KR100264340B1

KR100264340B1 - 항균성 폴리펩타이드

Info

Publication number: KR100264340B1
Application number: KR1019930010665A
Authority: KR
Inventors: 이복률
Original assignee: 허일섭; 주식회사녹십자
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 2000-08-16
Also published as: KR950000876A

Abstract

본 발명은 항균성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 항균활성을 갖는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드(테네신 1)는 바실러스, 스타필로코커스, 마이크로코커스, 코리네박테리움 및 마이코박테리움 속(genus) 등의 균에 대하여 우수한 항균활성을 가지는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 항균활성을 가지는 물질로서 의약 및 생활용품의 첨가제로 개발될 수 있을 것이다.

Description

항균성 폴리펩타이드

제1도는 총 세포 RNA를 나타내는 전기영동 사진이다.

제2도는 테네신 1의 cDNA 라이브러리 합성결과를 나타내는 사진이다.

제3도는 테네신 1의 유전자를 포함하는 플라스미드의 아가로즈 겔 전기 영동 사진이다.

제4도는 테네신 1의 cDNA 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타내는 것이다.

본 발명은 항균성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 항균활성을 갖는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것이다.

일반적으로 열악한 환경조건에서 서식하는 많은 곤충들이 개체를 방어하기 위하여는 외부에서 이물질이 도입되거나, 병원성균이 침입하거나 상처를 입을때 자신을 방어하기 위하여 생체방어 물질을 분비하는 것으로 알려져 있다[참조: Ann. Rev. Microbiol., 41:103-26 (1987)]. 이러한 항생물질로서는 개구리의 표피에서의 항균성 폴리펩타이드인 마게이닌(magainin) 외에도 세크로핀, 사르코톡신 등 항균작용이 있는 다수의 폴리펩타이드(Biochemical Pharmacology, No. 4, 39:625-629 (1990)) 및 사코파가 페레그리나(Sarcophaga peregrina)의 배 (embryo)로부터 확립된 세포주로부터 분리된 항바이러스성 폴리펩타이드(미국특허 제5008371호) 등이 보고되고 있다.

한편, 본 발명의 발명자는 탁정벌레 갈색거저리(Tenebrio molitor)의 유충에 외부에서 이물질이 주입될 때 체액으로 분비되는 항생활성을 가지는 폴리펩타이드를 분리, 정제하여 아미노산 서열을 확인한 결과, 신규한 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 폴리펩타이드는 열에 안정하고, 특히 그램양성(Gram-positive)균에 탁월한 항균성을 가지고 있으며, 베로 세포(Vero cell)에 대하여 세포독성이 거의 없는 것으로 확인되었다.

본 발명의 항균성 폴리펩타이드 아미노산 서열은 아래와 같다:

(상기 아미노산 서열에 대한 약자는 IUB의 규정에 따라 작성된 것이다)

본 발명에 의한 신규 폴리펩타이드는 자연산 또는 배양한 갈색거저리의 유충에 대장균(E. coli) K12를 주사한 후 채취한 체액으로부터 분리,정제하였으며, 본 발명에서는 ‘테네신(Tenecin) 1’,으로 명명되었다.

본 발명의 신규 폴리펩타이드는 통상적으로 갈색거저리의 유충으로부터 분리, 정제하거나, 펩타이드 합성기를 이용하여 합성될 수 있으며(J. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963); Nature, 310:105-111 (1984)), 후술하는 유전자 재조합방법에 의하여 적당한 숙주로부터 발현시켜 제조할 수도 있다.

