KR100204157B1

KR100204157B1 - 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 재생방법

Info

Publication number: KR100204157B1
Application number: KR1019940025766A
Authority: KR
Inventors: 강수형; 박충일; 박장현; 나규흠
Original assignee: 유충식; 동아제약 주식회사
Priority date: 1994-10-08
Filing date: 1994-10-08
Publication date: 1999-06-15
Also published as: KR960014342A

Abstract

숙주에서 발현된 봉입체 형태의 인 과립구 콜로니 자극인자를 회수하고; 상기의 회수된 인 과립구 콜로니 자극인자를 카오트로픽제, 2M 요소 및 수산화나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 용액에 용해시키고; 상기의 용해된 인 과립구 콜로니 자극인자를 pH를 9 내지 12.5로 유지하면서 최종 단백질 농도 0.2 내지 1.2 ㎎/㎖의 희석액을 제조하고; 상기의 인 과립구 콜로니 자극인자의 희석액을 일정시간동안 반응시키고; 상기 반응액의 pH를 5.5로 조절하여 인 과립구 콜로니 자극인자의 활성화를 종료시키는; 공정을 포함하는 인 과립구 콜로니 자극인자의 활성화 방법을 이용하면 봉입체 형태의 인 과립구 콜로니 자극인자에 인위적으로 산화제를 가하지 않고서도 자연적으로 천연의 구조를 형성하도록 하여 활성형으로 재생시킬수 있으며, 아울러 활성형 단백질로의 수율 또한 높일 수 있다.

Description

활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 재생 방법

제1도는 발효공정을 통하여 얻은 세포 배양액, 세포파쇄 상등액, 봉입체, 봉입체 세척액을 소듐 도데실 설페이트 폴리 아크릴 아마이드겔(PAGE)상에서 전기영동한 사진이다.

제2도는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 재생 과정중 각각 0시간, 8시간, 16시간경과 후 및 산 침전 후의 시료를 역상 고속 액체 크로마토그래피로 분석한 그래프이다.

[산업상 이용분야]

본 발명은 재조합 DAN(recombinant DNA) 기술에 의하여 대장균으로부터 생성되는 봉입체(inclusion body)의 형태의 인 과립구 콜로니 자극인자(human granulocyte colony stimulating factor)를 활성형으로 재생시키는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세히는 봉입체 형태의 인 과립구 콜로니 자극인자를 적당한 카오트로픽제(chaotropic agent)나 계면활성제(surfactant)를 포함하고 있는 알칼리성 용액에서 용해시킨후 천연 구조를 회복하기에 적당한 반응조건을 제공함으로써 활성형으로 재생(renaturation)시키는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

재조합 DNA 기술이 획기적으로 발달되면서 미생물 숙주를 이용한 호르몬(hormone), 사이토카인(cytokine), 인터페론(interferon)등과 같은 많은 생리활성 단백질들의 대량 생산이 가능하여 졌으며, 이들 중 일부는 이미 유용한 의약품으로 사용되어 오고 있다.

일반적으로 대장균은 유전자 조작이 용이하고 목적 단백질의 생성량이 많으며 배양이 순조롭다는 장점을 지니고 있어 숙주 세포로 주로 사용되고 있으나, 반면 대장균내에서 과발현되는 목적 단백질의 대부분이 불용성의 결합체(insoluble aggregates), 즉 봉입체(inclusion body)의 형태로 생산되므로 그 자체의 생리적 기능이 상실된 상태의 목적 단백질을 제공한다는 단점도 지니고 있다. 따라서 대장균내에서 생산된 봉입체 형태의 목적 단백질을 목적에 맞게 이용하기 위하여서는 봉입체 형태의 목적 단백질을 활성형으로 재생시키는 단계가 필수적으로 요구된다.(Goeddel 등 : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1979, 106, Williams 등 : Science 215, 1982, 697, Weis 등 : Nature 302, 1983, 72 Paul 등 : Eur. J. cell Biol. 31, 1983, 171.) 단백질의 활성은 단백질이 자신의 천연구조(native conformation)를 정확히 형성할 때 나타나게 되므로 목적 단백질 고유의 생리적 기능을 회복할 수 있기 위하여서는 단백질 덩어리인 봉입체를 적절한 용제에서 용해시킨 후 천연구조로 재생시켜야만 한다. (Marston : Biochem. J. 240, 1986, 1).

