KR100320370B1

KR100320370B1 - 신규한2,5-다이케토-디-글루코네이트환원효소유전자및이를이용한2-케토-엘-글로네이트생산

Info

Publication number: KR100320370B1
Application number: KR1019980039405A
Authority: KR
Inventors: 염도영; 이봉용; 함대현; 반재구
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1998-09-23
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2002-03-21
Also published as: KR20000020688A

Abstract

본 발명은 신규한 대장균 유래 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소(2,5-diketo-D-gluconate reductase)의 유전자 염기서열을 결정하고 이들 효소들의 유전자를 결손시켜 포도당 대사에 의한 비타민 C 제조시 중간산물의 세포내 대사를 저해하여 고수율로 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글로네이트(2-keto-L-gulonate) 생산에 관한 것으로 대장균으로부터 코리네박테리움 속(corynebacterium sp.) 미생물의 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소와 글루코노박터 옥시단스(gluconobacter oxydans)의 5-케토-디-글루코네이트 환원효소의 아미노산 배열과 유사성을 보이는 단백질의 유전자인yqhE,yafB및yjgU를 클로닝한 후 이들 유전자 산물의 효소 단백질을 정제한 후 효소활성을 측정하여 상기yqhE유전자는 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하고yafB유전자는 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하며yjgU유전자는 5-케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하는 유전자임을 검증하므로써yqhE유전자,yafB유전자 및yjgU가 각기 코딩하는 대장균으로부터 유래된 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소, 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 및 5-케토-디-글루코네이트 환원효소의 존재를 확인하고 이들 효소의 대사경로에 기초하여 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 유전자인yafB유전자를 결손시키므로써 대장균내 생물전환에 의한 2-케토-엘-글로네이트의 생산시에 중간산물인 2,5-다이케토-디-글루코네이트의 세포내 대사를 방지하여 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글로네이트의 생산수율을 향상시키는 뛰어난 효과가 있다.

Description

신규한 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 유전자 및 이를 이용한 2-케토-엘-글로네이트 생산

본 발명은 신규한 대장균 유래의 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원 효소(2,5-diketo-D-gluconate reductase(DG)) 유전자 염기서열 및 이를 이용한 2-케토-엘-글로네이트의 생산에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 신규한 대장균 유래 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글로코네이트 환원효소의 유전자 조작에 의한 효율적인 2-케토-엘-글로네이트의 생물전환에 관한 것이다.

생물전환공정을 이용한 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글로네이트(2-keto-L-

gulonate)의 미생물에 의한 생물전환공정 경로는 포도당으로부터 글루코네이트(gluconate), 2-케토-디-글루코네이트 (2-keto-D-gluconate)를 거쳐 2,5-다이케토-디-글루코네이트 (2,5-diketo-D-gluconate)를 생산한 후 2-케토-엘-글로네이트로 전환하는 포도당 경로이다. 이 경로는 최근에서야 상업적인 시험생산에 들어갔을 뿐 관련정보는 일본의 시오노기(Shionogi)사와 겐넨테크(Genentech)사의 연구에 국한되어 있다. 이 연구는 원료가격이 솔비톨(sorbitol)에 비해 40% 수준이기 때문에 80년대 초 처음으로 재조합균주에 의한 1단계 생산에 대한 연구가 시작된 이래 지속적인 연구가 수행되고 있다. 포도당 경로의 생리 대사적인 측면을 관찰해 보면 포도당은 막결합 포도당 탈수소효소 (glucose dehydrogenase)에 의하여 페리프라즘 (periplasm)에서 산화되어 글루코네이트로 전환되고 다시 막결합 글루코네이트, 2-케토-디-글루코네이트 탈수소효소에 의하여 2,5-다이케토-디-글루코네이트로 전환된다. 이들 탈수소화 반응에 관여하는 효소들은 모두 막결합 효소로 알려져 있어 배지중의 포도당으로부터 2,5-다이케토-디-글루코네이트까지의 효소반응이 페리프라즘 (periplasm)에서 진행되므로 2,5-다이케토-디-글루코네이트가 높은 수율로 생산된다(Matsushita 등,Adv. Microb. Physiol., 26, 247-301, 1994). 이들 효소들의 조효소인 막결합 포도당 탈수소효소는 PQQ-의존성이고 글루코네이트, 2-케토-디-글루코네이트 탈수소효소는 FAD-의존성인 것으로 알려져 있다. 포도당으로부터 3단계의 탈수소 반응을 통하여 전환된 2,5-다이케토-디-글루코네이트는 세포질 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 통하여 2-케토-엘-글로네이트로환원되어야 한다. 그러나 현재까지 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 생산하는 미생물들은 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 활성을 가지고 있지 않는 것으로 알려져 있으므로 이들 활성을 갖는 미생물을 이용하여 2-케토-엘-글로네이트로 전환시켜 주어야 한다. 이 경로가 2-케토-엘-글로네이트 생산에 이용될 수 있는 가능성은 1982년 소노야마(Sonoyama)가 코리네박테리아를 이용하여 2,5-다이케토-디-글루코네이트로부터 2-케토-엘-글로네이트를 생산하므로써 확인되었는데(Sonoyama 등,Appl. Environ. Microbiol., 43, 1064-1069, 1982; Sonoyama등, US patent 3,998,697), 이후 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 2-케토-엘-글로네이트로 전환할 수 있는 다수의 미생물이 알려지게 되었다(Sonoyama 등, JP 4,543,331). 현재까지 알려진 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소는 NADPH-의존성으로 알려져 있다. 실제로 초산발효에 이용되고 있는 대부분의 초산균과 어위니아(Erwinia), 슈도모나스 (Pseudomonas) 등 다양한 미생물이 포도당으로부터 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 생산할 수 있는 것으로 알려져 있으나 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 활성을 가지고 있지 않기 때문에 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 2-케토-엘-글로네이트로 전환할 수 있는 미생물의 확보가 포도당 경로를 통한 2-케토-엘-글로네이트 생산의 중요 관건이 된다(Sonoyama 등,Agric. Biol. Chem., 51, 2003-2004, 1987).

