KR100239219B1 - Sterile transfer apparatus of culture medium and cell for bioreactor - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동·식물의 세포, 조직, 기관 및 미생물 배양에 있어서 배양체의 초기접종이나 배양 과정에서 배지 및 세포의 안전하고, 간편한 이송을 목적으로 하는 생물반응기의 배지 및 세포 무균이송장치에 관한 것이다. 본 발명은 생물반응기와 종배양조 및 배지저장탱크 사이에 무균 상태의 이송연결장치를 제공함으로써 기존의 방법에 비하여 작업의 간편성 및 오염율을 극소화시킬 수 있도록 한다. 또한 본 발명은 동·식물 세포, 조직, 기관 뿐만 아니라 미생물 배양용 생물반응기에도 직접 응용이 가능하고, 특히 어떤 경우에도 거의 오염이 없이 성공적인 이송이 가능한 특징을 갖는다.The present invention relates to a medium and cell sterile transfer device of a bioreactor for the purpose of safe and convenient transfer of medium and cells in the initial inoculation or culture process of cells, tissues, organs and microorganisms of animals and plants. . The present invention provides a sterile transfer connection device between the bioreactor, the cultivation tank and the medium storage tank, thereby minimizing the simplicity of operation and the contamination rate compared to the conventional method. In addition, the present invention can be applied directly to animal and plant cells, tissues, organs, as well as bioreactors for cultivating microorganisms, and in particular, has a feature that can be successfully transported with little contamination in any case.

Description

생물반응기의 배지 및 세포의 무균 이송장치Aseptic conveying device of bioreactor medium and cells

본 발명은 생물반응기에 있어서 배지 및 배양된 세포의 무균이송장치에 관한 것이다.The present invention relates to a sterile transfer device for cultured cells and media in a bioreactor.

소규모 생물반응기를 이용하여 식물세포를 배양할 경우 대체로 공용으로 사용되는 배양배지 탱크 및 종배양조를 생물반응기의 본체에 부착하는 방법을 많이 채택하고 있다. 생물반응기를 실험실 규모로 한 두 대 설치할 경우에는 별문제가 되지 않으나 산업적인 규모로 생산하기 위해서는 수십대 또는 수백대의 생물반응기를 동시에 작동시키는 것이 불가피하다. 예를들어 20L 규모의 생물반응기를 50대 배양한다고 가정 할 때 100개의 보조탱크를 설치하여야 한다. 이 경우 오토클레이브(autoclave)를 이용하여 보조탱크를 멸균하기 위해서는 많은 인건비가 소요될 뿐만아니라 배양실의 공간도 아주 많이 필요하며 부가적으로 배양실 온도 적정화를 위한 연료 혹은 전기 소모량도 증가될 것이다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 소규모 생물반응기에서 무균적으로 소독할 수 있는 배지 및 세포의 이송장치를 제공하고자 한다.When cultivating plant cells using a small bioreactor, a large number of methods for attaching commonly used culture medium tanks and seed culture tanks to the body of the bioreactor have been adopted. It is not a problem if two or two bioreactors are installed on a laboratory scale, but for industrial production, it is inevitable to operate several tens or hundreds of bioreactors simultaneously. For example, assuming that 50 20L bioreactors are incubated, 100 auxiliary tanks should be installed. In this case, sterilization of the auxiliary tank using an autoclave requires not only a large labor cost but also a very large space in the culture chamber, and additionally fuel or electricity consumption for the optimization of the culture chamber temperature will be increased. In order to solve this problem, the present invention is to provide a medium and cell transfer device that can be aseptically sterilized in a small bioreactor.

대규모의 생물반응기에 관한 연구는 주로 미생물 대량배양에 관하여 이루어졌기 때문에 배양하려는 균주에 따라 다소 차이는 있지만 대체로 미생물의 우점현상에 의하여 극미량의 오염균은 큰 문제를 일으키지 않으므로 배양탱크에 초기 접종은 이중으로 된 소형 접종 부위에 알코올로 불을 붙인 다음 균주를 접종하는 방법을 일반적으로 많이 사용하고 있다. 균주의 접종량이 소량인 경우 주의를 기울이면 전술한 방법에 의하여 거의 오염을 일으키지 않고 성공적인 접종 및 배양이 가능하다.Since large-scale bioreactors have been mainly studied on microbial mass culture, there are some differences depending on the strains to be cultivated. However, micro-contaminant microorganisms do not cause significant problems. It is generally used to inoculate a small inoculation site with alcohol and then inoculate the strain. If the inoculation amount of the strain is a small amount of attention can be successfully inoculated and cultured with little contamination by the above-described method.

