CN115057842B - 胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体及其制备方法和应用 - Google Patents
胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体及其制备方法和应用,属于医药技术领域,涉及从胡椒科(Piperaceae)植物胡椒(Piper nigrum L.)的根中提取分离得到的4对二聚体酰胺生物碱对映体。通过将胡椒根粗提物依次经硅胶柱色谱,聚酰胺柱色谱,HP20柱色谱,ODS柱色谱,HPLC分离的色谱方法进行分离,并利用手性色谱柱对其进行手性拆分最终得到8个新二聚酰胺生物碱。本发明还通过测试上述化合物抑制LPS诱导的BV2细胞的NO释放量,对该类化合物抗神经炎症作用进行考察,证明所获得的化合物具有抗神经炎症作用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及从药用植物胡椒根中分离得到的4对二聚体酰胺生物碱对映体,并提供了其在抗神经炎症方面的用途。
背景技术
胡椒(Piper nigrum L.)为胡椒科(Piperaceae)胡椒属木质攀援藤本植物,广泛分布于热带和亚热带地区,我国台湾、福建、广东、广西及云南等省区均有栽培。胡椒的果实(白胡椒和黑胡椒)是世界上最受欢迎的香料,也是传统的中药。其具有温中散寒,下气消痰的功效。小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞,在维持中枢神经系统稳态和损伤修复过程中发挥重要作用。小胶质细胞介导的炎症反应在神经退行性疾病的发生发展过程中起关键作用。在外来或内源性刺激物质的作用下,小胶质细胞转变为激活状态产生一系列炎性细胞因子或细胞毒性因子。因此抑制小胶质细胞的过度活化是防治神经退行性疾病的重要策略之一。本发明选用的抗神经炎症的实验模型为脂多糖(LPS)诱导的BV2细胞模型,从胡椒根中寻找新的抗神经炎症的前体药物,并且研究它们的生物活性。
发明内容
本发明的目的在于提供4对从胡椒科胡椒属植物胡椒(Piper nigrum L.)的根中分离得到的二聚体酰胺生物碱类化合物,提供该类二聚体酰胺生物碱化合物的提取、制备方法,还提供其在抗神经炎症方面的用途。所述二聚体酰胺生物碱化合物结构如图所示:
所述胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体的制备方法,具体包括以下步骤:
取干燥的胡椒根以工业乙醇加热回流提取,合并提取液浓缩得浸膏,所得浸膏用水混悬,用二氯甲烷萃取3-4次,萃取后的水层用正丁醇萃取3-4次,将所得二氯甲烷层和正丁醇层去除溶剂后的干浸膏分别经硅胶柱色谱,均以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱,将所得流份进行交叉合并后共得到3个流份Fr.1、Fr.2、Fr.3;
流份Fr.1经减压硅胶柱色谱分离,以石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱,得到流份Fr.1-1、Fr.1-2、Fr.1-3,其中流份Fr.1-2聚酰胺柱色谱以乙醇-水系统进行梯度洗脱,经硅胶薄层检识和HPLC分析合并后得到2个流份A、B;
所得流份B经HP20柱色谱以乙醇-水系统进行梯度洗脱,经硅胶薄层检识和HPLC分析进行合并共得到4个流份B1、B2、B3、B4;
所得流份B1-B4经ODS柱色谱以乙醇-水系统进行梯度洗脱,经硅胶薄层检识和HPLC分析进行交叉合并共得到5个流份B’1、B’2、B’3、B’4、B’5;
流份B’4经硅胶柱色谱以石油醚-丙酮系统50:0-10:1进行梯度洗脱,共得到30份样品,后经硅胶薄层检识和HPLC分析进行合并得到10个组分B’4.1-B’4.10;
利用制备HPLC对组分B’4.8以甲醇-水系统38:62进行分离,得到10个组分B’4.8.1-B’4.8.10;
利用半制备HPLC对B’4.8.8以乙腈-水系统75:25进行洗脱,得到化合物2和3,利用相同方法,对B’4.8.10进行分离得到化合物1和4。
