KR100362896B1 - 마누카오일을주성분으로함유하는항균,항염및피부보호용외용제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 립토스퍼뭄 스코파리움(Leptospermum scoparium) 또는 렙토스퍼뭄 이리코이데스(Leptospermum ericoides)의 잎, 잔가지, 열매 또는 껍질에서 추출된 마누카 오일을 활성성분으로 함유하고 필요하면 항균제, 비타민제, 호르몬제, 항히스타민제등에서 선택된 1종이상의 유효성분을 더 함유하고 연고제, 크림제 또는 액제에 통상으로 사용되는 기제 및 보조제와 혼합하여 통상의 연고제, 크림제 또는 액제의 제조방법에 의하여 제조된 외용제를 제공하는 것이며, 본 발명의 외용제는 항균, 항염 및 피부보호작용을 가진다.

Description

마누카 오일을 주성분으로 함유하는 항균, 항염 및 피부보호용 외용제

본 발명은 마누카 오일(Manuka oil)을 주성분으로 함유하는 항균, 항염 및 피부보호용 치용제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

마누카 오일(및 카누카 오일)은 뉴질랜드에서 자생하는 렙토스퍼뭄 스코파리음(Leptospermum scoparium)(Manuka tree) 및 렙토스퍼뭄 에리코이데스(Leptospermum ericoides)(Kanuka tree)의 잎, 잔가지, 과실 및 껍질에서 추출한 식물성 오일이다. 카누카 나무에서 추출한 오일은 카누카 오일이라 하며, 마누카 오일과 같은 성분을 함유하고 있다. 따라서 본 발명의 명세서에서는 "마누카 오일"에는 카누카 오일을 함께 지칭한다.

렙토스퍼뭄 스코파리움 및 렙토스퍼뭄 에리코이데스는 뉴질랜드 전역에 풍부하게 자생하는 관목류이다.

마누카 오일에는 휘발성 정유성분이 다량 함유되어 있으며, 이중 테르베노이드(Terpenoid)계 성분으로는 모노테르페노이드 성분으로 알파-피넨(alpha-pinene),알파-테르피놀(alpha-terpinol), 1,8-시네올(1,8-cineole), p-사이멘(p-cymene)등이 존재하며, 세스키테르페노이드계 성분으로 비리디플로롤(viridiflorol) 및 이소메릭 알파, 베타, 감마-유데스몰류(isomeric alpha, beta, gamma-eudesmols)를 함유하고 있다.

또한 폴리페놀류(polyphenols) 및 탄닌(tannin)이 함유되어 있다.

렌토스퍼뭄속 관목류는 민간약으로서 전통적으로 마오리족이나 초기 유럽이주민들이 다음과 같은 용도로 사용하여 왔다.

1) 마누카 잎의 좋은 맛과 향을 이용하여 차(tea)로 상용한다.

2) 잎 및 어린 가지는 증기욕으로 사용.

3) 잎을 달여 비뇨기 질환 및 해열제로 복용.

4) 다량 복용시에 이뇨작용이 있어 수종환자(dropsy)에게 잎을 끓여 복용케 함.

5) 이질치료목적으로 어린 가지를 씹는다.

6) 내피를 우려낸 물을 내복하여 진정 및 수면유도에 사용.

7) 으깬 껍질을 끓는 물에 적셔서 여성의 유방울혈중에 사용.

8) 잎 및 껍질을 달여 등이 뻐근할 때나 관절 류마치스의 치료에 사용.

9) 껍질 조각을 끓여 액을 변비치료로 사용.

10) 내피를 끓인 액을 가글, 구강세척 및 안구세척에 사용.

11) 이물리언트 화이트 검(emolient white gum)은 유아 피부보호, 화상치료, 심한 감기 및 변비의 완화에 사용.

12) 줄기의 수액은 혈액 및 호흡을 정화시키는 효과.

그러나 마누카 오일이 항균, 항염 및 피부보호작용을 가지고 있다는 보고는 발표된 바 없으며, 마누카 오일을 주성분으로 함유하는 외용제를 제조한 바도 없다.

본 발명자들은 마누카 오일의 여러종류의 효능에 대하여 검증실험을 하던중 마누카 오일이 강력한 항균, 항염 및 피부보호작용이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은 마누카 오일을 주성분으로 함유하는 항균, 항염 및 피부보호용 외용제를 제공하는 것이다.

