KR100257306B1 - 신경세포활동측정용 2차원센서 및 이것을 사용한 측정장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경세포등의 활동에 따른 전위변화를 검출함으로써, 세포활동을 측정하기 위한 2차원센서와 이것을 사용한 측정장치에 관한 것으로서, 측정전극의 위치나 크기를 가변으로 하므로써, 범용성이 풍부한 세포활동측정용 2차원센서 및 이것을 사용한 측정장치를 제공하는 것을 목적으로 한것이며, 그 구성에 있어서, 광전도층의 이면에 작용전극용 박막(1a)이 증착되고, 표면에 절연층(1a)이 형성되고, 또 그 표면에 시료인 세포, 배양액 및 참조전극을 넣는 세포설치부(1b)가 형성된 2차원센서(1)가 인큐베이터(3)내에 세트되고, 참조전극과 작용전극과의 사이에 바이어스전압이 인가된다. 2차원센서(1)의 이면으로부터 레이저빔이 조사된 개소의 세포활동에 의한 전위변화의 신호가 작용전극으로부터 꺼내지고 증폭기(9)를 개재해서 컴퓨터(10)에 입력되는 것을 특징으로 한 것이다.

Description

신경세포활동측정용 2차원센서 및 이것을 사용한 측정장치

제1도는 본 발명의 실시예에 관한 세포활동측정장치의 구성도.

제2도는 제1도의 세포활동측정장치에 사용하는 2차원센서의 측면단면도(모식도) 및 평면도.

제3도는 측정된 세포활동에 대응하는 과도전류의 일예를 표시한 파형도.

제4도는 제1도의 측정장치에 있어서 과도전류가 흐르는 회로를 간략화한 도면.

〈도면의 주요부분에 대한 부호의 설명〉

(1) : 2차원센서 (1a) : 작용전극용 박막

(1b) : 울타리(세포설치부) (2) : 시료(세포)

(3) : 인큐베이터부 (4) : 온도제어유닛

(5) : 히터·팬유닛 (6) : 유량계

(7) : 전자밸브 (8) : 일정전위기

(9) : 증폭기 (10) : 컴퓨터

(11) : 레이저광원 (12) : 광원구동장치

(13) : XY스테이지

본 발명은, 신경세포 등의 활동에 따른 전위변화를 검출함으로써, 세포활동을 측정하기 위한 2차원센서와, 이것을 사용한 측정장치에 관한 것이다.

최근, 신경세포의 의학적검토나 전기소자로서의 응용의 가능성의 검토 등이 활발히 행해지고 있다. 신경세포가 활동할때에는 활동전위가 발생한다. 이 활동전위는, 신경세포의 이온투과성의 변화에 따라서 세포막내외의 이온농도가 변화하고, 이에 따라서 세포막전위가 변화함으로써 발생하는 것이다. 그래서, 시료세포 또는 조직의 활동상태를 관찰할때에, 상기한 세포막전위의 2차원분포를 측정함으로써 활동부위의 특정이나 활동의 정도를 관찰 할 수 있다.

이와 같은 세포전위의 측정에 있어서, 소위 유리나 자극을 주는 전극을 세포에 삽입하는 일없이 측정하고, 또한, 평면상의 복수개소를 동시에 측정하는 것을 가능하게 하는 2차원센서로서, 본 출원인에 의해서 먼저 출원된 일체화복합전극이 있다(일본국 특개평6-78889호 공보, 일본국 특개평 6-296595호 공보참조). 이 일체화복합전극은, 유리기판상에 도전성물질을 사용해서 매트릭스형상으로 배열된 복수의 미소전극과 그 인출패턴을 형성하고, 이 위에서의 세포배양을 가능하게 한 것이다. 이에 의해서, 유리전극 등을 사용하는 경우에 비해서 좁은 간격의 복수개소에 있어서 동시에 전위변화를 측정할 수 있고, 또한 세포·조직을 배양하면서 장시간에 걸쳐서 관측할 수 있게 되었다.