利用手性色谱柱对化合物1、2、3和4进行手性拆分分别得到了化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b。其手性拆分方法为:化合物1、2、3和4利用Daicel Chiralpak IC手性色谱柱,流动相为1:1的正己烷-异丙醇混合溶剂,流速为0.4mL/min,紫外检测器检测波长为210nm。
所述的制备方法中,采用的胡椒根来自胡椒科胡椒属植物胡椒(Piper nigrumL.)。
所述的制备方法中,干燥的胡椒根以70-80%工业乙醇回流提取2-3次;二氯甲烷-甲醇系统的梯度为50:0-3:1。
所述的制备方法中,流份Fr.1经减压硅胶柱色谱分离,以石油醚-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱时,石油醚-丙酮系统的梯度为50:0-3:1;流份Fr.1-2聚酰胺柱色谱以乙醇-水系统30:70-90:10进行梯度洗脱,且采用的乙醇的浓度为30%-90%。
所述的制备方法中,流份B经HP20柱色谱以乙醇-水系统20:80-90:10进行梯度洗脱;流份B1-B4经ODS柱色谱以乙醇-水系统20:80-90:10进行梯度洗脱;采用的乙醇的浓度均为20%-90%。
本发明中所述的手性拆分条件,适用于化合物1、2、3和4。
本发明所得化合物的结构鉴定结果如下:
利用紫外光谱、高分辨质谱、一维和二维NMR技术对化合物1、2、3和4的平面结构及相对构型进行确定。通过比较实测ECD和计算ECD谱图,对拆分后的光学纯化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b的绝对构型进行确定(如图1-图34)。
化合物1平面结构:无色油状物;易溶于甲醇,难溶于水。HR-ESIMS给出准分子离子峰m/z 523.3537[M+H]+(calcd for C32H47N2O4,523.3530),结合1H、13C NMR数据确定其分子式为C32H46N2O4,计算其不饱和度为11。1H NMR(600MHz,CDCl3)谱中,低场区给出δH5.68(1H,ddd,J=9.8,5.3,2.1Hz,H-3),5.81(1H,dt,J=9.8,2.0Hz,H-4)提示该化合物为酰胺二聚体类化合物,δH 6.72(1H,d,J=1.1Hz,H-7),6.65(1H,overlap,H-11),6.65(1H,overlap,H-10)为ABX耦合的芳香质子信号,δH 5.84(2H,d,J=1.5Hz)提示为一个亚甲二氧基。13CNMR(150MHz,CDCl3)谱共给出32个共振碳信号,其中含有2个酰胺羰基δC 170.6,173.5,8个sp2杂化碳信号及22个脂肪族碳信号。由氢谱和碳谱信息可知结构中应含有一个亚甲二氧苯基,两个哌啶胺酰基,一个长链烷基片段。1H-1H COSY谱中δH 5.81(H-4)-5.68(H-3)-3.55(H-2)-2.10(H-3″)-3.99(H-2″)-3.66(H-5)处于同一自旋耦合系统,得出中间的环己烯骨架。HMBC谱中,H-4,5与C-6有相关,H-7,11与C-5有相关,说明亚甲二氧苯基连在C-5位。H-2,1′,5′,3″与C-1有相关,H-2″,3″,1″′,5″′与C-1″可知两个哌啶环通过羰基分别连接于环己烯环的C-2和C-2″位。1H-1H COSY谱中δH 2.10与δH 1.19,1.37有相关,HMBC谱中H-2″与C-4″有相关,确定了正庚烷的连接位置。根据以上信息,得到该化合物的平面结构。平面结构如下图:
化合物1的相对构型:该化合物的相对构型是通过H-H耦合常数,NOESY谱共同确定的。H-2″与相邻的2个次甲基氢的耦合常数分别为10.4Hz和10.4Hz,因此推测H-2″与H-3″互为反式,H-2″与H-5互为反式,H-5和H-3″的NOESY相关证实了这一结论。由于H-2的信号重叠严重,加之H-3″的耦合裂分不明显,因此C-2位为相对构型的确定不能通过H-H耦合常数,NOESY谱来确定。在经过多次尝试后,在石油醚/丙酮/水(2:1:0.5)的混合溶剂中得到化合物1的单晶(CDCC 2153426),之后X-ray衍射实验结果确定了化合物的相对构型。
