KR100326433B1 - 수용성하이드록시프로필키토산의저분자화및올리고머화의방법 - Google Patents

Abstract

(목적) 동물의 치료제로 사용하거나 또는 화장품에 첨가하여도 피부에 발적을 일으키거나 유기용매에 응고, 침전되지 않고 피부등에 침투, 흡수가 잘되고 수불용분이 없는 수용성 하이드록시프로필 키토산 저분자화 및 올리고머화의 방법을 제공한다.

(구성) 비이커에 키토산과 이소프로판올을 넣고 이를 알칼리 슬러리화한 후이에 프로필렌옥사이드를 가하고 일정시간 가온, 교반후 pH를 약중성으로 조절한다음 이를 여별하고 잔사를 메탄올로 세척 후, 저온에서 건조하여 하이드록시프로필 키토산 분말을 얻는 한편,

비이커에 상기 하이드록시프로필 키토산 분말을 탈이온수에 용해 후, 55∼60℃로 가온하면서 셀룰라제 또는 키토사나제를 넣고 교반하여 발효시킨 후, 이를 약 80℃에서 일정시간 효소활성을 제거시키고, 침전된 효소를 여별제거하고 여액을 농축, 동결 건조시켜서 됨을 특징으로 하는 수용성 하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화의 방법이다.

Description

수용성 하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화의 방법

본원 발명은 고순도 하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화 방법에 관한 것이다.

일반 키토산은 분자량 및 올리고당을 제조함에 있어 먼저 선행조건으로서, 유기산을 이용하여 용해한다는 것이 필수적인 전제 조건이라 할 수 있는데 반하여 키토산을 수용성화 시킨 유도체인 경우에서는 물에 용해성이 우수함으로 인하여 일반 키토산과 같은 전처리 과정이 필요 없다고 할 수 있다. 이러한 수용성 키토산을 사용할 때 치환기의 도입에 따라 그 성질이 각각 고유의 특성을 보유함에 따라 그사용 용도가 매우 다르게 적용될 수 있는 성격을 보유하고 있기 때문에 이러한 치환기의 도입에 따른 제조법에 대한 다각적인 연구가 국내·외적으로 이루어지고 있다. 또한, 일반 키토산은 산에 쉽게 용해되는 대해 반하여 염기 용액 조건하에서 침전등이 발생하고, 일반적인 수용성기토산유도체는 일반수에 쉽게 용해되나 이는 메탄올, 아세톤 및 에탄올등의 유기용매하에서 침전반응이 일어나는 단점을 보유하고 있어 이에 따라 그 사용 용도는 극히 제한되고 있어 pH조건과 유기용매조건에 따라 안정된 키토산 유도체의 개발이 필요하다 할 수 있으며, 또한 고순도의 하이드록시프로필 키토산의 제조방법의 정립이 필요하다 할 수 있다. 따라서, 지금까지 공지되어온 하이드록시프로필 키토산의 제조법으로, 일반적인 제법으로서 키토산 100에 대하여 수산화나트륨 10중량과 물 45중량을 첨가하고 유기용매로서 n-헥산 250중량과 t-부타놀을 투여한 후 질소 분위기 및 감압하에 치환을 행하였다. 25℃온도에서 2시간 교반하고, 키토산에 알카리를 침투시킨 후 이어서, 프로필옥사이드 272중량을 첨가해서 80℃에서 5시간 반응을 실시하여 반응물을 획득하고 이 반응물을 초산을 이용하여 탈알칼리 처리한 후, 뜨거운 물에 용해 후 정제 처리를 거쳐 동결건조를 실시하여 분말상의 하이드록시프로필 키토산을 얻고있다. 그러나, 상술한 제조법은 불용분이 다량 발생함에 따라 이의 정제를 위한 번거로움이 발생하고, 또한 발암성 유기용매를 사용함으로써 이의 제거 또한 문제점으로서 제기되었다.

