KR100358020B1 - 러넬라 아쿠아틸리스로부터 유래된 프로모터와 전사 터미네이터 및 이들을 포함하는 대장균용 발현 벡터 - Google Patents

러넬라 아쿠아틸리스로부터 유래된 프로모터와 전사 터미네이터 및 이들을 포함하는 대장균용 발현 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 러넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilisATCC 33071)로부터 유래되고 대장균에서 강력한 기능을 발휘하는 프로모터와 전사 터미네이터, 및 이를 포함하는 대장균용 단백질 고발현 벡타에 관한 것이다. 이 대장균용 단백질 고발현 벡타는 대장균에서의 발현 정도가 유도성 발현계인 T7 프로모터를 이용한 발현계와 동등 또는 그 이상으로 외래단백질을 대장균에서 구성적으로 대량발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

러넬라 아쿠아틸리스로부터 유래된 프로모터와 전사 터미네이터 및 이들을 포함하는 대장균용 발현 벡터{PROMOTER AND TRANSCRIPTION TERMINATOR DERIVED FROM RAHNELLA AQUATILIS AND AN EXPRESSION VECTOR COMPRISING THEM FOR USE IN ESCHERICHIA COLI}
유용 단백질의 재조합 단백질 또는 펩타이드의 대량생산은 현재 미생물(대장균, 고초균, 효모, 곰팡이)에 의한 생산이 주류를 이루고 있다. 숙주세포나 목적 생성물의 종류에 따라 외래 목적물의 발현양, 불.수용성 여부, 발현 장소, 당부가반응 등이 각기 다른 것으로 알려지고 있다. 따라서 대량생산하고자 하는 단백질의 발현에 적당한 발현 시스템을 선택, 구성하여야 효율적인 생산계를 구축할 수 있다.
대장균에서 외래단백질을 대량생산하기 위한 발현계의 구성은 조절 요소(control element; 활성화 및 억제), 프로모터, N-말단 영역의 DNA 서열, 터미네이터, 선택 표지, 복제 기점 등으로 구성되어 있으며 대장균에서 발현에 효과적인 것으로 알려진 각 요소들은 단독 또는 복합적으로 선택되어 사용되고 있다.
대장균에서 단백질을 대량생산하기 위한 프로모터 시스템이 많이 개발되었으며 실제 산업적으로 가장 많이 이용되는 프로모터는 온도 유도성인 λPL 프로모터와 화학제 유도성인 trp 프로모터가 있으며 학문적으로는 IPTG 유도성인 tac나 trc 프로모터가 많이 이용되고 있다. 그러나 IPTG는 고가의 화합물이며 독성때문에 산업적으로는 사용되고 있지 않다. 이외에도 혐기적 조건에서 발현되는 nar 프로모터(Lee J. et al.,Biotechnol. Lett., 18, 129-134, 1996), 낮은 온도에서 발현되는 λPL 프로모터(Giladi et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2184-2188, 1995), pH에 의해 조절되는 CadA 프로모터(San K. Y.,Ann. NY Acad. Sci., 721, 268-276, 1994)등이 있다.
국내의 경우, 대장균에서 단백질을 생산하기 위한 프로모터로 2종(산소의존형 유도성 프로모터, 특허출원 공개 제97-061912호; 효모와 대장균의 두가지 프로모터 활성을 가진 신규 DNA 및 그 분리방법, 특허출원 공개 제89-005262호)이 개발되었을 뿐인데, 이들은 발현 정도가 낮아 재조합 단백질을 대장균에서 대량생산하기 위한 산업용 발현계로 사용하기에는 제한이 있다.
