KR100286792B1 - 정상소재 폴리메라아제 연쇄반응 증폭 시스템 - Google Patents

정상소재 폴리메라아제 연쇄반응 증폭 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 준비된 세포 또는 조직 샘플내에 포함된 핵산의 증폭을 위한 완전한 정상소재 PCR 시스템에 관한 것이다. PCR 샘플을 위한 포함 시스템은 유리 현미경 슬라이드, 슬라이드상에 놓인 타깃 핵산 시퀀스를 포함하는 재료 샘플, 샘플의 윗부분을 덮은 가요성 플라스틱 커버, 및 슬라이드 및 커버에 고정되어 열순환중 샘플에 대하여 반응 혼합물을 보지하고 시일하기위한 보지용 조립체를 포함한다.
보지용 조립체는 커버의 림부상의 견고한 링, 대향 평평한 단부에 의해 결합된 이격된 평행 레일을 지니는 크로스 비임, 및 슬라이드에 대하여 크로스 비임 및 커버를 고정하기위해 슬라이드의 단부 및 대향면에 압착된 한쌍의 클립을 포함한다.

Description

정상소재 폴리메라아제 연쇄반응 (PCR) 증폭 시스템
제1도는 본 발명에 따른 샘플 포함 시스템 조립체의 사시도.
제2도는 조립된 상태로 전도된, 제1도에서 도시된 시스템 조립체의 분해도.
제3도는 전도된, 제1도에서 도시된 조립체의 확대 부분 평면도.
제4도는 제3도의 선 4 - 4 를 따라 취해진 조립체의 단면도.
제5도는 제3도의 선 5 - 5 를 따라 취해진 조립체의 횡단면도.
제6도는 본 발명에 따른 스프링 클립 (spring clip) 의 단면도.
제7도는 제6도에 도시된 스프링 클립의 평면도.
제8도는 본 발명에 따른 조립체에서 사용된 적합한 크로스 비임 (cross beam) 의 저면도.
제9도는 제8도에 도시된 크로스 비임의 측면도.
제10도는 제8도의 선 10 - 10 을 따라 취해진, 크로스 비임의 횡단면도.
제11도는 본 발명의 포함 시스템을 위한 수동 조립체 설비 (manual assembly fixture) 의 사시도.
제12도는 본 발명에 따른 포함 시스템을 위한 기계 조립장치의 사시도.
제13도는 제12도의 장치로부터 분리된 집게 (plier) 조립체의 사시도.
제14도는 현존하는 열순환기를 위한 흠이진 어댑터 판의 평면도.
제15도는 제14도에서 도시된 흠이진 어댑터 판의 단면도.
제16도는 본 발명에 따른 샘플 포함 시스템을 수용하기에 적합한 개선된 열교환기 블록을 지닌 열순환기의 사시도.
제17도는 제16도에 도시된 열순환기의 열교환기 블록의 확대 부분 단면도.
제18도는 본 발명에 따른 크로스 비임 및 커버의 제 1 변형 실시예의 평면도.
제19도는 본 발명에 따른 크로스 비임 및 커버의 제 2 변형 실시예의 평면도.
제20도는 제18도 및 제19도에 도시된 변형 크로스 비임 및 변형 커버에 합체하는, 본 발명에 따라 조립된 포함 시스템의 단면도.
제21도는 제20도의 선 21 - 21 을 따라 취해진 포함 시스템의 확대 부분 단면도.
제22도는 크로스 비임 및 커버의 제 3 변형 실시예를 사용하는, 본 발명에 따라, 슬라이드에 조립된 포함 시스템의 평면도.
제23도는 제22도의 선 23 - 23 을 따라 취해진, 본 발명의 부분 단면도.
제24도는 제22도의 선 24 - 24 을 따라 취해진, 본 발명의 부분 단면도.
〈도면의 주요부분에 대한 부호의 설명〉
10 : 포함 시스템 (containment system) 12 : 샘플
13 : 시약 14 : 슬라이드
16 : 커버 20 : 링
28 : 클립 38 : 딤플 (dimple)
42 : 기둥 44, 82 : 유도장치
45 : 기부 (base) 52 : 이음쇠
54 : 슬라이브 58 : 스프링
80 : 공구 92 : 핀
94 : 아암 100 : 집게 (plier)
[발명의 배경]
[발명의 분야]
본 발명은 폴리메라아제 연쇄반응 (PCR) 용 시스템, 좀더 구체적으로는, 원세포내 존재 DNA 또는 RNA 샘플을 상대로 PCR 을 행할수있는 장치 및 방법에 관한다.
[관련기술분야]
폴리메라아제 연쇄반응 (PCR) 이란 1 개이상의 이본쇄 DNA 분자 (주형 DNA) 를 열에 안정한 DNA 폴리메라아제 효소 (대표적인 것으로, Taq 폴리메라아제), 4 개의 DNA 누클레오타이드 염기 및 2 개이상의 일본쇄 DNA 프라이머와 함께 열순환시켜, 다량의 충실한, 이본쇄 DNA 분절카피를 제조하는 (즉, 이본쇄 DNA 분절을 증폭시키는) 방법을 말한다. 상술한 프라이머는 이본쇄 주형을 구성하는 2 개의 상보적 일본쇄 DNA의 5' 말단에 상보적인, 보통 20 개 정도의 염기를 갖는 짧은 분절을 가리킨다.
매우 널리 사용되고 있는 굉장히 가치있는 기술인 PCR 은 분자생물학 분야에 일대 혁신을 가져왔다. 당해기술은 미합중국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,965,188 호에 상세히 기재되어있다. 최근까지, 당해 반응은 증폭될 DNA 가 현탁되어있는 소형반응조내 용액중에서 행해져왔다. 미합중국 특허 제 5,038,852 호 및 1992 년 4 월 출원된 미합중국 특허출원 제 07/871,274 호에는 당해 방법용 장치가 기재되어 있다.
최근에, 세포내 존재 특정 DNA 분절을 상대로한 (즉, 세포로부터 추출된 DNA 를 상대로 하는 것이아닌) PCR 이 가능함이 밝혀지게되었다. 당해 기술은 정상소재 PCR (in situ PCR) 이라 불린다. 세포들은 개별적으로 독립된 별개의 세포이거나 또는 조직 샘플의 일부가 될수있다. 정상소재 PCR 은, 흔히, 현미경 슬라이드상에 안치된 세포 또는 얇은 조직편을 상대로 행해진다. 이때, 보통은, 포르말린 처리나 또는 처리후에도 당해 세포들 또는 조직의 형태를 알아볼수있도록 그대로 보존시켜주는 기타의 시약 처리방법에 의해 당해 세포들 또는 조직을 고정시키게 된다.
만일 선택된 DNA 단편이 증폭된 DNA 만의 선별적 염색을 가능케해주는 어떤 방법을 통해 증폭되게 된다면, PCR 처리된 세포의 현미경 검사를 통해 우리는 조직 샘플내 어느 세포가 당해 특정 DNA 분절을 지니는지를, 더나아가서는 당해 세포내 어느 부위에 특정 DNA 가 위치하는지를 판별해낼수있게 될 것이다. 세포내 증폭된 DNA 는 2 가지 방법으로 가시화될 수 있다. 한가지 방법은 라벨 분자가 부착된 상보적 일본쇄 DNA 탐침을 사용하는 것으로, 당해 탐침과 증폭된 샘플내 특정 DNA 서열을 교잡시키는 단계, 잉여 탐침과 라벨을 세척해내는 단계 및 현상시약 (developer reagent) 처리를 통해 잔존하는 라벨분자의 위치를 가시화시키는 단계로 구성된다. 이같은 가시화방법은 정상소재 증폭된 DNA 의 "간접검측법", 또는 "정상소재 교잡화법(in situ hybridization)" 이라 불리운다.
가시화시키는 다른 한가지 방법은, PCR 실행시, 라벨 분자가 부착된 수정된 DNA 누클레오티드 염기를 포함하는 PCR 시약을 사용하는 것으로, 라벨분자를 지니는 수개의 수정된 염기를 DNA 폴리메라아제를 사용해 증폭된 생성물내에 직접 삽입시키는 단계 및 상술한 바와같이 슬라이드를 현상시약으로 처리 증폭된 DNA 의 위치를 가시화 시키는 단계로 구성된다. 당해 방법은 정상소재 증폭된 DNA 의 "직접삽입검측법(direct incorporation detection)" 이라 불리운다.
상술한 2 가지 방법의 현상시약은, 통상, 교잡화된 탐침 또는 증폭된 DNA 상에 존재하는 라벨분자에 강력하고, 특이적으로 결합하는 흑종의 분자에 결합된 알칼리성 포스파타제와 같은 효소 및 당해 효소에 의해 불용성이며, 강력한 흡수성을 지닌 염료로 전환되는 기질을 포함한다. 증폭된 DNA 상의 라벨분자가 바이오틴인 경우에는, 효소에 결합되는 결합분자가, 통상, 아비딘이되게 되고, 라벨분자가 디곡시게닌인 경우에는, 결합분자가 항 - 디곡시게닌항체 (anti - digoxigenin) 가 된다. 이상과 같은 현상시약들은 직접삽입검측법과 정상소재 교잡화에 의한 간접검측법 그 어느쪽에든 사용될 수 있다. 라벨분자상의 라벨은 유색물질이 될수있고, 형광성물질이 될수도 있으며, 방사성물질이 될수도 있다.
상술한 바와같은 정상소재 증폭된 DNA 의 검측방법들은 매우 감도가 좋아, 각 세포내 증폭된 DNA 분절 카피들을 10 개에서 수백개까지 검측해낸다. 상술한 방법들은 정상소재 PCR 열순환이 완결된후, 슬라이드가 흑종의 포스트 - PCR 처리 (post - PCR processing) 를 받을것을 요한다.
완전 세포 (whole cell) 정상소재 PCR 용 열순환방법들은 세포의 소스에 따라 달라지게된다. 백혈구 및 다수의 배양세포 (예컨대, HeLa 세포와 같은) 와 같이, 조직을 형성치아니하는 세포들의 경우에는 정상소재 PCR 열순환용의 특별한 기구가 필요치 않게된다. Hasse 등 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4971 - 4975 (1990)] 은 상술한 바와같은 고정시킨 세포현탁액을 액상 PCR 용으로 사용되는 것과 동일한 반응관내에서 열순환시킨뒤, 당해 열순환시킨 세포를 슬라이드상에 도말하는 방법으로 당해 증폭 생성물에 대한 검측을 행하였다고 보고한바 있다.
하지만, 그같은 세포들을 슬라이드상에서 열순환시킬수도 있다. 즉, 세포들을 원심분리법으로 슬라이드상에 도말시키면, 소위 "싸이토스핀 (cytospin)" 이라 불리는 표본을 얻게된다. 그같은 세포도말법은 고정 및 기타 PCR 샘플전 처리를 용이하게 해준다. 이같은 방법을 사용하면 슬라이드상의 증폭 생성물 가시화를 위한 별도의 싸이토스핀 단계가 필요치않게 된다. 싸이토스핀은 슬라이드상에 안치된 조직과 동일하게 증폭된다.
조직 단편세포들을 연구하는 경우에는, 조직형태 유지를 위해 표면에서 직접 증폭시키는 방법을 사용해야만 한다. 조직의 열순환과 관련한 주요한 문제점으로는 조직과 세포의 형태를 유지시키는 문제, 샘플상의 PCR 반응 혼합물 증발을 막는 문제 및 균일하고, 일정한 반복결과를 얻는 문제가 지적될 수 있다.
유리로만든 현미경 슬라이드상에서 고정된 세포 또는 조직 샘플에 대한 정상소재 PCR 을 행하기 위해서는, 먼저, 세포 또는 조직이 PCR 방법용으로 또는 증폭된 DNA 의 가시화를 위한 처리에 사용되는 수성 시약에 의해 세척되어 씻겨내려가거나 또는 부유되지않고, 고착될수있도록 처리된 슬라이드를 선정해야만 한다. 그같이 처리된 슬라이드의 예로는 표면이 3 - 아미노프로필 트리에톡시실란 분자와 공유결합하고 있는 실란화된 슬라이드, 및 표면이 폴리 (라이신) 또는 젤라틴/크롬 알럼으로 피복된 슬라이드를 들수있다.
슬라이드를 선정한후에는, 당해 슬라이드에 증폭시킬 표본을 안치시키고, 다시 표본이 안치된 곳에 정확한 농도의 DNA 폴리메라아제 효소, 누클레오티드, 프라이머 및 기타 성분들을 함유하는 과량의 PCR 시약을 부가해야하며, 이러한 시약부가후에는, 당해 슬라이드와 시약을 약 95℃ - 68℃ (때로는 37℃) 사이의 온도에서 10 - 30 시간동안 열순환 (이때, 당해 슬라이드와 시약은 각 순환시마다 두개 또는 세개의 선별된 온도 각각에서 최소한 1 분이상씩 체류케되는) 시켜야한다.