이에 따라 일본 특개평 94-216801호에서 "하이드록시프로필화탈아세틸화 키틴" 의 제조방법에 대해서 발표한 바 있다. 즉, 일반 키토산을 제조하여 물을 반응용매로 하여 상압조건 및 유기용매를 사용하지 않으며 하이드록시프로필 키토산을제조하는 제법으로서, 탈아세틸화도 70 및 82%의 키토산을 3차 탈이온수 120g중에 분산시켰으며, 다음에 프로필렌옥사이드를 4.5g∼12g을 첨가하고 이어서 1시간 30분에 걸쳐서 57∼85.5℃까지 승온시켰다. 이 반응을 3시간 진행하고 추가온도 승온을 94.5℃가 됐을 때, 하룻밤을 방치하여 냉각시켰다. 그리고, 2차로 프로필렌옥사이드를 4.5g∼13g을 3차로 12g을 첨가하고 다시 승온반응을 반복한 후 상등액만을 분리하고 과량의 이소프로필알코올을 첨가하고 교반후 여과시켰다. 이것을 건조하여 하이드록시프로필 12∼13g을 얻는 방법을 사용하였으며, 이때 얻은 중간체는 불용분이 있기 때문에 소량의 초산을 첨가하여 용해하고 그후 수산화나트륨용액으로 중화하여 여과하여 최종 액상상태의 하이드록시프로필 키토산을 제조하였다. 그러나, 이러한 제조법은 전술한 방법에서의 유해성 유기용매를 사용하는 점에 대신하여 물과 이소프로필알코올을 사용하여 이를 해소하였지만, 하이드록시프로필기의 치환도가 낮아 불용분이 과량 발생하는 단점이 있다.

본원 발명은 종래의 문제점을 해결하기 위해, 본원 발명의 키토산은 동물의 치료제로 사용하거나 또는 화장품에 첨가하여도 피부에 발적을 일으키거나 또는 유기용매에 응고, 침전되지 않고 피부등에 침투, 흡수가 잘되고 수불용분이 없는 수용성 하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화의 방법을 제공함을 목적으로 한다.

도1은 효소처리 후 시간별 형성되는 하이드록시프로필 키토산[Hydroxypropyl chitosan(HPCC)]의 박막크로마토그래피 판정.

도2는 하이드록시프로필 키토산을 효소처리 후 시간경과별 감소되는 분자량을 나타내는 GPC분자량 분포도 분석표.

도3은 최초 사용된 키토산의 분자량 분포도, 평균분자량의 그래프.

도4는 효소반응 24시간 경과 후, 평균분자량의 그래프.

비이커에 키토산과 이소프로판올을 넣고 이를 알칼리슬러리화한 후 이에 프로필렌옥사이드를 가하고 일정시간 가온, 교반후 pH를 약중성으로 조절한 다음 이를 여별하고 잔사를 메탄올로 세척후 저온에서 건조하여 하이드록시프로필 키토산분말을 얻는 한편,

비이커에 상기 하이드록시프로필 키토산 분말을 탈이온수에 용해후 55∼60℃로 가온하면서 셀룰라제 또는 키토사나제를 넣고, 교반하여 발효시킨 후 이를 약 80℃에서 일정시간 효소활성을 제거시키고, 침전된 효소를 여별제거하고, 여액을 농측, 동결 건조시켜서 됨을 특징으로 하는 수용성 하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화의 방법이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본원 발명을 하기 실시예로 예시하며, 전체 실시예에서 분자량의 감소수치인점도는 Brookfield점도계(미국)를 사용하여 100rpm로 측정하였고, 본원발명에 사용되는 키토산의 측정에서 키토산용액은 600㎖량이 되도록 1% 초산용액에 0.5%(W/W)키토산을 완전 용해하여 기포를 제거한 후 25℃조건에서 측정하였으며, 하이드록시프로필 키토산의 측정은 분말상의 불용분이 없는 하이드록시프로필 키토산 분말을 600㎖량이 되도록 3차 탈이온수에 0.5%(W/W)키토산을 완전 용해하여 기포를 제거한후 측정하였으며, 측정간 측정 스핀들은 1∼4번을 사용하여 측정하였다. 또한 제조된 하이드록시프로필 키토산 올리고당의 분자량 분포도를 검정하기 위하여는 GPC분석을 통하여 실시하였다. 그리고, 최초 사용된 키토산 순도를 확인하기 위한 탈아세틸화도는 데라야마방법(J. Polym. Sci., 8. 243, 1952)을 적용하여 콜로이드 적정법에 준해서 측정하였다. 그리고, 하이드록시프로필 기토산을 제조하고 용해성을검정하기 위해서는 3차 탈이온수 90㎖에 HPCC 분말 10g을 천천히 넣으면서 1시간 교반한 후 이를 일반 여과지를 사용하여 여과한 후 잔류하는 량을 측정하여 불용분의 양을 확인하였고, 또한 각각 HPCC의 pH치는 100㎖ 탈이온수에 1g 등급화별 수용성 키토산을 투여하고 교반 후 충분히 용해되면 pH 메타로 측정하였다. 산 및 염기조건 및 유기용매등에서 안전성을 확인하기 위하여, 하이드록시프로필 키토산분말 10g을 3차 탈이온수 90g에 용해한 후 2N-HCl용액과 5% NaOH용액을 첨가하면서 pH의변화에 따라 침전여부를 확인하였으며, 유기용매에서의 안정성 또한 에탄올, 아세톤등을 이용하여 침전여부를 확인함으로써 안정성을 측정하였다.