이에 본 발명자들은 대장균에서 저경비, 고수율로 외래 단백질을 생산할 수 있는 대장균용 단백질 발현계를 개발하기 위해 노력한 결과, 대장균에서 높은 효율을 나타내는 신규 프로모터 및 터미네이터를 발견하고 이들을 포함하는 발현 벡터가 대장균에서 외래 단백질을 40 %이상의 고수율로 생산할 수 있음을 확인함으로써본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 산업적으로 유용하게 이용될 수 있는 재조합 단백질 고발현용 프로모터 및 터미네이터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터, 터미네이터 및 유전자 삽입 클로닝부위를 가지며, 대장균에서 외래 단백질을 고수율로 발현할 수 있는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 외래 단백질을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 플라스미드 pRL1CP의 유전자 지도이다.
도 2는 플라스미드 pRL1CP를 함유한 대장균의 균체생육에 따른 레반슈크라제의 활성 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 플라스미드 pUC119 및 pRL1CP를 각각 함유하는 대장균에서 레반슈크라제의 발현을 SDS-PAGE로 분석하여 비교한 것이다.
도 4는 전사개시점 분석을 위해 대장균 전체 RNA를 이용하여 실시한 역전사 실험의 결과이다.
도 5는 플라스미드 pRL1CP와 결손변이 플라스미드들의 유전자 지도 및 각 결손변이주가 나타내는 레반슈크라제의 활성을 나타낸 것이다.
도 6a는 플라스미드 pRL1CP와 결손변이 플라스미드들의 유전자 지도이고, 도 6b는 결손변이 플라스미드 함유 대장균의 균체단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 7은 재조합 레반슈크라제 발현 벡터 pRL801의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 8은 플라스미드 pUC119 와 pRL2를 각각 함유하는 재조합 대장균에서 레반슈크라제의 발현을 SDS-PAGE로 분석하여 비교한 것이다.
도 9는 플라스미드 pUC119 와 pRZ4를 각각 함유하는 재조합 대장균에서 레반슈크라제의 발현을 SDS-PAGE로 분석하여 비교한 것이다.
도 10은 플라스미드 pUC119 및 pRS2를 각각 함유하는 재조합 대장균에서 유전자 조절 발현인자(LsrS) 단백질의 발현을 SDS-PAGE로 분석하여 비교한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 러넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilisATCC 33071)의 레반슈크라제 유전자(lsrA)의 상류 및 하류로부터 각각 분리된 대장균용 프로모터와 전사 터미네이터를 제공한다.
본 발명의 프로모터 영역('Plev')은 러넬라 아쿠아틸리스의 레반슈크라제 유전자(lsrA)의 상류쪽으로 첫번째 제한효소 ClaI 자리와lsrA유전자의 번역 개시 코돈(ATG) 사이의 서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호: 2의 DNA 염기서열을가진다. 서열번호: 2의 서열에서, 염기번호 1181 내지 1210은 서열번호: 5로 표시되는 프로모터이며, 1219번째 염기인 G(guanidine)가 본 발명의 프로모터 영역에 연결된 단백질 유전자의 전사개시점이다. 또한, 염기번호 416 내지 628은lsrA유전자의 발현을 촉진하는 발현촉진인자(activator)로서lsrS유전자로 명명되었고, 그의 염기서열 및 이에 의해 코드되는 아미노산 서열은 서열번호: 6 및 7로 각각 나타나 있다. 한편, 리보소옴 결합 부위인 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열(AAAGGA)이 염기번호 1258 내지 1262에 위치하고 있다.
본 발명의 프로모터는 구성형으로 대장균에서 발현되어 세포생육과 더불어 단백질이 발현되는 것을 특징으로 하며 통상적으로 대장균의 배양에 사용되는 배지 조성을 사용하여 대량발현을 시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 터미네이터는 러넬라 아쿠아틸리스의lsrA유전자의 2개의 연속된 번역종지 코돈(TAATGA)과lsrA유전자 하류쪽으로 첫번째 제한효소 ClaI 자리 사이의 서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호: 3의 DNA 염기서열을 가진다. 본 발명의 터미네이터는 서열번호: 9의 염기서열로 이루어진 역위 반복 서열을 포함하고 강력한 전사 종결 효과를 나타내므로 전사체를 안정화시켜 유전자의 발현을 촉진할 수 있다.