본 발명에서 외용제란, 연고제, 크림제, 액제,파스타제 등을 말하다.

최근 항생물질이나 부신피질 호르몬제가 여러가지의 질병의 치료에 많이 사용되면서부터 세균의 번식은 강력하게 억제된 반면, 항생물질에 영향을 받지 않는 곰팡이는 점차 증가되고 있는 추세이다(균교대현상). 즉, 과도하고 무절제한 항생제 및 부신피질호르몬의 남용, 오용의 결과 진균증이 급속히 증가되고 있는 실정이다. 진균증의 치료는 일반세균감염증과 마찬가지로 원인 곰팡이를 분리 확인한 후 이에 적절한 약물을 선택하여 치료하는 것이 원칙이며, 내복약을 사용하는 것보다 어느모로 보면 피부연고제를 사용하는 것이 더욱 중요하고 효과적이다.

이에 본 발명자들은 마누카 오일의 피부미화작용, 항균 및 항진균작용이 있는 사실을 발견하여 그 물리화학적 성질을 파악하고, 특히 피부에 노출되는 시간이 길은 제제의 개발에 따라 고려되는 피부작용 반응시험으로 급성독성과 광용혈작용, 피부자극시험, 살균 및 항진균시험을 행하고 제제의 설계 및 이에 부수되는 적절한방부제의 선택과 제제의 안정성 및 피부에 대한 적용성을 실험하였다.

마누카 오일은 단독으로 사용될 수도 있으며, 또한 다른 항균제, 비타민제, 항히스타민제, 호르몬제 및 기타 유용한 물질과 병용하여 사용될 수도 있다.

마누카 오일 및 카누카 오일은 다음과 같이 제조한다.

실시예 1

마누카 오일의 제조:

마누카 나무 및 카누카 나무의 잎과 잔가지를 수확하여 건조시킨후 마른 잎과 잔가지들을 잘게 절단하고 수증기 중류하여 나오는 혼합증기를 냉각하여 오일층과 물층을 분리한 후 오일층을 분리하여 여과하여 마누카 오일을 제조한다.

실험예:

시험재료 및 시험방법

1. 시약 및 기기

1) 시약

마누카 오일

2) 사용 균주

그람양성: 스타필로코커스 아우리우스 1916(Staphylucoccus aureus 1916)바실러스 섭틸리스 1021(Bacillus subtillis 1021)

마이크로코커스 fnxpdntm 1915(Micrococcus luteus 1915)

그람음성: 슈도모나스 아에루기노사 2513(Pseudomonas aeruginosa 2513)에스체리치아 콜라이 1682(Eschcrichia coli 1682)

크렙시엘라 유모니아에 2001(Klebsiella pneumoniae 2001)

프로테우스 불가리스 2433(Proteus vulgaris 2433)

효모(Yeast): 칸디다 알비칸스 1940(Candida albicans 1940)

진균(Funi): 아스페르길루스 니거 1374(Aspergillus niger 1374)

3) 기기

UV 스펙트로포토메타(Pye Unicam 8800), 원심분리기(Wifug), UVA(black-light fluorescent tube 40W, Digital grating spectrophotometer(Cecil 293 scries 2), Cooling photomultiplier tube monochro meter(Jarell-Ash), DSC, Particle size analyser, Ointment tester, Chemical balance(Metler), Vacuum dry oven, Life tester, Incubater, Autoclave, Mechanical stirrer, Homoenizer, Water bath, Autoclave, Clean bench, UV-spectrophotometer, microscope, Phase contrast microscope.

4) 실험동물

급성독성에는 ICR계 마우스를 4-5주간 사육한 것을 암컷 24-33g의 것을 사용하였고, 피부자극시험과 안점막자극시험에는 뉴질랜드 화이트 토끼를 체중이 2.2-2.5kg의 것을 사용하였다.

2. 실험방법

1) 급성독성시험: ICR계 마우스, 4-5주령 암컷 24-28g, 수컷 27-33g의 것을 사용하여, 투약전 약 16시간 절식시키고 절식도중 물은 섭취시켰다.

