KR100274182B1

KR100274182B1 - 인간 인터류킨-3의 효모에서의 발현

Info

Publication number: KR100274182B1
Application number: KR1019930015349A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 김성택
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1993-08-07
Filing date: 1993-08-07
Publication date: 2000-12-15
Also published as: KR950005989A

Abstract

본 발명은 유전공학적인 방법에 의해 제조된 인간 인터류킨-3 유전자, 그를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 이용한 인터류킨-3 의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, IL-3 단백질의 아미노산 서열은 그대로 유지하면서 유전자의 대량 발현을 가능케 하는 코돈을 사용하여 설계된 인간 인터류킨-3 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질 전환된 효모 및 상기 효모를 배양함으로써 인간 인터류킨-3 을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

인간 인터류킨-3(human interleukin-3)의 효모에서의 발현

제1도는 IL-3 유전자의 5'-말단에 Xbal 제한효소 인지 부위를, 3'-말단에 종료코돈과 제한효소 Sall 인지부위를 갖도록 설계된 IL-3 유전자의 뉴클레오티드서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제2도는 전체 IL-3 유전자의 합성 올리고머 1,2,3,4,5,6,7,8,9 및 10 의 위 치 및 그 접합 순서를 나타낸 것이고

제3도는 IL-3 유전자의 M13 벡터로의 클로닝 및 효모발현벡터로의 클로닝을 도식화한 것이고

제4도는 본 발명의 IL-3 발현 벡터(pYLBC-A/G- αF-IL-3)를 함유하는 효모의 농축 배양액을 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

IL-3 은 133 개의 아미노산으로 구성된 혈구 성장인자이며 여러가지 활성을 나타내기 때문에 Multi-콜로니 자극인자(CSF)라고 한다, 콜로니 자극인자(Colony-Stimulating Factor, CSF)로는 생체내에서 해당 혈구 클론의 분화를 촉진하는 대식세포-CSF(Macrophage-CSF), 과립구-CSF(Granulocyte-CSF), GM(Granulocyte-Macrophage)-CSF 및 Multi-CSF 등 4 가지가 있는데 그 중에서 대식세포-CSF 는 섬유아세포(fibroblast)와 골수세포에서 생성되고, 과립구-CSF 는 활성화된 대식세포에 의해 생성되며, GM-CSF 는 지방 다당류(lipopolysaccharide, LPS) 또는 인터류킨-1 에 의해 자극된 대식세포나 활성화된 T 세포에 의해 만들어 지는 반면 Multi-CSF, 즉 IL-3 은 활성화된 헬퍼 T 세포에 의해 주로 만들어진다. 따라서, 대식세포-, 과립구- 및 GM-CSF 는 골수의 혈구생성에 관여하며 GM-CSF 와 IL-3 은 면역적 스트레스에 반응하여 혈구세포의 빠른 팽창에 중요한 역할을 한다.

원래 IL-3 은 설치류의 누드 마우스(nude mouse)의 임파구에서 20a-스테로이드 탈수소효소의 합성을 유도하는 것으로 확인되었지만(Ihle, J. N. et at., J. Immunol. 126, 2184(1981)) 그 다음 연구 과정에서 GM-CSF 와 같은 광역의 활성을 보임이 밝혀졌고 가장 시원적이지는 않지만 상당히 근원적인 광역의 혈구촉진 인자임을 알 수 있었다(Ihle, J. N. et at., J. Immunol. 131, 282-287(1983)). 이후 칼란드(Kalland)등에 의해 IL-3 이 설치류의 골수에서 내츄럴 킬러(natural killer, NK)세포에 음성 조절 기작을 갖고 있음이 밝혀졌다(J. Immunol. 137, 2268 (1986), J. Immunol. 137, 1671 (1986)).

또한 킨들러(Kindler)등은 GM-CSF 와 IL-3 이 암질환 동물의 치료에 효과가 있고 IL-3 이 방사선이 과조사된 생쥐에서 혈구의 생성을 자극하는 효과가 있음을 보임으로써(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 1001-1005 (1986)), IL-3 은 연구 차원으로 뿐만아니라 치료제 차원으로도 그 중요성이 부각되었다.