그러나, 상기와 같은 종래의 일체화복합전극은, 측정전극의 위치나 크기가 고정이므로 범용성이 결여되고, 여러가지 세포나 조직의 활동측정에 겸용하는 것이 어려웠다. 실제로 측정대상의 세포에 맞추어서 측정전극의 간격이나 크기를 실험에 의해서 최적화하고, 거의 전용의 일체화복합전극을 작성하고 있었다.

그래서, 본 발명은, 상기 종래의 일체화복합전극을 개량하고, 측정전극의 위치 등을 가변으로 하므로써, 범용성이 풍부한 세포활동측정용 2차원 센서 및 이것을 사용한 측정장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 의한 세포활동측정용 2차원 센서의 특징은, 광이 조사된 부분의 전기전도율이 높아지는 광전도재료로 이루어진 광전도층과, 그 표면에 형성된 절연층과, 이면에 형성된 작용전극을 구비하고 있는 판형상의 2차원센서에 있어서 상기 절연층의 표면에 세포, 배양액 및 참조전극을 넣는 세포설치부가 형성되고, 그 세포설치부내에 놓인 세포의 활동에 의해서 발생하는 전위변화의 평면분포중, 광이 조사된 부분의 전위변화에 주로 대응하는 신호가 상기 작용전극으로부터 꺼내지는 점에 있다.

상기 광전도층은, 셀렌, CdS, Ge-Si, 진성Si등의 반도체로 구성할 수 있고, 또, 광도전성고분자재료로 구성할 수도 있다. 고분자의 옆사슬 또는 주사슬에 포함되는 광전도성 기로서, 안트라센 등의 축합다환방향족탄화수소, 카르바졸 등의 복소방향고리, 아릴아민등이 있다. 또는 프탈로시아닌증착막, 페릴렌계안료의 Me-PTC(메틸렌·페릴렌·카르복시산)등의 유기박막을 사용해도 된다.

또, 상기한 2차원센서를 사용한 본 발명에 의한 세포활동측정장치의 특징은, 상기 2차원센서의 이면에 레이저빔을 조사하는 레이저광원과, 상기 2차원센서의 작용전극과 세포설치부에 넣어진 참조전극과의 사이에 직류바이어스전압을 인가하는 직류전원과, 상기 양 전극간에 얻어지는 신호를 처리하는 처리수단을 구비하고 있는 점에 있다. 바람직한 구체구성에 대해서는 후술한다.

상기 특징을 가진 본 발명의 2차원센서에 의하면, 광전도층중, 광이 조사된 부분의 전기전도율이 높아지므로, 그 부분에 접하고 있는 세포부분의 전위변화에 주로 대응하는 신호가 검출된다. 즉, 광의 조사위치를 바꿈으로써, 말하자면 측정 전극의 위치를 임의로 바꿀 수 있고, 또, 조사스폿직경을 바꿈으로써, 말하자면 측정전극의 크기도 임의로 바꿀 수 있다. 또한, 광전도층과 시료의 세포와의 사이에는 절연층이 개재하고 있으므로, 세포전위 그 자체를 검출할 수는 없으나, 세포 전위의 변화분, 즉 교류성분 또는 펄스성분을 검출할수는 있다. 세포활동은 전위의 변화분으로부터 충분히 측정할 수 있다.

따라서, 이와 같은 2차원센서를 사용한 세포활동측정장치의 구성으로서, 2차원센서의 이면에 광빔을 조사하는 광원과, 2차원센서의 작용전극과 세포설치부에 넣어진 참조전극과의 사이에 직류바이어스전압을 인가하는 전원과, 양 전극간에 얻어지는 신호를 처리하는 처리수단이 필요하다. 광원으로서 레이저광원을 사용하면, 조사스폿의 위치결정이 정확하고, 스폿직경을 좁힐 수 있는 점에서 유리하다. 또, 세포설치부에 놓인 세포의 배양환경을 유지하는 배양유지수단을 구비함으로써 장시간에 걸친 측정이 가능하게 된다.