예비설험을 실시한 다음 투약량을 500mg/kg으로부터 5,000mg/kg까지로 투여 용량을 설정하고, 검체를 유탁액으로 만든 다음 존대를 이용하여 1군당 각각 5마리의 위내에 강제로 경구투여하고 투여후 물과 사료는 자유롭게 섭취시켜서 5시간동안은 자주 관찰하고 그 이후에는 하루 1회 이상 관찰하면서 14일간 폐사여부와 임상증상을 관찰하였다. 이 물질의 고유한 상대적 특성을 밝히기 위하여 마우스에 각종량의 약물을 경구투여하고 리치필드와 월콕슨의 방법에 따라서 LD₅₀을 계산한 결과는 다음 표 1과 같다.

표 1: 1회경구투여후 마우스에 대한 마누카 오일의 급성독성

이상의 실험결과 본 발명의 마누카 오일은 급성독성이 매우 적었다.

2) 피부자극시험: 피부자극시험은 뉴질랜드 화이트 토끼, 숫컷 2.2-2.5kg되는 것을 사용하였다. 토끼 6마리를 약물적용 24시간전에 투여부위(dosal area)의 앙쪽을 약 6cm²정도 클리퍼로 제모하였다. 검체는 무게로 동물 마리당 0.5g씩 투여부분의 오른쪽 부위애 적용하고 적용하지않은 왼쪽부위에는 대조로 사용 4시간 후 검체를 제거하고 비누물로 적용부위를 깨끗이 닦아내어 1시간, 1일, 2일, 3일 및 7일애 홍반과 부종을 관찰하였다.

그 결과는 다음의 표 2와 3에 나타내었다.

표 2: 토끼에서 마누카 오일에 대한 홍반실험(n=6)

이상의 실험결과로부터 확인되는 바와 같이 본 발명의 마누카 오일은 홍반이 전혀 나타나지 않았다.

표 3: 토끼에서 마누카 오일에 대한 부종실험(n=6)

이상의 실험결과로부터 확인되는 바와 같이 본 발명의 마누카 오일은 부종이 전혀 나타나지않았다.

3) 안막자극시험: OECD의 시험법에 따라 10%-유탁액으로 한 검체 0.1ml/마리 를 적용시켰다. 즉 가토의 양쪽눈을 시험개시 24시간전에 검사하여 눈에 이상이 없는 동물을 사용하여 오른쪽 눈에 넣은 다음 1시간, 1일, 2일, 3일 및 7일간 왼쪽눈과 비교하여 각막장해, 부종등을 관찰하였다.

그 결과를 다음의 표 4 및 5에 나타내었다.

표 4: 토끼의 눈에서 마누카 오일에 대한 안막실험(n=4)

표 5: 토끼의 눈에서 마누카 오일에 대한 부종실험(n=4)

이상의 실험에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 마누카 오일은 토끼의 눈에서 각막장애나 부종은 나타나지 않았다.

4) UV조사시험: 약물의 농도가 5×10^-5M인 포스페이트 완충 염수(phosphate buffered saline: pH 7.4, 0.05M)용액의 UV흡수 스펙트럼을 측정하고 따로 위의 시료에 UVA를 30분간 조사한다음 같은 조건으로 스펙트럼을 측정하여 스펙트럼의 변화를 측정하였다.

그 결과를 제 1도에 나타내었다.

이 실험에서 확인되는 바와 같이, 260nm 부근에서 극대 흡수가 나타났으며, UV조사후 극대 흡수파장이 약간 단파장쪽으로 이동한 것은 정확히 설명할 수는 없으나, 이는 용매의 효과로 생각된다. 또한 UV조사후의 흡광도가 약간 작아진 것은 UV조사에 의하여 약물의 흡광도가 일반적으로 감소한다는 륭그렌등의 보고와 일치하는 현상이었다.(Ljunggren. B. and Moller. H.: Phenothiaine phototoxicity: an experimental study on chloropromazine ad its metbolites. J. Invest. Dermatol. 68, 313-317(1977)).