1982년 소노야마(Sonoyama) 등은 어위니아속(Erwinia sp.)에서 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 생산하고 코리네박테리아속 미생물의 변이주를 이용하여 2-케토-엘-글로네이트로 전환하는 2단계 생물전환공정을 확립하여 전체 발효 100시간 동안 약85%의 수율로 106g/L의 2-케토-엘-글로네이트를 얻을 수 있다고 보고하였다(Sonoyama 등,Appl. Environ. Microbiol., 43, 1064-1069). 이들은 어위니아속 미생물과 코리네박테리아속 미생물의 혼합배양에 의한 공정과 새로운 2,5-다이케토-디-글루코네이트 생산균 탐색에 관한 연구를 하였다. 대부분의 2,5-다이케토-디-글루코네이트 생산균주와 2-케토-엘-글로네이트 전환균주들은 2,5-다이케토-디-글루코네이트의 대사능이 높고 생산된 2-케토-엘-글로네이트를 아이도네이트 (idonate)로 환원하여 다시 대사시킬 수 있기 때문에 이에 관련된 효소활성이 변이된 새로운 균주의 육종이 필요한 것으로 보고되고 있다. 1987년 소노야마(Sonoyama) 등은 코리네박테리아속 미생물을 이용하여 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 2-케토-엘-글로네이트로 전환할 때 2-케토-엘-글로네이트의 광학적 이성질체인 2-케토-디-글루코네이트가 함께 축적되는 것을 해결하기 위하여 코리네박테리아속 미생물의 2,5-다이케토-디-글루코네이트의 대사경로를 분석하였다(Sonoyama 등,Agric. Biol. Chem., 51, 3039-3047, 1987). 이들의 결과에 따르면 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 2-케토-엘-글로네이트로 전환할 때 발생될 수 있는 문제는 2,5-다이케토-디-글루코네이트가 2-케토알도네이트 환원효소(2-ketoaldonate reductase)와 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 작용을 받아 2-케토-디-글루코네이트와 2-케토-엘-글로네이트로 동시에 전환된다는 것이다. 또한 2,5-다이케토-디-글루코네이트로부터 전환된 2-케토-엘-글로네이트는 2-케토알도네이트 환원효소에 의하여 아이도네이트로 전환된 후 5-케토-디-글루코네이트(5KDG)를 거쳐 5-케토-디-글루코네이트 환원효소에 의해 글루코네이트로전환, 대사될 수 있음이 확인되었다. 이러한 문제해결을 위하여 2-케토알도네이트 환원효소와 5-케토-디-글루코네이트 환원효소의 활성을 잃어버린 돌연 변이주를 유도하여 2,5-다이케토-디-글루코네이트로부터 2-케토-디-글루코네이트의 축적없이 2-케토-엘-글로네이트를 생산하는 변이주를 얻어 90.5 mole% 수율을 얻었으나 부산물인 아이도네이트의 생성은 막을 수 없었다.

앤더슨(Anderson) 등은 코리네박테리아속 미생물로부터 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 유전자를 분리하여 2,5-다이케토-디-글루코네이트 생산균인 어위니아 허비콜라 (Erwinia herbicola)에 도입하여 1단계 생산공정을 확립하였다(Anderson 등,Science, 230, 144-148, 1985). 초기의 수율은 아주 낮았지만 꾸준한 수율향상을 위한 실험결과 약 100시간에 100g/L의 2-케토-엘-글로네이트를 생산하였다. 유사한 특성을 지닌 효소를 같은 균주에서 클로닝하여 초기의 수율로 볼 때는 더 높은(20-30g/L) 공정을 그린들리(Glindley) 등도 발표하였다(Glindley 등,Appl. Environ. Microbiol., 54, 1770-1775, 19988). 포도당 경로를 이용한 위의 재조합 균주의 생산수율이 낮은 이유는 첫째, 세포내 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소에 필요한 NADPH 재생의 필요성, 둘째는 2,5-다이케토-디-글루코네이트의 세포내로 전송, 세째는 세포내에서 형성된 2-케토-엘-글로네이트의 분비, 네째는 2,5-다이케토-디-글루코네이트 및 2-케토-엘-글로네이트의 숙주세포에 의한 분해 등에 기인한 것으로 분석되고 있다. 수율 향상은 부산물인 아이도네이트 생성경로와 2,5-다이케토-디-글루코네이트와 2-케토-엘-글로네이트 분해 대사경로를 막는 쪽으로 시도되었다. 앤더슨(Anderson)등은 어위니아의 2-케토알도네이트 환원효소가 2,5-다이케토-디-글루코네이트에서 5-케토-디-글루코네이트, 2-케토-디-글루코네이트에서 글루코네이트, 2-케토-엘-글로네이트에서 아이도네이트의 전환을 모두 촉매한다는 사실을 밝히고, 2-케토알도네이트 환원효소를 코딩하는 유전자를 결손시켜 부산물인 아이도네이트의 생산을 막으려고 시도하였으나 큰 진전을 보지 못하였다. 이는 어위니아 균주에 이미 밝혀진 2-케토알도네이트 환원효소이외에 같은 기능을 하는 효소 시스템이 존재하기 때문인 것으로 확인되었다.