유전자 재조합 방법에 의한 제조를 위하여, 본 발명자는 당업계의 통상의 방법으로 cDNA를 클로닝하였다. 이 cDNA를 클로닝한 후 적당한 플라스미드 또는 벡터에 서브클로닝하여 대장균, 효모 및 동물세포 등의 숙주세포에 형질전환하여 발현시키면, 유전자 재조합 방법에 의해 테네신 1의 제조가 가능하다.

cDNA의 염기서열은 아래와 같다:

본 발명에 의한 신규 폴리펩타이드는 세균, 진균 및 바이러스에 대하여 탁월한 항균활성을 나타내었는데, 분리한 폴리펩타이드계 생물학적 활성물질의 활성도는 세균에 대하여 최저 억제 농도(MIC)를 측정하여 확인하였으며, 또한 이 폴리펩타이드를 50, 25, 12.5, …, 0.78ug/ml까지 희석하여 베로 세포와 혼합하여 3일간 배양한 후, 트리판 블루(trypan blue)로 염색하여 대조군의 세포와 비교한 결과 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 폴리펩타이드는 사람 또는 그 외의 동물에 바람직하게 사용되어질 수 있다. 항균효과를 나타낼 수 있는 충분한 양의 유효 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 비독성 완충용액 또는 생리식염수 등과 같은 비독성 약리학적 기초제 및 담체 등과 조합하여 다양한 조성물의 형태로 사용되어질 수 있으며, 그 대표적인 투여형태로서는 액체, 고체, 연고제, 주사용제, 정제, 로션제 및 캠슐제 등 경구 또는 비경구로 어느 것이나 사용되어 질 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

이들 실시예는 본 발명을 오로지 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[폴리펩타이드의 분리 정제]

자연산 또는 배양한 갈색거저리(Tenebrio molitor)의 유충 4,000 내지 5,000마리에 대장균(E. coli) K12(10³내지 10⁴세포)를 마이크로시린지(microsyringe)로 취하여 주사하고, 24시간 방치하고 유충으로부터 체액 및 체세포를 채취하였다. 이 액을 4℃에서 15,000rmp으로 원심분리하여 체액만을 신속히 분리하고 사용전까지 -80℃에서 보관하였다. 이들 조추출한 체액은 실시예 4에 개시된 콜로니계수법으로 항균력을 측정하여 항균력이 있는 체액에 대하여만 분리, 정제에 사용하였다. 이렇게 채취한 체액 100ml를 아래 표 1과 같은 조성의 완충액 1(pH 6.0)에 10배 희석한 후 4℃에서 신속하게 여과하였다.

[표 1]

50ml씩 모은 플라스틱제 튜브를 100℃의 끓는 물속에서 15분간 열처리하여, 4℃에서 24시간동안 방치시키고 3,000rpm에서 원심분리하여 그 여액을 취하였다. 열처리한 여액을 1차 C₁₈역상 컬럼(TSK gel, ODS-120T, 0.5 ×30cm, Toyosoda, JAPAN)에 로딩한 후 직선구배 시스템(A: 5% CH₃CN in 0.05% TFA; B: 45% CH₃CN in 0.05% TFA)으로 용출하여 각 분획에 대하여 280nm에서 흡광도를 측정하고, 항균력을 측정하였다. 이렇게 얻어진 폴리펩타이드를 2차 C₁₈역상 컬럼으로 상기와 동일한 조건으로 처리하였다.

그 후, C₁₈역상 컬럼(TSK gel, ODS-120T, 0.5 ×30cm, Toyosoda, JAPAN)에 직선구배 (유속: 1ml/분, A: 5% CHCN₃in 0.05% TFA; B: 90% CHCN₃in 0.05% TFA)로 항균활성이 있는 활성분획만을 취하였다. 이와 같이 얻은 항균성 폴리펩타이드 분획을 더욱 순수하게 분리, 정제하기 위하여 겔여과 컬럼(TSK gel, G3000SW, 1 ×30cm, Toyosoda, JAPAN)에 아이소크래틱 시스템(isocratic system, 유속: 0.5ml/분, 30% CH₃CN in 0.05% TFA)으로 폴리펩타이드를 분리, 정제하였다.