또, 레이저광원으로부터 조사되는 레이저빔을 2차원센서의 이면의 소정범위내에서(고속으로)주사하는 수단이 구비되어 있는 것이 바람직하고, 이에 의해서, 소정범위내의 복수개소의 세포활동을 거의 동시에 측정할 수 있다. 1개의 레이저빔을 주사시키는 대신에, 2차원센서의 이면에 대해서 거의 수직으로 레이저광을 조사하는 복수의 레이저소자를 2차원매트릭스형상으로 배열한 레이저어레이를 구비하고, 이들 복수의 레이저소자를 시분할에 의해서 구동시키면, 한층더 고속의 주사가 가능하게 된다. 또는, 레이저빔을 주사시키는 대신에, 2차원센서의 수평방향에 있어서의 위치를 제어하는 XY스테이지를 구비하고, 이것을 제어함으로써 2차원센서의 레이저광을 조사시키는 위치를 바꾸도록 해도 된다.

이하, 도면을 참조하면서 본 발명의 실시예를 설명한다.

제 1도에 본 발명에 의한 세포활동측정장치의 일실시예의 구성을 표시한다. 세포활동측정용 2차원센서(1)의 위에 샘플인 세포(2) 및 배양액을 세트한 것이 인큐베이터부(3)에 수납되고 있다.

2차원센서(1)는 제 2도에 단면도(a) 및 평면도(b)를 표시한 바와 같이, 진성 실리콘(I-Si)기판으로 구성된 광전도층의 이면에 작용전극용의 금안티몬박막(1a)을 증착하고, 표면에 절연층으로서의 산화피막(SiO₂)을 형성하고, 그 표면에 세포 및 배양액, 그리고, 참조전극을 넣는 세포설치부로서의 울타리(1b)를 형성한 것이다. 또한, 제 2도(a)의 단면도는 두께방향으로 과장해서 그려져 있고, 실제로는 전체의 두께가 200㎛이다.

진성실리콘 기판은 이면도 경면연마한 것을 사용하고, 증착한 금안티몬박막(1a)은, 500℃에서 합금화해서 오믹콘택트를 형성했다.

세포 등을 넣는 울타리(1b)에는, 내경 26㎜의 폴리카보네이트제원통체를 사용하고, 이것을 절연층에 접착했다. 또한, 원판형상의 2차원센서는 보강이나 취급의 용이함때문에, 알루미늄제 프레임에 장착해서 사용했다.

제 1도로 돌아와서 인큐베이터부(3)는 이중구조를 채용하고 있고, 잡균에 의한 외부로부터의 오염방지에 만전을 기하고 있다. 인큐베이터부(3)의 샘플실(3a)은, 온도제어유닛(4)이 온도센서의 출력에 의거해서 히터·팬유닛(5)을 제어함으로써, 37±0.5℃로 유지된다. 또, 공기 95%, 이산화탄소 5%의 비율로 조정된 혼합가스가 샘플실에 도입되고 있다. 이 혼합가스공급로에는 유량계(6) 및 전자밸브(7)가 구비되고, 또 전자밸브(7)의 구동회로(7a)를 ON·OFF하는 타이머(7b)도 구비되고 있다. 이들 인큐베이터부, 온도제어유닛(4)등에 의해서 배양유지수단이 구성되어 있다.

상기 2차원센서(1)의 울타리내에 넣어진 참조전극(RE)과 이면의 작용전극과의 사이에 바이어스전압을 인가하기 위한 일정전위기(8)가 설치되고, 양 전극간에 흐르는 전류신호가 증폭기(9)를 개재해서 처리수단인 컴퓨터(10)에 입력된다. 컴퓨터(10)에는 16비트 A/D변환기가 장착되어 있다.

또, 2차원센서(1)의 울타리내에는 배양액에 침지된 참조전극(RE)과 마찬가지로 일정전위기(8)에 접속된 대향전극(CE)이 구비되어 있다. 이 대향전극(CE)을 샘플에 접촉시켜서 참조전극(RE)과의 사이에 펄스전압을 인가함으로써, 샘플에 자극을 주고, 그 결과 발생하는 유발전위를 측정할 수 있다. 이 자극전압(펄스전압)은 컴퓨터(10)로부터의 지령에 의해서 일정전위기(8)가 발생시킨다. 물론, 자극을 주지 않고 자발전위의 측정을 할 수도 있다.