1984 년 펑(Fung)등 (Nature 307, 233-237 (1984))에 의해 설치류의 cDNA 가 밝혀진 이래로 여러 그룹에서 인간의 IL-3 cDNA 를 클로닝 하고 발현시켰는데 특히 1987년 다께시 오쯔까(Takeshi Otsuka)등은 인간 T 세포로 부터 IL-3 cDNA 를 클로닝한 후 효모의 알파인자를 이용하여 IL-3의 발현 및 세포외 분비를 이루었고, IL-3 의 글리코실화(glycosylation)가 활성에 중요함을 밝혔다(J, of Immunology 140, 2288-2295 (1988)). 하지만 인간 IL-3 cDNA 는 인간 T 세포에 적합한 핵산 코오돈으로 구성되어 있어 실제로 효모에서의 대량 발현에는 한계가 있었다.

이에 본 발명자들은 인간 IL-3 의 효모내 대량발현 및 세포외 분비를 목적으로 기존의 공지된 아미노산 서열의 변화없이 인간 IL-3 유전자의 코오돈을 효모에서 사용빈도가 높은 코오돈(Bennetzen, J. M. ＆ Hall, B. D., J. Biol. Chem. 257, 3026(1982))으로 변화시킴과 동시에 DNA 의 전사시 생성될 수 있는 mRNA 의 2 차 구조를 최소화 시키고 5'-말단에 Xbal 및 3' - 말단에 Sall 제한효소 인지 부위를 갖도록 하여 유전자 조작이 용이하도록 고안된 IL-3 유전자를 제작하였다.

또한, 올리고 뉴클레오타이드 화학합성 및 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, Saiki et al., Science, 230, 1350 (1985))을 이용하여 상기 IL-3 유전자를 합성한 뒤 M13 벡터(구입처: New England Biolabs, 32 Tozer Rd., Beverly, MA 01915-5510, U S.A.)에 클로닝 하였다, 서열분석(sequencing)에 의해 본 발명의 IL-3 를 포함하는 것으로 확인된 M13 벡터로 부터 IL-3 유전자를 효모발현 벡터에 옮겨 효모내에서 인간 IL-3 의 대량 생산을 유도할 수 있는 IL-3 효모발현 벡터를 제작하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 효모에서 사용 빈도가 높은 코오돈을 사용하여 제작된 인간 IL-3 유전자의 5'-말단에 Xbal 및 3'-말단에 Sall 제한 효소 인지 부위를 포함하는 신규한 인간 IL-3 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 신규한 인간 IL-3 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기의 형질전환된 미생물을 배양하여 인간 IL-3 를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

IL-3 의 133 개 아미노산의 서열(Yu-Chung, Yang. et al., Cell 47, 3-10 (1986))을 이용하여 발현되는 단백질의 아미노산 서열은 변화시키지 않고 효모에서 통상적으로 사용되는 코돈을 기준으로 하되 효모가 유전자를 대량발현시킬때 사용하는 코돈(Bennetzen, J. M. ＆ Hall. B D., J. Biol. Chem. 257, 3026 (1982))을 선택하여 사용함으로써 IL-3 유전자가 대량 발현되도록 설계한다(제 1 도), 상기의 염기서열을 갖는 IL-3 유전자를 발현 벡터에 용이하게 클로닝시키기 위해 효모의 교배(mating)에 관여하는 알파-인자의 리더 서열(leader sequence)의 카복시 말단에 있는 Xbal 제한효소 인지 부위를 포함하는 13 개의 염기를 IL-3 유전자의 5'-말단에 연결하고, 3'-말단에는 2 개의 종료코돈과 Sall 제한효소 인지 부위를 포함하는 11 개의 염기를 붙여서 신규한 염기 서열을 갖는 IL-3 유전자를 완성하였다(제 2 도).