이상의 생물전환방법이나 대사공학적 방법의 가장 큰 문제점은 산화적 대사과정을 갖는 미생물은 반드시 세포내에 중간산물이나 최종산물을 이용하는 대사경로도 함께 갖는다는 것이다. 기존에 밝혀진 대사경로를 단순히 차단하므로써 부산물의 생성을 막을 수는 있으나 미생물의 성장이나 원활한 대사과정의 운용에는 많은 문제점을 야기하였다.

본 발명자들은 어위니아 시프리페디 (Erwinia cypripedii)의 세개 서브유니트로 구성되어 있고 글루코네이트를 2-케토-디-글루코네이트로 전환시키는 막결합 글루코네이트 탈수소효소 (membrane-bound gluconate dehydrogenase; GADH) (Yum등,J. Bacteriol. 179, 6566-6572, 1997)를 코딩하는 유전자 클러스터를 클로닝하고 대장균에서 발현시켜 높은 수율로 전환시켰다. 그러나 재조합 대장균을 사용하여 글루코네이트로부터 2-케토-디-글루코네이트로의 전환실험을 수행하는 중 도 1에서 보여주는 바와 같이 글루코네이트가 배지에서 완전히 소모된 다음 글루코네이트로부터 전환된 2-케토-디-글루코네이트로가 조금씩 배양액에서 소실되었다. 물론 글루코네이트가 높은 수율로 빠르게 2-케토-디-글루코네이트로 전환되기 때문에 2-케토-디-글루코네이트 생물전환에는 문제가 없지만 상술한 바와 같이 포도당 대사과정을 이용한 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글로네이트 생물전환에 대장균을 숙주세포로 이용하기 위해서 그 원인을 검증하였다. 이 과정에서 본 발명자들 2-케토-디-글루코네이트가 대사되어 이용되었다면 2-케토-디-글루코네이트를 글루코네이트로 전환시켜 이용할 수 밖에 없으므로 대장균의 세포추출물을 조효소액으로 사용하여 2-케토-디-글루코네이트를 글루코네이트로 환원시키는 NADPH-의존성 환원효소 활성을 측정하였다. 그 결과 2-케토-디-글루코네이트를 글루코네이트로 환원시키는 효소활성을 관찰하였으며 이는 코리네박테리움 (Corynebacterium), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 어위니아 (Erwinia), 아세토박터 (Acetobacter), 글루코노박터(Gluconobacter), 세라티아 (Serratia), 슈도모나스 (Pseudomonas) 등의 미생물(Sonoyama 등,Agric. Biol. Chem.51, 3039-3047, 1987; Truesdell, 등,J. Bacteriol. 173, 6651-6656, 1991; Yum, 등,Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 154-156 1998)에서 보고된 케토글루코네이트에 관련된 대사과정이 대장균에도 존재할 수 있다는 가능성을 보여주었다. 어위니아, 아세토박터, 글루코노박터, 세라티아, 슈도모나스 등의 미생물에서는 포도당이 2-케토-디-글루코네이트, 5-케토-디-글루코네이트, 2,5-다이케토-디-글루코네이트 등의 케토글루코네이트로 산화되기 위해서는 앞서 설명한 바와 같이 전자전달 사슬과 연결되어 있는 막결합 탈수소효소에 의해 진행된다(Ameyama 등,Agric. Biol. Chem. 51, 2943-2950, 1987; Sonoyama 등,Agric. Biol. Chem. 52, 667-674, 1988). 케토글루코네이트 혹은 인산화된 케토글루코네이트가 대사과정에 들어가기 위해서는 NADPH-의존성 환원효소에 의해 환원된 후에만 가능하다 (Sonoyama 등,J. Ferment. Technol. 65, 311-317, 1987; Truesdell, 등,J. Bacteriol.173, 6651-6656, 1991). 2-케토-디-글루코네이트를 글루코네이트로, 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 5-케토-디-글루코네이트로, 2-케토-엘-글로네이트를 아이도네이트로 전환시키는 반응을 촉매하는 것으로 알려진 NADPH-의존성 2-케토알도네이트 환원 효소가 브레비박테리움 케토소레덕텀(Brevibacterium ketosoreductum)( Yum, 등,Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 154-156, 1998)과 어위니아 허비콜라 (Erwinia herbicola) ( Truesdell, 등,J. Bacteriol. 173, 6651-6656, 1991) 등에서 순수정제 혹은 부분정제를 통하여 생화학적 특성이 보고된 바 있다. 또한 2,5-다이케토-디-글루코네이트에 대한 기질특이성이 조사되지는 않았지만 초산균의 2-케토-디-글루코네이트 환원효소도 2-케토-엘-글로네이트를 아이도네이트, 2-케토-디-글루코네이트를 글루코네이트로 전환시키는 것으로 알려져 있다 (Ameyama와 Adachi, CARBOHYDRATE METABOLISM. PART D. Wood, W.A. ed. 89, 198-202, 1982). 보다 세부적인 케토글루코네이트의 이용에 관련된 대사경로는 코리네박테리움(Sonoyama 등,Agric. Biol. Chem. 51, 3039-3047, 1987)과 어위니아속(Truesdell, 등,J. Bacteriol. 173, 6651-6656, 1991)에서만 연구되었다. 이들 두 미생물의 케토글루코네이트 대사경로는, 2,5-다이케토-디-글루코네이트가 어위니아속에서는 5-케토-디-글루코네이트로 전환되지만, 코리네박테리움속 미생물에서는 글루코네이트로 전환되기 전에 2-케토-디-글루코네이트로 전환된다는 것을 제외하고는 상당한 유사성을 갖는다. 케토글루코네이트를 연속적으로 글루코네이트로 전환하는 것은 용성 NAD(P)H-의존성 환원효소들에 의하여 이루어지며, 글루코네이트는 인산화되어 6-포스포글루코네이트 (6-phosphogluconate)가 된 뒤 펜토스 포스페이트 경로(pentose phosphate pathway)를 통해 대사된다.

