KR100324257B1 - 폴리아미노산올리고뉴크레오타이드운반체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리 리신:세린 랜덤 공중합체로 구성된 폴리아미노산 올리고뉴크레오타이드 운반체를 제공한다.
이 운반체는, 올리고뉴크레오타이드와 결합하여 침전을 일으키지 않고, 세포내에서 결합된 올리고뉴크레오타이드와 용이하게 해리된다. 그러므로, 다양한 유전자 질병과 AIDS와 같은 바이러스성 질병에 대항하는 올리고뉴크레오타이드 약제의 생체내 운반체로서 유용하다. 바이러스에 저항하는 식물을 포함한 유전공학에 의해서 여러 유용한 동물과 식물의 창조에도 크게 기여한다.

Description

폴리아미노산 올리고뉴크레오타이드 운반체
올리고뉴크레오타이드의 의학용도(예를 들면, 안티센스올리고머(antisense oligomer))에 대한 기초연구가 최근에 활발하게 수행되고 있으며, 지금은 이의 가능성을 위한 구체적인 연구단계에 들어가고 있다. 실제적으로, 실험관 내의 실험에 있어서, 올리고뉴크레오타이드에 대한 많은 보고서가 나와 있다. 예를 들면 용매에 대한 안전성, 안티센스 올리고머에 대한 표적유전자염기배열의 선택, 세포라인에서의 막투과성, 수명, 뉴크레아제에 대한 저항성, 세포간 분포성, 등에 대한 것이 있다.
이러한 기초연구의 진척에 따라서, 올리고뉴크레오타이드를 의학약품으로 사용할 경우에 적절한 운반체 물질을 선택하고, 이러한 물질을 개발하는 것이 매우 중요하게 고려되고 있으므로, 그 목적을 해결하고자 하는 것이 필할 수 없는 과제가 되어왔다. 특히, 예를 들면, 이 운반체에 있어서, 정맥내 주사와 같은 투여경로의 체내운동에 있어서 바람직하지 않은 양전하를 제거하는 것도 이 운반체가 해결해야 하는 중요한 문제이다. 또한 세포막투과성, 수명의 연장, 올리고뉴크레오타이드 약품안정성, 세포내로 흡수율을 증가시키는 효과적인 타겟팅시스템을 이 운반체가 갖도록 하는 것이다.
올리고뉴크레오타이드 자체는 매우 불안정하고 외부조건의 영향에 따라서 분해되기 쉽기 때문에, 많은 연구가 목적하는 장기로 올리고뉴크레오타이드를 안정하고 효과적으로 운반하기 위한 약품운반체를 개발하기 위해 노력을 기울이고 있다.
기존에 이루어진 연구와 개발에 대한 대략적인 단계는 생물학적막과 유사한 지질이중막 배열구조를 가지는 리포솜에 기준한 종래의 운반체에 관한 것이다. 예를 들면, 리포솜에 포함된 올리고뉴크레오타이드 약품은 올리고뉴크레오타이드가 리포솜에서 안정하고, 동시에, 올리고뉴크레오타이드의 화학적 혹은 세포학적 특이성은 리포솜의 화학적수정에 의해서 증가되리라고 보고되었다(Alain R. Thierry & Anatoly Dritshils, 핵산연구, 제20권, 5691∼5698페이지(1992)).
그러나 리포솜의 미세한 분자는 혈액중에서 짧은 반감기를 가진다는 단점을 가지고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해서, 산화안정성과 같은 화학적 안정성과 생물학적 안정성과 콜로이드의 화학적안정성에서 많은 진보가 있었고, 긴 반감기를 가지고 면역리포솜(표면에 면역체를 이식한 리포솜)을 가진 신세대 리포솜이 개발되고 있지만 실제적인 문제는 아직도 해결되지 않고있다.
다른 한편, 올리고뉴크레오타이드의 양이온성을 이용하여 올리고뉴크레오타이드를 양이온성의 천연단백질이나 양이온성의 합성 폴리아미노산에 결합하는 기술과 이 생성된 이온성복합체를 포적세포로 혹은 그 안으로 운송하는 기술의 분야에 대한 연구가 갑자기 증가하게 되었다(Nature, 제271권, 130∼135페이지, 1978년, J. of Biol. Chem., 제262권, 4429∼4432페이지, 1987년, J. of Biol. Chem., 제263권, 14621∼14624페이지, 1988년, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제87권, 3410∼3414페이지, 1990년). 이 기술은 올리고뉴크레오타이드가 리신(Lys)잔기의 ε-아미노군과 같은 아미노산의 양이온성 측쇄에 전하로 결합되어 진다는 사실에 기초한 것이다(Lemaitre, M., et al., Prec. Natl. Acad. Sci. USA, 제84권, 648∼651페이지, 1987년). 그러나, 이러한 복합체를 형성하는데 있어서 문제점은 침전을 형성한다는 것이다. 그러므로, 이들 모든 연구에 있어서, 한계는 복합체가 양이온 이성질체라는 것이다.