대장균으로부터 생산된 봉입체들은 세포를 파쇄한 후 원심분리, 여과 등의 물리적 방법으로 쉽게 분리할 수 있으며, 세정제(detergent)가 포함된 완충액으로 수회에 걸쳐 세척함으로써 비특이적으로 오염됨 대장균 단백질들을 제거하여 목적 단백질의 순도를 증가시킬 수 있다(Langley 등 : Eur. J. biochem, 163, 1987, 313).

세척된 봉입체들의 천연구조를 재생하기 위하여 사용되어온 기존의 방법으로는 봉입체 형태의 목적 단백질을 요소(urea), 구아니딘-염산(guanidine-hydrochloride)과 같은 카오트로픽제나 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate)와 같은 계면활성제가 포함된 용액, 또는 강산이나 강염기 용액에 용해시키고; 글루타치온(glutathione)과 같은 산화제를 첨가하거나, 또는 공기로 자연 산화시킴으로서 단백질 분자내의 디설파이드 결합(disulfide bond)을 형성하도록하여; 천연구조로 재생되게 하는 방법이 있다.

불활성형의 봉입체를 용해하여 활성형으로 재생시키는 과정은 변성상태로부터 부분적으로 구조가 형성된 중간체(intermediate)의 생성을 거쳐 천연구조를 가진 활성형으로 전환되는 단계를 거친다. 그러나 중간체는 완전한 천연구조로 진행되려는 경향과 응집체(aggregate)를 형성하여 불활성형으로 진행되려는 경향을 공유하고 있으며(Mitraki등 Bio/Technology 7,1989,690), 이 중간체가 두가지 방향으로 진행하려는 경향은 pH, 반응온도, 반응시간, 목적 단백질의 농도와 생화학적 특성 등의 외부환경 조건에 따라 크게 달라지게 된다.

따라서, 목적 단백질의 활성형으로의 재생과정에 있어서, 여러 가지 영향인자가 결정적인 변수로 작용하므로 이에 대한 조건 확립은 필수적이다. 일반적으로 재생과정의 수율에 영향을 주는 중요한 조건으로는 다음과 같은 것들이 있다.

① pH

② 반응 온도

③ 반응 시간

④ 용액내의 이온함량

⑤ 목적 단백질의 생화학적 특성

⑥ 목적 단백질의 순도

⑦ 목적 단백질의 농도

⑧ 산화·환원제의 첨가

상기한 영향인자들은 목적 단백질에 따라 특이하게 결정되는 것으로 일반적인 지침은 없고 상황에 따라 조건을 확립해야 한다. 즉 재생과정에 적용하는 목적 단백질에 대한 특성을 조사하여 이에 따라 각 영향인자에 대한 조건을 확립해야 한다.

인 과립구 콜로니 자극인자는 사이토카인류의 하나로서, 조혈계(hematopoietic system)에서 골수(bone marrow)의 다기능 조혈간 세포(pluriopotent hematopoietic stem cell)로부터 과립구 세포(granulocyte)와 거식 세포(macrophage)등으로의 분화 및 성숙을 유도 조절한다(Burgess등 : Blood 56, 1980, 947). 대장균으로부터 생산되는 인 과립구 콜로니 자극인자는 N-말단의 메치오닌을 포함하여 175개의 아미노산으로 구성되어 있으며 분자량은 약 19KD정도이고 생체내에 존재하는 천연형과 동일한 생물학적 활성을 나타낸다(Souza 등 : Science 232, 1986, 61).

