KR0178367B1 - Got 아이소자임 분석법 - Google Patents

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KR0178367B1
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나까모또 히로유끼
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Abstract

내용없음.

Description

GOT 아이소자임 분석법
본 발명은 특히 임상용의 GOT 아이소자임 분석법 (GOT isozyme assay) 에 관한 것이다.
GOT (글루타민-옥살초산 트랜스아미나제; glutamic-oxaloacetic transaminase)는 심근층, 간세포 및 골격근과 같은 조직에 주로 포함되어 있는 효소이다. 임상적으로, 이러한 조직들이 예를들면 심근경색, 간질환, 근염 및 영양실조와 같은 상태하에서 손상될 때, GOT 가 혈액으로 흘러들어가므로, 혈청에서 GOT 농도가 상승하게 된다.
GOT가 세포중에 별도고 분포된 2개의 아이소자임을 갖는다는 것은 공지이다. 즉, 그들 중에 하나는 세포의 상층분획에서 발견되며 (s-GOT), 다른 하나는 미토콘드리아 분획에 포함되어 있다(m-GOT). 혈액중에서 총 GOT를 기준으로 한m-GOT 농도 또는 m-GOT 수준은 상술한 질병, 특히 급성 또는 전격성 간염 및 알콜성 간염의 진단 및 예후에 유용하다.
통상의 GOT 아이소자임 분석법으로서는, 예를 들면 전기영동, 이온-교환 분석 및 면역 분석이 공지되어 있다. 그러나, 이러한 분석 방법들은 복잡한 공정을 요구하고, 긴 작업시간을 필요로 하며, 임상적으로 사용되는 통상의 자동분석기를 사용하여서는 수행될 수 없다.
이러한 문제점들을 해결하기 위한 목적으로, 일본국 특허공개 제237797/1988 호에는 단백질 존재하에 프로테아제의 의해 시료중의 아이소자임을 선택적으로 억제하고, 손상되지 않고 남아있는 또다른 아이소자임을 측정하는 아이소자임 분석방법이 기재되어 있다.
본 발명의 목적은 통상의 자동 분석기를 사용하여 수행될 수 있는 개선된 GOT 아이소자임 분석법을 제공하는 것이다.
종래의 아이소자임 분석에 있어서 프로테아제로서 프로테이나제 K를 사용할 때, 단백질 부재하에도 s-GOT를 선택적으로 억제할 수 있을 뿐 아니라 분석 매질을 안정화할 수 있다는 것이 발견되었다.
따라서, 본 발명은 프로테이나제 K에 의해 시료중의 s-GOT를 선택적으로 억제하고, 손상되지 않고 남아있는 m-GOT를 측정함을 특징으로 하는 GOT 아이소자임 분석법을 제공하는 것이다.
프로테이나제 K(EC 3, 4, 21, 14)는 미생물, 특히 트리티라치움 알붐(Tritirachium album)에 의해 생산되는 세린-프로테이나제이며 pH6.0~11.0에서 안정하다.
본 발명에 따라, 프로테이나제 K는 시료중의 s-GOT의 역제를 위해 보통 1~1000단위/ml, 바람직하게는 5~500단위/ml의 양으로 사용된다.
s-GOT의 억제 후, m-GOT는 통상의 면역 분석법에 의해 측정될 수 있다.
본 분석법에서는 알칼리성 조건하에 안정한 프로테이나제 K가 사용된다. 그러므로, m-GOT의 안정한 측정은 시료 및 시약을 변질시키지 않는, 예를들면 NADH를 함유한 알칼리성 매질중에서 성취될 수 있다.
s-GOT의 억제 후, 과량의 프로테이나제 K를 프로테아제 억제제에 의해 실활시키면, 프로테아제의 의해 야기될 수 있는 방해가 이후의 측정단계에서 방지될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 프로테이나제 K에 의해 시료중의 s-GOT를 선택적으로 억제하고, 프로테아제 억제제에 의해 과량의 포르테이나제 K를 실활시킨 후, 손상되지 않고 남아있는 m-GOT를 측정함을 특징으로 하는 GOT 아이소자임 분석법을 제공하는 것이다.
프로테아제 억제제의 특정예로는 다음과 같은 것들이 있다:키모스타틴, 아프로티닌, 트립신 억제제, 류펩틴, 페닐메틸술포닐 플루오라이드, (p-아이디노페닐) 메탄술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드 및 에틸 4-(6-구아니디노 헥사노일옥시)벤조에이트 메탄술포네이트.
프로테아제 억제제의 양은 개개의 측정조건에 따라 다양할 수 있다. 예를들면 키모스타틴을 억제제로 사용할 때, 그의 농도는 보통 0.5 ~ 50mM, 바람직하게는 1 ~ 10mM이다.
프로테아제 억제제는 부분적으로 또는 전체적으로 측정시약에 배합될 수 있다.
본 분석법이 수행되는 시료는 혈청 및 혈장과 같은 임상시료일 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명된다.
[실시예 1]