예를 들면, 폴리 L-Lys(PLL)은 잘알려진 약품운반체이다(H.J.P. Ryser & W.C. Shen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제75권, 3867∼3879페이지, 1978년). PLL과 올리고뉴크레오타이드의 복합물은 생물학적으로 매우 안정적이고 PLL과 혼합물을 형성하는 것은 올리고뉴크레오타이드를 뉴크레아제에 대해서 안정화할 수 있게 한다(B.Bayard, et al., Eur. J. Biochem., 제151권, 319∼325페이지, 1985년). 그러나 PLL과 올리고뉴크레오타이드의 혼합물을 농축하는 것은 침전 때문에 제한된다. 반면에, 복합물의 침전에 대한 문제의 해결은 이 혼합물의 농도를 증가하여,올리고뉴크레오타이드의 안정성을 꾀할 수 있다는 가능성이 제시되었다.
또한, 세포안으로 올리고뉴크레오타이드의 흡수는 PLL과 혼합물을 형성하여 향상될 수 있다는 것이 보고되었다(Wu, G.Y. & Wu, C. H., J. Biol. Chem., 제27권, 887∼892페이지, 1988년). PLL의 부분적인 화학수정이 여러 세포에 대한 올리고뉴크레오타이드의 특이성을 향상시킨다는 또 다른 보고도 있다(E. Wanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제87권, 3410∼3414페이지, 1990년). 이의 작용기작이 아직 밝혀지지 않았지만, 보고서는 PLL이 세포막에서 올리고뉴크레오타이드의 삽입을 도와주는 작용하고 또한 PLL과 올리고뉴크레오타이드의 공유결합에 의해서 형성된 복합체는 결과적으로 세포막에 대한 친화력이 증가된다고 설명하고 있다(M. Fechheimer, et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 제84권, 8463∼8467페이지, 1987년)). 앞에서 설명한 침전의 문제는 이 보고서에 의해서 조차도 아직 해결되지 않고 있다.
또 다른 심각한 문제로는, 많은 보고서에서 PLL의 세포독성화(cytotoxicity)를 지적하고 있다(J.P. Leonetti, et al., Bio-conjugate Chem., 제1권, 149∼153페이지, 1990년). 죠 등(Zhou, et al.)은 PLL의 입체이성체인 poly-D-Lys(PDL)과 올리고뉴크레오타이드의 복합물과 PLL과 올리고뉴크레오타이드의 복합물을 비교하였다. 그 결과는 PDL과 올리고뉴크레오타이드의 복합물이 PLL의 혼합물보다 생물학적으로 더 안정하다는 것을 보고하였지만 세포에게는 더 독성을 있다는 것을 보고하였다(X. Zhou. et al., Biochem. Biophys. Acta, 제1065권, 8∼14페이지, 1985년). 그러나 비록 PLL과 올리고뉴크레오타이드의 복합물이 PDL의 세포독성보다 덜하다고 해서, 세포독성의 문제가 해결된 것은 아니다. 세포독성에 관한 관점에서, 보고자는 PLL이 14,000이상의 분자량을 가지면 세포독성이 없다고 지적하였다(J.P. Leonetti, et al., Bio-conjugate Chem., 제1권, 149∼153페이지, 1990년). 그러나, 이 복합물은 대사에 장해를 일으키기 때문에 약품운반체로는 적당하지 않다.
드골 등(Degols, et al.)은 HIV(인체면역결핍을 일으키는 바이러스)-1 게놈의 tat 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴크레오타이드를 합성하고, PLL과 올리고뉴크레오타이드의 혼합물의 tat 유전자 저해효과에 대해 연구하였다. 그러므로, 실험관안에서, 안티센스 단독인 경우보다 혼합물의 경우에는 활성이 100배이상 높다는 것이 알려졌다(P. Degols, etal., Antiviral Res., 제17권, 279∼281페이지, 1992년). 그러므로, PLL을 동시에 사용하는 것은 안티센스 올리고뉴크레오타이드의 유전자저해효과를 갖도록 작용할 수 있다.