식물세포 배양함에 있어서 초기 식물세포 접종량이 많으므로 접종시간이 장기화되면서 오염이 발생하게 된다. 예를들면 식물세포의 파이럿트(Pilot-scale) 규모 배양에 있어서는 전체 배양액의 20% 이상의 세포를 초기에 접종하여야 하므로 500L 규모로 회분배양을 할 경우 배양세포를 적어도 100L를 넣어주어야 한다. 따라서 미생물 균주를 접종하는 방법으로 초기배양을 실시할 경우 세포접종에 많은 시간이 소요되기 때문에 오염율이 극히 높다. 이러한 관점에서 볼 때 무균적으로 배지 및 세포를 이송하는 장치의 개발이 절실히 요구된다. 전술한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 무균이송장치를 제공하되 작업후 공급관의 말단을 오토클레이브로 소독하도록 하고 생물반응기에 부착된 일련의 연결장치는 스팀에 의하여 소독하는 장치를 제공하고자 한다.In plant cell culture, the initial plant cell inoculation amount is large, and thus contamination occurs as the inoculation time is prolonged. For example, in a pilot-scale culture of plant cells, at least 20% of the total culture solution must be initially inoculated, and when batch cultured at 500L, at least 100L of cultured cells should be added. Therefore, when the initial culture by the method of inoculating microbial strain takes a lot of time for cell inoculation, the contamination rate is extremely high. In view of this, there is an urgent need for the development of devices for aseptically transferring medium and cells. In order to solve the above problems, the present invention provides a sterile transfer device, but after the end of the supply pipe to autoclave sterilization and a series of connecting devices attached to the bioreactor to provide a device for sterilization by steam.

제1도는 종래 사용되는 배지 저장탱트와 배양체의 수확용 탱크사진.Figure 1 is a conventional tank storage tank and harvesting tank photograph of the culture medium used.

제2도는 본 발명의 소규모 생물반응기에서 무균적으로 소독할 수 있는 배지 및 세포이송 장치의 요부발췌사진.Figure 2 is an excerpt photograph of a medium and cell transfer device that can be aseptically sterilized in the small scale bioreactor of the present invention.

제3도는 제2도의 요부인 소독관의 단면구성도.3 is a cross-sectional view of the disinfection tube which is the main part of FIG.

제4도는 Pilot-scale 생물반응기에 있어서 배지 및 세포 이송장치의 사진.4 is a photograph of a medium and cell transfer device in a pilot-scale bioreactor.

제5도는 본 발명의 전체구성도.5 is an overall configuration diagram of the present invention.

〈도면의 주요부분에 대한 부호의 설명〉<Explanation of symbols for main parts of drawing>

10 : 생물반응기 20 : 탱크10 bioreactor 20 tank

30 : 무균이송장치 31 : 이송장치본체30: Aseptic conveying device 31: conveying device body

32 : 이송관 34,35 : 연결관32: transfer pipe 34,35: connection pipe

36 : 실리콘 마개 40 : 소독관36: silicone stopper 40: disinfection tube

본 발명은 통상의 생물반응기(10)와 종배양조 및 배지저장탱크(2)(이하 탱크라 약칭함)를 구비하되 생물반응기(10)와 탱크(20) 사이에 배지 및 세포를 이송하는 무균의 이송장치(30)를 연결한다.The present invention includes a conventional bioreactor 10 and a cultivation tank and a medium storage tank 2 (hereinafter, abbreviated as a tank), but which are used aseptically for transferring medium and cells between the bioreactor 10 and the tank 20. Connect the transfer device 30.

상기 무균의 이송장치(3)는 스텐드(33)에 지지된 이송장치본체(31), 그리고 이송관(32)으로 구성되어 상호 분리 결합되도록 하는 한편 이송장치 본체(31)는 생물반응기(10)와, 그리고 이송관(32)은 탱크(20)와 각각 연결하고 그 타단은 각각의 연결과(34)(35)으로 결합하되 이송관(32)의 연결관(35) 일단에는 실리콘 마개(36)가 환착되어 있다. 이송장치본체(31)에는 제 1 및 제 2 밸브(V1)(V2) 를 구성하는 것과 함께 생물반응기(10)를 거친 스팀 공급관(70)을 연결하는 한편 상기 탱크(20)에는 공기공급관(50) 및 배지 및 세포공급관(60)이 구비된다.The sterile transfer device 3 is composed of a transfer device body 31 supported on the stand 33 and a transfer pipe 32 to be separated and coupled to each other while the transfer device body 31 is a bioreactor 10. And, and the transfer pipe 32 is connected to the tank 20, respectively, and the other end thereof is coupled to each connection and 34, 35, but one end of the connection pipe 35 of the transfer pipe 32 silicon plug 36 ) Is returned. The transfer device body 31 is configured with the first and second valves V 1 and V 2 , and is connected to the steam supply pipe 70 through the bioreactor 10, while the tank 20 has an air supply pipe. 50 and a medium and cell supply tube 60 are provided.