IL-3 전체 유전자를 합성하기 위하여 15 개의 염기가 서로 상보적인 윗가닥 5 개, 아랫가닥 5 개의 올리고뉴클레오티드를 고안하여 핵산 합성기로 합성하였다(제 2 도 참조). 상기에서 얻은 단일가닥 올리고머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였고, 그 결과로 생긴 434 염기쌍의 핵산을 전기영동을 통해 확인하였다. 상기의 434 염기쌍의 IL-3 핵산을 Xbal/Sall 제한효소로 절단하여 419 염기쌍의 핵산절편을 전기영동 젤로 부터 핵산 추출 방법으로 분리한 후, 이를 Xbal/sall 제한 효소로 절단된 M13 벡터에 클로닝하여 대장균 세포를 형질전환시킨다. M13 벡터의 헥산을 디데옥시 핵산 서열분석 방법으로 염기서열을 확인하여 제 2 도의 서열을 포함한 M13 벡터를 선별한다. 이 선별된 벡터를 제한효소 Xbal/Sall 로 절단하여 IL-3 유전자를 얻은 다음 본 출원인이 선출원한 인간 인슐린 유사성 장인자(IGF-I)" 의 발현 벡터 pYLBC-A/G- αF-IGF-I (대한민국 특허출원 제 90-22193 호, 공고번호 제 92-8376 호)에서 IGF-I 유전자 대신 IL-3 유전자를 치환하여 발현벡터 pYLBC-A/G- αF-IL-3 을 제작한다. 상기 발현벡터로 형질전환된 효모를 배양하여 IL-3 이 배양액으로 분비된 것을 SDS-폴리아크릴아미드젤에서 확인하였다.

본 발명의 IL-3 유전자를 함유하는 효모 발현 벡터는 pYLBC-A/G-αF-IL-3 로 명명되었으며, 이로 형질전환시킨 사카로 마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) DCO4 는 1992년 12월 30일자로 한국 균주 보존센터에 기탁번호 KCTC O071BP 로 기탁되었다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하지만, 이로써 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

인간 인터류킨-3 유전자의 합성

[단계 1]

인간 인터류킨-3 유전자의 염기서열 설계

기존의 공지된 IL-3 의 133 개 아미노산의 서열(Yu-Chung, Yang. et al., Cell 47, 3-10, (1986))을 이용하여 IL-3 단백질의 아미노산 서열은 변화시키지 않으면서, 효모내에서 통상적으로 많이 사용되는 코돈을 기준으로 하되 효모가 유전자를 대량 발현할 때 사용하는 코돈(Bennetzen, J. M. ＆ Hall, B. D., J. Biol. Chem. 257, 3026 (1982))을 선택하여 사용함으로써 효모내에서 대량발현될 수 있는 인간 IL-3 유전자의 염기서열을 설계하였다(제 1 도).

상기 염기서열을 갖는 IL-3 유전자를 발현벡터에 용이하게 클로닝시키고 발현 단백질을 세포밖으로 분비시키기 위해 효모의 교배(mating)에 관여하는 알파인자의 리더 서열(leader sequence)의 아미노 말단에 있는 Xbal 제한 효소 인지 부위를 포함하는 13 개의 염기를 IL-3 유전자의 5'-말단에 도입하고 3'-말단에는 2 개의 종료코돈과 Sall 제한효소 인지 부위를 포함하는 11 개의 염기를 도입하여 신규한 염기 서열을 갖는 IL-3 유전자를 완성하였다(제 2 도).

[단계 2]

올리고머의 합성

IL-3 전체 유전자를 경제적으로 합성하기 위하여 18 개의 염기가 서로 상보적인 윗가닥 5 개, 아랫가닥 5 개의 올리고 뉴클레오티드를 고안하였다(제 2 도). 이 올리고머는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid phase phosphoamidite chemis-try)를 이용하여 DNA 합성기(Applied Biosystem 380B, U.S.A)로 합성한 후 변성 폴리아크릴아미드젤(2M 우레아, 12% 아크릴 아미드: 비스(29:1 w/w), 50mM 트리스, 50nM 붕산, 1mM EDTA)을 이용한 전기영동으로 분리하였다. 전기영동 젤을 추출 완충용액(0.5M 염화나트륨, 0.1M 트리스, pH 8.0, 50mM EDTA)중에 37℃에서 12 시간동안 보관하여 젤로 부터 올리고머를 추출하였다. 다음으로 추출된 올리고머를 C_{1 8}컬럼인 SEP-PAK(Waters, U.S.A.)에 부착시킨 후 50% 의 아세토니트릴로 용출시켜 순수 정제하였고, 260nm 에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다. 올리고머를 진공건조 시켜서 흡광도 5 를 기준으로 증류수에 녹여 영하 20℃ 에 보관하였다.