그러나, 최근의 상황에서, PLL과 올리고뉴크레오타이드의 혼합물은 덩어리를 형성하기 매우 쉽다는 심각한 문제가 대두되고 있다(J.P. Leonetti, et al., GENE, 제72권, 323∼332페이지, 1988년). 이러한 이유로, 양이온성 천연단백질과 양이온성 합성폴리아미노산을 약품운반체로서 유기체에 적용하는 것이 어렵다고 믿어졌다. 이러한 환경하에서, 체내로 운반되어지고, 안정한 혼합물로 형성된 후라도 침전되지 않는 새로운 올리고뉴크레오타이드 운반체의 개발에 대한 요구가 증가되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 앞서 설명된 환경하에서 이루어졌고, 이에 본 발명은 새로운 폴리아미노산 올리고뉴크레오타이드 운반체를 제공하여, PLL과 양이온성 고분자 혼합물이 음이온성 올리고뉴크레오타이드와 결합하여 침전을 일으키는 경향이 있고, 침전이 생기지 않는 낮은 혼합농도로 형성한 복한체의 경우에는 양이온이고, 세포독성을 가지고 있다는 종래의 기술의 결점을 극복하고, 균일한 계로 형성된 혼합물을 구성하고 또한, 약품운반체로서 이것의 기능을 효과적으로 향상시키는 것을 발명의 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기한 문제를 해결하기 위한 수단으로서 폴리아미노산 올리고뉴크레오타이드 운반체가 폴리-리신:세린의 렌덤공중합체(random copolymer)로 구성되는 것을 제공한다.
본 발명의 운반체에 있어서, 바람직한 실시예는 리신:세린의 비가 5:1∼1:3이고, 평균 분자량이 3,000∼35,000인 것이다.
본 발명의 폴리아미노산의 운반체는 올리고뉴크레오타이드와 결합하여 균일하고 안정한 혼합물을 형성하고, 인체세포안(pH:5.0)에 올리고뉴크레오타이드 약품을 효과적으로 방출한다.
본 발명은 폴리아미노산 올리고뉴크레오타이드 운반체(poly amino acidic oligonucleotide-carrier)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 새로운 올리고뉴크레오타이드를 위한 폴리아미노산 운반체에 관한 것으로, 이 운반체는 올리고뉴크레오타이드약물이 클로모좀에 병합되어서 세포내에서 올리고뉴크레오타이드의 RNA발현하도록 처리하는 플라스미드 DNA요소를 운반할 때 유용하거나, 효과적인 성분으로 올리고뉴크레오타이드를 함유하는 약물이 바이러스 유전자의 mRNA대항하는 특수기능을 하도록 처리할 때 유용하다.
제1도(a)와 (b)는 실시예에서 사용된 올리고뉴크레오타이드 DRD12와 R32를 나타내는 1차구조식이다.
제2도는 올리고뉴크레오타이드와 이온결합을 형성한 폴리아미노산의 농도와 이 혼합물의 흡수율사이의 관계를 나타내는 도면이다.
제3도는 본 발명의 PLS 운반체와 결합하는 올리고뉴크레오타이드의 전기영동의 결과를 나타내는 도면이다.
제4도는 올리고뉴크레오타이드 R32와 DRD와 결합하는 폴리아미노산의 운반체의 농도를 나타내는 도면이다.
제5도는 폴리아미노산 운반체와 올리고뉴크레오타이드 pU119의 농도를 나타내는 도면이다.
제6(a),(b),(c)도는 각 폴리아미노산의 운반체의 모세관 전기영동의 결과를 나타내는 도면이다.
제7(a),(b)도는 R32를 PLS(3/1)과 PLS(1/1)과 각각 반응한 후의 전기영동의 결과를 나타내는 도면이다.
제8도는 폴리아미노산 운반체와 결합한 올리고뉴크레오타이드의 인체혈청내에서의 미분해율을 나타내는 도면이다.
제9도는 폴리아미노산 운반체와 결합한 올리고뉴크레오타이드 R32의 방전율과 pH사이의 관계를 나타내는 도면이다.
제10도는 폴리아미노산 운반체와 결합한 올리고뉴크레오타이드 pU119의 방전율과 pH사이의 관계를 나타내는 도면이다.
발명을 수행하는 최상의 형태
폴리-리신:세린 램덤공중합체를 포함한 폴리-아미노산 혼합물인 폴리아미노산은 항바이러스제와 같은 올리고뉴크레오타이드를 위한 생체내운반체로서 유용하다.
본 발명의 폴리아미노산 운반체는 측쇄가 강한 친수성인 세린(Ser)에 삽입되어져서 양이온이 되어, 침전을 일으키지 않고 올리고뉴크레오타이드와 안정한 이온혼합물을 형성한다. 또한, 산성의 pH상태에서, 결합된 올리고뉴크레오타이드는 효과적으로 방전된다.