[실시예 2]

[아미노산 서열의 결정]

실시예 1에서 단일 물질로 동정된 항균성 폴리펩타이드의 부분 아미노산을 결정하기 위하여, 라이신 특이적 단백질 가수분해효소(lysyl specific endopeptidase, Sigma, U.S.A.)를 50mM-Tris HCl(pH 9.0) 용액중에 1nmol의 항균 단백질과 0.025ug/ul 농도가 되도록 전기 효소를 가하고 30℃에서 19시간 배양후 반응액을 C₁₈역상 컬럼(Synchrion Inc., Synchropack, 0.5 ×30cm)으로 직선구배 (A: 0% CH₃CN in 0.05% TFA; B: 100% CH₃CN in 0.05% TFA)로 단편화된 펩타이드를 분취하였다. 이렇게 얻은 펩타이드 단편을 동결건조시킨 후, 자동 아미노산 서열 분석기(Applied Biosystems, 470A, U.S.A.)로부터 아미노산 서열을 결정하고, ‘테네신(Tenecin) 1’이라고 명명하였다.

[실시예 3]

[cDNA 클로닝 및 DNA 염기배열 결정]

실시예 2에서 얻어진 테네신 1의 부분 아미노산 서열 중 Val-Glu-Ala-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-Asn-Asp-Ala 부분에 해당하는 DNA 탐침(probe)을 화학적으로 합성하고, 그들의 DNA 염기서열을 아래에 나타내었다:

Leu에 해당하는 코돈이 복잡하므로 상기에서 보는 바와 같이 두 종류의 DNA 탐침을 합성하여 사용시는 동일량을 혼합하여 클로닝에 사용하였다.

갈색거저리의 cDNA 라이브러리를 구축하기 위하여 갈색거저리의 유충으로부터 총 세포 RNA를 추출하였다. 그 순도를 확인한 결과를 제1도에 나타내고 있다. 제1도에서, 제1레인은 갈색거저리의 총 RNA를; 제2레인은 에리히 암세포의 총 RNA를 각각 나타낸다. 분해되지 않고 정제된 것이 예상되므로, 이들 총 RNA로부터 올리고(dT) 컬럼을 이용하여 mRNA를 분리 정제하여 정량한 후 ZAP-cDNA^TM(Stratagene, U.S.A.)을 사용하여 cDNA를 합성하였다.

합성된 cDNA을 크기 별로 세파크릴 컬럼으로 분획시킨 후, 알카리 아가로즈(alkaline agarose) 겔 전기영동으로 그 크기를 조사하였다. 그 결과를 제2도에 나타내었으며, 제1레인은 세파크릴 컬럼으로부터 가장 먼저 용출된 분자량이 큰 cDNA 분획; 제2레인은 중간에서 나온 분획; 제3레인은 가장 나중에 용출된 분자량이 작은 cDNA 분획을 각각 나타낸다. 단백질의 크기가 4kDa 정도이므로, 가장 길이가 짧은 분자량이 작은 cDNA(제3레인)를 포함하고 있는 부분을 Gigapack 11 packaging extract(Stratagene, U.S.A.)을 이용하여 갈색거저리의 유충의 cDNA 라이브러리를 구축하였다.

구축된 cDNA 라이브러리로 부터 테네신 1의 cDNA를 클로닝하기 위하여, cDNA 라이브러리로부터 50,000의 프라크(plaque)를 포함하는 파지를 대장균에 감염시켜 배양하였다. 그런다음, 생성된 프라크의 DNA를 나이론 막에 옮겨 고정시킨 후, 합성한 DNA 탐침을 Υ-³²P-아데노신트리포스페이트(ATP)를 이용하여 5′-말단을 인산화시켰다. 이어, 테네신 1의 유전자를 포함하는 프라크를 검출하여 DNA 탐침과 혼성화(hybridization)시키고 양성의 프라크로부터 플라스미드를 추출하여 아가로스 전기영동으로 그 크기를 확인하였다[참조: 제3도]. 제3도의 제1레인과 제6레인은 사이즈(size) 마커이고, 제2레인 내지 제4레인까지는 얻어진 플라스미드를 Eco R1 제한효소로 절단한 것을 나타내고, 제7레인 내지 제10레인까지는 Xho 1 제한효소로 절단한 것을 나타내고 있다. 얻어진 플라스미드의 DNA 염기서열을 결정하기 위하여, 생거(Sanger)의 디데옥시(dideoxy) 법으로 DNA 염기서열을 결정하였다[참조: Sanger, f. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74:5463-5467 (1977)]. 그 결과를 제4도에 나타내었으며, 테네신 1의 유전자는 전부 252개의 DNA 염기로 구성되며, 이는 84개의 아미노산으로 번역됨을 알 수 있었다. 이중 테네신 1은 42번째의 발린(val)으로부터 시작하여 아르기닌(arg)으로 종결되는 43개의 아미노산으로 구성되는 단백질임을 확인하였다. 또한, 테네신 1은 41개의 시그날 펩타이드를 가지는 유전자로 이 시그날 펩타이드 중에는 Arg-X-X-Arg 등의 아미노산 배열이 존재함으로, 테네신 1은 분비성 단백질임을 확인하였다.