[단계 3]

중합효소 연쇄 반응에 의한 이중나선의 IL-3 전체 DNA 의 합성

IL-3 전체 DNA 를 중합효소 연쇄반응으로 얻기 위해서 먼저 올리고머들을 3 부분(제 2 도, 올리고머 1-4, 올리고머 5-8, 올리고머 9-10)으로 나누어서 반응시켰다.

10 ㎕ 의 1OX Taq 중합효소 완충용액 (100mM 트리스 pH 8.3, 500mM 염화칼륨, 15mM 염화마그네슘, 0 1%(w/v) 젤라틴), 및 10 ㎕ 의 dNTP 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각각 1.25mM)에 주형으로서 올리고머 1-4 부분 합성의 경우는 5 ㎕ 의 올리고머 1 및 4 (각각 0.8 ㎍)와 100 배 희석한 올리고머 2 및 3 을 각각 1 ㎕(1.6ng)씩 넣었고, 올리고머 5-8 부분 합성의 경우는 5 ㎕ 의 올리고머 5 및 8(0.8 ㎍)과 100 배 희석한 올리고머 6 및 7 을 각각 1 ㎍(1.6ng)씩 넣었으며, 올리고머 9-10 부분 합성의 경우는 5 ㎍ 의 올리고머 9 및 10(0.8 ㎍)을 넣었다. 그 다음 각각의 부분합성 반응에 67 ㎍ 의 증류수와 0.5 ㎍ (5 단위/㎕)의 Ampli Taq 중합효소(Perkin Elmer-Cetus U.S.A)를 넣고 온도순환기

(Perkin Elmer Cetus U.S.A)를 이용하여 95 ℃에서 30 초, 45 ℃ 에서 30 초, 72 ℃ 에서 1 분간의 순판을 25 회 반복하고 마지막으로 72 ℃ 에서 10 분간 추가 반응시키는 순환프로그램으로 반응시켰다.

폴리아크릴아미드젤 전기영동을 통해 올리고머 1-4 (199 염기쌍), 올리고머 5-8 (197 염기쌍) 및 올리고머 9-10 (75 염기쌍)의 DNA 가 합성된 것을 확인한 후 각각의 젤을 잘라낸 다음 전기용출(electroelution)하여 각 부분합성 DNA 를 얻고 이를 전체 IL-3 DNA 합성을 위한 중합효소 연쇄 반응에 사용하였다.

10 ㎕ 의 1OX Taq 중합효소 완충용액(상기와 동일) 및 10 ㎕ 의 dNTP 혼합액 (상기와 동일)에 주형으로서 5 ㎕ 의 올리고머 1 및 10(각각 0.8 ㎍)과 부분 합성 DNA(올리고머 1-4, 5-8 및 9-10)를 희석하여 각각 1 ㎍ (1.6ng)씩 넣고, 67 ㎍ 의 증류수와 0.5 ㎍ (5 단위/ ㎍) 의 Ampli Taq DNA 중합효소를 넣고 잘 혼합시킨 다음 온도 순환기에서 IL-3 부분 합성 반응의 경우 같은 순환프로그램으로 반응시킴으로써 전체 IL-4 DNA 합성 반응을 수행하였다. 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동을 통해 434 염기쌍의 DNA 가 합성된 것을 확인한 후 반응액에 남아있는 중합효소를 제거하기 위해 반응액에 동일부피의 페놀/클로로포름을 넣고 잘 섞은 후 원심 분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옳기고 1/10 부피의 3N 아세트산 나트륨(pH 4.5)과 2 배 부피의 100% 에탄올을 넣고 섞은 후 원심분리하여 DNA 침전물을 얻었다. 침전된 DNA 를 건조시킨 후 TE 완충용액(10mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA) 20 ㎕ 에 용해 시켜 M13 벡터로의 클로닝에 이용하였다.