본 발명자들은 대장균내에 케토글루코네이트 환원효소가 존재할 수 있으므로 1997년 완결된 대장균의 게놈 염기 데이터베이스를 이용하여 관련 효소를 그 산물이 아직 밝혀져 있지않은 유전자중에서 검색하여 가능성이 있는 유전자를 PCR로 분리하고 그 유전자 산물을 정제한 후 그 기질 특이성을 검토하여 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 2-케토-디-글루코네이트로 전환하는 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소, 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 2-케토-엘-글로네이트로 전환하는 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소, 5-케토-디-글루코네이트를 글루코네이트로 전환하는 5-케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하는 유전자를 대장균에서 발견하였다. 이들 중 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소는 포도당 대사경로를 대장균에 도입할 경우 중간 전환산물이 대사되는데 관여하여 최종수율에 영향을 줄 수 있는 효소이다.

따라서, 본 발명은 상기 언급한 종래의 문제점을 해결하고자 안출한 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 대장균 유래 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 유전자 염기서열을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 대장균 유래 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 유전자를 결손시켜 포도당 대사에 의한 비타민 C 제조시 중간산물인 2,5-다이케토-디-글루코네이트의 세포내 대사를 저해하여 고수율로 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글로네이트를 생산함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 대장균 유래 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 유전자를 결손시킨 결손 유전자로 균주를 형질전환시키므로써 세포내에서 포도당을 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글루타네이트로 전환하는 형질전환된 숙주세포를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 대장균으로부터 코리레박테리움속 미생물의 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소와 글루코노박터 옥시단스의 5-케토-디-글루코네이트 환원효소의 아미노산 배열과 유사성을 보이는 단백질의 유전자인yqhE,yafB및yjgU를 클로닝한 후 이들 유전자 산물의 효소 단백질을 정제한 후 효소활성을 측정하여 상기yqhE유전자는 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하고yafB유전자는 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하며yjgU유전자는 5-케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하는 유전자임을 검증하고 상기 환원효소들의 기질특이성을 바탕으로 대장균내에서의 케토글루코네이트 대사경로를 작성하므로써 달성하였다.

도 1은 클로닝된 막결합 글루코네이트 탈수소효소 유전자를 갖는 재조합 대장균을 이용하여 글루코네이트를 2-케토-디-글루코네이트로 전환하는 효소활성을 나타낸 그래프이다.

도 2a와 도 2b는 대장균으로부터 유래하는 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네트 환원효소 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3은 대장균을 비롯한 다른 균주내에서의 케토글루코네이트의 대사과정을 나타낸다.

본 발명은 글루코박터 옥시단스의 5-케토-디-글루코네이트 환원효소와 코리네박테리움 속의 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 아미노산 서열과 유사성을 보이는 단백질을 검색하여yqhE와yafB유전자가 코딩하는 2개의 가상적인 산화환원효소(hypothetical oxidoreductase)와 5-케토-디-글루코네이트 환원효소와 유사성을 보이는yjgU유전자가 코딩하는 1개의 가상적인 산화환원효소를 얻은 단계; 상기 얻어진yqhE,yafB및yjgU유전자가 클로닝된 재조합 플라스미드로 대장균을 각각 형질전환시키고 배양하여 정제된 효소를 얻은 후 효소의 기질특이성을 조사하는 단계를 실시하여 대장균이 생산하는 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하는 유전자인yqhE, 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하는 유전자인yafB및 5-케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하는 유전자인 yigU를 얻고 상기 효소들의 기질특이성을 바탕으로 케토글루코네이트 대사경로를 작성하였다.