본 발명의 프로모터 및 전사 터미네이터는 러넬라 아쿠아틸리스에서lsrA유전자의 상류 및 하류 서열을 분리함으로써 얻거나, 서열번호: 2 또는 서열번호: 3의 염기서열을 갖도록 화학적 방법으로 합성할 수도 있다. 예를 들어, 러넬라 아쿠아틸리스에서lsrA유전자 및 그의 상류 및 하류 서열을 포함하는 약 3 Kb의 DNA단편을 분리하여 상기 프로모터 및 터미네이터를 얻을 수 있는데, 그러한 3 Kb DNA 단편은, 예를 들어, 서열번호: 1의 서열을 가진다. 서열번호: 1의 서열에서, 염기번호 1번 내지 1269번의 서열(1,269 bp)이 프로모터 영역이고, 염기번호 1270번 내지 2520번의 서열이lsrA유전자이고, 염기번호 2521번 내지 3027번의 서열(507 bp)이 터미네이터 영역이다. 본 발명의 프로모터 및 터미네이터는 클로닝에 이용할 수 있는 다수의 제한효소 자리들을 포함하므로, 발현벡터의 제조에 다양하게 이용될 수 있다.
본 발명의 프로모터 및 터미네이터를 외래 단백질 유전자와 함께 단백질의 발현이 가능하도록 적당한 벡터에 삽입하여 단백질 발현 벡터를 제조하고, 이를 적절한 대장균 숙주에 형질전환시키고, 형질전환된 균주를 배양함으로써 재조합 단백질을 생산할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 상기 프로모터 및 상기 전사 터미네이터를 포함하는 대장균용 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 역시 제공한다. 본 발명의 발현벡터는 바람직하게는 상기 프로모터와 전사 터미네이터 사이에 외래유전자를 도입할 클로닝 부위를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 프로모터, 5'-말단과 3'-말단에 NcoI과 MluI 자리를 각각 가지도록 변형된lsrA유전자, 및 상기 터미네이터를 포함하는 플라스미드 pRL801일 수 있다. 상기 플라스미드 pRL801에서lsrA유전자를 다른 외래 단백질의 유전자로 대치함으로써 다양한 발현 벡터를 제조할 수 있다.
본 발명의 형질전환체는 상기 발현 벡터로 적절한 숙주, 예를 들면, 대장균을 형질전환시킴으로써 제조할 수 있으며, 플라스미드 pRL1CP로 형질전환된 대장균 DH5@/EP70은 1999년 9월 6일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 8964P호로서 기탁되어 있다.
본 발명에 의해 형질전환된 대장균은 당분야에 공지된 적절한 배양배지에서 배양할 때 외래 단백질을 대장균 전체 단백질의 40 %이상으로 고발현하여, 공지된 대장균 프로모터인 T7 프로모터를 사용한 경우와 비교할 때 동등하거나 더 높은 수율을 나타낸다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 본 발명의 범위를 하기 실시예로 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 : 러넬라 아쿠아틸리스로부터 lsrA 유전자 상류부위의 염기서열 결정
러넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilisATCC 33071)로부터 추출한 염색체 DNA를 Sau3AI으로 부분 절단한 후, 미리 제한효소 BamHI 자리를 절단하여 디포소포릴레이션(dephosphorylation)시킨 클로닝 벡터 pUC119에 도입하여 라이브러리를 제조하였다. 이 라이브러리로부터 레반슈크라제 활성을 갖는 재조합 플라스미드 pRL1을 얻었다. pRL1에는 약 12 Kb의 DNA가 도입되어 있었으며 이로부터 결손변이법을 이용하여 레반슈크라제 활성을 보이는 약 3 Kb의 DNA 단편을 함유한 플라스미드 pRL1CP를 분리하였다. 플라스미드 pRL1CP의 유전자 지도는 도 1에 나타나 있다. 플라스미드 pRL1CP를 함유한 대장균의 레반슈크라제 활성을 조사하던 중 레반슈크라제 유전자(lsrA)가 대장균에서 대장균 전체 단백질의 약 40% 이상으로 고발현되는것을 발견하고, 레반슈크라제 유전자(lsrA)의 상류부위에 존재하는 프로모터 영역과lsrA유전자의 하류부위에 존재하는 전사 터미네이터의 염기서열을 결정하였다.