실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나, 이 실시예는 본원 발명의 기술범위를 한정하는 것은 아니다.

<수용성 키토산 제조>

실시예 1-1

본원 발명에 사용된 하이드록시프로필 키토산을 제조하기 위한 키토산은 탈아세틸화도 79.06%를 보유하고, 분자량(점도)이 235.8cps의 물성을 갖는 키토산을준비하여 본원발명에 따라 제조하였다. 즉, 10g의 키토산에 200㎖의 이소프로판올 가하고, 1시간 30분 동안 교반하였다, 이어서 키토산의 아민기 당량 기준에 대하여 30% NaOH(w/w)용액을 2당량을 준비하여 1시간 동안 균일한 양을 천천히 투여하고, 2시간 동안 교반하여 키토산을 알칼리 슬러리화하였다. 그리고, 프로필렌옥사이드 용액을 키토산 기준 2당량을 투여하고 밀봉한 후 21시간 동안 교반하였으며, 이어서 온도를 35℃로 승온시키고 16시간 동안 교반하였다. 그리고, 무수초산을 이용하여 pH를 7.5로 조절하고 여과하였다. 여과된 중간체를 70%(v/v) 메탄올 150㎖용액을 이용하여 3회 반복하여 생성된 염기를 제거하였으며, 69℃에서 건조하여 하이드록시프로필 키토산 분말을 획득하였다.

실시예 1-2

실시예 1-2에서는 실시예 1-1과 동일한 조건에서 실시하였으나, 다만, 키토산에 하이드록시프로필기의 치환을 유도하기 위한 프로필렌옥사이드용액의 첨가량을 3당량으로 높여 반응하였다.

실시예 1-3

실시예 1-3에서는 1-2와 동일한 조건에서 실시하였으나, 다만, 키토산에 하이드록시프로필기의 치환을 유도하기 위한 프로필렌옥사이드용액의 첨가량을 10당량으로 높여 반응하였다.

실시예 1-4

실시예 1-4에서는 실시예 1-1∼1-3에서의 사용된 키토산 10g에 200㎖의 이소프로판올을 가하고, 1시간 30분 동안 교반하였다. 이어서 키토산의 아민기 당량 기준으로 30% NaOH(w/w)용액을 3당량을 1시간 23분 동안 균일하게 천천히 투여하고, 1시간 30분 동안 교반하여 키토산을 알칼리 슬러리화하였다. 그리고, 이에 프로필렌옥사이드용액을 키토산 기준 30당량을 투여하고 밀봉한 후 2시간 동안 교반하였으며, 이어서 온도를 36℃로 승온시키고 43시간동안 교반하였다. 그리고, 무수초산으로 pH를 7.3으로 조절하고 여과하였다. 여과시 중간체를 70%(v/v) 메탄올 150㎖ 용액으로 2회 반복하여 1차로 생성된 염기를 제거하고, 2차로 순수 에탄올 150㎖용액으로 추가 세척한 후, 40℃에서 강제 건조하여 최종 하이드록시프로필 키토산분말 17g을 획득하였다.

실시예 1-5

실시예 1-5에서는 실시예 1-1∼1-4에서의 사용된 키토산 20g에 400㎖의 이소프로판올을 가하고, 2시간 동안 교반하였다. 이어서 키토산의 아민기 당량 기준에 대하여 30% NaOH(w/w)용액 3당량을 1시간 20분 동안 균일하게 천천히 투여하고, 18시간 동안 교반하여 키토산을 알칼리 슬러리화하였다. 그리고, 프로필렌옥사이드용액을 키토산 기준 35당량을 투여하고 밀봉한 후 2시간 30분 동안 교반하였으며, 이어서 온도를 30℃로 승온시키고 70시간 동안 교반하였다. 그리고, 무수초산으로 pH를 7.5으로 조절하고 여과하였다. 여과시 중간체를 70%(v/v) 메탄올 300㎖용액을 이용하여 2회 반복하여 1차로 생성된 염기를 제거하고, 2차로 순수 아세톤 300㎖용액씩 2회 추가 세척한 후, 60℃에서 강제 건조하여 최종 하이드록시프로필 키토산분말 35g을 획득하였다.