5) 광용혈작용에 대한 시험: 광용혈(Photohemolysis)은 칸(Kahn)등의 방법에 준하여 시약처리하여 측정하였다. 즉, 일정량의 약물완충용액 5ml에 20v/v% 적혈구(RBC)생리식염용액 50ul를 넣어 마누카 오일 - RBC 유탁액(500 : 1)을 만든다. 음 일정시간 UVA를 조사(암실, 10cm거리)하고 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액 3ml를 취해서 Drabkin's 용액(K₃Fe(CN)₆200mg, KCN 50mg, KH₂PO₄140mg, TritonX100 0.5ml를 증류수로 희석하여 1000ml로 한 것) 1ml를 넣어 생성된 cyanmethemoglobin의 흡광도를 540nm에서 측정하고 대조물과 비교하여 광용혈비를 구하였다.

피부적용 약물의 광에 대한 작용중에서 광용혈은 대단히 중요한 문제이다. 따라서 광용혈을 칸등의 방법에 준하여 농도별, 조사시간별로 측정한 결과는 다음과 같다.

(1) 약물의 농도애 따른 광용혈: 0.05M Phosphate buffed saline(pH7.4)으로약물을 1ug/ml, 25ug/ml, 50ug/ml, 100ug/ml 용액으로 만든다음 광용혈실험방법에 따라 10cm거리에서 UVA를 10분간(1.5J/cm²)조사하여 광용혈을 측정하였다.

그 결과는 다음의 표 6에 나타내었다.

표 6: 10cm거리에서 10분간 UVA 조사하에서 마누카 오일의

농도(ug/ml)에 따른 광용혈 효과(%)

즉 100ug/ml까지의 농도에서 광용혈작용을 인지할 수 없었다.

(2) UVA조사시간에 따른 약물의 광용혈 시험: 시료약물을 0.05M phosphate buffered saline(pH 7.4)에 약물을 녹여 농도 25ug/ml용액으로 한다음, 광용혈실험방법에 따라 10cm거리에서 UVA를 1분(0.15J/cm²), 10분(1.5J/cm²), 30분(4.5J/cm²), 60분(9.0J/cm²), 120분(18.0J/cm²), 240분(36.0J/cm²)조사하여 광용혈의 유무를 판단한다.

그 결과를 다음의 표 7에 나타내었다.

표 7: 10cm거리에서 10분간 UVA조사에 의한 마누카 오일의 광용혈 효과(%)

본 실험애서도 어떠한 광용혈작용도 괸찰 할 수 없었다.

(3) 독성물질의 생성에 대한 실험: 약물농도가 5Oug/ml인 0.05M phosphatebuffered saline(pH 7.4) 용액 5ml에 미리 UVA를 10분(4.5J/cm²)간 조사한후 20v/v% RBC 생리식염용액 50ul를 넣고 상온에서 10분간 방치한후 용혈을 측정한 것과 광용혈측정방법에 따라 측정한 값을 비교하여 독성물질의 생성여부를 검토하였다.

그 결과를 다음의 표 8에 나타내었다.

표 8: 용혈측정방법에 의하여 측정된 마누카 오일의 투여전과

투여후의 UVA조사의 의한 독성물질의 생성에 대한 비교

즉, 광용혈작용은 약물이 UV조사에 의해 여기상태(excited state)가 된뒤 기저상태(ground state)로 되면서 방출되는 에너지가 세포막을 과산화(peroxidation)시켜서 콜로이드 삼투 용혈(Colloid osmotic hemolysis)(Edward. S. and Rina. S.: Drug-induced photosensitivity. JAPA. 13(4), 200-204(1973); Harber. L. C. and Baer. R. L.: Pathogenic mechanisms of drug-induced photosensitivity. J. Invest. Dermatol. 58(6), 327-342(1972))을 일으키는 것과, UV 조사에 의하여 약물이 독성 광화학생성물을 형성하여 광용혈작용을 일으키는 두가지 기전으로 분류된다.(Klaassen. C. D., Amdur. M. O. and Doull. J., : Casarett ad Doull's Toxicology. Macmillan, 3rd, 412-431(1986); Saucin. M.: Mechanisms of phothsensitazation by phenothiazine derivatives. Arch. Int. Physiol. Biochem. 87, 1051-1052(1979): and Guy. F. W., Hays. H. K. and Albert. M. K.:Phototoxicity from benoxaprofen: in vivo and in vitro studies. Photochem. Phtobiol. 36, 59-64(1982)).