10개의 혈청시료 (각각 0.02ml) 각각에, NADH(0.3mM) 및 프로테이나제 K(16단위/ml)를 함유한 40mM CHES [2-(시클로헥실아미노)에탄술폰산]완충액 (pH9.0 : 0.25ml)를 가하고, 37℃에서 5분 동안 반응시킨다. 그리고나서, 효소 분석 시약(0.1ml)을 37℃에서 혼합물에 가한다. 효소 분석 시약은 락테이트 탈수소 효소(LDH; EC 1.1.1.28; 10 단위/ml). 말레이트 탈수소 효소 (MDH; EC 1.1.1.37; 5단위/ml), L-아스파르트산(740mM) 및 α-케토클루타르산(45mM)을 함유한 100mM HEPES (N-2-히드록시 에틸피페라진-N'-에틸술폰산) 완충액 (pH 7.5)으로 구성되어 있다. 2분 후, 340nm에서 흡광도의 감소를 측정한다. 그 데이터를 기초로 하여 m-GOT 활성을 계산한다.
한편, 동일한 시료에 대해 에이껭 케미칼사 (Eiken Chemical Co. Ltd)의 m-GOT 분석키트를 사용하여 통상의 면역 분석을 수행한다.
본 발명의 분석법의 결과는 표1에 나타낸 바와 같이 통상의 면역 분석 결과와 매우 상관관계가 크다.
Figure kpo00001
[실시예 2]
프로테이나제 K (30 단위/ml) 및 α-키모트립신 (EC 3.4.21.1; 21.1; 500 단위/ml)을 각각 100mM CHES 완충액 (pH 9.0)에 용해시키고 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 100mM CHES 완충액 (pH 9.0)으로 100배 희석한다. 희석용액(0.6ml)에, 1 단위/ml 의 s-GOT를 함유한 표준 s-GOT(0.1ml)를 가하고, 37℃에서 5분 동안 반응시켜 s-GOT를 억제시킨다. 그리고나서, NADH(0.2mM), LDH(10 단위/ml), L-아스파르트산 (270mM) 및 α-케토글루타르산(12mM)을 함유한 100mM 트리스 완충액(pH 7.5; 3.0ml)을 가한 후, 용액중에 남아있는 s-GOT 활성을 측정한다. 구경측정곡선으로부터, 남아있는 프로테아제 활성을 알수 있다.
상술한 공정 후에도 프로테이나제 K는 100% 활성으로 남아있으나, α-키모트립신의 활성은 단지 19%로 저하되어 있다는 것을 알수 있다. 그러므로, 프로테이나제 K는 알칼리성 조건하에서 매우 안정하다.
[실시예 3]
프로테아제 억제제에 의해 과량의 프로테이나제 K를 실활시키는 본 발명의 분석법을 통상의 면역 분석법과 비교한다.
하기의 4개의 시약을 제조한다:
시약 1:프로테이나제 K(200 단위/ml)를 함유한 500mM 트리스완충액(pH7.8); 시약 2:키모스타틴(5mM), 피루베이트 옥시다제(POP; EC 1.2.3.3; 40 단위/ml), 퍼옥시다제(POD; EC 1.11.1.7; 10 단위/ml), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘(도넷; 2mM), 염화마그네슘(6mM), 티아민 피로포스페이트(8mM) 및 인산 2 수소칼륨(2mM)을 함유한 100mM HEPES 완충액(pH 7.0); 시약 3:L-아스파르트산(400mM), α-케토글루타르산(20mM), 4-아미노산티피린(0.4mM) 및 옥살아세테이트 데카르복실라제(OAC; EC 4.1.1.3; 40 단위/ml)를 함유한 100mM HEPES 완충액(pH 7.0); 시약 4:100mM 시트레이트 완충액.
10개의 혈청시료(각각 0.05ml)각가에, 시약 1(50㎕)를 가하고, 37℃에서 약 5분 동안 방응시킨다. 그리고나서, 시약 2(0.5ml)를 가하고, 37℃에서 다시 약 5분 동안 반응시킨다. 시약 3(0.5ml)를 가한 후, 같은 온도에서 정확히 30분 동안 반응을 계속한다. 최종적으로 시약 4(2.0ml)를 가한다. 실온에서 약 5분후, 555nm에서 시료의 흡광도를 측정한다. 시료의 m-GOT 활성은 구경측정곡선으로부터 알수 있다.
한편, 동일한 시료에 대해 에이껭 케미칼사의 m-GOT 분석키트를 사용하여 통상적인 면역 분석을 수행한다.
본 발명의 분석결과는 표2에 나타낸 바와 같이 통상적인 면역 분석 결과와 높은 상관관계가 있다.
Figure kpo00002

Claims (5)

  1. pH 8.5 ~ 10에서, 보조효소 NADH 또는 NADPH의 존재하에, 프로테이나제 K에 의해 시료중의 s-GOT를 선택적으로 억제하고, 손상되지 않고 남아있는 m-GOT를 측정함을 특징으로 하는, 글루타민-옥살초산 트랜스아미나제(GOT) 아이소자임 분석법.
  2. 제1항에 있어서, 시료가 혈청 또는 혈장인 분석법.
  3. 제1항에 있어서, m-GOT 의 측정을 흡광도 분석을 기초로 한 통상의 효소 분석법에 의해 수행하는 분석법.
  4. 제1항에 있어서, s-GOT 의 억제 후 프로테아제 억제제에 의해 과량의 프로테이나제 K를 실활시키는 단계를 더 포함하는 분석법.
  5. 제4항에 있어서, 프로테아제 억제제가 키모스타틴, 아프로티틴, 아프로티닌, 트립신 억제제, 류펩틴, 페닐메틸술포닐 플루오라이드, (p-아미디노페닐)메탄술포닐플루오라이드 히드로클로라이드 및 에틸 4-(6-구아니디노헥사노일옥시) 벤조에이트메탄술포네이트의 군에서 선택되는 분석법.
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