KR100291701B1

KR100291701B1 - 갈리신의 항암제로서의 용도

Info

Publication number: KR100291701B1
Application number: KR1019970060039A
Authority: KR
Inventors: 한성수; 노석초; 최용화
Original assignee: 한성수; 최용화
Priority date: 1997-11-14
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 2001-11-14
Also published as: KR19990039816A

Abstract

본 발명은 신나무 잎의 추출물으로부터 분리, 정제한 하기 화학식(Ⅰ)으로 표시되는 항암제용 갈리신 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 항암제용 갈리신 화합물은 항암능이 탁월하며 천연재료에서 추출한 것으로 안전한 천연 항암제이다.

Description

항암제용 갈리신 화합물 및 그 제조방법

본 발명은 신나무(Acer ginnala) 지상부로부터 메칠갈레이트로 표현되는 항암제용 갈리신(Gallicin) 화합물과 그 제조방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 본 발명은 신나무 지상부 잎으로부터 추출된 아래 표기한 화학식 1의 구조를 갖는 갈리신 화합물을 천연 항암제로 사용하는 새로운 용도 및 상기 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 갈리신 화합물이 포함된 약학적 조성물 및 신나무 추출물은 항암능이 탁월하여 그 산업적 이용성이 크게 기대된다.

신나무는 단풍나무과에 속하며, 각지의 산기슭과 낮은 산에서 널리 자라며 잎은 탄닌의 원료로 쓰이며 민간에서는 설사멎이 약으로 쓰인다(동의학사전, 630p, 199; 약초의 성분과 이용, 378p, 1984).

따라서 본 발명의 목적은 신나무 지상부 잎으로부터 추출한 추출물을 분리, 정제한 물질을 천연의 항암제로 제공하는 것과 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

따라서, 상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명자들은 신나무 지상부 잎으로부터 용리물질을 유기용매로 추출한 다음 실리카겔 칼람 크로마토그라피, ODS 칼람 크로마토그라피, GPC 칼람 크로마토그라피를 수행하여 메칠갈레이트로 표현되는 갈리신 화합물을 분리, 정제하고 SRB (sulforhodamine B) 분석방법을 사용하여 항암성을 조사하므로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 설명한다.

제1도는 본 발명 메칠-3,4,5-트리하이드록시벤조에이트(Methyl-3,4,5-trihydroxybenzoate)로 표현되는 갈리신(Gallicin)의 수소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

제2도는 본 발명의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

제3도는 본 발명의 질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.

본 발명은 신나무 지상부 잎으로부터 용리물질을 추출하는 공정; 용리물질로부터 갈리신을 분리정제하는 공정; 갈리신의 항암활성을 조사하는 공정으로 구성된다.

도 1은 디메칠설폭사이드(DMSO)를 용매로하고 테트라메칠실린(TMS)를 표준물질로 하여 메칠-3,4,5-트리하이드록시벤조에이트(Methyl-3,4,5-trihydroxybenzoate)로 표현되는 갈리신(Gallicin)의 수소 핵자기공명 스펙트럼을 조사한 결과를 나타낸 것이다. 도 2는 본 발명의 디메칠설폭사이드(DMSO)를 용매로하고 테트라메칠실린(TMS)를 표준물질로 하여 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 조사한 결과를 나타낸 것이다. 도 3은 본 발명의 질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.

본 발명은 시료로 WKI-1, WKI-2 및 WKI-3을 시료로하고 Tumor cell lines로 A549(human lung), SKOV-3(human ovarian), SKMEL-2(human melanoma), HCT 15(human colon) 그리고 XF 498(human CNS)을 사용하여 SRB(sulforhodamine B) 분석을 이용하여 항암 활성을 평가하였다.

신나무잎은 전라북도 익산지역에서 채취하였으며 이들 잎을 메탄올로 추출한 추출물에 증류수를 첨가하여 헥산, 클로로포롬, 에틸아세테이트, 부탄올분획 및 물분획 등으로 용리물질을 분리하여 각 분획의 항암활성을 조사하였다. 이때 용매로서 에틸아세테이트를 사용하는 경우 상기 추출물이 바람직한 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 본 발명은 신나무 지상부 잎으로부터 항암활성을 나타내는 활성물질을 분리, 정제한 후 그의 화학적 구조를 결정한 결과 상기 화학식 1의 구조를 갖는 메칠-3,3,5-트리하이드록시벤조에이트(Methyl-3,3,5-trihydroxybenzoate)임을 확인하였다. 상기 신나무의 지상부잎으로부터 얻은 에틸아세테이트 분획을 실리카겔 칼람크로마토그라피를 수행함에 있어서 전개용매로는 클로로포름: 메탄올의 혼합용매를 사용하였다. 이에 더하여 상기 활성분획을 ODS 칼람 크로마토그라피를 수행하며, 이때의 전개용매로는 증류수와 메탄올을 사용하였다. 상기 정제과정에서 확인된 활성분획은 GPC 칼람 크로마토그라피를 수행하였고 이때 전개용매로서는 증류수와 메탄올의 혼합용매를 사용하였다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 설명한 실시예는 본 발명의 구체적으로 예시하는 것에 지나지 않으며 따라서, 본 발명의 권리범위는 실시예에 단지 기재된 것에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 신나무 지상부 잎의 용매 분획

전북 익산 지역에서 채취한 신나무의 잎을 용매 분획하여 그의 항암 활성을 조사하였다. 생체중 700g을 메탄올(MeOH) 10ℓ로 2회 추출하여 농축 건조시켜 메탄올 추출물 185.2g을 얻었다. 메탄올 추출물을 증류수 500㎖에 첨가한 다음 핵산 500㎖를 첨가하여 클로로포롬층과 물층으로 3회 분획하였다. 물층에 클로로포롬 500㎖를 첨가하여 클로로포롬층과 물층으로 3회 용매분획하고, 물층에 다시 에틸아세테이트 500㎖를 첨가하여 에틸아세트층과 물층으로 3회 용매분획하고, 최종적으로 물층에 부탄올 500㎖를 첨가하여 부탄올층과 물층으로 3회 분획하였다.