化合物1的绝对构型:采用Daicel Chiralpak IC手性色谱柱对化合物1进行了拆分,得到一对比例为1:1的对映异构体1a和1b,它们的ECD谱图呈镜像关系。他们的绝对构型是通过计算ECD与实测ECD相比较的方法确定的。化合物1a与计算的2R,5S,2″S,3″R构型吻合较好,化合物1b与其对映异构体2S,5R,2″R,3″S构型趋势一致。
化合物2的平面结构:无色油状物;易溶于甲醇,难溶于水。HR-ESIMS给出准分子离子峰m/z 521.3376[M+H]+(calcd for C32H45N2O4,521.3374),结合1H、13C NMR数据确定其分子式为C32H44N2O4,计算其不饱和度为12。1H NMR(600MHz,CDCl3)谱中,低场区给出δH5.81(1H,ddd,J=10.0,5.0,2.8Hz,H-4),5.69(1H,dt,J=10.0,1.9Hz,H-3)提示该化合物为酰胺二聚体类化合物,δH 6.78(2H,overlap,H-10,11),6.77(1H,d,J=1.3Hz,H-7)为芳香质子信号,δH 5.93(2H,s)提示为一个亚甲二氧基,δH 5.46(1H,dt,J=15.2,6.8Hz,H-5″),4.59(1H,ddt,J=15.2,10.0,1.5Hz,H-4″)为一个反式双建。13C NMR(150MHz,CDCl3)谱共给出32个共振碳信号,其中含有2个酰胺羰基δC 171.0,172.7,10个sp2杂化碳信号及20个脂肪族碳信号。由氢谱和碳谱信息可知结构中应含有一个亚甲二氧苯基,两个哌啶胺酰基,一个长链烷基片段。1H-1H COSY谱中δH 5.81(H-4)-5.69(H-3)-4.09(H-2)-2.76(H-3″)-3.55(H-2″)-3.36(H-5)处于同一自旋耦合系统,得出中间的环己烯骨架。HMBC谱中,H-2,3,1′,5′与C-1有相关,H-2,3″,1″′,5″′与C-1″有相关,说明两个哌啶环通过羰基分别连接于环己烯环的C-2和C-2″位;H-4″与C-3″,6″有相关,H-5″与C-3″,6″,7″有相关,说明正庚烯片段连接在C-3″位;H-5与C-7,11有相关,H-3″与C-6有相关,说明亚甲二氧苯基片断连接在C-5位上。根据以上信息,得到该化合物的平面结构。平面结构如下图:
化合物2的相对构型:该化合物的相对构型是通过H-H耦合常数和NOESY谱共同确定的,H-2与H-3″有相关,说明H-2与H-3″的相对构型为同取向;H-11和H-4″有相关,说明H-3″与H-5的相对构型为同取向;H-3″与相邻的2个次甲基氢的耦合常数分别为11.8Hz和5.7Hz,因此推测H-2″与H-3″互为反式,H-3″与H-5互为顺式,由此确定了该化合物的相对构型为2S*,5R*,2″S*,3″R*。
化合物2的绝对构型:采用Daicel Chiralpak IC手性色谱柱对化合物2进行了拆分,得到一对比例为1:1的对映异构体2a和2b,它们的ECD谱图呈镜像关系。他们的绝对构型是通过计算ECD与实测ECD相比较的方法确定的。化合物2b与计算的2S,5R,2″S,3″R构型吻合较好,化合物2a与其对映异构体2R,5S,2″R,3″S构型趋势一致。
表1化合物1-2在CDCl3中1H(400MHz)与13C(100MHz)NMR数据
化合物3平面结构:白色无定型粉末;易溶于甲醇,难溶于水。HR-ESIMS给出准分子离子峰m/z 509.3377[M+H]+(calcd for C31H45N2O4,509.3374),结合1H、13C NMR数据确定其分子式为C31H44N2O4,计算其不饱和度为11。1H NMR(600MHz,CDCl3)谱低场区中,δH5.97(1H,ddd,J=10.1,5.0,2.6Hz,H-4),5.59(1H,dt,J=10.1,1.9Hz,H-3)为[4+2]环加成的酰胺二聚体中间六元环上特征性的烯氢质子信号。