이하, 본 발명의 상세한 설명을 실시예를 들어 단계별로 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 대장균 유래의 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하는 유전자 검출

제 1단계: 유전자 클로닝

본 발명자들은 대장균내 5-케토-디-글루코네이트 환원효소나 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소와 같은 케토글루코네이트 환원효소 유전자 및 이들 효소와 관련된 케토글루코네이트 대사과정을 가지고 있을 가능성을 나타내는 대장균에서 케토글루코네이트 환원효소 유전자를 찾기 위한 방법으로 글리코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)의 5-케토-디-글루코네이트 환원효소(SP:P50199)(Klasen 등, J. Bacteriol. 177, 2637-43, 1995)와 코리네박테리움 속(Corynebacteriumsp.)의 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 (PIR:I40838) (Anderson 등, Science 230, 144-149, 1985)의 아미노산 서열을 이용, FASTA탐색을 하여 단백질 데이터 베이스상에 아미노산서열상이 유사한 단백질을 검색하였다. 실험결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 본 발명자들은 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소와 각각 49.8%와 42% 유사성을 보인yqhE와yafB유전자가 코딩(coding)하는 두개의 가상적인 산화환원효소(hypothetical oxidoreductases)(SP:Q46857과 SP:P30863)와 5-케토-디-글루코네이트 환원효소와 56% 유사성을 보인yjgU유전자가 코딩하는 한 개의 가상적인 산화환원효소(hypothetical oxidoreductase) (SP:P39345)를 검출하였다. 이들yqhE,yafB,yjgU유전자가 코딩하는 3개의 가상적인 산화환원효소(hypothetical oxidoreductase)의 기능을 알아보기 위하여 이들 유전자를 PCR로 증폭하고 벡터 플라스미드 pUC19에 클로닝하였다. 이때 PCR에 사용된 프라이머들을 표 2에 나타냈다. 유전자은행(GeneBank)에 등록된yqhE,yafB, 그리고yjgU의 염기서열(nucleotide sequences)(각각 accession No. AE000383, AE000129, 그리고 AE000497) (Blattner, et al., 1997)를 이용하여 프라이머들(yqhE-5,yqhE-3,yafB-5,yafB-3,yjgU-5, 와yjgU-3)을 고안하였다. 5'와 3' 말단에XbaI 제한효소 인식부위를 인위적으로 만들기 위하여 몇 개의 염기를 치환하였다. PCR은 GeneAmp PCR system 2400 (Perkin Elmer)을 사용하여 95℃에서 30 초간 변성, 65℃에서 30 초간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 중합반응의 조건으로 30회 반복하였고 72℃에서 3분 동안 신장기간(extension period)를 두었다. 생성된 PCR 산물들을XbaI으로 자른 플라스미드 pUC19에 클론(clone)하여 플라스미드(plasmid) pYQHE, pYAFB 그리고 pYJGU를 만들고 대장균 DH5α에 도입하고 배양하였다. 이때yqhE,yafB,yjgU유전자들이 바르게 삽입되어 있는지는 시퀀싱을 통하여 확인하였고 유전자은행에 등록된yafB유전자의 염기서열은 도 2a와 도 2b에 나타낸 바와 같으며 상기 플라스미드 pYAFB가 도입된 대장균 DH5α/pYAFB는 1998년 8월 7일 한국과학기술원 생명공학연구소내 유전자 은행에 기탁번호 KCTC 0509BP로 기탁하였다.

다른 단백질과 케토글루코네이트 환원효소의 유사성

조회서열	크기(aa)	서열 유사성	FASTAscore	match %	크기(aa)
코리네박테리움 속.2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소(PIR:140838)	276	SP:Q46857:YQHE_ECOLI,Esscherichia.coli metC-sufl내의 가상적인 산화환원효소	1091	49.8	274
		PIR:A32950:P100_LEIMA, Leishmania major예상되는 환원효소	958	44.6	284
		SP:P15339:2DKG_CORSP,Corynebacteriumsp. 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소	817	40.5	277
		SP:P30836:YAFB_ECOLI,Escherichia.coli aspU-mltD내의 가상적인 산화환원효소	772	42.0	267
		SP:Q02198:MORA_PSEPU,Pseudomonas putidamorphine 6-dehydrogenase	616	43.4	295
글루코노박터 옥시단스5-케토-디-글루코네이트 환원효소(SP:P50199)	256	SP:P39345:YJGU_ECOLIEscherichia.coli pepA-gntV내의 가상적인 산화환원효소	1125	56.0	254
		SP:P50842:KDUD_BACSU,Bacillus subtilis2-데옥시-디-글루코네이트 3-디하이드로젼나아제	759	42.9	254
		SP:P37769:KDUD_ECOLI,Escherichia.coli2-데옥시-디-글루코네이트 3-디하이드로젼나아제	712	43.0	253
		SP:Q05528:KDUD_ERWCH,Erwinia chrysanthemi2-데옥시-디-글루코네이트 3-디하이드젼나아제	694	40.5	253
		SP:P76633:YGCW_ECOLI,Escherichia.coli cysJ-eno내의 가상적인 산화환원효소	683	38.0	261