정상소재 PCR 을 성공적으로 이끌기위해 열순환시 충족되어야하는 여러가지 중요한 선결요건들이 존재한다. 첫번째는 시약으로 부터의 수 (水) 증발을 거의 완전히 배제시켜야한다는 것이다. 최적 시약농도의 약 5 % 의 변화는 저증폭수율이나 불량한 특이성의 결과를 가져오지않는다. 두번째 선결요건은 당해 방법실행시 당해 PCR 반응에 해를 미칠수있는 물질이 당해 시약과 접촉치않도록 해야된다는 것이다. 세번째는 시약이 가열되는 경우, 당해 시약이 방출되는 공기 또는 용존가스의 기포가 처리될 전체 영역에 대한 당해 액체 시약의 접근을 가로막는 요인이 되어서는 안된다는 것이다.
끝으로 정상소재 PCR 에 관한 공개된 논문은 높은 특이적 증폭을 이루기위해서는 "핫 스타트 (hot start)" 또는 그에 상당하는 화학적 반응을 이루어낼수있을 정도의 반응 조립체가 중요하다는 사실을 보여준다. 물리적 핫 스타트에 있어서는, 반응에 필요로되는 모든 성분들이 고온에 이를때까지 당해 완결시약이 조립되거나 샘플 DNA 와 접촉치않게 된다. 당해온도는 프라이머 (세포의 전체게놈과 비특이적 부분 교잡화를 이루어낼 수 있는) 가 목적 주형부위외의 부위와는 부분교잡화를 이루어낼수 없도록 하기에 그리고 당해 프라이머가 함께 결합 소위 "프라이머 다이머 (primer dimer)" 라 불리는 증폭 생산물을 형성치않도록 하기에 충분할 정도로 높아야만 한다. 이같은 안전한 스타팅 온도는, 통상, 68℃ - 75℃, 그러므로 PCR 에 사용되는 어닐링온도보다 약 10℃ 더 높은 온도가 된다.
PCR 에서 "화학적 핫 스타트 (chemical hot start)" 를 이룰수있는 한가지 방법은 반응 혼합물이 첫번째 PCR 순환에서 비특이적 교잡화를 억제키에 그리고 열불안정성 성분을 파괴시키기에 충분히 높은 온도까지 가열될때까지 폴리메라아제 효소가 더이상의 사슬연장을 못하도록하는 일본쇄 결합 단백질 (SSB) 과 같은 열불안정성 성분 반응시약내에 포함시키는 것이다. 화학적 핫 스타트를 실행할 수 있는 또다른 방법은 dUTP 를 우라실로 치환시킨뒤, 첫번째 PCR 순환전의 저온 배양시에 형성된 모든 PCR 생성물을 파괴시킬수있는 열불안정성 효소 UNG (우라실 - N- 글리코실라제) 를 당해 시약에 부가하는 것이다.
화학적 핫 스타트를 실행할 수 있는 또다른 방법은 Taq 폴리메라아제 효소를 시약에 부가키전에 Taq 항체와 결합시키는 것이다. 그같은 Taq 단클론성 항체는 코닥 임상약품국의 Dr. John Findlay 가 연구하여 "Development of PCR for In Vitro Diagnostics" 라는 표제가 달린 논문 (1992 년 11 월 18 - 20 일간 샌디에고에서 개최된 Genetic Recognition 에 관한 샌디에고 회의에 제출했던) 에 발표하였다. Taq 항체는 Taq 폴리메라아제 효소에 결합하여 Taq 폴리메라아제 효소의 상온에서의 기능을 억제한다. 하지만, 당해 억제된 Taq 폴리메라아제를 약 95℃ 까지 가열하면, 당해 Taq 항체 (정상 단백질인) 가 변성되어 당해 Taq 폴리메라아제 효소로부터 분리되어 나가므로서, 당해 Taq 폴리메라아제 효소가 PCR 반응시 자신의 정상적인 기능을 되찾게 된다.
이같은 화학적 핫 스타트는 값비싼 시약내 성분 (예컨대, UNG 또는 Taq 항체) 을 필요로할뿐 아니라 PCR 실행에 바람직스럽지 아니한 구속 (시약을 제조하여 곧바로 사용해야되는 시간제약 또는 낮은 증폭 효율과 같은) 을 가하게 된다. 그러므로, 정상소재 PCR 에서의 물리적 핫 스타트의 실행은 최소한 모든 조건이 갖추어진 실행가능한 경우에한해 이루어지는 것이 바람직하다.
오늘날 정상소재 PCR 을 사용하는 연구원들은 대부분 자신들이 자신들의 연구실에서 개발한 방법을 사용해 상술한 선결요건을 충족시키고 있다. 그들은 정상소재 PCR 을 사용하면서 여러가지 불편함을 극복하고, 숙련된 기술을 통해 이따금, 다른 방법으로는 얻을수없는 귀중한 정보를 얻기도 한다.
한가지 보편적인 방법은 증폭시킬 샘플위에 커버슬립을 안치시킨뒤, 매니큐어에나멜 또는 Komminoth 등 [Diagnostic Molecular Pathology 1, #2, 85 - 97 (1992)] 의 접착방법으로 밀봉시키는 것이다. 하지만, 매니큐어에나멜이 조직 샘플에 강하게 접착되지않기 때문에, 그같은 방법을 사용하게되면, 흔히, 누출이 초래된다. 시약을 함유하는 모든 성분들이 강성체인 때문에, 변성 온도 (통상 94℃) 에서는 매니큐어에나멜을 제거시킬수있을 정도의 고압이 발생하게 된다. 경질의 커버슬립은 또한 세포와 접촉시 연약한 세포의 형태에 손상을 가하게된다. 이같은 방법은 핫스타트의 실행을 곤란하게 한다. 이같은 방법은 또한 순환후 메니큐어에나멜을 용해시키기위해 당해 조립체를 클로로포름으로 처리해야되는 단점을 지닌다.
그같은 슬라이드는 당해 슬라이드용으로 디자인된 것이아닌 열순환기 (thermal cycler) 의 샘플 블럭위에 놓여지게 된다. Komminoth 등은 좋은 열접촉을 얻기위한 방편으로 순환기의 샘플 구획커버와 슬라이드사이에 샘플 블럭에 슬라이드를 압착시켜 줄수있는 스페이서를 도입시켰다. 열블럭을 수용하는 반응 튜브내에 구멍을 지니는 기존의 열순환기들은 균일한 열 접촉을 지니지 아니하고, 그에따라, 슬라이드에 균일한 온도를 제공치 못한다.
관련 기술이, 챔버된 (chambered) 슬라이드상에서 연구될 세포를 배양하고, 그 슬라이드상의 세포에 대하여 정상소재 PCR 을 적용한 Chiu 등 [J. Histochemistry and Cytochemistry 40, #3, 333 - 341 (1992)] 에 의해 설명되었다. 배양후, 샘플 챔버벽은 제거되지만, 슬라이드와 챔버사이의 가스킷은 슬라이드상에 남겨진다. 정상소재 PCR 을 수행하기위하여, 세포는 우선 2.5 % 고온 아가로스 (agarose) 를 포함하는 PCR 반응 혼합물로 덮여지고, 슬라이드는 사란 (saran) 랩으로 단단히 포장된다. 본 방법은, 세포의 손상을 피하기위한 가스킷상에 놓인, 세포에 대한 가요성 덮개를 구비한다. 사란랩은 증발 대조부를 구비한다. 완전한 조립체는 샘플사이에 긴 슬롯이 첨가된 물을지닌 Perkin - Elmer Cetus DNA 열 순환기상에 배치된다. 그 조립체는 순환전에 플라스틱 필름 및 플라스틱 커버로 덮여진다.
Nuovo 등 [American Journal of Pathology 139, #6, 1239 - 1244 (1992)] 은 가요성, 열안정성 폴리프로필렌으로 만들어진 커버 슬립을 지닌 샘플을 포함한다. 그 커버 슬립은 전형적으로 한쪽 구석에 매니큐어에나멜 방울로 원하는 조직 부분위에 고정된다. 그 슬라이드는 전형적으로 Perkin - Elmer Cetus DNA 열 순환기의 샘플 블럭상에 위치한 알루미늄 "보트 (boat)" 내에 배치된다. 이 "보트" 는 주로 시약의 증발을 방지하기위해 슬라이드 조립체에 가해진 광물성기름을 보지하는 작용을 한다. Taq DNA 폴리메라아제 없이 PCR 반응 혼합물을 지닌 샘플을 덮은후, 그 샘플의 온도는 전형적으로 약 65℃ 까지 올려지고, 커버슬립은 반응 혼합물안의 Taq DNA 폴리메라아제 도입이 PCR 반응을 개시하도록 부분적으로 상승된다.
커버슬립을 상승시키는 힘은 핫 스타트를 허용하는바, 그것은 특이성에 있어서 주로 개선점의 산출을 제시하고, 정상소재 PCR 증폭에 있어서 특정한 PCR 생성물의 산출을 제시한다. 효소의 도입에이어, 예열된 광물성기름이 커버슬립의 윗면과 측면에 가해진다. 그 기름의 약간은 또한 모관작용에 의해 커버슬립 아래로 이동한다. 기름의 존재는 커버슬립 아래부분 PCR 시약 방울의 직경을 감소시키며 또한 PCR 시약 방울의 정확한 배치에 대한 제어를 감소시킨다. 본 방법은 우수한 결과를 초래하지만, 하나 또는 그이상의 고도로 숙련된 조작자를 필요로하여, 다수의 슬라이드에는 번거럽고, 적합하지 못하다.
열순환시키고, 증발 및 응축문제를 감소시키기위해 사용된 다른 방법은 슬라이드를 플라스틱 백 (plastic bag) 내에 위치시키고, 공기 - 오븐 (air - oven) 형태 열순환기내에서 슬라이드를 열순환시킨다. 예를들면, Staskus 등 [Microbial Pathogenesis 1991, 11, 67 - 76 (1993)] 및 Emberto 등 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 357 - 361 (1993)] 은 공기 오븐 열순환기내에서 순환된 열 시일가능한 플라스틱 주머니내에 슬라이드를 배치시키기전에 커버슬립과 광물성기름을 지닌 조직을 포함한다. 공기 오븐법은, 열순환중 전체 조립체가 대체로 등온이기때문에 커버슬립 상에서 압축한 샘플로부터 수분증발의 문제점을 회피할 수 있다.
공기 오븐법의 주요 단점은 시스템의 불충분한 열전달 특성때문에 매우 느린 열순환시간을 갖는다는 점이다. 또한 그러한 시스템은 종종 오븐내의 전체 샘플의 불충분한 온도일치를 보인다.
요컨대, 충분한 온도일치, 광물성기름없이 증발의 조절, 작은 시약부피, 세포형태의 유지, 핫 스타트를 할수있는 능력, 및 수평면이 아닌 위치에서 열순환을 위해 다수의 슬라이드를 조립할수있는 편의의 모든 바람직한 점을 포함하는 방법은 존재하지 않는다는 것이다. 현재는 대체로 열순환중 시약으로부터 수분의 증발을 방지하기 위해 광물성 기름에 조합한 슬라이드를 침유 (浸由) 시키는 방법을 사용한다.
기름 오버레이 (oil overlay) 의 주요 불편한점은 열순환후 및 시약검출의 2 차 처리전의 부가단계에서 조심스럽게 그리고 완전히 제거되어야한다는 것이다. 또한 기름은 때때로 PCR 을 죽일수있는 오염물질의 캐리어이다.
우리는 실험에서, 표본위에 플라스틱 커버슬립의 장착, 및 접착물로 슬라이드의 구석 또는 에지에 커버슬립을 부착시킴으로써 샘플상에 수성에 기초한 (aqueous - based) 시약의 포괄시스템이 완성되면, 표면장력효과 및 가스의 용출이 순환중 유동성 시약을 이동시킨다는 것을 발견했다. 결과적으로 본 방법은 완전히 신뢰성있는 것은 아니다. 일반적으로, 본 발명은 슬라이드가 수평이 되도록, 열순환기내에 슬라이드가 고정될수있는 방법을 제한한다. 접착제만으로는 내 (耐) 가스 (gas - tight) 시일을 유지하기가 어렵거나 또는 불가능하기때문에, 밀폐용 접착제로 커버슬립의 둘레를 완전히 둘러싸는 것에 의해 커버슬립 아래의 시약을 시일하는 것은 종종 실패한다. 더우기, 슬라이드의 표면은 일반적으로 커버슬립 둘레의 최소한의 부분아래에 표본의 얇은층으로 덮여있어서, 슬라이드에 대한 접착력은 약하다.