δH 6.85(1H,d,J=1.3Hz,H-7″),6.74(1H,overlap,H-10″),6.73(1H,overlap,H-11″)可能为一个1,2,4-三取代苯环,δH 5.95(1H,d,J=1.5Hz),5.94(1H,d,J=1.5Hz)为连接于芳香环上的亚甲二氧基上质子信号,提示结构中可能含有一个亚甲二氧苯基。此外,结构中还含有一个异丁基δH 6.06(1H,t,J=6.0Hz,N-H),3.03(2H,m,H-1′),1.70(1H,m,H-2′),0.88(6H,d,J=6.7Hz,H-3′,4′),一个哌啶δH3.56(2H,m,H-5″′),3.43(2H,m,H-1″′),1.26-1.54(6H,overlap,H-2″′,3″′,4″′),一个正戊基δH 0.88(3H,t,J=6.8Hz,H-10),1.29-1.62(8H,overlap,H-6~9),一对反式双键上的烯氢质子信号δH 6.31(1H,d,J=15.6Hz,H-5″),5.92(1H,dd,J=15.6,10.0Hz,H-4″)。13CNMR(150MHz,CDCl3)谱共给出31个共振碳信号,包括10个sp2杂化碳信号,2个羰基碳信号,19个sp3杂化碳信号。在HMBC谱中,H-4″与C-6″有相关,H-5″与H-7″,11″有相关,说明多出的反式双建与苯环相连;H-4″与C-5,2″,3″有相关,确定了8″,9″-亚甲二氧苯基-6″-乙烯基在环己烯环上的连接位置;H-3与C-1有相关,H-1′与C-1有相关,证明异丁胺酰基连接在环己烯环的C-2位;H-3″与C-1″有相关,H-1″′,5″′与C-1″有相关,可以确定哌啶胺酰基的连接位置;H-4,6″与C-6有相关,加之1H-1H COSY谱中,H-5与H-6有相关,确定了正戊基的连接位置。根据以上信息得到该化合物的平面结构。平面结构如下图:
化合物3的相对构型:在NOESY谱中,H-6与H-4″有相关,说明H-5和H-3″的相对构型为顺式,据此可知5.3Hz为5,3″位氢之间的耦合常数,10.4Hz为2″,3″位氢之间的耦合常数,所以可以判断H-2″和H-3″的相对构型为反式。由H-2和H-3″间的NOESY相关信号可推测H-2和H-2″的相对构型为反式,因此确定化合物的相对构型为2R*,5S*,2″R*,3″S*。
化合物3的绝对构型:采用Daicel Chiralpak IC手性色谱柱对化合物3进行了拆分,得到一对比例为1:1的对映异构体3a和3b,它们的ECD谱图呈镜像关系。他们的绝对构型是通过计算ECD与实测ECD相比较的方法确定的。化合物3a与计算的2R,5S,2″R,3″S构型吻合较好,化合物3b与其对映异构体2S,5R,2″S,3″R构型趋势一致。
化合物4平面结构:无色油状物;易溶于甲醇,难溶于水。HR-ESIMS给出准分子离子峰m/z 509.3372[M+H]+(calcd for C31H45N2O4,509.3374),结合1H、13C NMR数据确定其分子式为C31H44N2O4,计算其不饱和度为11。1H NMR(600MHz,CDCl3)谱中,由δH 5.83(1H,ddd,J=9.9,5.2,2.8Hz,H-4),5.64(1H,dt,J=9.9,1.9Hz,H-3)可知,该化合物为一[4+2]环合的酰胺二聚体,δH 5.48(1H,dt,J=15.2,6.8Hz,H-4″),4.64(1H,ddt,J=15.2,9.4,1.5Hz,H-5″)为反式双建上的2个氢信号,且化学位移值为5.48的氢与亚甲基相连,化学位移值为4.64的氢与次甲基相连,且含有烯丙耦合。此外,结合13C NMR(150MHz,CDCl3)谱数据可以看出,结构中还含有一个哌啶胺酰基,一个异丁胺酰基,一个亚甲二氧苯基和一个正戊基。首先,由1H-1H COSY相关信号连出中间的环己烯骨架δH 5.64(H-3)-5.83(H-4)-3.37(H-5)-2.77(H-3″)-2.84(H-2″)-3.95(H-2)。此外,H-3″与反式双键上的氢信号H-4″,5″、亚甲基氢信号H-6″也属于同一自旋耦合系统,在HMBC谱中,H-3″与C-4″,5″有相关,H-4″与C-6″有相关,由此可知结构中含有一个正庚烯片断,连接在C-3″位。H-2,3与C-1存在远程相关,H-1′,5′与C-1存在远程相关,说明哌啶胺酰基连在C-2位。H-3″′,4″′与C-1″′、H-1″′与C-1″存在远程相关,H-2″与C-1″有相关,确定了异丁胺酰基的连接位置。H-5与C-7,11存在远程相关,说明亚甲二氧苯基片段连接在C-5位上,