실시예 1-6

실시예 1-6에서는 실시예 1-1∼1-5에서 사용된 키토산 10g에 200㎖의 이소프로판올을 가하고, 4시간 동안 교반하였다. 이어서 키토산의 아민기 당량 기준에 대하여 30% NaOH(w/w)용액을 2.5당량을 1시간 동안 균일하게 천천히 투여하고, 20시동안 교반하여 키토산을 알칼리 슬러리화하였다. 그리고, 프로필렌옥사이드용액을키토산 기준 35당량을 투여하고 밀봉한 후 2시간 30분 동안 교반하였으며, 이어서 온도를 35℃로 승온시키고 240시간 동안 교반하였다. 그리고, 무수초산으로 pH를7.5으로 조절하고 여과하였다. 여과시 중간체를 80%(v/v) 메탄올 250㎖용액을 이용하여 2회 반복하여 1차로 생성된 염기를 제거하고, 2차로 순수 메탄올 200㎖, 3차로 순수 아세톤 500㎖용액으로 각각 추가 세척한 후, 70℃에서 강제 건조하여 최종 하이드록시프로필 키토산분말 35g을 획득하였다.

실시예 1-7

실시예 1-7에서는 탈아세틸화도 50.5%, 점도(분자량)가 235.8cps의 물성을 나타내는 키토산 10g에 200㎖의 이소프로판올을 가하고, 2시간 동안 교반하였다.

이어서, 키토산의 아민기 당량 기준예 대하여 30% NaOH(w/w)용액을 3.2당량을 1시간 동안 균일하게 천천히 투여하고, 2시간 동안 교반하여 키토산을 알칼리 슬러리화하였다. 그리고, 프로필렌옥사이드용액을 키토산 기준 46당량을 30분 동안 균일하게 투여하고 밀봉한 후 교반과 동시에 온도를 34℃로 승온시키고 48시간 동안 교반하였다. 그리고, 무수초산으로 pH를 7.3으로 조절하고 여과하였다. 여과시중간체를 순수 메탄올 500㎖용액을 이용하여 1차로 생성된 염기를 제거하고, 2차로 순수 메탄올 500㎖로 각각 추가 세척한 후, 진공 건조하여 최종 하이드록시프로필 키토산분말 20g을 획득하였다.

본원 발명에서 실시예 1-1∼1-7의 결과는 다음과 같다.

[실시예 2-1]

<셀룰라제 효소를 이용한 분자량 조절>

실시예 2-1

실시예 2-1에서는 효소에 의해 실시에 1-7에서 제조된 하이드록시프로필 키토산의 분자량 감소를 효과적으로 유도하는 효소투여량 범위를 확인하여 보기 위하여 실시하였다. 본 실시예에서는 효소중 셀룰라제(상품명 : Bio-ACE, Antarctic Amalgamated Resoures Limited. USA.)를 선택하여 이를 사용하였으며, 효소의 역가치는 24.733units/g이었다.

3L 비이커에 3차 탈이온수 2.75L를 투입하고 150rpm으로 교반하면서 실시예 1-7에서 제조된 HPCC 20g을 천천히 투입하면서 완전 용해시킨 호 이를 0.5L 용량의 3구 둥근 플리스크에 0.25L씩 11개에 투입하고 온도를 55∼60℃로 승온 후, 이어서 셀룰라제를 각각 20㎖ 투여후 150rpm으로 교반하면서 1시간에서 24시간까지 11개로 구분 가수분해시킨 후, 이를 80℃에서 30분간씩 교반하여 효소의 활성을 제거한 후, 침전된 효소를 원심분리(15,000rpm, 15분)하여 침전물을 완전히 제거하였다.

이를 농축하고 동결 건조하여 분말상의 분자량이 등급화된 수용성하이드록시 프로필 키토산을 제조하였다.

실시예 2-2

본원 발명의 실시예 2-2는 실시예 2-1에서 셀룰라제의 투입량을 10㎖로 한 이외에는 실시예 2-1과 동일하게 실시하였다.

실시예 2-3

본원 발명의 실시예 2-3은 실시예 2-1에서 셸룰라제의 투입량을 5㎖로 한 이외에는 실시예 2-1과 동일하게 실시하였다.

실시예 2-4

본원 발명의 실시예 2-4은 실시예 2-1에서 셀룰라제의 투입량을 2.5㎖로 한이외에는 실시예 2-1과 동일하게 실시하였다.