[실시예 4]

[항균성 및 세포독성 확인]

탁정벌레로부터 분리한 테네신 1의 항균성 폴리펩타이드 활성을 측정하기 위하여, 항균활성을 콜로니 계수법과 분광법으로 측정하였다.

(1) 콜로니 계수법에 의한 항균성 측정

대장균(E. coli) K-12 및 스타필로코커스 어레우스(S. aureus) 285균을 M-3 배지에서 대수기(log phase, 2 ×10⁸)까지 배양시킨 후, 그 액을 1ml 취하여 8,000rpm(4℃)에서 5분간 원심분리시켰다. 균을 K-완충용액(pH 7.0, 1M-인산칼륨완충용액 3ml, NaCl 0.35g, 증류수 100ml)에 현탁시킨 후, 그 액 100ul을 K-완충용액 900ul으로 희석시킨다(세포수: 2 ×10⁷). 그런다음, 이 액 200ul를 취하여 유충의 체액 200ul를 가하여 37℃에서 1시간 배양시키고, 다시 10ul를 취하여 100배 희석시켜 아가 플레이트에 도말하였다(최종 500 콜로니). 이 플레이트를 37℃에서 18시간 배양시킨 후 대조구(500 콜로니 전후) 플레이트와 감소되는 콜로니수를 비교하여 항균력 시험을 하였다.

(2) 분광법

M-3 아가 플레이트에서 배양한 대장균 K-12 및 스타필로코커스 어레우스 285균의 단일 콜로니를 취하여 37℃에서 3시간 배양하여 균이 대수기(세포수: 2 ×10⁸)에 도달한 액 1ml를 취하여 8,000rpm(4℃)에서 원심분리하여 균을 수확하였다. 수확한 균을 전기 K-완충용액에 현탁한 후 650nm에서 흡광도를 측정하여 0.3이 되도록 조정하고, 이 액 3ml와 M-3 배지 27ml를 가하여 보관용액(stock solution)을 제조한다. 이 보관용액 200ul와 S-BSA 완충용액(NaH₂PO₄2H₂O 6.84g, Na₂HPO₄12H₂O 2.22g, NaCl 38g, 증류수 4,953ml, BSA분획 0.2g) 및 컬럼으로 분리한 각 분획 120ul를 실리콘으로 코팅한 시험관에 가하고 37℃에서 3시간 배양시켰다. 배양 후 K-완충용액을 표준액으로하여 650nm에서 흡광도를 측정하여 항균력 시험을 하였다.

이상과 같은 방법으로 각 시험 미생물에 대하여 최저억제농도(MIC)값을 구한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

이상에서 상세히 설명하고 입증되었듯이, 본 발명의 폴리펩타이드(테네신 1)는 바실러스, 스타필로코커스, 마이크로코커스, 코리네박테리움 및 마이코박테리움 속(genus) 등의 균에대하여 우수한 항균활성을 가지는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 항균활성을 가지는 물질로서 의약 및 생활용품의 첨가제로 개발될 수 있을 것이다.

Claims

다음과 같은 아미노산 서열을 가지는 항균성 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 탁정벌레 갈색거저리(Tenebrio molitor)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 항균성 폴리펩타이드.
다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 가지는 탁정벌레 갈색거저리로부터 분리된 cDNA.
제1항의 폴리펩타이드를 생물학적 활성성분으로 함유하는 항균제 조성물.