化合物4的相对构型:该化合物的相对构型是通过H-H耦合常数和NOESY谱共同确定的。NOESY谱中,H-2和H-3″有相关,H-2″和H-4″与H-11也有相关,说明H-2″和H-2与H-3″互为反式;H-3″与H-5位互为顺式,因此该化合物的相对构型为2S*,5R*,2″S*,3″R*,这一结果被化合物4的单晶(CDCC 21522947)验证。
化合物4的绝对构型:采用Daicel Chiralpak IC手性色谱柱对化合物4进行了拆分,得到一对比例为1:1的对映异构体4a和4b,它们的ECD谱图呈镜像关系。他们的绝对构型是通过计算ECD与实测ECD相比较的方法确定的。化合物4b与计算的2S,5R,2″S,3″R构型吻合较好,化合物4a与其对映异构体2R,5S,2″R,3″S构型趋势一致。
表2化合物3-4在CDCl3中1H(400MHz)与13C(100MHz)NMR数据
一种药物组合物,包含上述二聚体酰胺生物碱类化合物1、2、3和4或其在药学上可接受的盐、异构体和药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供所述化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b或包含上述化合物的药物组合物,在制备抗炎症药物中的应用。同时还提供所述化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b或包含上述化合物的药物组合物,在制备LPS诱导的人BV2细胞的抗炎症药物中的应用。
本发明的有益效果:
对发明所述8个新的二聚酰胺生物碱类化合物对LPS诱导的人BV2细胞的抗炎作用进行了考察,体外细胞试验结果表明化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b对LPS诱导的人BV2细胞具有显著的抗炎作用。因此本发明所述的新的二聚酰胺生物碱类化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b,具有抗神经炎症作用的医药用途。本发明为抗神经炎症领域提供新的二聚酰胺生物碱类化合物,所述化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b均为新化合物,化合物特点鲜明为酰胺生物碱二聚体易于分离纯化,且均为立体构型确定的光学纯化合物,同时有较好的抗神经炎症活性为抗神经炎症提供新的化合物类型,具有进一步开发的价值。此外本发明方法设计合理,具有工艺过程简单、成本低和可工业化生产的特点。
附图说明
图1化合物1的HRESIMS谱;
图2化合物1的1H-NMR谱(600MHz,CDCl3);
图3化合物1的13C-NMR谱(150MHz,CDCl3);
图4化合物1的HSQC谱(600MHz,CDCl3);
图5化合物1的HMBC谱(600MHz,CDCl3);
图6化合物1的1H-1H COSY谱(600MHz,CDCl3);
图7化合物1的NOESY谱(600MHz,CDCl3);
图8化合物1的手性拆分色谱图;
图9化合物2的HRESIMS谱;
图10化合物2的1H-NMR谱(600MHz,CDCl3);
图11化合物2的13C-NMR谱(150MHz,CDCl3);
图12化合物2的HSQC谱(600MHz,CDCl3);
图13化合物2的HMBC谱(600MHz,CDCl3);
图14化合物2的1H-1H COSY谱(600MHz,CDCl3);
图15化合物2的NOESY谱(600MHz,CDCl3);
图16化合物2的手性拆分色谱图;
图17化合物3的HRESIMS谱;