플라스미드 pRL1CP에 도입된lsrA유전자를 포함하는 약 3 Kb DNA의 염기서열을 결정하였다. 플라스미드 pRL1CP로부터 엑소멍빈 결손키트(Takara사)를 이용하여 재조합 결손 플라스미드를 제조하고 각 2 ㎍을 2 N NaOH로 변성시키고 초산 암모늄(pH 4.5)으로 중화시키고, 에탄올로 침전시킨 다음 물에 녹였다. 시쿼나제 키트(Sequenase kit, 미국 USB사 제품)를 이용하여 표지화(labelling)하고 반응액 4 ㎕를 3분간 끊인 후, 8 % 폴리아크릴아마이드/8 M 요소 겔로 1500-1700 V에서 약 3시간동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 겔을 건조시키고 X선 필름에 -70℃에서 8시간동안 노출시켜 각각의 결손 플라스미드의 DNA 염기서열을 판독하였다.
플라스미드 pRL1CP에 도입된 3 Kb의 DNA 단편은lsrA유전자의 상류쪽 제한효소 ClaI 자리와lsrA유전자 번역개시 코돈(ATG) 사이의 프로모터 영역(Plev프로모터) 1,269 bp와lsrA유전자 영역 1,251 bp, 그리고lsrA유전자의 2개의 연속된 번역종지 코돈(TAATGA)과lsrA유전자의 하류쪽 제한효소 ClaI 자리 사이의 터미네이터 영역 507 bp로 구성되어 있으며 전체 3,027 bp의 DNA가 도입되어 있었다(서열번호: 1). 상기 DNA 단편은 다수의 제한효소 자리를 포함하는데, 이들의 위치 및 종류는 하기 표 1에 나타낸 것과 같다.
제한효소 인식부위(염기번호)
ClaI 1-6, 3022-3027
ScaI 112-117
PstI 168-173, 477-482
NheI 411-416
BamHI 1875-1880
HindIII 1909-1914
AflII 2437-2442
SacI 2787-2792
실시예 2 : P lev 프로모터의 발현특성
Plev프로모터에 의한lsrA자체 유전자의 발현을 다음과 같이 조사하였다.
플라스미드 pRL1CP로 대장균 DH5@를 형질전환시켜 형질전환체인 대장균 EP70을 얻고, 이를 LB배지에서 37℃로 배양하면서 일정시간 간격으로 시료를 취하여 원심분리한 후, 침전된 세포를 50 mM의 인산완충용액(pH 6.0)에 현탁하고 초음파처리법으로 세포를 파쇄하였다. 세포파쇄액을 원심분리하여 상등액중의 레반슈크라제의 활성을 조사하였다. 대장균 EP70에서 발현되는 레반슈크라제의 활성은 세포의 생장과 거의 일치하여 증가하는 구성적인 발현특성을 보였다(도 2). 도 2에서, ●는 균체증식을, ○는 레반슈크라제 활성을 각각 나타낸다.
프로모터 Plev에 의한lsrA유전자의 발현을 SDS-PAGE와 덴시토메터(densitometer)를 이용하여 분석하였다. 분석 결과 플라스미드 pRL1CP를 함유한 대장균 EP70에서 레반슈크라제가 전체 단백질의 약 50%까지 생성되는 것으로 확인되었다(도 3). 도 3에서, 제1열은 표준분자량 마커이고, 제2열은 플라스미드 pUC119를 함유한 대장균의 단백질 패턴이고, 제3열은 플라스미드 pRL1CP를 함유한 대장균 EP70의 단백질 패턴을 나타낸다.