이러한 폴리아미노산 운반체는 예를 들면 다음의 식으로 표현될 수 있다. 이식에서, 세린 잔기의 수와 삽입된 위치는 제한되지 않고, m과 n은 정수이다. Lys:Ser의 비는 5:1∼3:1의 범위 안에 있고, 보다 바람직하게는 3:1∼1:1인 것이다.
이 화합물은 종래의 어떠한 방법으로도 만들어질 수 있다(Rajendra, B.R., et al., Human Genetics, 제55권, 3633페이지, 1980년; Lim F. & Sun, A.M., Science, 제210권, 908페이지, 1980년).
이제부터 본 발명은, 실시예를 가지고 더 자세하게 설명될 것이다. 본 발명이 이들 실시예로 제한되는 것이 아니라는 것은 말할 필요도 없을 것이다.
아래에 설명된 실시예에서, 다음 올리고뉴크레오타이드는 운반체와 혼합물을 형성하기 위하여 적용된다. 제1(a)(b)도에 나타난 2종류의 올리고뉴크레오타이드는 DNA합성기(Applied Biosystems사 제조;380B형 혹은 392형)를 사용하여 합성되었다.제1도에서, 아데닌-뉴크레오타이드는 A로 표기되고, 구아닌-뉴크레오타이드는 G로, 시토신-뉴크레오타이드는 C로, 유라실-뉴크레오타이드는 U로, 표기된다. 이들은 t-부틸디메틸시릴군을 2'-염화수소군을 보호하는 군으로 사용하는 포스포아미다이트(phosphoramidite)법으로 합성되었다(Nucleic Acid Res., 제17권, 7059∼7071페이지, 1989년).
제1(a)도는 12개의 염기(DRD12)로 이루어진 선형의 키메라 올리고뉴크레오타이드를 보여주고 있다. 주사슬의 실질적 부위는 DNA를 구성하고 있지만, 중심근처에는 오직 3개의 GUC염기만이 RNA를 포함한다. 제1(b)도는 농축되어 부분적으로 밀집한 2차구조를 형성하는 32염기(R32)를 구성하는 리보뉴크레오타이드를 보여주고 있다.
올리고뉴크레오타이드의 이러한 모델들은 참고문헌(Nucleic Acid Res., 제19권, 5125∼5130페이지, 1991년)에 설명된 방법으로 정화되었다.
또한, 이미 알려진 플라스미드 pU119(3162 염기의 쌍)는 고분자량을 가진 올리고뉴크레오타이드로서 사용되었다.
＜폴리아미노산과 올리고뉴크레오타이드의 표식＞
비교를 위한 PLL은 주로 시그마사의 Lot. 111H-5520인 분자량 3,000의 폴리L리신하이드로브로마이드(Poly-L-Lys-Hydrobromide(PLL①)가 사용되었다. 또한, Lot, 51H-5516인 분자량 4,600의 폴리-L-리신-하이드로브로마이드(PLL②), Lot. 72H-5539인 분자량 20,500(PLL③)과, Lot. 111H-5506인 분자량 37,200(PLL④)도 비교를 위해 사용되었다. 폴리-리신:세린 램덤공중합체(PLS)의 예로서 시그마사의Lot. 30H-5525인 분자량 21,800인 폴리-(리신:세린=3:1)-하이드로부로마이드 [PLS(3/1)]와 화학적으로 합성된 분자량 30,000의 폴리-(리신:세린=1:1)-하이드로부로마이드[PLS(1/1)]를 포함한다.
이들 모든 폴리-아미노산은 이온강도 0.02의 인산완충액(PH=7.2)에 용해된다. 또 올리고뉴크레오타이드의32P 표식은 올리고뉴크레오타이드(1.83 OD, 5pmol)의 27.3㎕, 오토크레이브시킨 정제수 15.7㎕, ×10키나아제(kinase)완충용액(250mM의 tris염산완충액으로 pH가 7.6이고, 100mM DTT, 100mM MgCl2) 5㎕, T4 폴리뉴크레아제(10unit/㎕) 1㎕, -32P ATP의 1㎕와 혼합한 후, 37℃에서 1시간동안 반응시킨다.
＜흡광도측정과 복합체 형성 및 침전생성)
폴리아미드산과 올리고뉴크레오타이드의 이온성 복합체 형성에 기인한 혼탁과 침전의 형성은 이 용액의 360nm에서 흡광도를 측정하여 광학적으로 연구되어졌다. 이 결과는 제2도에 나와있다. 올리고뉴크레오타이드의 농도는 5 pmol/㎕이다. 이 이온성 복합물의 형성에 있어서 하전의 중화의 상대적 농도는 폴리아미노산과 올리고뉴크레오타이드의 분자량으로 부터 계산 가능한 전하의 수로 부터 계산되었다.