제 1도에는, 2차원센서(1)의 이면에 레이저빔을 조사하는 레이저광원(11)이나 그 구동장치(12)도 표시되어 있다. 레이저광원(11)으로부터 나온 레이저빔은 미러나 렌즈(도립현미경의 대물렌즈를 사용했다)에 의한 광학계에 의해서 수㎛정도의 빔직경으로 집광되어 2차원센서(1)의 이면에 조사된다.

또, 2차원센서(1)의 이면의 레이저빔이 조사되는 위치를 변경하기 위한 수단으로서, 인큐베이터부(3)마다 2차원센서(1)를 수평방향으로 변위시키는 XY스테이지(13)가 구비되어 있다. 이 XY스테이지(13)는 컴퓨터(10)로부터의 지령에 따라서 스텝모터가 구동됨으로써, 2차원센서(1)의 레이저빔이 조사되는 위치를 1㎛단위로 XY방향으로 변위시킬 수 있다.

본 실시예에서는 이와 같이 레이저빔의 위치를 고정해서 2차원센서(1)를 XY 방향으로 변위시켰으나, 고속스캔(주사)을 실현하기 위해서는, 오히려 2차원센서(1)의 위치를 고정해서, 레이저빔을 주사시키는 편이 좋다. 이것은, 광학계에 XY 갤버너미러를 사용함으로써 실현할 수 있다. 또는, 2차원센서의 이면에 대해서 거의 수직으로 레이저광을 조사하는 복수의 레이저소자를 2차원매트릭스형상으로 배열한 레이저어레이를 사용하고, 이들 복수의 레이저소자를 시분할에 의해서 구동시키는 방법도 생각할 수 있다.

상기와 같이 해서, 2차원센서(1)의 광전도층중 레이저광이 조사된 부분에는 정공·전자쌍이 발생하고, 참조전극과 작용전극과의 사이에 인가되고 있는 바이어스전압에 의해서 광전류가 흐르도록 한다. 2차원센서(1)의 표면에는 절연층(SiO₂)이 형성되어 있으므로 직류전류는 흐르지 않으나, 교류전류, 특히 펄스전류가 흐를 수 있다. 따라서, 신경세포의 자발발화에 의해 발생한 펄스성의 전위변화, 또는 대향전극(CE)과 참조전극(RE)과의 사이에 인가된 펄스전압에 유발되어 발생하는 펄스성의 전위변화를 참조전극과 작용전극과의 사이에 흐르는 과도적인 전류로서 검출할 수 있다.

이하에, 상기와 같은 측정장치를 사용해서 쥐의 뇌조각의 신경활동의 관찰을 행한 실험예에 대해서 설명한다. 생후 2일된 SD쥐의 뇌를 적출하고, 그 시각야의 부분을 약 0.5㎜두께의 조각으로 잘라냈다. 이 뇌조각을 상기 2차원센서의 울타리 속에서 배양했다. 조각의 부착성을 좋게하기 위하여, 센서표면의 실리콘질화막을 폴리리신에 의해서 처리하고, 배지에는 DF+f를 사용했다. 여기서, DF는 DMEM과 Nutrient Mixture(F12배지)를 1대1로 혼합한 것이고, f는 인슐린 5㎍/ml, 트랜스페린 100㎍/ml, 프로게스테론 20nM, 하이드로코티존 20nM, 푸트레신 100μM, 셀렌 20nM, 또 우태아혈청 5%를 첨가한 것이다.