PCR에 사용한 프라이머

유전자	올리고뉴클레오타이드	절단부위	프라이머 염기서열^a
yqhE	yqhE-5	XbaI	5-TGAACGCGTCT A GAACATCACTG-3
	yqhE-3	XbaI	5-CTTCCGGCTCT AG ATGATGATGT-3
	yqhE-Nde	NdeI	5-AGGAACATATGGCTAATCCAACCGTTTATTAAG-3
	yqhE-Sap	SapI	5-GAGAAGCTCTTCCGCAGCCGCCGAACTGGTCAGGATC-3
yafB	yafB-5	XbaI	5-TCGCGGGTTC T AG A CCCGTCCGT-3
yafB	yafB-3	XbaI	5-GTGTTTGTCCG T CTA G ATGATCGACA-3
yjgU	yjgU-5	XbaI	5-AATACCTGTCT A GAGGTCACTCGT-3
	yjgU-3	XbaI	5-ATACCATTTTGT C TAGAGTGCAGG-3
	yjgU-5-Bam	BamHI	5'-GAATAA GGATCC GAACGATCTATTTTCACTGGCAGGAA-3'
	yjgU-3-Hin	HindⅢ	5'-GTAGGGGGG AAGC TTAAACAGCCAC-3'
[주] a 밑줄친 부분은 제한효소 인식부위를 나타내고 진한 글씨체는 제한효소 인 식부위를 만들기위하여 인위적으로 치환된 염기를 나타낸다.

제 2단계: yqhE , yafB , yjgU 유전자가 클로닝된 대장균 배양세포 추출물의 환원효소활성 측정

본 단계에서는 각각의yqhE,yafB,yjgU유전자가 클로닝된 대장균의 배양세포 추출물을 조효소액으로 해서 NADPH를 조효소로 사용하여 2-케토-디-글루코네이트, 5-케토-디-글루코네이트, 2-케토-엘-글로네이트, 2,5-다이케토-디-글루코네이트 등에 대한 환원효소 활성을 측정하였다. 실험결과,yqhE와yafB유전자를 갖는 대장균 pYQHE와 대장균 pYAFB는 기질 2,5-다이케토-디-글루코네이트에 대한 효소비활성이 10배이상 증가하였고 반응산물은 각각 2-케토-엘-글로네이트와 2-케토-디-글루코네이트로 나타났다. 이는yqhE유전자가 2-케토-엘-글로네이트를 만드는 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 코딩하고yafB유전자는 2-케토-디-글루코네이트를 만드는 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 (25DKG reductase (DG))임을 나타낸다. 또 현재까지 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 2-케토-디-글루코네이트로 환원시키는 효소와 그 유전자는 보고된 바 없으므로 본 발명에서 밝혀진 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소는 신규한 효소이다.yjgU유전자를 갖는 대장균(pYJGU)는 5-케토-디-글루코네이트를 글루코네이트로 전환 시키는 5-케토-디-글루코네이트 환원효소 활성을 10배이상 증가시켜yjgU유전자 산물은 5-케토-디-글루코네이트 환원효소임을 확인 할 수 있었다.

제 3단계: yqhE , yafB , yjgU 유전자가 클로닝된 대장균 배양세포 추출물의 환원효소활성 측정

본 단계에서는 상기 제 2단계를 더욱 확실히 증명하기 위하여 이들 환원효소의 순수 분리를 시도하였고 그 기질 특이성을 검토하였다.

첫 번째로 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소는 NEB사의 IMPACT^TM(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) 단단계-단백질 정제 시스템(one-step protein purification system)을 사용하여 분리하였다.yqhE유전자의 코딩 부위를 포함하는 DNA 단편은 제 1단계 표 4의 프라이머yqhE-Nde 와yqhE-Sap을 사용하여 합성하였고 합성된 DNA단편을 제한효소NdeI과SapI으로 처리한 후, 이소프로필-β-D-치오갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside;IPTG)-인두시블(inducible) T7 프로모터(promoter)를 가진 벡터 pTYB1에 클론하였다.yqhE유전자에 인테인(intein) 유전자가 연결된 플라스미드 pTY-YQH로 대장균 ER2566를 형질전환시켰다. 재조합 단백질정제를 위하여 재조합 대장균 ER2566 (pTY-YQH)을 LB 배지에서 600nm에서 OD 값이 0.5되게 배양하여 IPTG를 농도가 1 mM되게 첨가하여 4 시간 동안 단백질을 발현시켰다. 배양세포를 완충액 (20 mM Tris-HCl [pH 8.0], 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100)에 현탁시켜 초음파 파쇄하고 파쇄되지 않은 세포와 세포조각을 원심분리로 제거하여 얻은 상징액을 키틴(chitin)수지에 흡착 시킨 후 상기 완충액으로 2회 세척하였다. 단백질을 30 mM DTT로 절단한 후 절단 완충액 (20 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA)으로 용출시켰다.