图18化合物3的1H-NMR谱(600MHz,CDCl3);
图19化合物3的13C-NMR谱(150MHz,CDCl3);
图20化合物3的HSQC谱(600MHz,CDCl3);
图21化合物3的HMBC谱(600MHz,CDCl3);
图22化合物3的1H-1H COSY谱(600MHz,CDCl3);
图23化合物3的NOESY谱(600MHz,CDCl3);
图24化合物3的手性拆分色谱图;
图25化合物4的HRESIMS谱;
图26化合物4的1H-NMR谱(600MHz,CDCl3);
图27化合物4的13C-NMR谱(150MHz,CDCl3);
图28化合物4的HMBC谱(600MHz,CDCl3);
图29化合物4的HSQC谱(600MHz,CDCl3);
图30化合物4的1H-1H COSY谱(600MHz,CDCl3);
图31化合物4的NOESY谱(600MHz,CDCl3);
图32化合物4的手性拆分色谱图;
图33化合物1a/1b-4a/4b实测ECD与计算ECD比对图;
图34化合物1和化合物4的单晶图;
图35化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b对LPS诱导的BV2小鼠小胶质细胞神经炎症损伤保护活性;所有数据以means±SD表示三次独立实验;Dex为阳性药。
具体实施方式
实施例1
化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b的制备,包括如下步骤:
干燥的胡椒根(Piper nigrum L.)60kg,以70%工业乙醇加热回流提取3次,每次2h,提取液经减压浓缩后得总浸膏5.0kg。将总浸膏用水混悬后,首先用二氯甲烷萃取3次,所得水层用正丁醇萃取3次,最终得到二氯甲烷层萃取物干浸膏2.0kg,正丁醇层萃取物干浸膏1.0kg。将2份萃取物干浸膏分别进行减压硅胶柱色谱分离,以极性逐渐增大的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进(50:0-3:1(v:v))行快速梯度洗脱,所得样品经硅胶薄层色谱整合为3个粗流份:Fr.1(1000g)(二氯甲烷-甲醇50:0和50:1流份之和)、Fr.2(895g)(二氯甲烷-甲醇30:1和10:1流份之和)、Fr.3(1000g)(二氯甲烷-甲醇5:1和3:1流份之和)。
所得流份Fr.1经硅胶柱色谱以石油醚-丙酮系统50:0-3:1(v:v)进行梯度洗脱,所得流份经硅胶薄层色谱检识并合并为3个流份Fr.1-1(195g)(石油醚-丙酮50:0和50:1流份之和)、Fr.1-2(200g)(石油醚-丙酮30:1和10:1流份之和)、Fr.1-3(450g)(石油醚-丙酮5:1和3:1流份之和),其中流份Fr.1-2经聚酰胺柱色谱以乙醇-水系统30:70-90:10(v:v)进行梯度洗脱,所得流份经硅胶薄层检识和HPLC分析合并后进一步得到了2个流份A(乙醇-水30:70和50:50流份之和)、B(乙醇-水70:30和90:10流份之和)。
所得流份B经HP20柱色谱以乙醇-水系统20:80-90:10(v:v)进行梯度洗脱,经硅胶薄层检识和HPLC分析进行合并共得到4个流份B1(乙醇-水20:80流份)、B2(乙醇-水40:60流份)、B3(乙醇-水60:40流份)、B4(乙醇-水80:20和90:10流份之和)。
所得流份B1、B2、B3、B4经ODS柱色谱以乙醇-水系统20:80-90:10(v:v)进行梯度洗脱,经薄层检识和HPLC分析进行合并共得到5个流份B’1(乙醇-水20:80和30:70流份之和)、B’2(乙醇-水40:60流份)、B’3(乙醇-水60:40流份)、B’4(乙醇-水80:20流份)、B’5(乙醇-水90:10流份)。
流份B’4经硅胶柱色谱以石油醚-丙酮系统50:0-10:1(v:v)进行梯度洗脱,共得到30份样品,后经薄层检识和HPLC分析进行合并得到10个组分B’4.1-B’4.10(依次为石油醚-丙酮50:0、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1(v:v)流份)。