따라서, 정상소재 PCR 을 수행하기 위하여 새롭고 개선된 완전한 샘플 포함 시스템이 필요하다. 열순환중 시약 및 샘플의 증발을 방지하는 샘플에 대한 시약을 위하여 편리한 물리적 포함 시스템의 제공이 필요하다. 또한, 기름을 사용할 필요없는, 접착제를 사용하지않는, 그리고 열순환중 슬라이드가 수평일 필요가없는 시스템을 필요로한다.
[발명의 개요]
아래에 설명된 본 발명은 상기 요구들을 충족시킨다. 본 발명에 따른 포함 시스템은 유리 슬라이드상에 놓인 타깃 (target) 핵산을 포함하는 조직샘플을 지닌 재래식 유리 슬라이드, 샘플위의 가요성 커버부재, 및 슬라이드상의 커버부재 아래 샘플에 대하여 시약을 보지하기위하여 슬라이드에 기계적으로 고정된 보지기 조립체 (retainer assembly) 로 구성된다.
본 발명에 따른 시스템에서, 시약은, 슬라이드에 기계적으로 고정된 얇고, 적절한 덮개에 의해 샘플 표본의 선택된 부분과 접촉된 상태로 포함된다. 조립중 시약이 커버를 통하여 보이는 것보다 오히려 유리를 통하여 보이는 것이 바람직하기 때문에 커버는 불투명하거나 또는 투명할수있고, 커버는 PCR 시약 및 샘플에 대하여 비활성이어야 한다. 커버 둘레의 원형 시일링은 밀폐 시일을 유지하기위해 슬라이드에 대하여 커버를 압착한다. 압착력은 스프링 크립 및 크로스 비임 장치에 의해 유지된다. 슬라이드상에서 증폭된 샘플은 커버 및 보지기가 제거된후 현미경을 통하여 종래의 방식으로 관찰될 것이다.
본 시스템은 슬라이드상의 완전한 반응 조립체를 빠르고, 편리하고, 반복가능하게 하는데 최소한의 기술을 요한다. 조립체의 처리절차는 물리적 핫 스타트와 모순되지않는다. 최종적으로, 본 발명의 시스템은 종래의 현미경 검출기술과 모순되지 않는다.
본 발명의 이러저러한 특징, 목적, 및 장점들이 첨부도면과 관련하여 취해진 아래의 상세한 설명에서 더 명백히 될 것이다.
[발명의 상세한 설명]
제 1 도에는, 유리 슬라이드 (14) 상에 놓인 샘플 (12) 상의 타깃핵산 및 시약 (13) 을 포함하는 샘플 표본 (12) 을 보지하기위한 포함 시스템 (10) 이 도시되어 있다. 그 시스템 (10) 은 유리 슬라이드 (14), 샘플 (12) 을 덮는 일반적으로 적합한 커버부재 (16) 및 커버 (16) 를 슬라이드 (14) 에 고정하는 보지용 조립체 (18)를 포함한다.
이러한 시스템 조립체 (10) 는 제 1 도의 사시도에 도시되어 있다. 제 2 도는 각각의 부품의 분해도이고, 제 3 도는 제 1 도에서 도시된, 조립된 시스템의 확대평면도이다. 제 4 도 및 제 5 도는 제 3 도에서 도시된 시스템 (10) 의 단면도이다.
약 1 방울의 시약 (13) 이 적합한 시일부재 또는 시일부재 주변의 가스킷 (gasket) 에 의해 커버부재 (16) 와 슬라이드 (14) 사이의 부피에 시일된다. 그 시일부재는 독립된 부품이거나 또는 커버 (16) 와 일체로된 부품일 수 있다. 그 시일은, PCR 시약들과 화학반응이 일어나지않는 탄성중합체 재료의 커버부재 (16) 의 적합한 림 (rim) 부분 (19) 이 바람직하다. 적합한 실시예에서, 그것은 실리콘 고무로 만들어진다. 그것은 상당히 넓고, 슬라이드 (14) 에 대한 견고한 시일링으로써 단위면적당 충분한 힘으로 압축되므로, 열순환중 시일링하의 슬라이드 표면이 세포의 얇은 층 또는 샘플 (12) 의 조직으로 덮여있을때조차, 물, 액체 또는 증기가 커버 (16) 밑의 공간으로부터 새어나오지 못한다. 그 가스킷 시일은 비등온도 상태에서조차 여전히 유지된다.
그 적합한 커버 (16) 는, 이완될때, 시약과 접촉하는 면상에서 서서히 요면체가 되도록 형성된다. 이 요면의 각도는, 시일링 (20) 이 슬라이드 (14) 에 대한 커버 (16) 의 림부분 (19) 을 누를때 커버 (16) 와 슬라이드사이에 포함되는 시약 (13) 의 부피를 정하도록 결정된다. 전형적으로, 직경 약 12 mm 의 원형 커버에 대하여, 이것은 약 10 마이크로리터이다. 그 부피는 다음과 같이 정해진다. 부피가 너무크면, 필요한 시약 (13) 의 총액이 불필요하게 비싸고, 가열 및 냉각하는데 시간이 더 걸릴것이다. 부피가 너무적으면, 커버하의 표면대 부피비가 바람직하지 못하게 크게되어, 표면상의 효소 흡착작용에 기인하거나 또는 부품상 또는 샘플재료 (12) 상에서 금지된 오염물질의 영향에 의한 시약 (13) 의 중독에 기인하여 불충분한 증폭의 위험에 처한다.
전형적으로, 시험될 샘플 (12) 의 관심영역은 직경 10 mm 이내의 영역이다. 일반적으로 일단부는 라벨링 (labeling) 을 위하여 광택지워졌기 때문에 슬라이드의 투명한 영역은 약 27 mm × 57 mm 이다. 슬라이드상의 미리 정해진 위치에 조직부분을 단지 몇미크롱 (micron) 의 두께로 정밀하게 도말시키는 것은 상당히 어렵기때문에, 투명한 영역내의 어느곳에라도 배치될 수 있는 커버 (16) 를 제작하는 것이 바람직하다. 또한, 슬라이드상에 하나이상의 관심영역이 존재할 수 있으므로, 제 1 도에 도시된 것과같이, 슬라이드상에 하나이상의 샘플 및 시스템 (10) 을 장착할 수 있는 것이 유리하다.
슬라이드 (14) 에 커버 (16) 를 고정시키기위한 새로운 보지용 조립체는 커버 (16) 에 대하여 매우 다양한 위치를 허용한다. 슬라이드의 투명한 영역의 수밀리미터의 에지의 가장자리내의 어느곳에라도 위치한 샘플은 포함될수있고 증폭될 수 있다. 그 수 밀리미터의 가장자리는 시일링 (20) 을 위하여 필요하다. 커버 (16) 의 림 부분 (19) 은 그것의 주위를 따라 견고한 시일링 (20) 으로 보강되어, 만일 덮개의 2 개의 대응에지의 시일링 (20) 이 충분한 시일을 수행하기위하여 슬라이드에 대하여 압착되면 커버 주위의 모든 타부분들에서 충분히 시일될 것이다. 이런식으로 견고한 시일링 (20) 은 커버의 주위를 한평면내에 머무르게 한다.
커버 (16) 는 얇은 고무판의 원형 디스크가 바람직하다. 견고한 시일링 (20) 은 고무 커버 (16) 의 림 (19) 에 결합된 스테인레스강이다. 그 링 (20) 은 커버 (16) 와 결합하기위한 최소한 하나의 평평한 면이기 위하여, 직사각형, 사다리꼴, 삼각형 또는 다른 다각형의 횡단면 형태를 지닐수있다. 링 (20) 은 직사각형 또는 사다리꼴 횡단면 형태를 지니는 것이 가장 바람직하다. " D " 형태의 횡단면도 또한 무방하다. 부가적으로 그 링은 원형일 필요는 없다. 그것은, 커버 (16) 가 슬라이드 표면에 시일될수만 있다면, 타원형 또는 다른 연속적인 형태일 수 있다. 강재의 링 (20) 에 결합될수있는 고무 디스크 커버 (16) 의 림 (19) 은 디스크의 잔부 (rest) 에 연속적 가스킷을 형성한다. 이러한 실시예는, 얇은 고무판 커버 (16) 가 그것을 통과하는 수증기의 전파에 둔감하고, 동시에 PCR 시약에 저항하지 않는것을 필요로 한다. 실리콘 고무는, PCR 에 저항하지않지만, 수증기에 과침투성이다. 따라서, 실리콘 고무와 같은 비저항성 탄성중합체 및 폴리프로필렌과 같은 비침투성 탄성중합체의 샌드위치 또는 복합물, 또는 비침투성 탄성중합체층의 최소한의 하면상에 유니온 카바이드 (Union Carbide) 사의 파릴렌 C 와 같은 비저항성 피복 또는 층 (21) 이, 제 4 도 및 제 5 도에 지시된 것과 같은 커버재료로서 바람직하다.
커버 (16) 의 필요한 요면 형태는 성형중 형성될 수 있다. 즉, 커버가 견고한 링 (20) 에 잡합될때 평평한 시트 커버 (16) 를 변형시킴으로써 또는 링 (20) 의 평면에서 약간 떨어져 디스크의 중심을 잡기위해 커버 (16) 의 외표면의 중심을 링 (20) 에 부착된 가로대 (cross - piece ; 도시되지않았음) 에 부착하므로써 형성될 수 있다.
커버 (16) 는, 시일링 (20) 의 단지 대향부에만 접하는 평행 레일 (24) 을 지닌 견고한 크로스 비임 (22) 에 의해 슬라이드 (14) 에 고정된다. 그 비임 (22) 의 레일 (24) 은 하나의 긴에지로부터 다른 에지까지 슬라이드와 교차하여 연장한다. 따라서, 커버 (16) 는, 제 3 도에 도시된 것과 같이, 크로스 비임 (22) 상의 어느곳에나 위치할 수 있다. 또한, 크로스 비임 (22) 은 슬라이드의 길이를 따라 슬라이드의 어느곳에나 고정될 수 있다. 그러므로, 본 발명에서, 커버 (16) 는 슬라이드의 투명한 영역내의 어느곳에나 배치될 수 있다.
크로스 비임 (22) 의 레일 (24) 은, 강도를 향상시키기 위하여, 제 5 도에 도시된 것과 같이 L 형태의 횡단면을 지니는 것이 바람직하다. 레일 (24) 은, 제 1 도, 제 3 도 및 제 4 도에 도시된 것과 같이 2 개의 클립 (28) 으로 슬라이드 (14) 에 고정된 평평한 단부 (26) 로써 결합된다. 이러한 클립 (28) 은 슬라이드 (14) 의 배면 (30) 의 긴 에지위로 각각 연장하는바, 상기 배면의 대향면은 샘플 (12) 을 지니고 있다. 크로스 비임 (22) 의 각각의 단부 (26) 는 경사면을 형성하기위해 약간 굽었다. 클립 (28) 들이 적소에 밀어넣어짐에 따라, 클립들은, 이러한 경사면 단부 (26) 상에 미끄러져 들어오고, 커버 (16) 의 림 부분 (19) 및 슬라이드 (14) 에 대한 림 부분 (19) 을 압착하기위해 크로스 비임 (22) 및 시일링 (20) 상에 상당한 압력을 가한다.
클립 (28) 과 크로스 비임 (22) 은 대개 스테인레스강과 같은 비교적 얇은 재료로 제조되었지만, 그것들은 충분히 견고해서, 조립중에 거의 굽지않는다. 고정력을 유지하는 축적에너지는 크로스 비임 (22) 또는 클립 (28) 의 굴곡부로부터 발생하는 것이 아니라, 주로 (시일링 (20) 하의 커버 (16) 의 림 (19) 의) 고무 가스킷의 압축으로 부터 발생하는 것이 바람직하다. 이것의 유익한 결과는, 커버 (16) 가 슬라이드 (14) 상의 어느곳에 위치하더라도, 크로스 비임 (22) 의 레일 (24) 은 슬라이드에 항상 평행하고, 림 (19) 은, 그것의 전체 주위를 따라 균일하게, 동일한 힘으로 압축된다는 것이다. 슬라이드 (14) 에 커버 (16) 를 고정하는 크로스 비임 (22) 과 클립 (28) 은 또한 충분히 견고해서 시약 (13) 을 거의 비등온도까지 가열시키는 것에의한 압력증가에 견딜수있다. 커버 (16) 가 적합하다는 사실은 커버밑에서 발생할수있는 최대 압력을 매우 감소시킨다. 게다가, 적합한 커버 (16) 는, 슬라이드 (14) 의 파괴없이, 가열중에 밀폐된 부피를 효과적으로 가압하는, 유체 팽창에 견딜수있다. 이것은, 독립적인 본 발명의 방식의 포함 시스템을 사용하면서, 열순환중 본 시약 (13) 내에서 기포형성을 방지하거나 또는 적어도 기포형성을 최소화할수 있다. 크로스 비임에 의해 링에 가해진 압력은 4 파운드이내의 범위이고, 고무림 (19) 압축의 약 20 % 이다.