실시예 2-5

본원 발명의 실시예 2-5는 실시예 2-1에서 셀룰라제의 투입량을 1.5㎖로 한 이외에는 실시예 2-1과 동일하게 실시하였다.

실시예 2-1∼2-5의 결과는 다음과 같다.

<키토사나제를 사용한 분자량 조절>

실시예 3-1

실시예 3-1에서는 키토사나제[曉津水産化學工業(주), 일본]를 사용하였다.

키토사나제의 순도는 3,000-20,000U/g였으며, Bacillus pumilus BN-262이 생산하는 키토산 분해 효소였다. 또한 분자량은 약 31,000(SDS-PAGE법)을 나타내는 물성을 보유하고 있는 효소롤 사용하였다.

3L 비이커에 3차 탈이온수 2L를 투입하고 150rpm으로 교반하면서 실시예 1-7에서 제조된 HPCC를 20g을 천천히 투입하면서 완전 용해시킨 후 pH를 염산 희석 용액과 NaOH희석용액을 사용하여 pH를 6∼7로 조절하여 이중 0.5L 용량의 3구 둥근 플리스크에 0.25L씩 11개에 넣은 후, 온도를 50℃로 승온 후, 수용성 키토산 1g에 대하여 효소 0.011g을 투입한 후 150rpm으로 교반하면서 1시간에서 24시간까지 11개로 구분 가수분해시킨 후, 이를 80℃에서 30분간씩 교반하여 효소의 활성을 제거한 후, 12시간 정치시켜 침전된 효소를 원심분리(15,000rpm, 15분)하여 침전물을 완전히 제거하였다. 여액을 농축하고 동결건조하여 분말상의 분자량이 등급화된 수용성 키토산을 제조하였다.

실시예 3-2

본원 발명의 실시예 3-2는 실시예 3-1에서 키토사나제의 투입량을 0.022g으로 한 이외에는 실시예 3-1과 동일하게 실시하였다.

실시예 3-3

본원 발명의 실시예 3-3은 실시예 3-1에서 셀룰라제의 투입량을 0.044g으로 한 이외에는 실시예 3-1과 동일하게 실시하였다.

실시예 3-4

본원 발명의 실시예 3-4는 실시예 3-1에서 셀룰라제의 투입량을 0.066g으로 한 이외에는 동일하게 적용하였다.

실시예 3-1∼3-4의 결과는 다음과 같다.

동물의 치료제로 사용하거나 또는 화장품에 첨가하여도 피부에 발적을 일으키지 않으며 유기용매에 응고, 침전되지 않으며 피부에 침투, 흡수가 잘되고 수불용분이 없는 수용성 하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화 한다.

Claims (5)

1. 비이커에 키토산과 이소프로판올을 넣고, 이를 알칼리 슬러리화한 후 이에 프로필렌옥사이드를 가하고 0.5∼21시간 교반 후 30∼36℃로 가온하고 16∼240시간 교반 후 PH 7.3∼7.5로 조절한 다음 이를 여별하고 잔사를 메탄올로 세척 후, 40∼70℃에서 건조시키든가 또는 진공하에서 건조하여 하이드록시프로필 키토산 분말을 얻는 한편,

   비이커에 상기 하이드록시 프로필 기토산 분말을 탈이온수에 용해 후 55∼60℃로 가온하면서 셀룰라제 또는 키토사나제를 넣고 교반하여 발효시킨 후, 이를 승온시켜 80℃에서 30분간 효소활성을 제거시키고 침전된 효소를 여별 제거하고 여액을 농축, 동결 건조시켜서 됨을 특징으로 하는 수용성 하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화의 방법.
2. 제1항에 있어서, 탈아세틸화도 50%이상의 키토산임을 특징으로 하는 수용성하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화의 방법.
3. 제1항에 있어서, 알칼리 슬러리에 프로필렌옥사이드를 가하고 20∼35℃, 30%가성소다 용액을 키토산의 아민기를 기준으로 2∼3.5당량 첨가하여 반응시킴을 특징으로 하는 수용성 하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화의 방법.
4. 제1항에 있어서, 키토산에 프로필렌옥사이드의 첨가량을 키토산의 아미노기기준으로 30∼46당량이고, 첨가시간 30∼120분, 20∼35℃에서 18∼70시간 반응시킴을 특징으로 하는 수용성 하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화의 방법.
5. 제1항에 있어서, 수용성 하이드록시프로필 키토산 올리고당이 80wt%이상 함유함을 특징으로 하는 수용성 하이드록시프로필 키토산의 저분자화 및 올리고머화의 방법.