한편, 본 발명은 작업후 상기 이송관(32)의 연결관(35)을 소독하기 위한 소독관(40)이 별도로 제공된다.On the other hand, the present invention is provided with a disinfection tube 40 for disinfecting the connection pipe 35 of the transfer pipe 32 after the operation.

본 발명의 이송장치(30)는 최초에 무균 상태로 제공되며 탱크(20)내의 배지 및 세포는 콤푸레셔에 의하여 공기공급관(50)으로 공급되는 공기압에 의해 생물반응기(10)로 이송된다.The transfer device 30 of the present invention is initially provided in a sterile state and the medium and the cells in the tank 20 are transferred to the bioreactor 10 by air pressure supplied to the air supply pipe 50 by a compressor.

따라서 본 발명은 배지 및 세포이송 작업이 간단하고 작업성이 우수하다.Therefore, the present invention is simple and excellent workability of medium and cell transfer.

특히 본 발명이 목적하는바, 지속적인 100% 무균작업이 가능한바, 즉, 본 발명은 세포이송 작업후 재작업 이전에 각 연결관(34)(35)을 분리한다.In particular, the present invention is intended to be capable of continuous 100% sterile operation, that is, the present invention separates each connecting tube 34, 35 before the rework after the cell transfer operation.

분리한 일단의 연결관(35)은 도 3에서와 같이 알코올이 수용된 소독관(40)내에 침지시키면서 그 일단에 환착된 실리콘 마개(36)로 소독관(40) 상부를 밀폐시키면 연결과(34)은 외부와 차단된채 알코올에 의해 소독된다.The separated end of the connection pipe 35 is immersed in the disinfection tube 40 containing the alcohol as shown in Figure 3 while sealing the upper part of the disinfection tube 40 with the silicone stopper 36 returned to the end and the connection (34) ) Is sterilized by alcohol while blocked from the outside.

상기 알코올은 70~95%가 바람직하다.The alcohol is preferably 70 to 95%.

무균이송장치(30)에서 이송장치 본체(31)는 따로 분리하여 제 1밸브(V1)와 제 2밸브(V2)을 열고 먼저 오토클래이브에서 멸균한 후 뜨거운 상태로 제 1 밸브(V1)와 제 2밸브(V2)를 닫는다. 냉각된 뒤에 생물반응기 본체(10)와 연결하여 제 2 밸브(V2)만 연 상태로 스팀 공급관(70)을 통하여 스팀을 공급하게 되면 연결과정에서 노출되었던 생물반응기(10)와 연결부분 및 이송장치 본체(31) 내부가 소독된다.In the aseptic conveying apparatus 30, the conveying apparatus main body 31 is separated, and the first valve V 1 and the second valve V 2 are opened, first sterilized in an autoclave, and then the first valve V is heated. 1 ) and the second valve (V 2 ) close. After cooling and supplying steam through the steam supply pipe 70 with only the second valve V 2 opened by connecting with the bioreactor main body 10, the connection part and the transfer and the bioreactor 10 exposed during the connection process The inside of the apparatus main body 31 is disinfected.

이와같이 소독된 상태에서 상기한 각 연결관(34)(35)을 재결합하게 되면 배지 및 세포의 무균이송작업이 지속적으로 이루어질 수 있다.By recombining each of the connection pipes 34 and 35 in the sterilized state as described above, sterile transfer of the medium and the cells may be continuously performed.

또한 본 발명은 클램프의 연결구성으로 하여 탈착이 용이하도록 한다.In addition, the present invention is to facilitate the removable connection to the clamp configuration.

즉, 본 발명은 파이럿트 규모의 생물반응기에 있어서 배지 및 세포이송장치를 멸균한 후 종배양용 생물반응기와 연결할 부분의 소규모 생물 반응기에서 무균적으로 소독할 수 있는 배지 및 세포 이송연결장치를 제공하게 되는바 첫째; 배지 및 세포 이송장치를 파이럿트용 생물반응기에 부착한 다음 각 밸브를 선택적으로 잠근 상태에서 스팀으로 멸균을 실시하고 둘째; 배지 및 세포의 이송장치가 완전히 냉각되었을 때 생물반응기에 배양중인 세포 및 배양액의 전체 용적과 이에 대한 세포의 비율을 정확히 계산하여 생물반응기내의 초기 접종량을 20%에서 40%가 되게 새로운 배지로 양을 조절한다.That is, the present invention provides a medium and cell transfer connection device capable of aseptic sterilization in a small bioreactor of a part to be connected to a bioreactor for species culture after sterilizing the medium and cell transfer device in a pilot scale bioreactor. Firstly; Attaching the medium and cell transfer device to the pilot bioreactor and sterilizing with steam with each valve selectively locked; Accurately calculate the total volume of cells and cultures in the bioreactor and the ratio of cells to them when the medium and cell transfer device are completely cooled, so that the initial inoculum in the bioreactor is 20% to 40% with fresh medium. Adjust