[실시예 2]

합성된 IL-3 유전자의 M13 벡터로의 클로닝 및 염기서열 확인

상기 실시예 1 의 단계 3 에서 얻은 TE 완충용액에 용해된 IL-3 DNA 의 용액 10 ㎕ 에 2 ㎕ 의 1Ox 완충용액 (10mM 트리스 pH 7.9, 10mM 염화마그네슘, 5OmM 염화나트륨, 10mM 디티오트 레이톨(DTT)), 7 ㎕ 의 증류수 및 1 ㎕ 의 Xbal 제한효소(20 단위/㎕, new England Biolabs., U.S.A)를 처리하고 37 ℃ 에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 여기에 다시 3 ㎕ 의 1Ox 완충용액 (50mM 트리스 pH 7.9, 10mM 염화마그네슘, 100mM 염화나트륨, 1mM DTT), 6 ㎕ 의 증류수 및 1 ㎕ 의 Sall 제한효소(15 단위/1㎕, New England Blolabs U.S.A)를 추가하고 37 ℃ 에서 1 시간동안 반응시켰다.

5% 아크릴아미드 젤에서 전기영동하여 용출된 IL-3 DNA 용액으로부터 Elutip-D(Schleicher ＆ Schuell, U.S.A.)를 이용하여 419 염기쌍의 DNA 절편을 순수 정제하였다. 정제된 DNA 절편을 10 ㎕ 의 증류수에 용해시켜 접합 반응(ligation)에 이용하였다. 위의 반응조건과 동일한 방법으로 M13 RFDNA 를 Xbal, Sall 제한 효소로 절단하고 큰 핵산절편을 순수분리하였다. 2 ㎕ 의 1Ox 접 합 완충용액(660mM 트리스 pH 7.6, 66mM 염화마그네슘, 100mM DTT), 2 ㎕ 의 10mM ATP, 2 ㎕ 의 IL-3 DNA 절편(0.2㎍), 1 ㎕ 의 Xbal, Sall 으로 절단된 M13 벡터 DNA(약 0.1 ㎍), 12 ㎕ 의 증류수 및 1 ㎕ 의 T4 DNA 접합효소(T4 DNA ligase, 1 단위/㎕, United States Biochemicals, U.S.A.)를 14 ℃ 에서 1 시간 정도 반응시켜 IL-3 의 419 염기쌍 DNA 와 M13 벡터 DNA 를 접합시켰다. 반응액 중 10 ㎕ 를 사용하여 대장균 JM 105 (ATCC 47016) 세포를 하나한(Hanahan)의 방법 (J. Mol. Biol. 116, 557 (1983))으로 형질전환시켰다(제 3 도).

형질 전환된 세포에 8 ㎕ 의 0 2M IPTG 용액을 넣고 미리 배양된 헬프 세포(Help Cell, E. coli JM 105) 100 ㎕, 3㎖ 의 2XYT 상층아가(Soft Agar, 1 ℓ당 16g 의 박토트립톤, 10g 의 효모추출물, 5g 의 염화나트륨, 5g 의 박토아)와 25 ㎕ 의 4% X-gal 용액을 혼합시킨 후 Min A 평판(1 ℓ당 10.5g 의 K₂HPO₄, 1g 의 (NH₃)₂S0₄, 0.5g 의 시트르산나트륨, 12g 의 박토아가, 1㎖ 의 20% MgSO₄, 0.5㎖ 의 1% vit B(), 10㎖ 의 50% 포도당)위에 고르게 도말하였다. 37 ℃ 의 배양기에서 12 시간 동안 배양하여 생성된 투명한 프라크(plaque)를 이쑤시개로 찍어서 2㎖ 의 2XYT 액체배지로 옮기고 이를 37℃ 로 5 시간 정도 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 상층액을 취한 후 1/4 부피의 20% PEG(폴리에틸렌글리콜) 및 2.5M 의 염화나트륨을 넣은 다음 M13 파아지를 수거하였다. 페놀/클로로포름(1:1 혼합액) 추출 방법으로 단일가닥 핵산을 추출한 후 서열분석효소(Sequenase, United States Biochemicals, U.S.A)를 이용한 디데옥시 DNA 서열분석방법(Tabor S, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767 (1987))으로 IL-3 의 염기서열을 확인하었고 제 2 도와 같이 설계한 염기서열의 유전자를 갖는 벡터 DNA 를 선별하였다. 상기 벡터 를 M13 rt2E-IL-3 로 명명하였다.