제 6 도 및 제 7 도에는 클립 (28) 의 확대평면도와 확대단면도가 도시되어 있다. 클립 (28) 은 장면 (32), 및 단면 (34) 및 연결수직면 (36) 을 형성하기위해 J 형태로 굽은 스테인레스강 시트메탈의 단편이다. 면 (32) 은 단면 (34) 을 향해 돌출한 한쌍의 딤플 (38 ; dimple) 을 지닐수 있다. 이러한 딤플 (38) 들은, 제 1 도 및 제 4 도에 도시된 것과 같이, 클립 (28), 크로스 비임 (22), 및 슬라이드 (14) 를 함께 걸기위해, 크로스 비임 (22) 의 경사면 단부 (26) 의 내측 에지와 계합 및 잠기도록 (snap over) 이격되어 있다. 선택적으로, 딤플 (38) 의 기능은, 상승된 리지 (ridge) 또는 결합하는 보지용 조립체 (18) 부품들간의 다른 간섭기계장치에 의해 실행될 수 있다.
크로스 비임 (22) 의 다른방도의 적합한 실시예가 제 8 도, 제 9 도 및 제 10 도에 도시되어 있다. 그 크로스 비임 (22a) 은 대체로 횡단부 (26a) 에 의해 결합된 2 개의 평행 레일 (24a) 을 형성하는 직사각형 개구부를 지닌 틀로찍어낸 (stamped) 직사각형 시트메탈바디이다. 크로스 비임 (22a) 의 레일 (24a) 은 제 10 도에 도시된 것과 같이 L 형태의 횡단면을 지닌다. 조립체상에서, 평평한 단부 (26) 로써 결합된 레일 (24a) 은 전술한 바와같이 슬라이드 (14) 에 고정된다. 제 3 도 내지 제 5 도에서 도시된 제 1 크로스 비임 (22) 의 주요한 차이는 단부 (26a) 가 이중 굴곡부 (27a) 에서 레일 (24a) 과 결합한다는 것이다. 이중 굴곡부 (27a) 는 클립 (28) 의 긴레그 (leg) 부분을 단부 (26a) 의 표면과 계합하도록 한다. 또한 이러한 이중 굴곡부 (27a) 는, 클립 (28) 이 장치될때, 조립된 슬라이드와 커버 조립체의 전체두께가 최소로 되는 한단계를 만들어낸다.
단부 (26a) 에 대한 약 3°의 경사는 비임 단부 (26a), 슬라이드 (14) 및 클립 (28) 사이에 필요한 통제력을 제공하기에 충분하고, 견고한 링 (20) 상에 충분한 압력을 확보하기에 충분하다. 따라서, 제 8 도 내지 제 10 도에 도시된 이러한 변형 비임이 사용될때, 클립 (28) 상의 딤플 (38) 은 불필요하다.
커버 (16) 가 더이상 필요하지 않으므로, 요구되는 시약의 부피는 더이상 필요하지 않고, 시일링으로 누출방지 시일을 만드는데 필요한 힘 또한 최소한된다. 이러한 특성 모두가 장점이다. 큰 시일링 힘은 조립체를 더 쉽게 제작하고, 견고하게 더 큰힘을 유지하는데 필요한 기계장치는 조립체를 불필요하게 두껍고 부피가 크게 제작하기때문에, 큰 시일링 힘을 필요로하지 않는것이 바람직하다. 이것은 또한, 슬라이드가 에지위에 놓인 경우 순환기내에 동시에 수용될수있는 슬라이드의 수를 제한할 것이다. 그것은 또한 조립체의 열 시정수 (time constant) 를 증가시키고, 순환처리를 느리게 한다.
[정상소재 PCR 을 위한 슬라이드 조립체]
커버 (16) 하의 적소에 시약 (13) 을 지닌 슬라이드 (14) 상에 완전한 포함 시스템 (10) 의 조립체는 본 발명의 일부인 유일한 절차에 의해 완성된다. 하나의 적합한 실시예에서, 수동 조립체 설비 (40) 가 사용된다. 이러한 설비 (40) 는 제 11 도에 도시되어 있다. 또하나의 적합한 실시예에서, 기계적으로 조력받는 조립체 설비 또는 공구가 사용된다. 그러한 공구는 제 12 도에 도시되어 있다.
제 11 도에 도시된 수동 조립체 설비는 기본적으로 기부 (45) 에 고정된 조립체 기둥 (42) 과 기부 (45) 상에 놓여있는 이동가능한 슬라이드 유도장치 (44) 로 이루어져있다. 그 슬라이드 유도장치 (44) 는 기둥 (42) 의 둘레를 따라 수직으로 이동하도록 상방으로 편향된 스프링이다. 기둥 (42) 의 윗면은 슬라이드 (14) 조립체에 대하여 적소에 고정하기 위한 클립 (28) 과 크로스 비임 (22) 을 헐겁게 수용하도록 형성된 오목한 영역 (46, 48) 을 지닌다. 그 기둥 (42) 은 또한 중심부 공기통로 (43) 를 지닌다.
그 슬라이드 유도장치 (44) 는 기둥 (42) 의 인접 대향면에 위치한 2 개의 일상의 평평한 접시 부분을 지닌 U 형태의 몸체이다. 이러한 접시부분 (50) 은 일반 현미경 슬라이드를 수용하기에 적합한 치수로 제작된 홈을 지닌다. 2 개의 접시 부분 (5) 은 일체 성형된 U - 형태의 이음쇠 (52) 로써 함께 연결된다. 각각의 접시부분 (50) 은, 기부 (45) 에 고정된 결합핀 (56) 윗부분에서 미끄러지는 접시부분의 아래쪽에 고정된 슬리브 (54) 를 지닌다. 핀 (56) 둘레에 장착된 스프링 (58) 은, 접시부분 (44) 에 의해 유지된 슬라이드 (14) 가 기둥 (42) 의 윗면내의 오목한 영역 (46, 48) 위쪽에 배치될 위치까지 상방으로 유도장치를 편향시킨다.
포함 시스템 (10) 의 조립체는 다음과 같다. 우선, 2 개의 클립 (28) 은 기둥 (42) 에 대하여 아래로쳐진 클립의 장면 (32) 을 지닌 조립체 기둥 (42) 의 윗면상의 오목한 영역 (46) 내에 위치한다. 그후에 클립들은, 그들의 마주보는 단면 (34) 간의 공간이 일반 1 인치 현미경 슬라이드의 폭보다 약간 넓도록 배치된다. 다음으로, 크로스 비임 (22) 은, 오목한 영역 (46) 들간에, 제 2 도에서와 같이 상방레일에지를 지니고, 오목한 영역 (48) 내에 레일 (24) 을 지닌 조립체 기둥상에 위치한다. 여러가지 부품의 치수는, 크로스 비임 (22) 의 단부 (26) 들로써 형성된 각각의 경사면 부분이 클립 (28) 의 장면 (32) 의 윗면에 놓이는 것과 같다. 따라서, 크로스 비임 (22) 을 지닌 클립 (28) 의 초기 계합이 우선 확립된다.
대안으로, 약한 접착력으로 초기 계합되고, 절절히 이격된 관계내에서 유지된, 크로스 비임 (22) 및 2 개의 클립 (28) 의 이미 조립된 조합이, 조립체 (8) 를 제작하는데 필요한 조작을 줄이기위해 제공된다. 게다가, 클립 (28) 이 자기 스테인레스 강으로 제작되면, 조립체 기둥내에 삽입된 소형영구자석은 최소의 조작으로 적절하게 클립의 위치를 자동조절할 수 있다.
다음으로, 림부분 (19) 에 부착된 시일링 (20) 을 지닌 커버 (16) 는, 요면, 커버 (16) 의 가스킷면 및 크로스 비임 (22) 의 레일 (24) 상에 위치한 시일링 (20) 을 지닌 크로스 비임 (22) 의 레일 (24) 상 및 레일간에 위치한다. 커버 (16) 는, 슬라이드상의 (샘플을 포함하는) 관심영역하에 중심잡도록 배치된다. 커버의 치수는, 림 (19) 이 압착된후에조차 제 4 도 및 제 5 도에 도시된 것과 같이, 크로스 비임 (22) 이 유리 슬라이드 (14) 와 실제로가 아니라 바람직하게 접촉하기위해, 조립될때 가스킷이 압축되는 것보다 더 많은 양으로, 림 (19), 즉 가스킷 또는 시일표면이 크로스 비임 (22) 의 레일위로 돌출하는 것과 같다.
시약 (13) 의 작은방울은 커버 (16) 상에 위치한다. 손으로 작은방울의 시약을 요면체 표면의 중심에 가깝게 운반하기위해 원하는 시약의 부피를 운반하기위한 피펫셀이 사용되는 것이 바람직하다. 커버의 표면은 단지 부분적으로 젖을수있으므로, 그 작은 방울은 뚜렷이 퍼지지않는다. 그것은 또한 커버 (16) 의 림 (19) 위쪽에 적절히 지속한다.
이미 슬라이드에 고정된 최소한 하나의 자료 샘플을 지닌 슬라이드 (14) 는, 시약 (13) 의 작은 방울 바로위에, 샘플면을 지닌 조립체 설비 (40) 의 슬라이드 유도장치 (44) 상에 위치한다. 그 슬라이드 유도장치 (44) 는, 슬라이드의 밑면이 스프링 (58) 에 의해 시약의 작은방울 (13) 의 윗면위에 최소한 몇 밀리미터를 유지하도록 초기에 배치된다. 슬라이드 (14) 는, 샘플 영역이 커버 (16) 상의 작은방울위로 처리되도록 중심잡기위해 그것의 장방향에서 그것을 미끄러뜨림으로써 배치된다. 이것은 슬라이드 (14) 의 이면을 (현재는 윗면상에 있는) 관찰함으로써 실행될 수 있다. 그것은, 일반적인 관례로서, 관심영역이 슬라이드 (14) 의 이면 (30) 상에서 차이나마커 (china - maker) 로 동그라미 처지면, 특히 쉽게 제작된다.
다음으로, 사용자는 (장갑끼워진) 손가락을 조립체 기둥 (42) 바로위의 슬라이드 (14) 의 이면 (30) 상에 올려놓고, 상방 확장 스프링 (58) 을 압도하고 슬라이드 유도장치 (44) 를 아래로 이동시키기에 충분한 힘으로 똑바로 누른다. 이것은 슬라이드 (14) 의 샘플 측면을 시약의 작은 방울 (13) 과 접촉시키고, 작은방울 (13) 을 슬라이드 (14) 와 림 (19) 내의 커버 표면위로 퍼지도록 한다. 시약의 작은 방울의 부피는, 커버 (16) 의 요면체 표면과 커버의 림 (19) 과 접촉하는 면 (슬라이드 표면) 사이의 부피보다 약간 크게 선택된다. 따라서 시약의 작은방울 (13) 은, 슬라이드 표면이 림 (19) 과 접촉하기 바로전에 림 (19) 의 에지위에 이르고 통과한다. 이것은, 슬라이드 (14) 와 커버의 림 (19) 이 시일을 형성하기전에 커버 (16) 아래로부터 모든 공기를, 또는 거의 모든 공기를 방출시킨다. 시약의 약간 초과한 부피가 커버 (16) 의 림 (19) 을 지나 빠져나가는 것을 받아들일수 있다. 그것은 결국은 마른다. 슬라이드 (14) 상의 부가의 하향력이 림 (19) 을 압축하기 시작한다.
림 (19) 이 부분적으로 압축될때, 슬라이드 (14) 의 이면 (30) 은 각각의 클립 (28) 의 단면 (34) 의 바로 하부에지에 또는 하부에지 아래에 있어야한다. 이러한 점에서, 조작자는, 클립 (28) 이 슬라이드 (14) 의 에지에 대하여 그들의 수직 연결면 (36) 으로 막을때까지, 2 개의 클립 (28) 을 서로 각각을 향하여, 슬라이드 (14) 의 에지위로, 및 크로스 비임 (22) 의 단부 (26) 위로 압착하기위해 (장갑끼워진) 엄지손가락과 다른손의 손가락을 사용한다. 이러한 조치는 커버 (16) 의 림 (19) 을 압축시킨다. 크로스 비임 (22) 의 단부 (26) 와 계합하는 작은 멈춤쇠 (detent ; 38) 때문에, 및/또는 각각의 크로스 비임 단부 (26) 상의 경사면의 탄젠트 각도가 클립 (28) 과 크로스 비임 단부 (26) 사이의 마찰계수보다 작기때문에, 클립 (28) 은 고의로 이동될때까지 같은자리에 머무른다.