이 흡수도 측정의 결과로 부터 PLL①(분자량=3,000)을 폴리아미노산으로 사용한 경우, 혼탁이나 침전이 복합물의 형성이 예상되는 PLL의 농도 근처에서 관찰되었다(제2a도). PLL의 분자량을 변화하면(4,600, 20,500 및 37,200) 즉 PLLs②,③및 ④에 대해서, 그 결과는 동일했다. 반대로, PLL에서 친수성 세린을 30% 정도 함유한 본 발명의 PLS(3/1)램던 공중합체를 사용한 경우, 전하적으로 중화되었고, 완전히 이온성 복합물이 형성되었다고 예상되는 농도에서도 혼탁이 관찰되지 않았다(제2b도). 고농도에서 조차, 혼합된 용액은 균일했다. 이것은 세린의 잔기가 PLL로 삽입되어진 결과 형성된 혼합물의 친수성의 증가에 기인하고 생물학적 운반체로서 본 발명의 PLS가 대단히 유효한 것으로 고려된다.
＜전기영동＞
올리고뉴크레오타이드는, 음성적으로 하전된 인산염군 때문에, 양성적으로 하전된 방향으로 전기영동을 한다. 양성적으로 하전된 폴리아미노산을 음성적으로 하전된 올리고뉴크레오타이드에 부가함으로서, 올리고뉴크레오타이드의 음성적 하전이 폴리아미노산의 농도의 증가를 저해한다. 그러므로 그 결과, 올리고뉴크레오타이드의 이동도가 감소한다. 이동도는 결합을 위해서 올리고뉴크레오타이드로 PLS(3/1)가 첨가되는 것으로 평가되었고, 결합혼합물의 전기영동이 관찰되었다. 이 결과는 제3도에 나와있다. 복합물의 모든 실험작동은 폴리아미노산과 올리고뉴크레오타이드가 혼합된 후 15분동안 교반되어서 충분히 반응된 후 수행되었다.
제3도에서 보여지는 바대로, 전기영동은 PLS농도의 증가에 따라 올리고뉴크레오타이드의 이동도가 감소되었다. 전하적으로 중화된 혼합물형성에 있어서, 올리고뉴크레오타이드의 전기영동은 관찰되지 않았다. 혼합물형성에서 이들의 혼합농도는 이들 농도에 기초해서 설정되었다.
＜막분리 및 혼합물형성 농도＞
형성된 혼합물이 통과할 수 없는 구획막을 가진 초여과용(ultrafiltration) 튜브(일본 Millopre Company제, limited ultrafree C3-GC uFC3 TGCOO 여과기가 부착된 원심튜브)를 미리32P-ATP로 표식하고 특정된 함량의32P를 가진 올리고뉴크레오타이드로 채운다. 이 용액과 폴리아미노산용액은 여러 비율로 혼합되고, 각각 혼합물은 원심분리하기 위해서 튜브에 담겨지고, 여과된 용액의 유리 올리고뉴크레오타이드에서32p함량이 측정되었다. 결국, 초기의32P의 양에 대한 여과된 용액에서의32P함량을 정량하는 동안 형성된 혼합물의 정량은 직접 측정된다. 결과는 제1도에서 보여진 DRA1 및 R32와 PLL①, PLS(33/1) 및 PLS(1/1)에 대한 복합물형성의 결과를 보여주는 제4도에 나타나 있다.
측정된 혼합물형성농도는 상기한 흡수도와 전기영동의 측정치로 부터 얻어진 값과 일치한다. PLS의 경우에는, 혼합물 용액에서 혼탁이 관찰되지 않았다.
올리고뉴크레오타이드와 폴리아미노산의 혼합체 형성농도는 이들 결과에서 얻어진다.
보편적으로, 직쇄와 비교 하면, 올리고뉴크레오타이드가 스템루프(stem loop)와 같은 제2구조를 형성하는 것이 스템지역을 가지는 표적 안티센스분자와 결합하기에 어렵다는 것이 잘 알려져있다. 이것은 본 발명의 운반체에도 자연예상되어진다. 그러므로, 올리고뉴크레오타이드의 분자량과 3차원구조가 폴리아미노산결합에 어느정도 영향을 미치는지 조사되었다. 막분리에 기초한 측정기술에 의해 수행되었고, 제1도에 나타난 올리고뉴크레오타이드(a), (b)의 2종류를 사용하는 것을포함한다. 올리고뉴크레오타이드와 폴리아노산의 농도로 어느정도 복합체가 형성되는지 구해졌다.