[실시예 3]

인간 인터류킨-3 의 효모에서의 발현

[단계 1]

M13 벡터로 부터 IL-3 의 효모 발현 벡터(pYLBC-A/G- αF-IL-3) 로 의 클로닝

상기 실시예 2 에서 얻은 벡터 M13 rt2 IL-3 을 제한효소 Xbal, Sall 으로 절단하여 알파인자의 카복시 말단 13 염기쌍이 IL-3 DNA 에 붙어 있는 419 염기쌍의 DNA절편을 전기 영동 젤로 부터 DNA 추출 방법으로 순수 분리하였다. 그리고 본출원인이 선출원한 인간 인슐린 유사 성장인자-I(IGF-I)의 발현벡터 pYLBC-A/G- αF-10F-I (대한민국 특허출원 제 90-22193 호, 특허공고 제 92-8376 호)를 Pst1, Sall 제한효소로 절단하여 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)의 종료 서열을 갖고 있는 9750 염기쌍의 DNA 절편을 얻고, 이 절편을 다시 Pst1, Xbal 제한 효소로 절단하여 ADH2/GAPDH 혼성 프로모터 서열과 알파인자 서열을 갖고 있는 4330 염기쌍의 DNA 절편을 얻은 후 이를 상기에서 얻은 419 염기쌍의 DNA 절편 (IL-3 의 Xbal -Sall 절편)과 동일 몰 비율로 10 배 농도의 2 ㎕ 의 접합 완충액(600mM 트리스-Cl pH 7.5, 10mM DTT, 100mM MgCl₂), 2 ㎕ 의 10mM ATP, 1 단위의 T4 DNA 접합효소(USB, U.S A.) 및 20 ㎕ 의 증류수와 혼합하여 14 ℃ 에서 2 시간 이상 반응시켰다. 그 후 이 접합 반응액을 대장균 HB 101(ATCC 33694) 컴피 턴트(competent)세포에 첨가하여 하나한(Hanahan)의 방법(J. Mol. Biol., 116, 557 (1983))에 따라 형질 전환 시킨 후 임피실린 함유 평판에서 선별하여 알파-인자 리더 서열과 IL-3 유전자가 연결된 발현 벡터(pYLBC-A/G-αF-IL-3)를 제조하였다.

[단계 2]

발현 벡터를 사용한 효모의 형질 전환 및 SDS-폴리아크릴 아미드 젤 전기 영동에 의한 발현 확인

효모균주 사카로마이세스 세레비지애 DCO4(Yeast Genetic Stock Center, University of California, Berkeley, CA, U.S.A.)를 힌넨(Hinnen)의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1929 (1978))에 따라 자이몰라제를 이용하여 스피로플라스트(spheroplast) 로 만든 후 단계 1 의 발현 벡터(pYLBC-A/G-αF-IL-3)로 형질 전환시키고 루이신 결핍 아가평판(6.7g 의 아미노산 결핍 효모 질소 기질, 182g 의 솔비톨, 2% 의 글루코스, 0.25% 의 루이신-보충물, 20g 의 박토아가)에 도말한 후 30 ℃ 에서 3 일간 배양하였다. 배양액의 최종 흡광도는 OD650 에서 25 정도였다. OD650 에서 10 에 해당하는 양의 배양액을 원심분리하여 상층액과 침전물을 별도로 회수한 후 다음 실험에 각각 이용하였다.