본 발명에 따라 조립된 시스템 (10) 에서, 슬라이드 (14) 와 커버 (16) 사이에 트랩 (trap) 된 부피는 비압축성 시약 액체 (13) 로 완전히 채워진다. 따라서, 커버 (16) 의 림 부분 (19) 이 완전히 압축됨에 따라, 압력의 큰 증가없이 고정된 시약의 부피를 조절하도록 팽창하기위해, 만약 그렇지않으면 조립체를 제작하기 어려워지며, 커버자체가 적합하게되는 것이 바람직하다. 커버 (16) 가 적합해야하는 다른 이유는 시약 (13) 이 비등점에 접근하는 온도 또는 그이하의 온도까지 가열될때, 그것은 팽창하고, 그것의 증기압은 상승되고, 그리고, 그속에 용해된 가스들은 용액에서 추출되는 경향이 있다는 것이다. 만일 커버가 전혀 적합하지않다면, 커버내의 압력은 슬라이드 또는 커버 시일을 파괴할 정도로 상승하고, 시약의 손실의 원인이 된다. 그러나, 발생하는 기포의 부피를 조절하기에 충분한, 적은양의 적합성 (small amount of compliance) 은 압력이 과도히 상승되는 것을 저지한다. 압력은, 보통, 외부 대기압 이상의 시약의 증기압의 초과보다 단지 약간 높은 정도까지 상승될 것이다. 이것은, 자유시약 (free reagent) 의 비등점이 PCR 변성온도보다 낮은, 높은 고도에서조차 그 시스템이 잘 작동하도록 한다.
제 12 도에는 기계적으로 보조된 조립체 장치 또는 공구 (80) 가 도시되어 있다. 이 공구는, 사실상 손가락으로 조립체를 취급하는 것이 배제된 것을 제외하고는 제 11 도에 도시된 공구와 유사하다. 이 공구 (80) 는, 특히 (아래에서 상세히 설명된) 물리적 핫스타트 (physical hot starts) 가 이행되면, 바람직하다. 제 12 도에 도시된 그 공구 (80) 는 기부 (45) 및 제 11 도에서와 같이 기부상에 장착된 기둥 (42) 을 지니며, 형태에 있어서 제 11 도에 도시된 유도장치 (44) 와 다소 유사한 슬라이드 유도장치 (82) 를 사용한다. 더우기, 공구 (80) 는, 사용자가 조립체 작동중에 보지용 조립체 (18) 의 고온의 요소와 육체적으로 접촉할 필요없도록 압축아암 (84) 및 클립 설치장치를 지닌다.
그 슬라이드 유도장치 (82) 는, 슬라이드 (14) 를 수용하도록 치수되어진 한쌍의 이격된 평평한 접시부분 (88) 을 지닌다. 그 접시부분은, 수평 피봇핀 (92) 둘레를 회전하는, 일체 성형된, U - 형태의 이음쇠 (90) 로써 연결된다. 피봇핀 (92) 은, 기둥 (42) 의 윗면과 거의 같은 높이에서 2 개의 고정된 지지대 (94) 로써, 기부 (45) 위쪽에서, 수평으로 지지된다.
압축아암 (84) 의 한단부는 또한 핀 (92) 위에서 이음쇠 (90) 내부로 피봇가능하게 장착된다. 아암 (84) 은 크로스 비임 (22) 과 클립 (28) 을 수용 및 지지하는 기둥 (42) 의 윗면 윗쪽에 배치된 보통의 직사각형 개구부 (96) 를 지닌 평평하고, 가늘고긴 부재이다. 그 개구부 (96) 는, 아암 (84) 이 기둥 (42) 위의 슬라이드 (14) 상으로 낮추어짐에 따라 슬라이드 (14) 상의 커버 부재 (16), 크로스 비임 (22) 및 샘플 (12) 의 관찰을 가능케한다. 개구부 (96) 를 둘러싸는 고무 쿠션패드 (rubber cushion pad ; 98) 가, 아암 (94) 이 슬라이드 (14) 에 대하여 압착될때 슬라이드의 파괴를 방지하기위해 사용된다. 그 아암 (94) 은 필요될때까지 상승된채로 비켜있기 위하여 상방으로 편향된 스프링이 바람직하다. 마찬가지로, 슬라이드 유도장치 (82) 는, 아암 (94) 이 보지용 조립체 (18) 의 최종 설치를 위하여 슬라이드 (14) 로 낮추어질때까지 크로스 비임 (22), 클립 (28), 커버부재 (16) 및 시약방울 (13) 위쪽에 슬라이드 (14) 를 유지하기위해 상방으로 편향된 스프링이 바람직하다. 아암 (84) 과 슬라이드 유도장치 (82) 양자는 핀 (90) 상에 장착된 종래의 스프링 (도시되지 않았음) 을 지닐수있는바, 그 스프링은 바람직한 상방 편향을 제공하기 위하여 기부 (45) 로부터 연장될 수 있다.
클립 설치장치 (86) 는, 유도장치 (82) 에 장착된 슬라이드 (14) 의 에지에 인접한 클립 (28) 과 일체로 형성된 대향 손잡이 부분 (104) 을 배치시키는 오목한 영역 (46) 에 대하여 각각 굽은 2 개의 대향 핑거 (102) 를 지닌 기둥 (42) 에 장착된 집게 (100) 가 적재된 한쌍의 스프링이 바람직하다. 집게 (100) 의 대향 손잡이 부분 (104) 은, 클립 (28) 을 슬라이드 에지위의 슬라이드 측면 위쪽으로 밀고, 포함 시스템 (10) 의 조립체를 완성하기위하여 크로스 비임 (22) 의 단부 (26) 를 밀기위해 손으로 함께 조여준다. 각각의 집게 (100) 는, 핑거 (102) 와 클립 (28) 사이의 접촉점 바로아래서, 기둥 (42) 의 측면을 관통하여 돌출된 고정된 피봇핀 (106) 상에 피봇가능하게 장착된다.
제 13 도의 사시도는 클립 설치 장치 (84) 가 단독으로 도시되어 있다. 각각의 L 형태의 핑거 (102) 는 기둥 (42) 의 윗면의 오목한 영역 (46) 중 하나로 고정되는 짧은 레그를 지닌다. 각각의 평평한 손잡이 부분 (104) 은 기둥 (42) 의 2 개의 인접한 측면을 둘러싼다. 각각의 손잡이 부분 (104) 과 기둥 (도시되지 않았음) 사이에 배치된 스프링 (도시되지 않았음) 은, 오목부 (46) 에 보지용 클립 (28) 의 설치를 가능케하기위해 손잡이 부분 (104) 과 집게 (100) 의 핑거부분 (102) 을 편향시킨다. 대향 손잡이 부분 (104) 이 함께 조여질때, 끝부분 (102) 은, 클립 (28) 을 슬라이드 (14) 위로 밀면서, 상호 다른방향으로 이동한다.
공구 (80) 는 아래와 같이 조작된다. 2 개의 클립은 전술한 바와같이 오목부 (46) 내에 설치된다. 크로스 부재 (22), 시일링 (20), 커버 (16), 및 시약 (13) 은 차례로 기둥 (42) 상에 배치되고, 샘플 (12) 을 지닌 슬라이드 (14) 는, 아래에 샘플 측면을 지니고, 커버 (16) 의 시약 (13) 위에 수직으로 배치된 샘플을 지닌 유도장치 (82) 의 접시부분 (86) 내에 위치한다. 압축 아암 (94) 은, 슬라이드 (14) 를 커버 (16) 위로 낮추고, 슬라이드 (14) 상의 샘플 위에있는 시약과 효소를 퍼지게하기위해 슬라이드에 대하여 하방으로 피봇된다. 아암 (94) 이 완전히 낮추어지면, 집게 (100) 는, 핑거 (102) 를 상호 다른방향으로 이동시키고, 보지용 클립 (28) 을 슬라이드 (14) 와 크로스 비임 단부 (26) 위쪽으로 밀면서, 조여진다. 완전한 슬라이드 조립체 (10) 는 공구 (80) 로 부터 제거되고, 개량된 열순환기내에 넣어져, 전술한 바와같이 열순환된다.
[핫 스타트 (Hot Start) 응용법]
본 발명을 사용하는 핫 스타트를 수행하기 위해, 수동 조립체 설비 (40) 또는 기계적으로 보조된 공구 (80) 에 가열 시스템을 부가하는 것이 필요하고, 시스템의 요소를 저장하기위한 가열된 용기의 사용을 필요로한다. 또한, 전술한 바와같이, 슬라이드 및 보지용 조립체 요소의 몇몇은, 일시적으로 함께 조립될수있고, 설비상의 배치 및 모든 포함 시스템 요소의 최종 결합체보다 먼저 가열될 수 있다.
후술될 설명은, 제 11 도에 도시된 수동 가열 조립체 설비 (40) 에 적용되고, 유사하게, 제 12 도에 도시된 기계적으로 보조된 조립체 공구 (80) 에 적용된다. 조립체 기둥 (42) 은 수직구멍 즉, 하부에서 공기와 통하는, 기둥을 관통하는 공기통로 (43) 로 제작된다. 내부 온도조절장치로써 제어된 가열기는, 가동중에 약 70℃ 의 핫 스타트 온도보다 고온인, 약 75℃ 로 기둥 (42) 의 몸체를 유지시킨다. 이 가열기는 중심구멍 (43) 을 둘러싼 저항 코일일수있고, 또는, 기부 (45) 또는 기둥 (42) 내에 단순히 삽입될 수 있다. 구멍 (43) 의 내부에, 수직통로에서 일어나는 공기의 가열을 돕기위해 핀 (fin) 이 제공된다. 대류는, 최종 조립체보다 먼저 기둥 (42) 의 윗면에 놓인 크로스 비임 (22) 및 커버 (16) 를, 굴뚝내에서처럼, 가득채우는 고온공기의 상승기둥을 유지한다. 크로스 비임 (22) 및 클립 (28) 은 또한 금속 조립체 기둥 (42) 과의 접촉에의해 가열된다.
처리될 슬라이드 (14) 는 슬라이드를 약 75℃ 로 유지시키는 가열된 운반설비내에 저장된다. 클립 (28), 커버 (16) 및 크로스 비임 (22) 은 워크 스테이션 (work station) 에서 가열된 작은 용기내에 저장될 수 있고, 핀셋으로 처리될 수 있다. 2 개의 미리 가열된 클립, 1 개의 크로스 비임 및 하나의 커버를 가열된 조립체 기둥 (42) 위에 올려놓는데 필요한 시간은 약 10 내지 15 초이다. 미리 가열된 양변위 (positive displacement) 피펫 끝부분을 사용하여 미리 가열된 시약 (13) 을 이동시키는 시간은 10 초보다 짧다. 가열된 시약 (13) 은, 시약을 시일하고, 보지용 조립체 (18) 의 요소를 함께 고정하기위해, 미리 가열된 슬라이드가 밀어내려지기전에 단지 또다른 10 초동안 노출될 필요가 있다. 몇초후에, 조립된 슬라이드는, 70℃ 보다 결코 차지않은 온도로 가열된 운반설비내로 돌아올수있다. 따라서, 노출시간이 매우 짧으므로 증발에의한 시약의 농축은 최소화될 것이다.
전형적인 물리적 핫 스타트는, 단지 조립체 공구를 가열함으로써, 그리고 조립체 워크 스테이션에서 가열된 운반설비내에 슬라이드, 포함 시스템 부품, 시약, 및 피펫 끝부분을 저장함으로써 수행될 수 있다. 절차에서 다른 변화는 필요하지 않다. 가열된 요소 및 유도장치 (82) 의 가열된 요소와 접촉의 저장이 제거되었으므로, 이러한 절차는 제 12 도에 도시된 조립체 공구 (80) 의 사용으로 단순화된다. 요소들이, 대기온도에서 포장과 적하를 촉진하는 강한 접착물로 상호부착되면, 클립 (28) 및 크로스 비임 (22) 의 사전 조립체 (pre - assemblie) 들 또한 핫 스타트를 위하여 사용될 수 있으나, 핫 스타트 온도에서 최종조립체를 약화시킨다.
[조립체의 열순환]
포함 시스템 (10) 의 클립 (28) 은 슬라이드 (14) 의 에지위에 걸쳐있고, 슬라이드 이면 (30) 의 수밀리미터를 차지하고 있다. 이러한 이유는, 새로운 포함 시스템으로 사용되는 열순환기의 평평한 열교환면에는 클립 (28) 을 수용하기위한 깊이 1 밀리미터, 너비 3 밀리미터 보다 약간 작은 홈이 제공되어야한다.