PLL과 혼합물을 형성함에 있어서, 2종류의 올리고뉴크레오타이드 사이에 차이가 관찰되었다. PLL농도의 증가에 따라서, DRD12와 PLL의 혼합물의 형성이 진행되면, 최종적인 혼합물형성의 량은 80%에 이른다. 반면에, PLL과 R32의 혼합물의 양은 PLL의 고농도의 부근에서 50%정도로 있다. 직쇄상의 올리고뉴크레오타이드와 비교하면, 제2구조의 올리고뉴크레오타이드가 주사슬로 리신을 가지는 아미노산과 결합하는 것은 더 어렵다.
다른 한편, 올리고뉴크레오타이드는 본 발명의 PLS에 올리고뉴크레오타이드가 결합하는데 있어서, 전혀영향을 미치지 않는다. 모든 경우에 있어서, 올리고뉴크레오타이드에 PLS결합운 PLS농도의 증가와 함께 진행되어 결국, PLL-DRD12 혹은 PLS-R32의 복합물형성양이 100%에 이르도록 한다. 특히, 세린과 리신이 동량 함유된 PLS(1/1)는 DRD12 혹은 R32의 100%혼합물을 빠르게 형성한다. 유연한 골격을 가진 세린 잔기를 삽입한 것이 전체 PLS의 자유성을 증가했다는 사실에 기인한다. 결과로, 특이한 3차구조를 가진 올리고뉴크레오타이드와 결합을 방해하는 것을 회피하도록한다. 그러므로, 적어도 올리고뉴크레오타이드의 배열에 관해서는 본 발명의 새로운 운반체가 올리고뉴크레오타이드약품을 제한하지는 않는다. 이 결과, 본 발명의 운반체는 특히 최근에 연구자료의 증가하고 있는 리포솜약품이나 안티센스약품의 생체내 운반에 유용하다.
유사한 연구가 상기한 올리고뉴크레오타이드 DRD12(12염기)와 R32(32염기)보다 훨씬 높은 분자량을 가진 플라스미드 uP119(3162염기쌍)와 폴리아미노산 운반체의 복합물의 형성을 수행한 것이다. 결과는 표5에 나와 있다. 즉 본 발명의 운반체 PLS는, 비록 저분자량의 DRD12 혹은 R32보다는 낮은 복합물형성비율을 보였지만, 종래의 PLL운반체(약30%)보다 유의적으로 높은 고분자량의 올리고뉴크레오타이드(pU119)와 혼합물형성비(약40%)를 보였다. 이 결과는 본 발명의 운반체가 플라스미드 발현인자의 생체내 운반에 잘 적용한다는 것을 보여준다.
＜모세관 전기영동＞
전기영동에 관한 실험의 상기한 결과(제3도)로 부터, PLS와 올리고뉴크레오타이드복합물이 하전되지 않았다는 것이 예상된다. 그러므로, 이 결과는 이 복합물을 모세관 전기영동(Otsuka Electronics Company제, MCPD-3600 발광 다채널 검출기가 장착된 다채널 모세관 전기영동기 : CAPI-3000)에 적용하므로서 더욱 명확하게 확인되었다. Si가 코팅된 모세관(음이온으로 하전됨)을 사용하였다.
제6a, 6b, 및 6c도(200nm에서 pherogram)에 결과가 보여진다. 이러한 조건하에서, 하전되지 않은 페닐알라닌(Phe)의 피크는 4.35분(a)의 홀딩시간에서 검출되었고, PLL과 올리고뉴크레오타이드이 피크는 29.46분(b)에서 검출되어졌다. 이것은 이 복합물의 양극하전 때문에, 모세관으로 결합이 일어나므로, 결과로 페닐알라닌에 비해서 픽크 검출시간에 지연이 생긴다.
PLS(3/1)와 올리고뉴크레오타이드의 복합물의 피크는 전하를 가지지 않은 페닐알라닌의 홀딩시간과 인접한 홀딩시간(4.52분)에서 관측되었다. 이 결과 PLS와 올리고뉴크레오타이드의 혼합물은 전하를 제공하지 않는다는 것을 나타낸다.
기관에 대한 전하(주로 양극전하)의 영향은 운반체계의 평가에 중요하다고 고려되기 때문에, 전하를 가지지 않은 PLS운반체는 세포에 대해 낮은 독성을 가지고 있다고 예상되고, 새로운 생체 약품운반체로서 의미를 가진 것으로 제시된다.