실시예 3 : lsrA 유전자 상류의 프로모터 영역
실시예 1에서 분리된 3 Kb DNA 단편에서lsrA유전자의 번역개시코돈의 상류에 존재하는 프로모터를 포함하는 상류부위에 관하여 조사하였다.lsrA유전자의 번역개시 코돈으로부터 +37 bp에서 +60 bp사이의 24 bp의 뉴클레오티드 서열과 상보하는 서열번호: 4의 올리고머를 합성하였다. 상기 올리고머의 서열은 서열번호: 1의 서열에서 염기번호 1306번 내지 1329번에 해당한다. 이 프라이머(primer)를 사용하여 플라스미드 pRL1CP를 함유한 대장균의 전체 RNA를 주형으로 역전사실험(primer extension analysis)을 실시한 결과,lsrA유전자의 번역 개시코돈으로부터 -51 bp 상류부위, 즉, 서열번호: 1의 서열에서 염기번호 1219번에 존재하는 구아닌(Guanine)이 전사개시점임이 발견되었다(도 4).
lsrA유전자의 번역개시코돈으로부터 7 bp 상류부위에서 리보좀 결합부위인 샤인달가노(SD) 염기서열(AAAGGA)이 존재함을 발견하였다. 상기 샤인달가노 염기서열은 서열번호: 1의 서열에서 염기번호 1258번-1262번에 해당한다. 또한lsrA유전자의 상류부위에서 대장균 프로모터와 상동성이 있으며lsrA유전자의 프로모터 역할을 할 것으로 추정되는 서열번호: 5의 프로모터 부위가 존재함을 발견하였다. 상기 프로모터 서열은 서열번호: 1의 서열에서 염기번호 1181번-1210번에 해당한다.
pRL1CP에서lsrA유전자의 발현에 미치는 프로모터를 포함하는 상류부위의 영향을 확인하기 위하여, 엑소멍빈 결손키트(Takara사)를 이용하여 도 5에 나타낸바와 같은 결손 플라스미드들을 제조하고 이들을 이용하여 대장균 DH5@를 형질전환시킨 후 생성된 레반슈크라제의 활성을 조사하였다.
각각의 결손 플라스미드들은 pNd1은 레반슈크라제 유전자의 ATG 번역개시점의 첫번째 뉴클레오타이드를 +1로 하였을 때 프로모터 영역을 포함하는 -1135 bp의 염기서열을 포함하고 있으며, pNd2은 -789 bp의 염기서열을, pNd3은 -658 bp의 염기서열을, pNd4는 -490 bp의 염기서열을, pNd5는 -275 bp의 염기서열을, pNd6은 -205 bp의 염기서열을, pNd7은 -86 bp의 염기서열을 각각 포함하고 있다(도 5).
플라스미드 pNd1과 pNd2를 가진 대장균에서 레반슈크라제 활성은 pRL1CP의 효소활성과 비슷한 수준으로 발현되었으나, 플라스미드 pNd3, pNd4, pNd5와 pNd6을 가진 대장균에서는 레반슈크라제 활성이 pRL1CP의 효소활성에 비하여 약 7배 감소한 것으로 나타났다. 이는 상류 -789 bp와 프로모터 영역사이에 레반슈크라제 유전자의 발현을 촉진하는 작용을 하는 발현촉진인자 (Activator)가 존재하는 것을 의미하였고, 이에 대해 더욱 자세히 조사한 결과 레반슈크라제 유전자의 번역개시점으로부터 -641 bp 상류부위에서 레반슈크라제 유전자와는 역방향으로 213 bp로 구성된 하나의 ORF(open reading frame)가 발견되어 이를lsrS유전자로 명명하였다. 상기lsrS유전자 서열(서열번호: 6)은 서열번호: 1의 서열에서 염기번호 628번 내지 416번에 해당한다. 아미노산 서열 분석에서 lsrS 의 아미노산 서열(서열번호: 7)은 P2 Ogr 계열의 전사촉진인자(Slettanet al.,J. Bacteriol.,174, 4094-4100(1992))와 높은 상동성을 보였다. P2 Ogr 계열은 징크 바인딩 (zinc-binding)단백질이고, 이를 위한 징크휭거(C-X2-C-X22-C-X4-C) 서열이 존재하는데 lsrS의 아미노산 서열의 N-말단 부위에서 징크휭거 서열(서열번호: 8)이 발견되었다. 상기 징크휭거 서열은 서열번호: 1의 서열에서 염기번호 620번-524번에 해당한다. LsrS 단백질이 레반슈크라제 유전자의 발현에 전사촉진인자로 작용하는 것으로 확인되었으며 그의 작용기작에 관해서는 아직 알려진 바가 없다.