특히 인 과립구 콜로니 자극인자의 분자내에는 5개의 시스테인(cysteine)이 존재하는데 36번과 42번 시스테인 사이와 64번과 74번 시스테인 사이에는 디설파이드 결합이 형성되며 17번 시스테인은 디설파이드 결합에 참여하지 않는다. 상기 36번과 42번, 64번과 74번의 시스테인 사이의 2개이 디설파이드 결합은 인 과립구 콜로니 자극인자의 천연 구조 형성과 생물학적 활성유지에 결정적인 역할을 하며 17번 시스테인은 세린(serine)으로 교체되어도 인 과립구 콜로니 자극인자의 생물학적 활성에 변화를 주지 않으므로 천연구조 형성과 생물학적 활성에는 전혀 기여를 하지 않는 것으로 알려져 있다(winfield 등 : Biochem. J. 256, 1988, 213). 그러나 17번 시스테인은 반응조건에 따라 분자간 디설파이드 결합(intermolecular disulfide bond)이나 분자내 디설파이드 결합(intramolecular disulfide)을 형성하여 천연구조와 다른 구조를 형성할 가능성이 있으므로 이를 배제하기 위해서는 최적 조건을 수립해야 한다(Piget 등 : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 1986, 7643).

인 과립구 자극인자의 활성화에 사용되어온 종래의 방법으로는 숙주에서 발현된 봉입체 형태의 인 과립구 자극인자를 회수한 후, 2% 사코실에 용해시킨 후, 희석의 과정을 거치지 않고, 용해된 상태로 천연 구조로의 재생을 수행하는 방법이 있다. 이때 사용되는 완충용액은 50mM 트리스 HCl이며, pH 8.0, 온도 25℃, 단백질 농도 1∼2㎎/㎖ 천연구조로의 재생을 수행한다. 재생 촉진을 위해 CuSO₄등을 첨가하기도 한다.

[발명의 목적]

본 발명은 변성된 단백질들이 최적 조건하에서는 봉입체 형태로 진행되려는 경향보다는 자신의 천연구조로 진행되려는 경향을 지니고 있다는 사실에 기초하여, 산화제를 인위적으로 도입하지 않고 외부환경의 조건, 예를 들면, pH, 반응온도, 반응시간, 단백질의 농도등을 적절히 조절함으로써 봉입체 형태의 인 과립구 자극인자가 자연적으로 자신의 천연구조를 형성하여 활성을 회복하도록 하고, 아울러 상기 단백질의 수율도 높이는데 그 목적을 둔다.

[발명의 구성]

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여 숙주에서 발현된 봉입체 형태의 인 과립구 콜로니 자극인자를 회수하고; 상기의 회수된 인 과립구 콜로니 자극인자를 카오트로픽제, 2M 요소 및 수산화나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 용액에 용해시키고; 상기의 용해된 인 과립구 콜로니 자극인자를 pH를 9 내지 12.5로 유지하면서 최종 단백질 농도 0.2 내지 1.2㎎/㎖로 희석 시키고; 상기의 희석된 인 과립구 콜로니 자극인자의 희석액을 일정시간동안 반응시키고; 상기 반응액의 pH를 5.5로 조절하여 인 과립구 콜로니 자극인자의 활성화를 종료시키는; 공정을 포함하는 인 과립구 콜로니 자극인자의 활성화 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 방법에 있어서, 용해된 인 과립구 콜로니 자극인자의 용액의 pH는 10.0∼12이고 희석된 인 과립구 콜로니 자극인자 용액의 최종 농도는 0.2 내지 1.0㎎/㎖로 유지되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 pH 10.5, 단백질 농도 0.4㎎/㎖이다.

본 발명에 있어서 희석은 pH 9∼11의 증류수로 행하며, 희석된 용액의 pH는 인산을 이용하여 조절한다.

본 발명에 있어서, 활성형으로의 재생 공정은 4 내지 37℃의 온도에서 행하여지는 것이 바람직하고 재생시간은 8∼24시간이 바람직하며, 활성화 반응 종료를 위한 pH는 인산으로 조절한다.