利用制备HPLC对组分B’4.8以甲醇-水系统38:62(v:v)进行分离,得到了B’4.8.1-B’4.8.10。
利用半制备HPLC对B’4.8.8以乙腈-水系统75:25(v:v)进行洗脱,得到了化合物2(8.0mg,tR 26.0min)和化合物3(14.7mg,tR 30.0min),利用相同方法,对B’4.8.10进行分离得到了化合物1(10.0mg,tR 30.0min)和4(4.3mg,tR 26min)。
并利用手性色谱柱Daicel Chiralpak IC对化合物1进行手性拆分(正己烷/异丙醇,1:1(v:v),流速0.4ml/min)得到化合物1a(4.3mg,tR 12.5min)和1b(4.5mg,tR16.2min),对化合物2进行手性拆分(正己烷/异丙醇,1:1(v:v),流速0.4ml/min)得到化合物2a(3.4mg,tR 28.7min)和2b(7.7mg,tR 52.1min),对化合物3进行手性拆分(正己烷/异丙醇,1:1(v:v),流速0.4ml/min)得到化合物3a(6.0mg,tR 28.7min)和3b(7.7mg,tR52.1min),对化合物4进行手性拆分(正己烷/异丙醇,1:1(v:v),流速0.4ml/min)得到化合物4a(2.1mg,tR 9.5min)和4b(2.0mg,tR 10.4min)。
实施例2
化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b对抗神经炎症作用的考察
利用一氧化氮检测试剂盒考察化合物对LPS诱导的人BV2细胞的NO释放的抑制作用。将BV2小鼠小胶质细胞于含10%FBS的DMEM培养基中,并置于充有37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞汇合度达80%时进行传代。
通过NO含量检测考察二聚体酰胺生物碱类化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b的抗神经炎症活性。将BV2小胶质细胞种于96孔板,种板密度为6×104个/mL,每孔100μL,设置3个复孔,置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养。12h后,加药(10μM)。1h后,加入10μg/mLLPS刺激BV2小胶质细胞。24小时后,收集培养上清液,使用一氧化氮测定试剂盒来测量上清液中的一氧化氮含量。
首先将Griess ReagentⅠ和ReagentⅡ恢复室温,在96孔板中按每孔50μL加入培养基上清,再依次加入Griess ReagentⅠ和ReagentⅡ试剂,采用酶标仪于540nm处测定吸光度。所有实验都平行进行并重复三次,设置空白组及阳性对照组,并利用GraphPad Prism 6软件进行分析,结果如图35所示,结果表明化合物1a/1b、2a/2b、3a/3b和4a/4b对LPS诱导的人BV2细胞均具有显著的抗炎作用。
Claims (9)
1.一种胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体,其特征在于,所述二聚体酰胺生物碱对映体结构为:
。
2.根据权利要求1所述的胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体,其特征在于,所述胡椒根来自胡椒科胡椒属植物胡椒。
3.一种权利要求1或 2所述的胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
取干燥的胡椒根以工业乙醇加热回流提取,合并提取液浓缩得浸膏,所得浸膏用水混悬,用二氯甲烷萃取3-4次,萃取后的水层用正丁醇萃取3-4次,将所得二氯甲烷层和正丁醇层去除溶剂后的干浸膏分别经硅胶柱色谱,均以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱,将所得流份进行交叉合并后共得到3个流份Fr.1、Fr.2、Fr.3;