이와 같은 샘플(생후 1~2일된 쥐의 뇌조각)은 배양개시로부터 1주간에서부터 10일정도에 자발발화를 일으키게 된다. 제 3도에 상기한 측정장치에 의해서 검출된 샘플의 전기적활동, 즉 과도전류를 표시한다. 0.25초부근에서 정펄스상의 과도전류가 흐르고, 0.7초 부근에서 부펄스형상의 과도형상이 검출되고 있다. 또, 측정장치중의 과도전류가 흐르는 회로를 간략화한 것을 제 4도에 표시한다. 도면 중(8a)는 일정전위기(8)에 의해서 참조전극RE와 작용전극과의 사이에 (증폭기(9)를 개재해서)인가되는 바이어스전압이다. 제 3도 및 제 4도로부터 이하의 것이 설명된다.

제 3도의 0.25초부근에서 샘플(신경세포)이 자발발화하고, 제 4도에 표시한 바와 같이, 참조전극RE가 침지된 배양액에 대해서 정의 세포전위가 발생했다. 그 결과, 제 4도의 (a)방향으로 과도전류가 흘렀다. 그리고, 제 3도의 0.7초부근에서 자발화가 종료해서 세포전위가 소멸하고, 이때 제 4도의 (b)방향으로 과도전류가 흘렀다.

이 사실로부터, 레이저빔이 조사된 개소에 있어서, 신경세포의 자발발화에 의한 정의 세포전위(내부전위)가 약 0.45초간 발생했다고 생각할 수 있다. 레이저 빔의 조사개소를 기타에 이동시킨 경우에도, 신경세포의 자발발화가 발생하고 있다고 생각되는 개소에서는 마찬가지의 과도전류가 검출되었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 광전도층과 절연층, 그리고 작용전극을 구비한 2차원 센서를 사용하고 그 표면에 형성된 세포설치부에서 샘플의 세포를 배양할 수 있도록 해서, 2차원센서기판의 이면으로부터 레이저빔이 조사된 개소의 세포활동에 의한 전위변화를 검출할 수 있도록 했으므로, 레이저빔이 조사되는 위치 및 그 스폿직경을 바꿈으로써, 말하자면 측정전극의 위치 및 크기를 거의 임의로 조절하는 것이 가능하게 되었다. 즉, 샘플에 맞추어서 측정전극의 위치나 크기를 임의로 설정할 수 있는 범용성이 있는 2차원센서와 그것을 사용한 측정장치를 제공할 수 있었다.

Claims (19)