＜올리고뉴크레오타이드의 안정성＞
올리고뉴크레오타이드의 안정성에 대한 이온성 복합물형성의 효과는 인체혈청에서 다음과 같은 방법으로 평가되었다.
PLS(3/1)용액과 PLS(1/1)용액(농도 : 1×104M)은 인산염 완충용액으로 1E-4M으로 조재시킨 PLS stock 용액을 동일한 완충용액으로 희석하여 준비하였다. 그런후, 각각의 결과용액은32P-ATP(ribozyme R32)로 표식된 올리고뉴크레오타이드의 용액(농도 : 0.25㎍/㎕)에 첨가되어서, 다양한 혼합비를 가진 복합물용액이 준비되었다.
인간 혈청용액의 최종농도가 90%에 다다르도록 첨가량을 조절하는 동안 PLS와 올리고뉴크레오타이드의 복합물용액을 혼합한 후, 결과용액을 37℃에서 배양되었다. 적절한 시간간격으로 취해진 시료용액은 1N의 염산을 필요량 첨가하여 pH 5.0정도로 조절한 후, 막구획 분자량 10,000을 가진 과여과튜브(일본 Millipore사 제품의 limited ultrafree C3-GC UFC3 TGC00여과기기 부착된 원심튜브)로 전송되었다. 원심분리기로 5,000rpm에서 15분간 RNase를 제거한 후, 여과된 용액은 분석시 까지 -80℃에서 저장되었다. 분석에 있어서, 이들 시료는 실온에서 용해되고, 20% 폴리아크릴아미드 변성시킨 젤로서 전기영동(2000V의 일정한 전압으로 24시간 동안)시킨다.
이 결과는 제7a도와 제7b도에 나와 있다. 제7a도는 PLS(3/1)의 결과를 보여준다.: 5 라인은 각 시간의 경과에 따른 인간혈청에 존재하는 R32의 분해패턴을 보여준다. 겔 위에서 관찰된 밴드는 분해되지 않은 R32이고, 바닥에서 관찰된 가는 밴드는 리보뉴크레아제에 의해서 분해된 R32이다. 전기영동의 결과에서 명료한 바와 같이, PLS(3/1)을 사용한 경우, R32의 분해가 0.08시간의 경과까지 관측되지 않았다. 이 분해된 R32의 양은 시간에 따라서 증가하였다. 24시간 경과에 따른 분해된 R32의 양은 0.08시간 경과에 따른 치의 반이하이다. 다른 한편, 제7b도는 PLS(1/1)에 관한 결과를 보여주고 있다. 즉 24시간 경과하는 동안 분해되지 않은 R32는 0.08시간 경과에 따른 것과 거의 같은 수준의 결합강도를 가진다. 운반체에서 해리된 R32의 존재를 제시된 결과와 거의 비슷 했다. 결과적으로, 잔류 RNA는 bio-image 분석기(Fuji Film Company사 제품, BA100)로 측정되고, 이 결과는 분해되지 않은 올리고뉴크레오타이드로 적용된다. 대조군으로서, 유사한 실험이 PLL용액에서 수행되었다. 이들 연구의 결과는 제8도에 나타난다.
90%농도를 가지는 인체 혈청에 있어서는, 유리 올리고뉴크레오타이드(복합물로 형성된 경우가 아님)는 보통 단시간에 분해된다. 한편으로 폴리아미노산 운반체와 결합한 올리고뉴크레오타이드는 분해되기가 더 어렵다는 것이 확실하다. 그러나 PLL과 복합물을 형성하면, 시간에 따라 분해되고, 24시간 이후에 복잡한 올리고뉴크레오타이드가 관찰되지 않았다.
PLS(3/1)과 혼합물을 형성하여서 보호되는 올리고뉴크레오타이드의 경우에는, 24시간의 경과 후에도 안전하게 존재한다. 세린의 잔기가 많은 PLS(1/1)와 복합물을 형성하는 올리고뉴크레오타이드의 경우에는, 24시간 경과후에도 90%이상이 안전하게 존재한다.
이들의 결과는, 본 발명의 양이온 PLS운반체가 올리고뉴크레오타이드 약품과 결합하는 경우, 침전을 형성하지 않고, 이들이 생체에서 올리고뉴크레오타이드 약물의 투여의 안정성에 커다란 기여를 한다. 세린잔기함량의 증가가 운반체로서 PLS의 기능향상에 효과적으로 작용한다는 것이 명확하게 제시된다.
＜올리고뉴크레오타이드의 분리＞
일단 형성된 이온성 복합물에서 올리고뉴크레오타이드의 분리는 이 시스템에서 pH를 변경하는 것이 가능하다.