두 번째로 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 정제는 재조합 플라스미드 pYAFB를 가지고 있는 재조합 대장균에서 발현하여 행하였다. 모든 정제 과정은 4℃에서 수행하였다. 배양세포를 원심분리하고 20mM 인산완충액 (pH 7.5)로 2회 세척한 후, 0.1 mM 페닐메틸설포닐 프로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride;PMSF)와 스트렙토마이신(streptomycin)(0.1 mg/ml)이 포함된 동일 완충액에 현탁시켜 초음파 파쇄하였다. 세포파쇄액을 15,000 Xg에서 30 분 동안 원심분리 하여 얻은 상징액을 조효소액으로 하여 효소 정제에 사용하였다. 이 조효소액에 유안을 25%로 포화되게 첨가하여 7 시간 동안 서서히 교반 시킨 후, 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 얻어진 상징액에 유안을 60%로 포화되도록 더 첨가하여 용액을 하룻밤 방치하였다. 원심분리하여 침전물을 모아 완충액에 녹이고 2리터 20 mM 인산 완충액에서 3회에 걸쳐 투석하였다. 투석한 단백질 용액을 20 mM 인산 완충액 (pH 7.5)으로 평형화 시킨 DEAE-Toyopearl 컬럼 (2.5 by 7 cm)에 흡착시켜, 동일 인산 완충액으로 세척한 후 1.19 ml/min 유속으로 0-1.0 M NaCl 농도구배로 단백질을 용출시켰다. 기질로 2,5-다이케토-디-글루코네이트와 보효소로서 NADH를 사용하여 측정한 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 활성이 DEAE-Toyopearl 크로마토그라피(chromatography)에서 용출 되었다. 활성 분획을 모아 최종 농도 1M이 되게 유안을 첨가한 후, 1M 유안이 포함된 20mM 인산 완충액 (pH 7.5)으로 평형화 시킨 phenyl-Toyopearl 컬럼(2.5 by 8.2 cm) 크로마토그라피를 행하였다. 1M 유안이 포함된 동일 완충액으로 컬럼을 세척하고, 1.19 ml/min의 유속에서 1-0 M 유안 농도구배로 단백질을 용출시켰다. 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 활성을 갖는 분획을 모아 20 mM 인산완충액(pH 7.5)에 대해 하룻밤 투석을 행하였다. 투석된 단백질을 20mM 인산 완충액 (pH 7.5)으로 평형화 시킨 블루-세파로스(Blue-Sepharose) CL-6B (2.5 by 4.8 cm)에 흡착시켜, 0-1.0 M NaCl 농도구배로 단백질을 용출시켰다. 효소 활성 부분을 센트리프렙(Centriprep) 10 (Amicon)으로 2.0 ml로 농축한 후, 미리 0.15 M NaCl이 포함된 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)으로 평형화시킨 세파크릴(Sephacryl) S-200 겔 여과 컬럼(gel filtration column ;1.5 by 93 cm) 크로마토그라피를 행하고, 활성 분획(15 ml)을 모아 4℃에 보관하였다.

세 번째로 5-케토-디-글루코네이트 환원효소는 아미노 말단에 6개의 His을 붙여 Ni-NTA 레진을 사용하여 정제하였다. 우선 재조합 플라스미드(plasmid) pQE-YJG를 만들기 위하여 주형(template)로서 대장균 크로모좀 DNA(E. colichromosomal DNA)와BamHI 과HindⅢ 제한효소 인식부위를yjgU에 도입하기 위하여 고안된 프라이머,yjgU-5-Bam과yjgU-3-Hin (표 2)를 가지고 PCR로yjgU유전자를 증폭하였다. 생성된 DNA 단편을 플라스미드 pQE31(QIAGEN)의BamHI 과HindⅢ 제한효소 인식부위에 삽입시켜 플라스미드 pQE-YJG를 제조하였다. 이 플라스미드(plasmid)에서yjgU는 아미노 말단쪽이 플라스미드 pQE31의 six-His tag-코딩부위(coding region)과 융합(fusion)되었으며, IPTG-유인 프로모터(inducible promoter)의 조절하에서 발현되도록 하였다. 5-케토-디-글루코네이트 환원효소는 대장균 ER2566 (pQE-YJG)에서 1mM IPTG로 대량 유도발현하였다. 정제를 위하여, IPTG로 4시간 발현유도시킨 세포를 모았다. 6His-tag 융합단백질은 Ni-NTA 레진 (QIAGEN)을 사용하여 재조합 대장균으로부터 정제하였다. 5-케토-디-글루코네이트 환원효소를 정제하기 위하여대장균ER2566 (pQE-YJG) 500ml 배양액으로부터 얻은 배양세포를 20ml의 50 mM 인산완충액 (pH 8.0), 0.3 M NaCl에 현탁시켜 얼음에서 초음파 파쇄하였다. 세포분쇄물(cell lyste)를 16,000g에서 원심분리하여 직접 1.6 ml 의 Ni-NTA 레진(QIAGEN) 컬럼에 통과시켰다. 컬럼을 30ml의 50 mM 인산완충액 (pH8.0), 0.3M NaCl, 10% 글리세롤(glycerol)로 세척하고, N-terminal 6His-tagged 5-케토-디-글루코네이트 환원효소를 4ml 의 50 mM Na-시트레이트 버퍼(citrate buffer)(pH 6.0)로 용출시켰다. 상기와 같이 정제한 3가지 효소 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소, 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 및 2-케토-디-글루코네이트 환원효소의 기질특이성을 표 3에 정리하였으며 이 표에 나타낸 바와 같이 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소와 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소는 2,5-다이케토-디-글루코네이트에 특이적이고 다른 기질과는 기질특이성을 보이지 않았다. 또한 정제된 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소와 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 2,5-다이케토-디-글루코네이트와의 반응산물도 각각 2-케토-엘-글로네이트와 2-케토-디-글루코네이트로 앞서의 결과와 일치하였다. 5-케토-디-글루코네이트 환원효소도 기질 5-케토-디-글루코네이트에만 특이적으로 반응하였고반응산물은 글루코네이트였다. 조효소는 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 경우 NADPH에 특이적이였고 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소와 5-케토-디-글루코네이트 환원효소의 경우 NADPH 보다 NADH에 특이적이였다.