즉, 본 발명의 방법은 산화·환원제의 첨가를 배제하여 산화·환원제에 의한 인위적인 디설파이드 결합의 형성을 배제하고 pH, 반응온도, 반응시간, 인 과립구 콜로니 자극인자의 농도를 최적화함으로써 높은 수율의 활성형으로의 진행을 유도한다.

[실시예]

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 일 예일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

인 과립구 콜로니 자극인자의 봉입체를 포함한 대장균 세포배양액 15L를 할로우 휘버 카트리지(Hollow fiber catridge, Amicon사 : cutoff value 0.1㎛)를 사용하여 3L 정도까지 농축시킨 뒤 5mM 트리스, 1mM EDTA(pH 8.2)의 완충액 30L를 연속적으로 가하면서 한외 여과방법으로 세포 배양액을 세척한 다음 회수하였다.

[실시예 2]

상기 실시예 1에서 얻어진 세척된 대장균 배양액을 8,000 psi로 압력을 유지한 가울린(Gaulin) 세포 파쇄기에 3회 연속적으로 통과시켜 파쇄시킨 후, 얻어진 세포파쇄액을 12,000g에서 30분 동안 원심분리하여 상등액은 제거하고 봉입체인 침전만을 회수하였다.

[실시예 3]

상시 실시예 2에서 원심 분리하여 얻은 봉입체 침전율 0.2g 라이소자임(lysozyme), 1mM EDTA, 1g 디옥시콜레이트(deoxycholate)가 포함된 완충액 3L에 잘 현탁시킨 후 실온에서 1시간 정도 교반시키고 5mM 트리스, 1mM EDTA, 0.1% Triton X-100(pH 8.2)의 완충액 30L를 연속적으로 가하면서 한외 여과방법으로 봉입체를 세척하였다. 이때 봉입체로부터 핵산, 인지질, 당지질 등을 다량 제거시킬 수 있었다. 세척이 끝난 봉입체는 다시 12,000g에서 30분 동안 원심 분리하여 회수하였다.

[실시예 4]

상시 실시예 3에서 회수한 봉입체 침전율 2M 요소용액 30L에 현탁시키고 호모믹서(homomixer)로 잘 분산시킨 다음, 1몰 수산화나트륨을 가하면서 용해시킨다. 봉입체 분산 용액의 용해는 pH가 10이 되면서 가시적으로 나타나기 시작하여 1몰 수산화 나트륨을 pH 12.5까지 계속 가하여 봉입체 분산용액이 완전히 용해되도록 하였다. 봉입체 용해액의 단백질 농도는 2.0 g/L로 맞추고 pH 10.5의 증류수 120L를 가하여 희석하였다. 최종 봉입체 희석액의 pH는 1몰 인산을 가하여 10.5로 재조절 하였으며 최종단백질 농도는 0.4 g/L가 되었다. 단백질의 농도 및 pH의 활성화에의 영향을 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.

[실시예 5]

봉입체 최종 희석액의 인 과립구 콜로니 자극인자는 초기에는 완전히 변성된 형태로 존재하지만 실온(20℃)에서 자연 산화시킴에 따라 천연 구조 형태인 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자로 점차 재생 되어진다. 반응 시간을 16시간으로 하였을때의 반응 온도가 활성화에 미치는 영향과 반응온도를 20℃로 하였을때의 시간이 활성화 효율에 미치는 영향을 각각 하기 표 3및 표 4에 나타내었다.

[실시예 6]

실온에서 16시간 방치하여 자연적 산화에 의한 인 과립구 콜로니 자극인자의 활성형으로의 재생 과정은 1몰 인산으로 봉입체 최종 희석액의 pH를 5.5로 조절하여서 종료시켰다. 이때 대장균 유래 단백질 및 변성상태인 인 과립구 콜로니 자극인자가 다량 침전으로 가라 앉게 되고 상등액에는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자가 높은 비율로 존재함을 확인할 수 있었다.