실시예 4 : lsrA 유전자 하류의 전사 종결 인자
일반적으로 강력한 전사 종결 시그날은 전사체를 안정화시켜 유전자의 발현을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 대부분의 상업용 발현 시스템은 강력한 전사 종결 시그날을 사용한다. 실시예 1에서 분리된 3 Kb DNA 단편에서,lsrA유전자의 두 번째 종지 코돈(TGA)으로부터 6 bp 하류에 전사 종결에 중요한 역할을 하는 것으로 추정되는 하나의 역위 반복 서열(inverted repeat sequence; 서열번호: 9(CTGCCCtTCCGCAtattgttTGCGGAgGGGCAG))이 존재함을 발견하였다. 상기 역위 반복 서열은 서열번호: 1의 서열에서 염기번호 2527번-2559번에 해당한다.
pRL1CP에서lsrA유전자의 발현에 대한 전사 종결 시그날을 포함하는 하류 염기 서열의 영향을 확인하기 위하여, 엑소멍빈 결손키트(Takara사)를 이용하여 도 6a에 나타낸 바와 같은 결손 플라스미드들을 제조하고 이들을 이용하여 대장균 DH5@를 형질전환시킨 후 SDS-PAGE에 의해 균체 단백질을 조사하였다. 결손 플라스미드 pCd1은 레반슈크라제 유전자의 TAA 종지코돈의 첫 번째뉴크레오타이드를 +1로하였을때 +77 bp의 염기서열을 포함하고 있으며, pCd2는 TAA 종지코돈으로부터 상류로 -36 bp가 결손된 것이고, pCd3는 TAA 종지코돈으로부터 상류로 -345 bp가 결손된 것이고, pCd4는 TAA 종지코돈으로부터 상류로 -531 bp가 결손된 것이고, pCd5는 TAA 종지코돈으로부터 상류로 -794 bp가 결손된 것이다. 그 결과, 도 6b에서 볼 수 있는 바와 같이, 플라스미드 pCd1을 제외하고, 번역 종지코돈은 포함하지만 전사 종결 시그날은 포함하지 않는 다른 결손 플라스미드들을 포함한 대장균에서는lsrA유전자가 전혀 발현되지 않았다. 따라서 단백질의 효율적 발현을 위해서는 터미네이터가 적어도 상기의 역위 반복 서열을 포함하여야 한다는 것이 확인되었다.
실시예 5 : 클로닝 부위를 가진 발현벡터 pRL801의 제조
플라스미드 pRL1CP에 포함된lsrA유전자의 번역개시 부분과 번역종결 지점에 외래 유전자를 도입할 수 있는 클로닝 부위(cloning site)를 만들기 위하여,lsrA유전자의 5'-말단 프라이머로 서열번호: 10의 프라이머를, 3'-말단 프라이머로 서열번호: 11의 프라이머를 각각 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행함으로써 Plev프로모터의 3'-말단에 제한효소 NcoI 자리를 도입하고 터미네이터의 5'-말단부위에는 제한효소 MluI 자리를 도입한 발현벡터를 구축하였으며, 이 발현벡터를 pRL801로 명명하였다(도 7). pRL801은 NcoI과 MluI 자리를 각각 양말단에 가지도록 제조된 목적 외래 단백질의 유전자를lsrA유전자와 대치하여 도입함으로써 대장균에서 목적 외래 단백질을 발현시킬 수 있도록 고안되었다.
