 발명의 교반기가 장착된 생물반응기에서 건조 균사체 건조무게는 26g/L로 교반기가 장착되지 않은 본 발명의 생물반응기의 13g/L(실시예 1) 보다 균사체 생산수율이 2배 이상 증가하였다.

<실시예 4 : 스파자에 따른 산소전달계수>

산소전달계수 측정은 이를 위해 비교적 간단하게 수행할 수 있는 '다이나믹 방법(dynamic method)'을 사용하였다(Stanbury, P.F., Whitaker, A., and S.J. Hall 1994, In principles of Fermentation Technology, 2nd ed.). 다이나믹 방법은 기체 산소의 용존산소로의 전달률(oxygen transfer rate)과 미생물의 산소 흡수율(oxygen uptake rate)을 측정하여 용존산소에 근거한 물질수지식으로부터 산소전달계수(oxygen transfer rate coefficient,k _L a)를 측정하는 방법으로 세포배양액과 미생물이 존재하는 실제 발효 진행시에도 산소전달계수를 간편하고 정확하게 측정할 수 있다. 다이나믹 방법에서 사용되는 용존산소에 대한 물질수지식은 다음과 같다.

상기식에서, C_L은 발효배양액 내의 용존산소 농도 (mg O₂/L)이고, C^* _L는 포화 용존산소 농도(mg O₂/L)이며, q_O2는 세포당의 산소흡수율(specific oxygen uptake rate, mg O₂/g cell/h)이며, X는 배양액 내의 세포농도(g cell/L)이다.

배양중 어느 한 시점에서 공기의 공급을 멈추면 상기식의 k_La는 0이므로 배양액의 용존 산소농도는 다음 식을 만족하면서 감소하게 된다.

따라서, t에 대한 C_L선의 기울기를 측정함으로서 세포의 산소흡수율 q_O2X를 측정할 수 있다. 일정 시점이 지난 후 공기를 다시 발효조로 공급하면, 배양액내의 용존산소는 (1)식의 물질수지식을 만족하면서 증가할 것이다. 이 때 (1)식을 다시 정리하여 직선관계식으로 재배열하면 다음과 같다.

상기 (3)식으로부터에 대한 C_L의 플롯은 기울기가이며 y축의 절편이 C^* _L인 직선이므로 이로부터 기울기를 계산함으로써 산소전달계수인k _La 가 측정된다. 여기서 C_L=C⁰ _L(final steady dissolved-oxygen concentration)일 때, q_O2X =k _L a(C^* _L- C⁰ _L) 이므로 (1)식은

이 된다. (4)식을 t₂와 t₁사이에서 적분하여 정리하면

가 되므로 좌변을 Y 좌표로 우변의 (t₂-t₁)을 X 좌표로 교반속도나 공기유량 변화에 따른 C_L을 도시하여 그 기울기로부터 산소전달계수를 구할 수 있게 된다.

상기 수식에 의해 본 발명의 생물반응기에서 공기주입 장치가 3.14㎠의 동전형태이고, 스파자의 개수가 4, 8, 16개이고, 구경이 각각 0.5㎛, 2㎛, 5㎛, 10㎛일 경우의 산소전달계수를 측정하여, 일반적으로 미생물 배양에 많이 사용하고 있는구경이 1mm인 스파자와 비교하였다. 그 결과, 표 4과 같이 산소전달계수로서 나타났다.

구분	스파자 수	메쉬형 스파자	일반 스파자
구분	스파자 수	0.5㎛ 구경	2㎛ 구경	5㎛ 구경	10㎛ 구경	1mm 구경
산소전달계수(K_La)	4	0.153 min^-1	0.171 min^-1	0.167 min^-1	0.176 min^-1	0.041 min^-1
	8	0.161 min^-1	0.182 min^-1	0.175 min^-1	0.183 min^-1	0.052 min^-1
	16	0.173 min^-1	0.189 min^-1	0.182 min^-1	0.197 min^-1	0.058 min^-1

위 결과로부터, 본 발명의 메쉬형 스파자자 종래의 일반 스파자에 비해 산소 전달 계수가 높으며, 그 효과는 스파자 수가 증가할 수록 증대됨을 알 수 있다.

<실시예 5: 교반속도에 따른 산소 전달계수>

본 발명의 생물반응기에서 공기주입속도를 0.1vvm으로 고정하고 교반속도(agitation speed)를 0rpm, 100rpm, 150rpm 및 200rpm로 하여, 각 산소전달계수를 측정하여 그 결과를 도 7에 도시하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 실험 결과 교반을 하지 않고 공기만 주입하였을 경우 산소전달계수가 0.13(min^-1)이었으나 속도를 100rpm로 교반한 경우는 산소전달계수가 0.2828(min^-1), 150rpm로 교반한 경우는 산소전달계수가 0.4841(min^-1)로서 최대 3.7배 정도 산소전달율이 증가하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 생물반응기는 반응기의 하단면을 30 내지 60°로 테이퍼 처리함으로써 배양생물의 침전현상을 방지하고, 복수개의 메쉬형 스파자를 갖는 공기공급 장치를 설치함으로써 세포순환이 원활할 뿐만 아니라, 배양중기 이후 배양기내 세포의 밀도가 높아지는 경우를 대비하여 교반기를 장착하여 산소전달계수를 약 3.7배 이상 향상시킴으로써 세포엉김을 억제하고 물질순환이 원활히 이루어져, 결과적으로 고밀도 세포성장을 유도하는 효과를 제공하므로 산업적으로 매우 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Claims

소정지점에서 수직방향에 대하여 내측으로 30 내지 60°테이퍼진 원통형의 배양용기; 및

상기 배양용기의 밑면에 장착된, 구경이 0.05 내지 10 ㎛인 한 개 내지 복수개의 메쉬형 스파자를 구비한 원판 형태의 공기주입 장치를 포함하는 미생물 배양용 생물반응기.
제1항에 있어서, 상기 배양용기의 내부에 교반기를 더 포함하는 미생물 배양용 생물반응기.
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