[실시예 7]

상기 실시예 4 내지 6의 방법으로 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자로의 재생과정을 종료시킨 후 상등액만을 회수하여 효소면적 측정법에 의해 활성형인 과립구 콜로니 자극인자의 양을 측정하였다. 인 과립구 콜로니 자극인자에 대한 모노크로날 항체가 흡착된 96 웰 플레이트(96 well plate)에 0, 39.0, 78.1, 156.2, 312.5, 625, 1250, 2500 pg/㎖ 농도의 표준액과 상등액을 1/50,000, 1/100,000, 1/200,000로 희석하여 만든 검액을 200㎕씩 넣고 실온에서 2시간 동안 1차 반응을 시켰다. 1차 반응이 끝나면 세척용 완충액으로 3회 세척한 다음 효소-항체 접합체를 각 웰에 200㎕씩 넣고 실온에서 2시간 동안 2차 반응을 시켰다. 2차 반응이 끝나면 미리 조제한 발색 용액을 200㎕식 각 웰에 가한 후 실온에서 20분간 발색 반응을 시키고 50㎕의 반응 정지액을 넣어 발색 반응을 종료시킨 다음 450㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준액의 양을 횡축, 표준액의 흡광도 값을 종축으로 하여 표준곡선을 로그(log)그래프 용지에 그리고 이 표준 곡선에 검액의 흡광도를 대입하여 검액 중의 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 양을 결정하였다. 다시 각 검액의 희석비를 곱하여 상등액 중 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 양을 계산하고 그 결과를 상기표 1내지 4에 나타내었다.

[효과]

상기 실시예로부터 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 재생은 4 내지 37℃의 온도, 8 내지 24시간의 반응시간, 0.2 내지 1.2㎎/㎖의 단백질의 농도 및 9 내지 12.5의 pH조건에서 가장 바람직하게 진행됨을 알 수 있었으며, 본 발명의 방법은 인 과립구 콜로니 자극인자의 활성화 공정의 일부인 디설파이드 결합의 형성단계에 관한 것이지만 그 효과는 전체 생산수율에 결정적인 영향을 미칠 정도로 현저하여 인 과립구 콜로니 자극인자의 수율이 월등히 높아짐도 알 수 있었다.

아울러 본 발명의 공정은 인위적인 산화, 환원제의 첨가를 배제함으로써 공정을 단축시키고, 비용을 절감하는 효과도 지닌다.

Claims

숙주에서 발현된 봉입체 형태의 인 과립구 콜로니 자극인자를 회수하고; 상기의 회수된 인 과립구 콜로니 자극인자를 카오트로픽제, 2M 요소 및 수산화나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 용액에 용해시키고; 상기의 용해된 인 과립구 콜로니 자극인자를 pH를 9 내지 12.5로 유지하면서 최종 단백질 농도 0.2 내지 1.2 ㎎/㎖의 희석액을 제조하고; 상기의 희석된 인 과립구 콜로니 자극인자의 희석액을 일정 시간동안 반응시키고; 상기 반응액의 pH를 5.5로 조절하여 인 과립구 콜로니 자극인자의 활성화를 종료시키는; 공정을 포함하는 인 과립구 콜로니 자극인자의 활성화 방법.
제1항에 있어서, 상기 용해된 인 과립구 콜로니 자극인자의 용액의 pH는 10.0∼12.0인 방법.
제1항에 있어서, 상기 희석액의 최종 단백질의 농도는 0.2 내지 1.0 ㎎/㎖인 방법.
제1항에 있어서, 상기 희석액을 pH 9∼11의 증류수로 희석하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 희석액의 pH를 인산을 이용하여 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 활성형으로 재생 공정은 4 내지 37℃의 온도에서 행하여지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 활성형으로의 재생 공정은 8 내지 24시간동안인 방법.
제1항에 있어서, 상기 활성형으로의 재생 공정의 종료를 위한 pH를 인산으로 조절하는 방법.