2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소, 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소, 5-케토-디-글루코네이트 환원효소의 기질특이성

기 질	상대활성(%)
기 질	25DKGR(25DKG→2KLG)	25DKGR(DG)(25DKG→2KDG)	5KDGR(5DKG→GA)
2-케토-디-글루코네이트(2KDG)	0	0	0
2,5-다이케토-디-글루코네이트(25DKG)	100	100	0
2-케토-엘-글로네이트(2KLG)	0	0	0
5-케토-디-글루코네이트(5KDG)	0	0	100
과당(D-프럭토스)	0	0	0
솔보즈(L-솔보즈)	0	0	0
[주] 25DKGR: 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소5KDGR: 5-케토-디-글루코네이트 환원효소

실시예 2: 케토글루코네이트 대사경로

상기 실시예 1에서 서술한 바와 같이 본 발명에서는yqhE,yafB,yjgU유전자를 검출하고 이 유전자 산물이 케토글루코네이트 환원효소임을 증명하였으며 효소의 기질과 반응산물을 확인하였다. 따라서, 이와같은 사실을 바탕으로 대장균의 케토글루코네이트 대사경로를 도 3에 나타냈다. 즉 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소는 어위니아속 미생물에서는 5-케토-디-글루코네이트로 전환된 후 대사되고 코리네박테리움속 미생물에서는 2-케토-디-글루코네이트로 전환된 후 대사되나 본 발명 대장균의 경우는 2-케토-디-글루코네이트, 5-케토-디-글루코네이트, 2-케토-엘-글로네이트를 거쳐 글루코네이트로 전환 될 수 있다. 위의 경로를 거쳐 생성된 글루코네이트는 Entner-Doudoroff (ED) 경로를 거쳐 완전히 대사된다. 2,5-다이케토-디-글루코네이트의 2-케토-엘-글로네이트, 아이도네이트, 5-케토-디-글루코네이트를 거친 경로는 최근 Bausch 등(Bausch 등,J Bacteriol180, 3704-3710, 1998)이 아이도네이트 탈수소 효소 (IA dehydrogenase (5KR(I))의 존재를 밝힌 바 있으므로 그 경로가 가능하다고 할 수 있다. 결국 대장균을 생산 숙주미생물로 하여 막결합 글루코네이트 탈수소효소나 막결합 2-케토-디-글루코네이트 탈수소 효소를 이용하여 2-케토-디-글루코네이트나 2,5-다이케토-디-글루코네이트를 생산할 경우 케토글루코네이트가 세포내로 대사되지 않도록 하기 위해서는yafB유전자를 결손시킴으로써 가능한 것이 확인되었다.

본 발명은 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 대장균으로부터 유래되는 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소, 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소 및 5-케토-디-글루코네이트 환원효소의 유전자를 클로닝하고 이중 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디 글루코네이트 환원효소를 코딩하는yafB유전자 염기서열을 결정하여 제공하는 효과가 있고 또 이들 효소들의 대사경로에 기초하여 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소의 유전자인yafB유전자를 결손시키므로써 대장균내 생물전환에 의한 2-케토-엘-글로네이트의 생산시 중간산물인 2,5-다이케토-디-글루코네이트의 세포내 대사를 방지하여 비타민 C 전구체인 2-케토-엘-글로네이트의 생산수율을 향상시키는 뛰어난 효과가 있으므로 생물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

대장균에서 유래되고, 하기와 같은 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소를 암호화하는 유전자.
상기 제1항의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pYAFB.
상기 제2항의 재조합 플라스미드 pYAFB가 도입되어 형질전환된 대장균 DH5α/pYAFB 균주(기탁번호 KCTC 0509BP).
케토글루코네이트 대사 경로에 관여하는 특정 유전자를 삽입시킨 플라스미드 숙주세포에 도입하여 형질전환된 재조합 균주를 배양하여 2-케토-엘-글루코네이트를 생산하는 방법에 있어서, 상기 제1항 기재의 유전자를 결손시켜 2,5-다이케토-디-글루코네이트(2,5-diketo-D-gluconate)가 2-케토-디-글루코네이트(2-keto-D-gluconate)로 전환되는 경로를 차단하여,

2-케토-엘-글로네이트(2-keto-L-gulonate)을 제조하는 방법.
대장균으로부터 유래되고, 하기와 같은 특성을 가지는 2-케토-디-글루코네이트 생산 2,5-다이케토-디-글루코네이트 환원효소.

a) 기질특이성 및 활성 : 2,5-다이케토-디-글루코네이트(2,5-diketo-D-gluconate)를 2-케토-디-글루코네이트(2-keto-D-gluconate)로 전환시키고,

b) 조효소 : NADH,

c)아미노산 서열을 하기와 같다.