이 두기전을 실험결과와 비교하여 볼 때 마누카 오일을 UV조사후에 적혈구를 넣을 때는 광용혈작용이 없었고, 또한 약물과 적혈구 유탁액에 UVA를 조사하였을 때도 광용혈작용이 일어나지 않아서 마누카 오일은 광독성이 없는 것으로 생각된다.

이상의 실험에 의하여 마누카 오일은 피부보호작용이 있는 것으로 생각된다.

6) 살균력 시험: 마누카 오일은 다음과 같은 처방으로 시료를 가용화하여 검액을 제조하여 시험에 사용하였다.

(1) MIC(Minimum Inhibitory Concentration)

가) 세균시험: 시험용 균을 입수하여 균주마다 최적의 브로스(broth)배지에 37℃인큐베이터에서 24시간 배양하고 적당한 농도로 희석시켜 530nm에서 흡광도가 0.2되도록 조절한후 각각 균액으로 하였다.

시험관에 배지를 5ml씩 넣고 제조한 검체를 5ml가하여 균일하게 혼합시킨후,2배씩 계열희석하고 각 시험관에 위의 균액을 30uml씩 주입하고 잘 섞어준후 37℃에서 24시간 배양하고 균주의 증식을 억제한 최소농도를 육안으로 관찰하였다.

단, MIC가 높아서 시료자체의 탁도와 분별이 모호한 경우에는 배양액을 페이스 콘트라스트 현미경(phase contrast microscope)상에서 관찰하여 생균의 존재여부를 확인하고 염색하여 일반적인 현미경으로 관찰하여 MIC를 확정지었다.

나) 이스트와 진균류에 대한 시험: 시험용 균을 구입하여 균주마다 최적의 브로스 배지에 26℃인큐베이터에서 24시간 배양하고 적당한 농도로 희석시켜 530nm에서 흡광도가 0.2되도록 조절한후 각각 균액으로 제조하였다.

시험관에 균마다 적합한 한천배지를 10ml씩 넣고 제조한 검체를 10ml 가하여 균일하게 혼합한후 2배씩 계열희석하고 한천배지가 굳기전에 페트리 접시에 부어한천/오일 슬로프를 제조하였다.

제조한 배지 표면에 위의 균액을 30ml씩 주입한후 콘로드(corn rod)를 사용하여 잘 펴준후 25℃에서 24시간 배양한후 균주의 증식을 억제한 최소농도를 육안으로 관찰하였다.

그 결과를 다음의 표 9에 나타내었다.

표 9: 최소억제농도MIC에 의하여 측정된 항균활성

상기의 항균력실험으로부터 알 수 있는 바와 같이, 화농이나 염증을 일으키는 원인균인 스타필로코커스 아우레우스, 마이크호코커스 루테우스, 스트렙토코커스 파에카티스등과 칸디다 알비칸스 및 아스페르길루스 니거 등에는 비교적 항균활성이 크며, 그람음성균에는 항균력이 별로 없는 것으로 판단된다.

따라서 본원발명의 마누카 오일은 항균제로 사용될 수 있다.

제제실시예

외용 연고제 및 크림제를 개발하기 위하여 테포스(Tefose)와 고급알콜류, 스테아린산계 및 기타 연고제나 크림제에 통상으로 사용되는 기제 및 보조제등을 사용하여 연고제 및 크림제를 제조하고 이에 대한 제제학적인 제성질(諸性質)을 시험하였다.

즉, 설계에 따라 유상과 수상을 분리 용해하고 약 25 - 70℃에서 양액을 가온하고 호모믹서를 사용하여 1000-3000rpm으로 교반하면서 유성액에 수성액을 수분 내지 수시간 주가하고 서서히 냉각시켜서 제조하었다.

제제실시예 1:

제제실시예 2:

제제실시예 3:

제제실시예 4:

제제실시예 5:

제제실시예 6:

본 발명의 외용제는 다른 항균제, 비타민제, 호르몬제, 항히스타민제 또는 기타 유용한 물질을 병용하여 외용제를 제조할 수도 있다.

제제실시예 7:

제제실시예 8:

제 1도는 UV조사실험결과를 나타낸 그래프이다.

Claims (1)

1. 랩토스퍼뭄 스코파리움 또는 랩토스퍼뭄 에리코이데스에서 추출한 마누카 오일을 활성성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부보호용 외용제 조성물.

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