셋째; 종배양용 생물반응기의 출구를 잠근 다음 공기공급관으로 무균의 공기를 주입시켜 그 압력에 의하여 종배양체가 파이럿트용 생물반응기 속으로 이송하도록 한다. 이때 세포 이송 장치의 제 1 밸브를 풀린 상태로 둔다.third; Lock the outlet of the seed culture bioreactor and inject sterile air into the air supply line to transfer the seed culture into the pilot bioreactor by the pressure. At this time, the first valve of the cell transfer device is left in an unlocked state.

넷째; 종배양체가 완전히 접종된 후 일정한 양의 공기를 지속적으로 주입시킴으로써 배관 속에 머무르고 있는 배양체가 모두 파이럿트용 생물반응기속에 이송된 후 공기가 들어가는 상태가 확인되면 세포 이송장치와 생물반응기의 연결부위에 설치된 각 밸브를 잠그고 세포 이송장치를 분리시킨다.fourth; After the seed culture is completely inoculated, a constant amount of air is continuously injected, so that all cultures staying in the pipe are transferred to the pilot bioreactor. Lock the valve and disconnect the cell transfer unit.

소규모 생물반응기에서 무균적으로 소독할 수 있는 배지 및 세포의 이송 연결장치는 생물반응기의 몸체에 부착하여 오토클레이브에 의한 소독이 가능하며, 이를 실제로 적용 시켰을 때 오염없이 배양이 가능하였으며, 반연속배양(semi-continuous culture)이나 연속배양(continuous culture)에 있어서 특히 유리하였으며, 배양된 식물세포, 조직, 및 기관 배양에 있어서 생육상태에 따라 서로 다른 배양배지를 이용할 경우 1회의 멸균으로써 수확을 할 때까지 계속 사용할 수 있다.The medium and cell transfer connection device that can be sterilized in small bioreactors can be attached to the body of bioreactor for sterilization by autoclave, and it can be cultured without contamination when it is actually applied. (semi-continuous culture) or continuous culture (continuous culture) was particularly advantageous when using different culture media depending on the growth conditions in cultured plant cells, tissues, and organ cultures when harvesting by one sterilization You can continue to use.

따라서 본 발명은 제작이 간편하며, 100% 무균작업이 가능하고 식물세포 및 조직배양 뿐만 아니라 완전한 무균조작이 필요한 미생물 배양용 생물반응기에도 쉽게 적용될 수 있다.Therefore, the present invention is easy to manufacture, 100% aseptic work is possible and can be easily applied to plant cell and tissue culture as well as microbial cultivation bioreactor requiring a complete aseptic operation.

또한 작업이 간편하고 작업성이 우수하기 때문에 배양하고자 하는 생물반응기의 수가 많을수록, 그리고 규모가 클수록 인건비 절감액이 크다.In addition, because the operation is simple and excellent workability, the larger the number of bioreactors to be cultured, and the larger the size, the greater the labor savings.

이와함께 세포, 조직 및 기관을 대규모로 배양하기 위해 배양에 사용되는 용기를 대형의 스텐레스 스틸(stainless steel)로 제작할 경우에도 본 발명의 시스템을 그대로 이용할 수 있다.Along with this, the system of the present invention can be used as it is even when a container used for cultivation for large-scale culturing of cells, tissues and organs is made of large stainless steel.

Claims (1)

탱크(2)와 생물반응기(10) 그리고 일단의 스팀공급관(70)과 연결된 무균이송장치(30)로 이루어진 통상의 구조에 있어서, 이송장치(30)는 이송장치본체(31)와 이송관(32)으로 구성하여 각각의 연결관(34)(35)으로 결합하되 이송장치본체(31)에는 각각의 밸브(V1)(V2)를 구성하여 이를 선택적으로 열어 소독함을 특징으로 하는 생물반응기의 배지 및 세포의 무균이송장치.In the conventional structure consisting of a tank 2, a bioreactor 10 and a sterile transfer device 30 connected to one end of the steam supply pipe 70, the transfer device 30 is the transfer device body 31 and the transfer pipe ( 32) to each of the connecting pipes (34, 35) coupled to the transfer device body 31 of each of the valves (V1) (V2) by selectively opening and disinfecting the bioreactor characterized in that Aseptic conveying apparatus of medium and cells.
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