Perkin Elmer DNA 열순환기, 이를테면 Perkin Elmer 모델 제 480 호 또는 Perkin Elmer 모델 제 9,600 호와 같은 현재의 열순환기는, 어댑터 플레이트 (adapter plate) 가 열순환기의 평평한 상부면상에 위치하면, 본 발명에 따른 슬라이드 조립체를 열순환시키는데 사용될 수 있다. 그러한 어댑터 플레이트 (110) 는 제 14 도 및 제 15 도의 평면도 및 단면도에 도시되어 있다. 이러한 플레이트 (110) 는 평평한 밑면과 이격된 평행홈 (116) 을 지니는 윗면 (114) 을 지닌다. 이러한 홈 (116) 은 클립 (28) 을 수용하도록 치수되어, 홈 (116) 들 사이의 평평한 표면부분 (118) 은 어댑터 플레이트상에 위치한 슬라이드 (14) 의 유리표면과 완전히 접촉한다. 어댑터 플레이트 (110) 는 최고 3 또는 4 개의 슬라이드 조립체를 수용하도록 설계되어 질수있다.
기름 또는 열전도성 그리스 (grease) 와 같은 열전도성 액체가, 슬라이드 (14) 의 이면 (30) 과 홈 (116) 들 사이의 평평한 열교환면 (118) 사이의 계면의 전역에서 열 접촉을 증가시키기위해, 상부표면부분 (118) 에서 퍼지는 것이 바람직하다. 실리콘 그리스 또는 광물성 기름이 이러한 계면 전역에서 양호한 열접촉을 확실히하기위해 열순환기와 어댑터 플레이트 (110) 사이에서 사용되어야 한다. 에틸렌 글리콜 또는 그것의 중합체가 또한 양쪽의 계면들사이에 양호한 열접촉을 유리하게 제공하기위해 사용될 수 있다. 에틸렌 글리콜 또는 것의 중합체는 수용성이라는 장점을 지니며, 따라서, 조립체 요소 및 열순환기판의 세척을 용이하게 한다. 슬라이드와 어댑터 플레이트사이 및 열순환기판과 어댑터 플레이트사이에 기름, 그리스 또는 에틸렌 글리콜 또는 그것의 중합체를 사용하는 것의 다른 장점은, 액체층이 어댑터 플레이트 및 그판상의 적소에 있는 어댑터 플레이트에 슬라이드를 유지하기위한 흡착물 (suction clamp) 로 작용하여 처리중 감량의 가능성을 최소화한다는 것이다.
본 실험은, DNA 열순환기의 열 눈금 (thermal calibration) 을 재조정하는 것, 또는 전체 시스템의 열중량 (thermal mass) 에 있어서의 변화를 상쇄하기위해 정상소재 증폭의 약간 더 높은 온도를 지정할 필요가 있다는 것을 제시한다. 예를들면, 샘플판에서 슬라이드 표면의 윗면까지, 1℃ 이상의 온도에서 작은 물방울이 관찰된다. 적절한 온도에서 이 물방울은, 전술한 것과같은 기름, 그리스, 또는 에틸렌 글리콜을 사용함으로써 최소화될 수 있다.
[DNA 열 순환기의 정상소재 변형]
본 발명의 포함 시스템 (10) 은, 각각의 조립체 (10) 의 두께가 4 mm 보다 적기때문에 바로 논의된 수보다 더 많은 슬라이드를 순환시키는데 적용될 수 있고, 어떠한 물리적 상태에서도 순환될수있고, 기름에 담글 필요가 없다. 예를들면, 조립체 (10) 는 다수의 슬라이드 조립체를 수용하기위한 수정된 열순환기 블록내에 수직적으로 배열될 수 있다. 수정된 금속블록 (122) 을 포함하는 수정된 열순환기 (120) 는 제 16 도에 도시되어 있다. 그 블록 (122) 은, 블록사이의 금속 칸막이 (126) 사이의 중심상에서 10 밀리미터 떨어진 8 개의 홈 (slot ; 124) 을 포함한다. 각각의 홈 (124) 은 약 5 밀리미터의 너비이고, 각각의 칸막이 (126) 는 각각의 금속 칸막이 (126) 의 우측에 클립 (28) 을 수용하기 위해 한쌍의 홈 (groove ; 130) 을 지닌 평평한 수직 열교환 면 (128) 을 지닌다.
제 17 도는 그러한 홈 (124) 내의 에지에 장착된 슬라이드 조립체 (10) 를 관통시키는 블록 (122) 의 부분단면도이다. 기부홈 (130) 의 끝에지 (132) 는, 슬라이드 (14) 가 수직으로 제거될때 클립에 걸리는 것을 방지하기위해 매끈하게 챔퍼 (chamfer) 가공되어 있다. 유사한 이유로, 상부 홈 (130) 은 상부 에지를 지니지 않는다. 당연히, 슬라이드가 이런식으로 장착될때, 중력이 평평한 금속 열교환면 (128) 에 대하여 유리 슬라이드 (14) 를 고정시키는 것을 기대할 수 없다. 따라서, 종래 형태의 작은 겹판스프링 (도시되지 않았음) 이 수직금속면 (128) 에 대하여 슬라이드를 서서히 그러나 견고하게 고정하기 위하여 각각의 홈 (124) 의 단부에 위치할 수 있다. 다시한번, 광물성기름, 그리스, 에틸렌 글리콜 또는 다른 열전도성 액체가 슬라이드 (14) 와 평평한 금속 열교환면 (128) 사이에서 열전달을 최대화하기위해 사용되어야한다. 그 스프링은 슬라이드가 적재된후 계합될수있고, 슬라이드의 제거전 해제될수있으며, 또는 홈 (124) 내에 영구적으로 장착되어 슬라이드 (14), 조립체 (10) 를 표면 (128) 과 계합되도록 계속적으로 압착한다.
열순환이 완결된때, 조립된 슬라이드 (10) 는 부가의 분석을 위해 홈 (124) 으로 부터 제거된다. 그 포함 시스템 부품은 슬라이드 (14) 의 분리된 클립 (28) 을 미끄러뜨림으로써 쉽게 제거된다. 그 포함 시스템들은 살균하기위해 5 % 표백제 용기에 넣은후, 헹구어, 건조시키면, 그것들은 여러번 재사용될 수 있다. 재사용에 대한 제한은, 커버 (16) 가 슬라이드 (14) 에 고정되기 전 또는 후에 시각적검사에 의해 쉽게 조사되는 상태, 즉, 커버 (16) 및/또는 림 (19) 의 열화 (劣化) 에 의해 결정된다. 용해상태에서 샘플에 대하여 실행된 PCR 과는 다르게, 불필요한 DNA 로 인한 오염은 정상소재 PCR 에서 중요하지 않은 문제라는 것을 주목하라. 그 이유는 오염된 DNA 가 적절히 고정된 세포들 내부로 들어가지 못한다는 것이다. 더우기, 어떠한 오염 DNA 도, 열순환후 성장단계전에 시약에 의해 씻겨진다. 정상소재 PCR 에 관한 이러한 사실은 용해상태의 PCR 에 관해서보다 더 만족할만한, 세척가능하고, 재사용가능한 부품을 제조한다.
[정상소재 PCR 용 시약]
본 연구에서, 우리는 정상소재 PCR 용 적정시약의 양이 용해상태 PCR 과 상이하다는 것을 알수있다. 우선, 표면적 대 부피비의 문제가 있다. MicroAmpTM튜브내의 10 마이크로리터의 시약은 약 17 mm2의 용기 접촉 면적을 갖는다. 슬라이드 (14) 와 직경 10 mm 의 커버사이의 시약의 동일한 부피는 약 157 mm2, 즉 약 9 배 큰 부피를 지닌다. 따라서, 폴리메라아제 효소의 흡수와 같은 표면상태로 말미암은 PCR 에 반대되는 어떠한 결과도 정상소재의 경우에서 과장된다. 표면적이 PCR 반응 튜브의 신중히 선택된 폴리프로필렌 재료보다 더 적대적이라면, 그 적대적인 결과는 매우 크게 과장된 것이고, PCR 을 완전히 쉽게 약하게 할수있다. 예를들면, 널리사용되는 실란 (silane) 처리된 유리 슬라이드는 사실상 폴리프로필렌보다 더 적대적인 표면이다.
실란화된 슬라이드에 대한 PCR 시약의 본 발명에 따른 포함 시스템에서 용해 상태의 PCR 의 성공적인 증폭을 얻기위하여, 반응에서 Taq 폴리메라아제 양을 전형적인 용해상태 PCR 의 100 μl 당 2.5 단위부터 100 μl 당 12.5 단위까지 증가시킬 필요가 있다는 것을 알수있다. 또한, 슬라이드 표면에서 PCR 을 보호하는 시약에 ml 당 1 mg 의 소의 혈청 알부민 (BSA) 을 추가한다는 것을 알수있다. BSA 는 그것이 접촉하는 모든 표면위에 최소한 하나의 단백질 단층을 즉시 형성함으로써 작용한다. 따라서, 단층은 Taq 폴리메라아제 효소가 강하게 부착하지않는 표면을 발생시킨다.
순환중 반응으로부터 수분의 감소는 이미 검토되었다. 주의와 신속한 작업에도 불구하고, 핫스타트 적재중 약간의 수분은 감소될 것이다. 또한, 약간의 수분은 적합한 고무 또는 플라스틱 커버 (16) 의 얇은 벽안으로 또는 심지어 얇은 벽을 통하여 확산됨으로써 감소된다. 이러한 적은 부가의 감소를 고려하여, 정상소재 증폭을 위한 PCR 시약의 공식화는, 적재와 순환중 농도에 있어서의 유일한 변화는, 비록 있다하더라도, 수분의 감소에 의한 매우 적은 증가이기때문에, 각각의 요소에 대한 농도의 적정 범위중에서 가장 묽은범위 이어야한다.
따라서, 완전한 정상소재 PCR 시스템은 슬라이드와 포함 시스템 (10), 조립체 설비 (40 또는 80), 부속된 포함 시스템 조립체 (10) 를 지닌 하나 또는 그이상의 슬라이드 (14) 를 위하여 설계된, 수정된 열순환기, 및 전술한 것과 같이 수정된 시약 (13) 을 포함한다. 이러한 조합의 새롭고 의외의 결과는 편리하고, 튼튼하고, 민감한 검출 및, 세포 및 조직 재료내의 특수한 DNA 순서의 위치이다.
슬라이드 (14) 에지사이의 샘플 (12) 의 측면 배치 또는 간격이 일정하면, 링 (20) 은 크로스 비임 (22) 내로 통합될 수 있다. 이것은 보지용 조립체 (18) 의 부품구조 및 포함 시스템 (10) 을 단순화시킬 것이다.
포함 시스템 (10) 의 구조는 몇가지 방법으로 단순화될 수 있다. 예를들면, 크로스 비임과 보지용링은 통합될 수 있다. 본 발명에 따른 크로스 비임 및 커버의 제 1 변형 실시예는 제 18 도에 도시되어 있다. 이 변형 크로스 비임에 대한 변형물은 제 19 도에 도시되어 있다. 전술된 정상소재 PCR 포함 시스템에서, 동일한 또는 교환할수있는 부품을 설명하기위하여 아래의 명세서에서, 같은 번호가 사용될 것이다.
이제, 제 18 도 및 제 19 도를 참고하면, 변형 크로스 비임 (120 및 140) 의 평면도는 변형 커버 (122) 에 조립되어 각각 도시된다. 크로스 비임 (120 및 140) 들 사이의 차이점은 단지 원형 구경 (aperture ; 124 및 142) 의 배치이다. 크로스 비임 (120) 내의 구경 (124) 은 중앙에 위치한다. 대비하여, 크로스 비임 (140) 내의 구경 (142) 은 크로스 비임 (140) 의 일단부 (144) 에 인접하여 위치한다. 2 개의 크로스 비임 (120 및 140) 의 조합은, 단지 크로스 비임 (140) 의 방향을 변경함으로써, 또는 중앙에 배치된 구경 (124) 을 지닌 크로스 비임 (120) 을 선택함으로서 슬라이드 (14) 상의 어디엔가 놓인 샘플 (12) 을 덮는 커버 (122) 의 배치를 허용한다. 이러한 실시예에서, 시일링은 크로스 비임과 일체로 형성된다. 제 20 도 및 제 21 도의 부분단면도에 도시된 것과 같이 포함 시스템 (10) 이 조립되면, 크로스 비임 (120) 은 일반적으로 커버 (122) 의 림부분 (128) 에 대하여 압착하는 원형링부분 (126) 을 지닌다.
크로스 비임 (120) 은 스테인레스강 시트로 부터 압형된 단편인 것이 바람직하다. 크로스 비임 (120) 은, 전술한 제 1 실시예에서의 클립 (28) 과 거의유사한 클립 (134) 을 수용하기위해 약 3°의 작은 각도로 하방으로 굽은 대향단부 (132) 사이에서 연장하는 레일 (130) 을 형성하는 한쌍의 평행하고, 수직으로 굽은 단부를 지닌다. 제 21 도에 도시된 것과 같이, 슬라이드 (14) 에 커버 (122) 의 림부분 (128) 을 압축하기위한 설치중, 각각의 클립 (134) 은 단부 (132) 와 유리 슬라이드 (14) 를 함께 압착한다.