상층액에 5 배 농도의 단백질 침전용액(50% 의 트리클로로아세트산, 2% 의 데옥시콜레이트) 250 ㎕ 를 넣어주고, 10 분간 얼음 수조에 방치하였다. 상기 용액을 14,000rpm 에서 원심 분리하여 얻은 침전물을 1 ㎖ 의 아세톤으로 세척한 후 다시 원심 분리하였다. 아세톤으로 2 회 세척한 후 얻은 단백질 침전물을 20㎖ 의 TE(10mM 트리스-Cl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용해시키고 3 배 농도의 10 ㎕ 의 램리 시료 완충 용액(Laemmli Sample Buffer, Laemmli, D.K. Nature 227, 680 (1970))을 넣고 100℃ 에서 3 분간 끓인 다음 15% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 전기 영동시켰다.

한편, 상기 배양액을 원심 분리하여 얻은 침전물을 400 ㎕ 의 완충용액 (10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닌, 플루오라이드, 8M 우레 아)에 용존시키고, 직경 0.4nm 의 유리구슬을 같은 부피로 첨가하고 강하게 진탕시킴으로써 세포벽을 파괴하여 효모 추출물을 얻은 후, 상기와 같이 램리의 방법에 따라 전기 영동시켰다. 젤은 쿠마시블루(Coomassie brilliant blue R25O)로 염색하여 IL-3 의 발현을 확인하였다.

그 결과는 제 4 도에 나타내었다. 제 4 도에서 제 1,2,3,4 열은 pYLBC-A/G- αF-IL-3 을 함유한 효모를 24 시간 동안 배양한 후 채취한 배양 상층액, 제 5 열은 pYLBC-A/G-αF-IL-3 을 함유하지 않은 효모를 24 시간 동안 배양한 후 채취한 배양 상층액, 제 6,7,8,9 열은 pYLBC-A/G-αF-IL-3 을 함유한 효모를 48 시간 동안 배양한 후 채취한 배양 상층액, 제 10 열은 pYLBC-A/G-αF-IL-3 을 함유하지 않은 효모를 48 시간 동안 배양한 후 채취한 배양 상층액, 제 11, 12, 13, 14 열은 pYLBC-A/G-αF-IL-3 을 함유한 효모를 24 시간 동안 배양한 후 얻은 효모 추출물, 제 15 열은 pYLBC-A/G-αF-IL-3 을 함유하지 않은 효모를 24 시간 동안 배양한 후 얻은 효모추출물, 제 16, 17 열은 pYLBC-A/G-αF-IL-3 을 함유한 효모를 48 시간 동안 배양한 후 얻은 효모추출물, 제 18 열은 pYLBC-A/G-αF-IL-3 을 함유하지 않은 효모를 48 시간 동안 배양한 후 얻은 효모추출물을 각각 나타내고, MK 열은 단백질 표준분자량으로서 위로부터 43, 29, 18, 14, 7.5 및 3.5 킬로 달톤을 나타낸다.

제 4 도의 결과로 부터 본 발명의 발현벡터를 함유한 효모가 인간 IL-3 을 고도로 발현 및 분비함을 알 수 있다. 발현벡터 pYLBC-A/G-αF-IL-3 을 함유한 효모의 배양액인 제 1 내지 4 열 및 제 6 내지 9 열의 14K 바로 위의 밴드는 글리코실화되지 않은 IL-3 을, 18K 바로 위의 밴드는 글리코실화된 IL-3 을 나타낸다.

Claims

5' 말단에 Xbal 제한 효소 인지부위를 포함하고 3'-말단에 Sall 제한 효소 인지부위를 포함하는, 인간 인터류킨 3- 을 코딩하는 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
제1항의 DNA 를 포함하는 발현벡터.
제2항에 있어서, pYLBC-A/G-αF-IL-3 인 발현벡터.
제2항의 발현벡터로 형질전환된 효모.
제4항에 있어서, 발현벡터 pYLBC-A/G-αF-IL-3 으로 형질전환된 효모(KCTC 0071BP)
제4항 또는 5항의 효모를 배양함을 포함하는, 인간 인터류킨-3의 생산방법.