실시예 6 : 발현벡터 pRL2를 이용한 단백질의 고발현
lsrA유전자를 주형으로 하고, 5'-말단 프라이머로 서열번호: 12의 프라이머를, 3'-말단 프라이머로 서열번호: 13의 프라이머를 각각 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행함으로써lsrA유전자의 5'-말단에 제한효소 NcoI 자리를 도입하고 3'-말단에 제한효소 MluI 자리를 도입한lsrA유전자를 복제하였다. 이 유전자를 pRL801의 NcoI과 MluI으로 구성된 클로닝 부위에 도입하여 발현 플라스미드 pRL2를 제조하고 이를 사용하여 대장균 DH5@를 형질전환시킨 후 SDS-PAGE에 의해 레반슈크라제의 고발현 여부를 조사하였다.
도 8은 pRL2로 형질전환된 대장균에 의하여 발현된 레반슈크라제를 포함한 단백질 패턴을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 보여주고 있다. 제1열은 플라스미드 pUC119 함유 대장균의 단백질 패턴이고, 제2열은 플라스미드 pRL2 함유 대장균의 단백질 패턴이다. 덴시토메터(densitometer)를 이용한 분석 결과 대장균에서 레반슈크라제(LsrA)가 전체 단백질의 약 40 %이상까지 생성되는 것으로 확인되었다.
실시예 7 : 발현벡터 pRZ4를 이용한 단백질의 고발현
본 발명에 의하여 제조된 발현벡터 pRL801의 유용성을 입증하기 위하여, 외래 유전자로 지모모나스(Zymomonas) 유래의 레반슈크라제를 암호하는levU유전자를 선택하여 대장균에서 발현시켰다. 지모모나스 유래의 레반슈크라제를 암호하는levU유전자는 러넬라 아쿠아틸리스의 레반슈크라제 유전자(lsrA)와 52 %의 아미노산 상동성을 보인다. 지모모나스 유래의 레반슈크라제를 암호하는levU유전자를함유하는 플라스미드 pZL8 (대한민국 특허 제176410호)를 주형으로 하고, 5'-말단 프라이머로 서열번호: 14의 프라이머를, 3'-말단 프라이머로 서열번호: 15의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 행함으로써levU유전자의 5'-말단에 제한효소 NcoI 자리를 도입하고 3'-말단에 제한효소 MluI 자리를 도입한levU유전자를 복제하였다. 이를 pRL801의 NcoI과 MluI으로 구성된 클로닝 부위에 도입하여 지모모나스 레반슈크라제 발현벡터를 제조하고 이를 pRZ4로 명명하였다. 발현벡터 pRZ4를 사용하여 대장균 DH5@를 형질전환시킨 후 SDS-PAGE에 의해 레반슈크라제의 고발현 여부를 조사하였다.
도 9는 플라스미드 pUC119과 pRZ4를 각각 함유하는 재조합 대장균에서 레반슈크라제의 발현을 SDS-PAGE로 분석하여 비교한 것으로, 제1열은 플라스미드 pUC119 함유 대장균의 단백질 패턴이고, 제2열은 플라스미드 pRZ4 함유 대장균의 단백질 패턴이다. 발현벡터 pRZ4로 형질전환된 대장균에 의하여 발현된 지모모나스 레반슈크라제의 양을 덴시토메터로 분석한 결과, 대장균 전체 단백질의 약 40 %이상까지 생성되는 것으로 확인되었다.