크로스 비임 (120) 및 커버 (122) 장치의 본 변형 실시예의 특별히 유일한 특징은 커버 (122) 가 림부분 (128) 과 아래부분에 시약 혼합물 (13) 이 보유되는 중심반구형 또는 오목한 부분 (138) 사이에 환상의 리브 (rib) 또는 리지 (ridge ; 136) 를 지닌다는 것이다. 이러한 환상 리지 (136) 는, 스냅이, 단편들을 함께 보유하는 구멍 (124) 에 들어맞는 확대된 구상 두부 (bulbous top ; 137) 를 지니는 것이 바람직하다. 제 21 도에 도시된 것과같은 변형실시예의 포함 시스템 (10) 요소들의 최종 조립체를 단순화하기 위해, 커버 (122) 및 크로스 비임 (120) 은, 분리단위로서 조립될 수 있다.
크로스 비임 (120) 은 불필요한 금속재료를 제거하는 차단부 (cutout region ; 139) 를 지닐수 있다. 선택적으로, 이러한 차단부 (139) 는 크로스 비임 (120) 의 강도를 향상시키기위해 리브 또는 골 (corrugation) (도시되지 않았음) 로 대체될 수 있다.
제 19 도를 참조하면, 크로스 비임 (140) 은 평행하게 상승된 레일에지 (146) 와 크로스 비임 (120) 내의 2 개의 차단부와는 현저히 다른 단일 차단부 (148) 를 지닌다. 크로스 비임 (140) 은 슬라이드 (14) 상의 배치를 위해 제 19 도에 도시된 위치로부터 180°회전하여, 크로스 비임 (140) 과 크로스 비임 (120) 의 조합은 슬라이드 (14) 상에 사실상 모든 잠재 샘플 위치의 적용범위를 허용한다.
제 18 - 21 도에 도시된 것과 같은 변형 포함 시스템의 조립체는, 보지링 (20) 이 더이상 필요하지 않다는점과 커버 (120) 와 크로스 비임 (120) 이 우선 상호 조립되었다는 점을 제외하고는 전술한 제 1 실시예와 유사하다. 수동적으로 (manual) 또는 기계적으로 보조된 조립체 공구 (40 및 80) 는 전술된 것과같이 슬라이드에 포함 시스템을 조립하는 핫스타트를 수행하는데 사용될 수 있다.
제 22 도 내지 제 24 도는 또다른 변형 커버 및 크로스 비임 (150) 을 사용하는 본 발명에 따른 포함 시스템 (10) 의 제 3 실시예를 제시한다. 제 22 도의 평면도에서 도시된 본 실시예의 크로스 비임 (150) 은 평행 상승 레일 (152) 및 굽은 단부 (154) 를 지니는 압형된 시트 메탈 피스 (sheet metal piece) 이다. 그러나, 본 실시예는 커버 (156) 의 중심부가 연장 관통하는 중심구멍을 지니지않는다. 그 대신에, 환상 골 (trough) 또는 시트 메탈 크로스 비임 (150) 내의 요부 (depression ; 158) 가 제 1 실시예에서 보지링 (20) 의 기능을 수행하고 제 2 실시예에서 링부분 (126) 의 기능을 수행한다. 이 환상골 (158) 은 커버 (156) 의 림부분 (160) 이 골 (158) 의 밑면과 완전히 계합하도록 치수되어진다. 제 2 실시예의 커버에서와 같이, 상승된 리지 (162) 는 림부분 (160) 과 커버 (156) 의 중심부 (164) 사이에서 위쪽으로 돌출한다. 커버 (156) 는, 커버 (156) 와 크로스 비임 (150) 을 함께 보지하기 위해 환상골 (158) 내부의 중앙에 배치된 개구부 (168) 에 꼭들어맞도록 설계된 노브 (knob) 또는 중심 돌출부 (166) 을 선택적으로 포함할 수 있다. 도시된 것과 같이 이러한 중심 돌출부 (166) 가 구비되면, 커버 (156) 상에 리지 (162) 를 구비할 필요는 없다. 오목 중심부 (164) 를 지닌 커버 (156) 를 성형할 필요는 더욱 없다. 개구부 (168) 에 돌출부 (166) 를 끼워맞추는 것은 크로스 비임 (150) 의 중심부에 대하여 중심부를 상방으로 끌어당겨, 시약 (13) 을 수용하기위해 필요한 만곡부를 생기게한다. 이경우 리지 (162) 는 필요하지않지만, 리지 (162) 는 이러한 중심 만곡부의 윤곽형성을 도울수있다.
크로스 비임 (150) 은 또한 구조체의 경도를 증가시키기위해 시트 메탈 재료에 압축된, 제 22 도에 도시된 것과 같은 다수의 골 또는 리브 (170) 를 지녀서 그것은 매우 얇은 시트 메탈 재료로 제조될 수 있으며, 따라서 그것의 열중량 (thermal mass) 및 전체 두께를 감소시킬 수 있다.
이러한 제 3 변형실시예 (150) 는 전술한 실시예들에비해 별개의 장점을 갖는다. 크로스 비임 (150) 이 적합한 커버 (156) 를 완전히 덮기때문에, PCR 반응에 대하여 비저항일뿐 아니라 수분의 전파에 둔한 커버 재료의 필요가 매우 감소된다. 따라서, 이것은 재료의 폭넓은 선택을 허용한다. 예를들면, 커버 (156) 는 실리콘 고무의 단일 성형체일 수 있다. 폴리프로필렌과 같은 비침투성 탄성중합체와 실리콘 고무의 복합물 또는 샌드위치는 필요하지않다. 체적이 매우적은 이유로, 커버 (156) 의 중심부 (164) 를 통하여 폐쇄된 공간 (172) 으로 수분의 전파가 곧 평형에 도달하기 때문에 이러한 특성이 발생한다. 증발은, 도시된 변형 돌출부 (166) 및 변형 개구부 (168) 를 제거함으로써 더 최소화될 수 있다. 중심 노브 (166) 가 제거되면, 상승된 리지 (162) 는 크로스 비임 (150) 위의 및 크로스 비임 (150) 아래의 적소에 커버 (156) 를 일시적으로 고정시키기 위해 사용될 수 있다.
그러나, 샘플 (12) 에 대하여 시약 (13) 을 효과적으로 보지하기위한 시일을 제공하기 위해 클립 (28 또는 134) 의 설치중 림부분 (160) 을 압착하는 동안 커버 (156) 의 이동을 허용하기위해 공간 영역 (172) 은 필수적이다. 통제된 부피 (172) 는 또한 열순환중 커버 (156) 아래의 압력을 조절하는데 소용된다. 이것은 약 95℃ 의 변성온도에서 배양기간중 시약 (13) 의 기포형성을 감소시키거나 또는 저지할 수 있다.
레일 (152) 의 구조는 제 24 도의 부분단면도에 최상으로 도시되어 있다. 이러한 평행 레일 (152) 은 본질적으로 크로스비임 (150) 을 형성하는 시트 메탈 피스의 에지의 위쪽에 이중으로 겹쳐져있다. 이러한 설계는 비교적 견고하며, 최소한 두께의 시트재료의 사용을 가능케한다. 더우기 에지 위쪽의 이중으로 겹쳐진부분은 얇은 메탈 재료를 다루기에 위험한 예리한 에지의 존재를 최소화한다. 단부 (154) 는 또한 레일 (152) 과 동일한 이유로 구부려 접어질수 있다.
크로스 비임 (150) 은 슬라이드상의 중심에 위치한 샘플을 수용하도록 중심에 배치된 환상 골 (158) 을 지닐수있다. 이러한 변형은 제 22 도에 도시된 변형으로부터 명백한 변화이기때문에 도시되지 않았다.
상기 명세서는 본 발명의 적합한 실시예의 설명이지만, 본 발명에 따른 정상 소재 PCR 포함 시스템의 발명 개념을 구체적으로 설명한 것과 다른 방법으로 실행될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를들면, 크로스 비임 및 디프 (dip) 는 견고한 플라스틱 재료로 제조될 수 있거나 또는 클립 (28) 들중에 하나는 크로스 비임 (28) 의 일단부와 일체로 제조될 수 있어, 크로스 비임 (22) 의 대향단부 (26) 를 고정하는데 단지 하나의 클립 (28) 이 필요하다. 따라서 본 발명의 실시예들은, 첨부된 청구범위의 고유범위 및 정확한 의미에서 벗어나지않는 범위에서 수정, 변형 및 변화될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구범위의 의미 및 넓은 범위에 해당하는 모든 변화, 수정 및 변형을 포함하도록 의도된다. 본 명세서에서 인용된 모든 특허출원, 특허 및 간행물은 인용문 전체로서 포함된다.

Claims (70)

  1. 유리현미경 슬라이드 (glass microscope slide) ; 상기 슬라이드상에 놓인 타깃 핵산 시퀀스 (target nucleic acid sequence) 를 포함하는 샘플 ; 상기 샘플상의 시약 혼합물 ; 상기 샘플 및 상기 시약 혼합물의 윗부분을 덮는, 상기 슬라이드상의 커버 (cover) ; 및 상기 슬라이드에 기계적으로 고정되고, 상기 커버와 상기 슬라이드사이의 상기 샘플 및 상기 혼합물을 보지하고 상기 슬라이드에 대하여 상기 커버를 시일하도록 상기 커버에 고정된 보지용 조립체 ; 를 포함하는 타깃 핵산 시퀀스의 정상소재 PCR 증폭용 포함 시스템 (containment system).
  2. 제1항에 있어서, 상기 보지용 조립체는 상기 슬라이드에 상기 커버를 제거가능하게 보지하기 위하여 최소한 하나의 클립을 포함하는 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 상기 커버부재는 가요성인 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 상기 보지용 조립체는 상기 커버의 림부 (rim portion) 둘레에 시일부재를 포함하는 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 상기 커버부재는 탄력있게 그리고 적절하게 오목한 형태를 갖는 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 상기 커버의 형태가 상기 시약 혼합물 보지용 상기 오목부내의 예정된 비체적 (specific volume) 을 한정하는 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 상기 커버부재는 고무시트 (rubber sheet) 인 시스템.
  8. 제5항에 있어서, 상기 시일부재는 상기 림부에 고정된 견고한 환상 시일링을 포함하는 시스템.
  9. 제5항에 있어서, 상기 시일부재는 상기 커버부재의 상기 림부를 포함하는 시스템.
  10. 제5항에 있어서, 상기 커버는 스테인레스강 링에 접착된 상기 림부를 지니는 고무시트의 디스크인 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 상기 스테인레스강 링은 상기 림부에 접착된 평평한 베이스부분을 가지고있는 일반 다변형 단면을 갖는 시스템.
  12. 상기 클립수단과 상기 유리 슬라이드 사이에 고정시키기에 적합하고 상기 링의 일부를 덮는 크로스 비임 부재를 더 포함하는 제11항에 따른 시스템.
  13. 제4항에 있어서, 상기 클립 수단은, 상기 슬라이드에 상기 커버를 탄력있게 고정시키도록 치수된 한상의 이격된 대향면을 지니는 일반 U 형태의 시트 메탈 클립을 포함하는 시스템.
  14. 제12항에 있어서, 상기 클립수단은, 상기 슬라이드의 에지부분에 상기 크로스 비임 부재의 단부를 탄력있게 고정시키도록 치수된 한쌍의 이격된 대향면을 각각 지니는 한쌍의 일반 U 형태의 클립인 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 크로스 비임 부재는 상기 시일링의 이격부와 계합하는 한쌍의 이격된 레일, 및 상기 클립과 계합하는 상기 레일 결합용 대향 단부를 지니는 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 클립의 쌍이 상기 단부 및 상기 슬라이드의 상기 에지부분에 설치될때, 상기 각각의 단부가 상기 클립의 하나와 계합하는 경사면을 형성하도록 굽어, 상기 크로스 비임 부재가 상기 슬라이드에 대하여 상기 크로스 비임 부재 아래에 설치된 상기 림부를 압축하는 시스템.
  17. 제4항에 있어서, 상기 커버부재는 폴리메라아제 연쇄반응 시약에 대하여 비활성인층 및 비침투성층을 포함하는 복합체인 시스템.
  18. 가요성 커버부재, 상기 커버부재의 최소한 한부분을 둘러싸고있는 환상시일부재 및 상기 슬라이드에 대하여 상기 커버 및 시일부재를 제거가능하게 보지하기위한 최소한 하나의 클립수단을 포함하는, 유리 슬라이드에 대하여 유체를 보지하기위한 보지용 조립체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 커버부재는 탄력있게 그리고 적절하게 오목한 조립체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 오목한 커버 형태가 시약의 특정량을 보지하기 위한 예정된 체적을 형성하는 조립체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 커버부재는 고무 시트 재료로 제조된 조립체.