流份Fr.1经减压硅胶柱色谱分离,以石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱,得到流份Fr.1-1、Fr.1-2、Fr.1-3,其中流份Fr.1-2聚酰胺柱色谱以乙醇-水系统进行梯度洗脱,经硅胶薄层检识和HPLC分析合并后得到2个流份A、B;
所得流份B经HP20柱色谱以乙醇-水系统进行梯度洗脱,经硅胶薄层检识和HPLC分析进行合并共得到4个流份B1、B2、B3、B4;
所得流份B1-B4经ODS柱色谱以乙醇-水系统进行梯度洗脱,经硅胶薄层检识和HPLC分析进行交叉合并共得到5个流份B’1、B’2、B’3、B’4、B’5;
流份B’4经硅胶柱色谱以石油醚-丙酮系统50:0-10:1进行梯度洗脱,共得到30份样品,后经硅胶薄层检识和HPLC分析进行合并得到10个组分B’4.1-B’4.10;
利用制备HPLC对组分B’4.8以甲醇-水系统38:62进行分离,得到10个组分B’4.8.1- B’4.8.10;
利用半制备HPLC对组分B’4.8.8以乙腈-水系统75:25进行洗脱,得到化合物2和3,利用相同方法,对B’4.8.10进行分离得到化合物1和4;
利用手性色谱柱对化合物1、2、3和4进行手性拆分,分别得到化合物1a、1b、2a、2b、3a、3b和4a、4b;
采用的手性拆分方法为:化合物1、2、3和4利用Daicel Chiralpak IC手性色谱柱,流动相为体积比为1:1的正己烷-异丙醇混合溶剂,流速为0.4 mL/min,紫外检测器检测波长为210nm。
4.根据权利要求3所述的胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体的制备方法,其特征在于,干燥的胡椒根以70%-80%工业乙醇回流提取2-3次;二氯甲烷-甲醇系统的梯度为50:0-3:1。
5.根据权利要求3所述的胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体的制备方法,其特征在于,流份Fr.1经减压硅胶柱色谱分离,以石油醚-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱时,石油醚-丙酮系统的梯度为50:0-3:1;流份Fr.1-2聚酰胺柱色谱以乙醇-水系统30:70-90:10进行梯度洗脱,且采用的乙醇的浓度为30%-90%。
6.根据权利要求3所述的胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体的制备方法,其特征在于,流份B经HP20柱色谱以乙醇-水系统20:80-90:10进行梯度洗脱,采用的乙醇的浓度为20%-90%;流份B1-B4经ODS柱色谱以乙醇-水系统20:80-90:10进行梯度洗脱,采用的乙醇的浓度为20%-90%。
7.一种药物组合物,其特征在于,包含权利要求1或2所述胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体1a、1b、2a、2b、3a、3b和4a、4b或其在药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。
8.一种权利要求1或2所述胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体或权利要求7所述药物组合物在制备抗炎症药物中的应用。
9.一种权利要求1或2所述胡椒根中二聚体酰胺生物碱对映体或权利要求7所述药物组合物在制备LPS诱导的人BV2细胞的抗炎症药物中的应用。
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Nigramides A-S, Dimeric Amide Alkaloids from the Roots of Piper nigrum;Kun Wei 等;J. Org. Chem.;第70卷;第1164-1176页 * |
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