실시예 8 : 발현벡터 pRS2를 이용한 단백질의 고발현
본 발명에 의하여 제조된 발현벡터 pRL801의 유용성을 입증하기 위하여, 외래 유전자로 러넬라 아쿠아틸리스의 유전자 전사촉진인자인 LsrS를 암호하는lsrS유전자를 선택하여 대장균에서 발현시켰다. 상기의 플라스미드 pRL1CP를 주형으로 하고, 5'-말단 프라이머로 서열번호: 16의 프라이머를, 3'-말단 프라이머로 서열번호: 17의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 행함으로써lsrA유전자의 5'-말단에 제한효소 NcoI 자리를 도입하고 3'-말단에 제한효소 MluI 자리를 도입한lsrA유전자를 복제하였다. 이를 pRL801의 NcoI과 MluI으로 구성된 클로닝 부위에 도입하여 발현벡터 pRS2를 제조하고, 이를 이용하여 대장균 DH5@를 형질전환시킨 후 SDS-PAGE에 의해 LsrS의 고발현 여부를 조사하였다.
도 10은 플라스미드 pUC119 및 pRS2를 각각 함유하는 재조합 대장균에서 LsrS의 발현을 SDS-PAGE로 분석하여 비교한 것으로, 제1열은 플라스미드 pUC119 함유 대장균의 단백질 패턴이고, 제2열은 플라스미드 pRS2 함유 대장균의 단백질 패턴이다. 발현벡터 pRS2로 형질전환된 대장균에 의하여 발현된 LsrS의 양을 덴시토메터로 분석한 결과, 대장균 전체 단백질의 약 40 %이상까지 생성되는 것으로 확인되었다.
본 발명의 프로모터 및 터미네이터는 대장균에서 외래 단백질을 고수율로 발현시킬 수 있으므로, 이들을 포함하는 대장균용 발현벡터로 형질전환된 대장균을 이용하면 외래 단백질을 경제적으로 대량생산할 수 있다.

Claims (15)

  1. 서열번호: 2의 염기 서열로 기재되는, 러넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilisATCC 33071)의 레반슈크라제 유전자(lsrA)의 상류쪽으로 첫번째 제한효소 ClaI 자리와lsrA유전자의 번역 개시 코돈(ATG) 사이의 서열을 포함하는 대장균용 프로모터.
  2. 삭제
  3. 서열번호: 3의 염기 서열로 기재되는, 러넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilisATCC 33071)의 레반슈크라제 유전자(lsrA)의 2개의 연속된 번역종지 코돈(TAATGA)과lsrA유전자 하류쪽으로 첫번째 제한효소 ClaI 자리 사이의 서열을 포함하는 대장균용 전사 터미네이터.
  4. 삭제
  5. 제 1 항의 프로모터 및 제 3 항의 전사 터미네이터를 포함하는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 유전자.
  6. 러넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilisATCC 33071)의 전사촉진인자인 서열번호:6의 염기서열을 갖는lsrS유전자.
  7. 제 6 항의 유전자에 의해 코드되고, 러넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilisATCC 33071)의 전사촉진인자인 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 LsrS 단백질.
  8. 제 1 항의 프로모터 및 제 3 항의 전사 터미네이터를 포함하고, 도 1로 기재되는 유전자 지도를 갖는 대장균용 발현벡터.
  9. 제 8 항에 있어서,
    발현벡터 pRL1CP(기탁번호: KCTC 8964P).
  10. 제 8 항에 있어서,
    프로모터와 터미네이터 사이에 외래 유전자를 도입하기 위한 클로닝 부위(cloning site)를 추가로 포함하는 대장균용 발현벡터.
  11. 제 10 항에 있어서,
    플라스미드 pRL801, pRL2, pRZ4 또는 pRS2인 대장균용 발현벡터.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
  13. 제 12 항에 있어서,
    발현벡터 pRL1CP로 형질전환된 대장균 DH5α/EP70(기탁번호: KCTC 8964P).
  14. 제 12 항의 형질전환 대장균을 배양하여 대장균에서 외래 단백질을 생산하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 형질전환 대장균이 대장균 DH5α/EP70(기탁번호: KCTC 8964P)이고, 외래 단백질이 러넬라 아쿠아틸리스의 레반슈크라제인 방법.
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