1. 일정한 레이저광원이 조사된 때 전기전도율이 높아지는 진성실리콘, 셀렌, Cd-S, 또는 Ge-Si로 이루어진 광전도층과; 이 광전도층의 표면에 형성된 절연층과; 이 광전도층의 이면에 형성된 작용전극과; 세포, 배양액 및 참조전극을 포함하는 절연층에 인접하게 배치된 세포설치부를 구비한 활동하는 전기적 세포활동을 측정하는 2차원센서에 있어서, 활동하는 전기적 세포활동신호는 광이 작용전극상의 스폿에 조사될 때 작용전극으로부터 얻어지고, 이 신호는 광이 조사된 스폿에서 전위변화에 대응하고 상기 활동하는 전기적 세포활동에 대응하는 것을 특징으로 하는 활동하는 전기적 세포활동 측정용 2차원센서.
2. 제1항에 있어서, 상기 광전도층이 반도체로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 세포활동측정용 2차원 센서.
3. 제1항에 있어서, 상기 광전도층이 유기박막으로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 세포활동측정용 2차원센서.
4. 광이 조사된 때 전기전도율이 높아지는 진성실리콘으로 이루어진 광전도층과, 이 광전도층의 표면에 형성된 절연층과; 이 광전도층의 이면에 형성된 작용전극과; 세포, 배양액 및 참조전극을 포함하는 절연층에 인접하게 배치된 세포설치부를 구비한 2차원 센서와; 작용전극상의 스폿에 레이저빔을 조사하는 일정한 레이저광원과; 상기 광전도층의 이면상의 작용전극과 상기 광전도층의 표면상의 세포설치부내의 참조전극과의 사이에 직류바이어스전압을 인가하는 직류전원을 구비한 활동하는 전기적 세포활동을 측정하는 측정장치에 있어서, 활동하는 전기적 세포활동신호는 광이 작용전극상의 스폿에 조사될 때 작용 전극으로부터 얻어지고, 이 신호는 광이 조사된 스폿에서 전위변화에 대응하고 상기 활동하는 전기적 세포활동에 대응하고, 이 작용전극과 참조전극사이에서 얻은 상기 활동하는 전기적 세포활동신호를 처리하는 프로세서를 특징으로 하는 활동하는 전기적 세포활동을 측정하는 세포활동측정장치.
5. 제4항에 있어서, 상기 세포설치부에 놓인 세포의 배양환경을 유지하는 배양유지수단이 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 세포활동측정장치.
6. 제4항에 있어서, 상기 레이저광원으로부터 조사되는 레이저빔을 상기 세포활동측정용 2차원센서의 이면의 소정범위내에서 주사하는 수단이 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 세포활동측정장치.
7. 제4항에 있어서, 상기 레이저광원으로서, 상기 세포활동측정용 2차원센서의 이면에 대해서 거의 수직으로 레이저광을 조사하는 복수의 레이저가 2차원매트릭스형상으로 배열되어 이루어진 레이저어레이가 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 세포활동측정장치.
8. 제4항에 있어서, 상기 세포활동측정용 2차원센서의 수평방향에 있어서의 위치를 제어하는 XY스테이지가 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 세포활동측정장치.
9. 광이 조사된 때 전기전도율이 높아지는 진성실리콘으로 이루어진 광전도층과, 이 광전도층의 표면에 형성된 절연층과, 이 광전도층의 이면에 형성된 작용전극과, 세포, 배양액 및 참조전극을 포함하는 절연층에 인접하게 배치된 세포설치부를 구비한 2차원 센서와; 작용전극상의 스폿에 레이저빔을 조사하는 일정한 레이저광원을 구비한 활동하는 전기적 세포활동을 측정하는 측정장치에 있어서, 활동하는 전기적 세포활동신호는 광이 작용전극상의 스폿에 조사될 때 작용전극으로부터 얻어지고, 이 신호는 광이 조사된 스폿에서 전위변화에 대응하고 상기 활동하는 전기적 세포활동에 대응하고, 이 작용전극과 참조전극사이에서 얻은 양전기신호 및 음전기신호 양쪽을 측정하는 프로세서를 특징으로 하는 활동하는 전기적 세포활동을 측정하는 세포활동측정장치.
10. 제9항에 있어서, 상기 센서상의 세포설치부내의 세포의 배양환경을 유지하는 수단을 더 구비한 것을 특징으로 하는 세포활동측정장치.
11. 제9항에 있어서, 상기 레이저광원으로부터 조사된 레이저빔을 광전도층의 이면의 소정영역내에서 주사하는 수단을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 세포활동측정장치.
12. 제9항에 있어서, 매트릭스형상으로 배열된 복수의 레이저소자를 포함하는 레이저어레이를 더 구비하고, 상기 레이저소자는 광전도층의 이면에 수직으로 레이저빔을 조사하는 것을 특징으로 하는 세포활동측정장치.
13. 제9항에 있어서, 센서상에서 레이저조사된 스폿의 위치를 변경하는 2차원센서의 수평위치를 제어하는 X-Y포지셔너를 더 구비한 것을 특징으로 하는 세포활동측정장치.
14. 제1항에 있어서, 상기 광전도층은 진성실리콘으로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포활동측정용 2차원 센서.
15. 제1항에 있어서, 상기 광전도층은 셀렌으로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포활동측정용 2차원 센서.
16. 제1항에 있어서, 상기 광전도층은 Cd-S로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포활동측정용 2차원 센서.
17. 제1항에 있어서, 상기 광전도층은 Ge-Si로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포활동측정용 2차원센서.
18. 제4항에 있어서, 상기 광전도층은 진성실리콘, 셀렌, Cd-S 또는 Ge-Si로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포활동측정장치.
19. 제9항에 있어서, 상기 광전도층은, 진성실리콘, 셀렌, Cd-S 또는 Ge-Si로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포활동측정장치.