강알카리성 조건하에서 100% 나선구조로 존재하지만, 산성 조건하에서는 거의 100% 랜덤코일구조를 가진다. pH에 민감한 PLL의 특성에 관심을 기울이면, PLL의 랜덤공중합체인 PLS는 역시 pH에 민감하리라 예상된다. 원형 이색성 측정의 결과로, PLS는 pH7부근에서 PLL보다 더 많은 나선구조를 가지고 있지만, pH5이상에서 나선 함량은 PLL의 나선함량과 거의 같은 수준이다. 이것은 혈액에서(pH:7.0), PLS의 많은 나선구조가 뉴크레아제로부터 올리고뉴크레오타이드를 보호하리라는 가능성을 제시하고, 세포내로 병합되어 지는 리소솜(pH 5.0)에 도달할 때, 올리고뉴크레오타이드 약품은 항진적으로 분비된다.
흡수율, 전기영동, 막분리 측정에 대한 상기한 결과에 기준하여, PLS(3/1)및 PLS(1/1)용액의 각각은32P-ATP로 표식된 올리고뉴크레오타이드 R32용액(5 pmol/㎖)과 혼합되어, 이것의 혼합물의 용액이 준비된다. 복합물이 pH3∼10 범위 환경에 있는 복합물용액은 1N염산이나 1N NaOH 첨가로 ph를 조정하여 준비하였다. 각각의 용액은 초여과 튜브(일본 Millipore Company사의 limited utratfree C3-GC UFC3 TGC00 여과기가 장착된 원심튜브)로 통과하고 5,000rpm에서 15분간 원심분리시켰다.
여과된 용액에서32P의 양이 측정되고, 유리 올리고뉴크레오타이드의 양은 초기의32P 양에 대한 여과된 용액에서의32P용액에 대응된 값으로 결정된다. 이 결과는 제9도에 나와 있다.
폴리아미노산 운반체와 결합된 올리고뉴크레오타이드는 pH6 이하에서 해리되기 시작한다. 약 pH3의 산성측에서, 본 발명의 PLS운반체는 100%의 올리고뉴크레오타이드와 해리를 보이고, PLL 운반체는 오직 75%의 해리만을 보인다. 특히, pH5.0의 경우에서, 리소솜을 위한 조건과 동일 할때, PLL과 PLS사이에 현격한 차이가 관측되었다. 상기한 설명에서 나온 증거로, 바이러스 저지유전자와 같은 올리고뉴크레오타이드는, 본 발명의 PLS운반체에 의해 세포로 운반되고, 리소솜의 pH 효과로 PLS운반체와 해리되고, 그리하여 이올리고뉴크레오타이드의 기능을 완전하게 발휘할 수 있다.
유사한 연구가 고분자량을 가진 올리고뉴크레오타이드 pU119로 수행되어 진다. 제10도에 오직 산성조건(pH3)에서 PLS(1/1)dl 100%분리된다는 결과가 나와있다. 비록 100%가 아니더라도, PLS(3/1)은 PLL의 분리능력보다 훨씬 뛰어나다는 것을 보여준다. pH5에서는, 리소솜에서와 같은 조건에서, PLS와 PLL사이의 차이는 현저한 것이다. 이 결과로 부터, 본 발명의 PLS 운반체는 안티센스약품이나 리소솜약품에서 뿐아니라, 플라스미드 발현벡터등과 같은 것이 생체내에서 운반에도 유용하다는 것이 확인되었다.
본 발명의 폴리아미노산 올리고뉴크레오타이드운반체는 올리고뉴크레오타이드와 결합하여 침전을 형성하지 않고, 세포내에서 결합된 올리고뉴크레오타이드를 쉽게 분리한다. 그러므로, 여러 유전자적 질병과 AIDS와 같은 바이러스성 질병에 대한 치료의 올리고뉴크레오타이드 약제의 생체내에서 운반체로서 유용하다. 이것은 또한 바이러스 저항 식물과 같은 유전공학에 의해서 여러 유용한 동물과 식물을 창조하는데 기여한다.

Claims (3)

  1. 폴리리신:세린 랜덤공중합체를 포함하는 폴리아미노산 올리고뉴크레오타이드 운반체.
  2. 제1항에 있어서, 리산과 세린의 구성비가 5:1∼1:3의 범위에 있는 것을 특징으로하는 폴리아미노산 올리고뉴크레오타이드 운반체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기한 운반체가 3,000∼35,000의 평균분자량을 가지는 것을 특징으로하는 폴리아미노산 올리고뉴크레오타이드 운반체.
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