  22. 제18항에 있어서, 상기 커버부재는 상기 시일부재에 고정된 조립체.
  23. 제18항에 있어서, 상기 시일부재는 상기 커버부재와 일체된 조립체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 커버부재는 고무 시트재료의 디스크이고, 상기 시일부재는 견고한 링에 접착된 상기 디스크의 림부인 조립체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 견고한 링은 스테인레스강재의 링으로 제조된 조립체.
  26. 제24항에 있어서, 상기 견고한 링은 상기 커버 부재의 상기 림부에 접착된 평평한 베이스 (base) 부분을 지니는 조립체.
  27. 상기 클립수단과 상기 유리 슬라이드 사이에 고정시키기에 적합하고, 상기 링의 최소한 한부분을 덮는 크로스 비임 부재를 더 포함하는 제 26 항에 따른 조립체.
  28. 제18항에 있어서, 상기 클립수단은, 상기 슬라이드에 상기 커버부재를 고정하도록 치수된 한쌍의 이격된 대향면을 지니는 일반 U 형태의 시트 메탈 클립인 조립체.
  29. 제27항에 있어서, 상기 클립수단은 그사이에 상기 크로스 비임 부재 및 상기 슬라이드의 하나의 에지부분을 탄력있게 고정시키도록 치수된 한쌍의 이격된 대향면을 각각 지니는 한쌍의 일반 U 형태의 클립인 조립체.
  30. 제29항에 있어서, 상기 크로스 비임 부재는 링의 이격부와 계합하기위한 한쌍의 이격된 레일 및 상기 클립과 계합하기위한 상기 레일을 결합시키는 평평한 대향단부를 지니는 조립체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 각각의 단부는 경사면을 형성하도록 굽은 조립체.
  32. 제18항에 있어서, 상기 커버부재는 비침투성층 및 폴리메라아제 연쇄반응 시약에 대하여 비활성인 층을 포함하는 조립체.
  33. 슬라이드위에 장착된 샘플을 지니는 유리 현미경 슬라이드 ; 상기 샘플에 대한 시약 혼합물 ; 상기 슬라이드상의 상기 샘플 및 상기 시약 혼합물의 윗부분을 덮는 가요성 플라스틱 커버 ; 상기 커버와 상기 슬라이드사이의 상기 샘플 및 상기 혼합물을 보지하고 시일하도록 상기 슬라이드에 고정되고 상기 커버에 고정된 보지용 조립체 ; 및 온도 제어된 블록에 대하여 상기 현미경 슬라이드를 수용 및 지지하기에 적합한 온도 제어된 블록을 지녀, 상기 슬라이드상의 상기 샘플의 온도가 상기 온도제어된 블록의 온도와 같아지는 열순환기 ; 를 포함하는 샘플내에 포함된 핵산 시퀀스의 정상소재 PCR 증폭용 시스템.
  34. 제33항에 있어서, 상기 보지용 조립체는 가요성 커버부재, 환상 시일부재 및 상기 슬라이드에 상기 커버 및 시일부재를 제지가능하게 보지하기위한 최소한 하나의 클립수단을 포함하는 시스템.
  35. 제34항에 있어서, 상기 커버부재는 탄력있게 그리고 적절하게 오목한 형태를 갖는 시스템.
  36. 제35항에 있어서, 상기 커버 형태가 상기 시약 혼합물을 보지하기위한 상기 오목부내의 예정된 비체적을 한정하는 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 상기 커버부재는 고무 시트인 시스템.
  38. 제35항에 있어서, 상기 시일부재는 상기 커버부재의 림부 및 상기 림부에 고정된 견고한 환상시일링을 포함하는 시스템.
  39. 제35항에 있어서, 상기 시일부재는 상기 커버부재의 림부를 포함하는 시스템.
  40. 제38항에 있어서, 상기 림부가 상기 링에 접착된 시스템.
  41. 제40항에 있어서, 상기 링은 상기 림부에 접착된 평평한 베이스 부분을 지니는 시스템.
  42. 상기 클립 수단과 상기 유리 슬라이드 사이에 고정하기에 적합한 대향단부를 지니는, 상기 시일부재의 위로 연장하는 크로스 비임 부재를 더 포함하는 제34항에 따른 시스템.
  43. 제34항에 있어서, 상기 클립 수단은 상기 슬라이드에 상기 커버를 탄력있게 고정시키도록 치수된 한쌍의 이격된 대향면을 지니는 일반 U 형태의 클립인 시스템.
  44. 제42항에 있어서, 상기 클립수단은 상기 슬라이드의 에지부분에 상기 크로스 비임 부재의 상기 단부중 하나를 탄력있게 고정시키도록 치수된 한쌍의 이격된 대향면을 각각 지니는 한쌍의 일반 U 형태의 클립인 시스템.
  45. 제44항에 있어서, 상기 크로스 비임 부재는 상기 시일부재의 이격부를 계합시키기위한 상기 대향단부를 연결하는 한쌍의 이격된 평행한 레일을 지니는 시스템.
  46. 제45항에 있어서, 상기 클립의 쌍이 상기 단부 및 상기 슬라이드의 상기 에지부분이 설치될때, 상기 각각의 단부가 상기 클립과 계합하는 경사면을 형성하도록 굽어, 상기 크로스 비임 부재가 상기 슬라이드에 대하여 상기 크로스 비임 부재 아래에 설치된 상기 시일부재를 점진적으로 압축하는 시스템.
  47. 제44항에 있어서, 상기 블록은 상기 슬라이드, 커버, 및 보지용 조립체의 최소한 하나를 각각 수용하는 다수의 수직 슬롯 (slot) 을 지니는 금속체이며, 상기 슬롯은 그들사이에 격벽을 형성하며, 각각의 격벽은 평평한 열교환면 및 상기 열교환면내에 상기 클립을 수용하기위한 한쌍의 이격된 수평홈을지녀, 상기 슬롯내의 상기 슬라이드의 한면이 상기 열교환면을 향하여 배치될수있는 시스템.
  48. 열순환중 상기 슬라이드중 최소한 하나를 지지하기위하여 상기 블록상에 제거가능하게 장착된 평평한 어댑터 플레이트 (adapter plate) 를 더 포함하는 제33항에 따른 시스템.
  49. 제48항에 있어서, 상기 어댑터 플레이트는 한 표면내에 다수의 홈을 지니는 시스템.
  50. 열순환기 블록상의 최소한 하나의 유리 슬라이드 장착용 어댑터 플레이트에 있어서, 상기 슬라이드는 다수의 에지 및 상기 에지상의 한쌍의 클립에 의해 상기 슬라이드상에 고정된 샘플 보지용 조립체를 지니며, 상기 어댑터 플레이트는 상기 블록과 최소한 하나의 평평한 슬라이드 수용부를 지니는 상부 표면을 합치시키기위한 평탄한 하부표면을 지니는 어댑터 플레이트.
  51. 제50항에 있어서, 슬라이드 수용부는 상기 슬라이드의 에지위에 설치된 상기 클립의 쌍을 수용하기위한 최소한 한쌍의 오목부를 지니는 어댑터 플레이트.
  52. 제50항에 있어서, 상기 플레이트는 평평한 금속체인 어댑터 플레이트.
  53. 제52항에 있어서, 상기 플레이트는 알루미늄으로 제조된 어댑터 플레이트.
  54. 제51항에 있어서, 상기 오목부는 평평한 바닥 홈인 플레이트.
  55. 유리 슬라이드상에 정상소재 PCR 샘플 및 시약액 포함 시스템 조립체를 위한 장치에 있어서, 상기 포함 시스템은 커버부재 및 보지용 조립체를 포함하며, 상기 장치는 베이스 ; 예정된 공간 관계에 있어서, 상기 보지용 조립체의 요소를 수용하고 지지하기위한 일반 수평상부표면을 지니는, 상기 베이스에 장착된 지지기둥 ; 및 상기 기둥의 상부표면위의 위치와 유리 슬라이드 지지 플래튼의 부분이 상기 기둥의 상기 상부표면에 인접한 위치사이에서 이동가능한 수직이동가능한 유리 슬라이드 플래튼 ; 을 포함하는 장치.
  56. 상기 커버부재 및 상기 커버부재 조립전에 놓인 상기 시약액을 가열하기 위한 상기 기둥에 연결된 가열수단 및 상기 유리 슬라이드에 대한 보지용 조립체를 더 포함하는 제55항에 따른 장치.
  57. 제56항에 있어서, 상기 가열수단은 상기 커버부재 및 상기 시약액을 가열하기위한 상기 가열수단으로부터 가열된 공기의 통로를 조작하기위해 상기 기둥을 관통하는 구멍을 포함하는 장치.
  58. 제57항에 있어서, 상기 기둥은 상기 구멍의 내측으로 돌출하는 다수의 핀 (fin) 을지녀 상기 기둥과 상기 구멍을 통과하는 공기사이의 열전달을 향상시키는 장치.
  59. 유리 슬라이드상에 정상소재 PCR 샘플 및 시약액 포함 시스템 조립체를 위한 장치에 있어서, 상기 포함 시스템은 커버부재 및 보지용 조립체를 포함하며, 상기 장치는 베이스 ; 예정된 공간 관계에 있어서, 상기 보지용 조립체의 요소를 수용하고 지지하기위한 일반 수평상부표면을 지니는, 상기 베이스에 장착된 지지기둥 ; 상기 기둥의 상부표면위의 위치와 유리 슬라이드 지지 플래튼의 부분이 상기 기둥의 상기 상부표면에 인접한 위치사이에서 이동가능한 수직이동가능한 유리 슬라이드 플래튼 ; 상기 기둥으로부터 이격된 위치에서, 상기 베이스로부터 이동가능하게 장착되고, 상기 슬라이드가 상기 보지용 조립체와 계합될때까지 상기 지지 플래튼내에 위치한 유리 슬라이드와 계합하도록, 그리고 상기 플래튼 및 슬라이드를 낮추도록 조종할수있는, 가늘고긴 압축 아암 ; 및 서로를 향해 이동하도록 작동가능한 상기 기둥의 상기 수평 상부표면의 양 에지 근처 및 그 상부에 배치된 핑거부분들을 갖는 한쌍의 집게 (plier) 를 지니는, 상기 기둥에 피봇부착된 스프링 바이어스 보지용 조립체 설치장치 ; 를 포함하는 장치.
  60. 제59항에 있어서, 상기 설치장치는 각각의 상기 핑거부분으로부터 연장하는 핸들부분을 지니는, 상기 기둥에 피봇가능하게 장착된 각각의 상기 집게를 더 포함하는 장치.
  61. 제60항에 있어서, 상기 핸들부분이 상기 기둥의 두면중 최소한 한부분을 둘러싸는 장치.
  62. 제59항에 있어서, 상기 압축아암은 상기 지지기둥위에 정렬된 관통 구멍을 지니는 장치.
  63. 제62항에 있어서, 상기 아암은 상기 유리 슬라이드를 접촉시키기위해 상기 구멍주변에 쿠션재 패드 (cushioning pad) 를 지니는 장치.
  64. 가요성 커버부재, 상기 커버부재의 최소한 한부분 주변의 환상시일부재 및 상기 슬라이드에 대하여 상기 커버 및 시일부재를 제거가능하게 보지하기위한 최소한 하나의 클립수단을 포함하는 유리 슬라이드에 대하여 유체를 보지하기위한 보지용 조립체에 있어서, 상기 커버부재는 상기 커버부재의 상기 부분과 상기 커버부재의 중심부 사이에 환상 리지를 지니는 보지용 조립체.
  65. 크로스 비임 부재와 커버부재를 제거가능하게 함께 유지하기위한 상기 환상 리지를 수용하기에 적합한 관통구멍을 갖는 중심부를 지니는 크로스 비임 부재를 더 포함하는 제64항에 따른 조립체.
  66. 제65항에 있어서, 상기 크로스 비임 부재는 상기 중심부를 지니는 한쌍의 평행한 레일을 포함하는 조립체.
  67. 제66항에 있어서, 상기 시일부재는 상기 구멍 둘레에 그리고 상기 레일들사이에 평행한 환상 부분을 포함하는 조립체.
  68. 제67항에 있어서, 상기 크로스 비임 부재는 시트 메탈 69 로 제조된 조립체.
  69. 제67항에 있어서, 상기 크로스 비임 부재의 상기 중심부는 일반적으로 평평한 조립체.
  70. 제67항에 있어서, 상기 구멍 둘레의 상기 평평한 환상부분은 상기 크로스 비임 부재의 상기 중심부내의 환상 골 (annular trough) 의 부분인 조립체.
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