각 분획을 감압 농축한 결과 핵산 분획, 클로로포롬 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획 및 물 분획을 각각 10g, 20.7g, 57.5g, 54.5g, 42.3g씩 얻을 수 있었다.

[실시예 2] 신나무 잎으로부터 항암물질의 분리, 동정

실시예 1의 신나무의 잎에서 얻은 용매 분획중 항암활성이 강하면서 비교적 분리 정제가 용이한 에틸아세테이트 분획을 대상으로 활성물질을 분리하였다. 실리카겔(70-230mesh, Merck사)를 클로로포롬에 현탁시켜 충전시킨 유리 칼람(5×70cm)에 에틸아세테이트 분획 57.5g을 용출 분리하였는데, 이때 용출 용매는 클로로포롬: 메탄올의 용매계를 사용하였으며, 그 결과 항암활성을 나타내는 분획 5.58g을 얻었다. 이 활성분획(5.58g)을 ODS 겔(70-230mesh, YMC사)이 충진된 유리칼람(5×70cm)을 이용하여 메탄올: 증류수의 용매계로 용출시켜 활성분획 2.36g을 얻었다. 이를 다시 Sephadex LH-20 겔(70g, Pharmacia사)로 충전된 유리칼람을 이용하여 증류수: 메탄올의 용매계로 용출시켜 활성분획 0.5g을 얻었다. 마지막으로 이 활성분획을 GPC 칼람 크로마토그라피를 이용, 분리 정제하여 단일물질 갈리신을 얻었다.

[실시예 3] 항암 활성 조사

첫째, Human solid tumor cell lines인 A 549(non-small cell lung), SKMEL-2(melanoma), HCT-15(colon), SKOV-3(ovarian), XF-498(CNS) 등은 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 배양하였으며 계대는 1주일에 1~2회 실시하였다. 세포들을 부착면으로부터 분리할때는 0.25% Trysin 및 3mM CDTA를 PBS(-)에 녹인 용액을 사용하였다. 둘째, 96 well plate(Nunc)의 각 well에 5×10³-2×10⁴cell을 가하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양하였다. 셋째, 각종 약물들은 소량의 DMSO에 녹여 시험에 원하는 농도까지 실험용 배지로서 희석하여 최종 DMSO 농도는 0.5% 이하가 되도록 하였다. 이것을 0.22㎛ filter로서 filtration한 후 각 농도 단계별로 희석하였다. 넷째, 상기 두 번째 단계의 24시간 배양시킨 각 well의 배지를 모두 aspiration하여 제거한 후, 세 번째 단계에서 제조한 약물들을 각 well에 200㎕씩 가한 후 48시간 배양하였다. 약물을 가하는 시점에서 Tz(Time zero) plate를 collection 하였다. 이때, 약물을 가하여 배양을 시작하는 시간에 collection하여 SRB protein양의 값을 구하여 Time zero(Tz)로 하였다. 약물을 가하지 않고 세포만 있던 well의 OD값을 control value(C)라 하였다. 약물을 처리한 well의 OD값을 drug treated test value(T)라 하였다. Tz, C와 T로부터 growth stimulation, net growth inhibition 및 net killing등의 약물의 효과를 판단할 수 있었다. 만약 T≥Tz일 경우에는 그 cellular response function은 100×(T-Tz)/(C-Tz)이며, T〈Tz일 경우에는 100×(T-Tz)/Tz로서 계산하였다. 다섯째, Tz plate 및 각 배양이 끝난 plate는 SRB assay 방법에 준하여 TCA에 의한 cell fixing, 0.4 SRB 용액으로 staining, 1% acetic acid로서 washing을 실시한 후 10mM Tris 용액으로 dye를 elution 시켜 520mM에서 OD값을 측정하였다.

실험결과는 하기 표 1~3과 같다.

실험결과, 상기 세가지 화합물중 WKI-3(갈리신, Gallicin)에서 세포들의 ED50값이 가장 적게 나타났고 WKI-3(갈리신, Gallicin)에서 항암효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.

이상 실시예에서 확인되는 바와같이, 본 발명의 신나무 잎의 추출물 및 갈리신 화합물은 탁월한 항암 활성을 나타내므로 식물에서 유래한 안전하고 효과적인 천연 항암제로 널리 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법으로 얻어진 신나무 추출물은 의약품에 널리 응용될 수 있으므로 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

사람 폐암, 난소암, 피부세포암, 중추신경계암 및 결장암으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 암을 치료하기 위한 하기와 같은 구조식(Ⅰ)의 갈리신(메칠-3,4,5-트리하이드록시벤조에이트)을 유효성분으로 포함하는 사람 암 치료제.