KR0177313B1 - 재조합 대장균으로부터 헬리코박터 필로리의 우레아제 b 제조방법 - Google Patents

재조합 대장균으로부터 헬리코박터 필로리의 우레아제 b 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장균을 이용하여 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori: H. pylori)의 항원 결정부위 단백질인 우레아제 B(Urease B)를 융합단백질의 형태로 제조하는 방법에 관한 것으로, 헬리코박터 필로리의 우레아제 B 유전자에 히스티딘과 유비퀴틴 유전자가 연결된 융합유전자를 포함하는 His-Ub-Ure B 융합단백질 발현벡터로 형질전환된 대장균을 융합단백질의 발현에 적합한 조건에서 배양하고, 융합단백질이 발현된 재조합 대장균 세포를 구아니딘 염이 포함된 완충용액에서 분쇄하고, 원심분리한 상등액을 히스티딘 결합수지 친화성 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 본 발명의 His-Ub-Ure B 융합단백질의 제조방법에 의하면 H. pylori 감염 진단과 백신 개발에 유용하게 사용될 수 있는 His-Ub-Ure B 융합단백질을 높을 수율로 대량 생산할 수 있다.

Description

재조합 대장균으로부터 헬리코박터 피롤리의 우레아제 B 제조방법
제1도는 우레아제 B(Urease B) 유전자를 본 발명의 대장균 발현벡터 pETHUB-UREB로 클로닝하는 과정을 도시한 것이다.
제2도는 본 발명의 발현벡터 pETHUB-UREB로 형질전환된 대장균을 배양하여 얻은 세포 침전물을 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
제3도는 본 발명의 발현벡터 pETHUB-UREB로 형질전환된 대장균을 배양하여 얻은 세포 침전물을 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 후 유비퀴틴 단일 항체를 이용하여 웨스턴 블록팅(western blotting)한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 대장균을 이용하여 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori, 이하 H. pylori라 함)의 항원 결정부위 단백질인 우레아제 B(Urease B)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 위, 십이지장 궤양의 원인균으로 보고된 헬리코박터 필로리의 항원인 우레아제 B(Urease B, 이하 Ure B라 함)를 히스티딘(Histidine, 이하 His라 함)과 유비퀴틴(Ubiquitin, 이하 Ub라 함)과의 융합단백질(His-Ub-Ure B)로 발현시켜 H. pylori 감염 진단과 백신 개발에 유용하게 사용될 수 있도록 한 것이다.
H. pylori는 워렌과 마샬에 의해 십이지 궤양 환자에게서 최초로 분리배양된 미호기성 그람음성 나선형의 박테리아로서(Warren and Marshall, Lancet, 1, 1273-1275(1983)), 위점막 상피세포 사이에서 서식하는 것으로 알려졌다. H. pylori는 일단 서식하기 시작하면 평생동안 기생하는 미생물로 각종 위, 십이지장 질환환자의 위 점막에서 높은 빈도로 발견되는데, 최근의 여러 보고들에 의해 위염 및 위, 십이지장 궤양을 일으키는 근본적인 원인균인 것으로 밝혀졌으며(Alper J., et al., Science, 260, 159-160(1993)), 위암까지 일으킬 가능성이 있다는 사실도 보고된 바 있다(Parsonnet, et al., New Eng. J. Med., 325, 1127-1131(1991); The Urogust Study Group, Lancet, 341, 1359-1362(1993)).
1994년 미국 보건성(National Institute of Health, U.S.A.) 주최 컨센서스 회의에서는 위, 십이지장 궤양을 H. pylori에 의한 질병으로 규정하고, 기존의 위산 조절제 요법 대신 항생제를 이용하여 H. pylori를 박멸시키는 것을 치료요법으로 추천할 것을 결정하였다(NIH, NIH concensus development conference Helicobacter pylori in peptic ulcer disease(1994)).
위 질환 증상이 없는 정상인을 대상으로 위내시경 검사, 방사성 동위원소로 표지된 요소호흡 실험 및 혈청학적인 실험을 통해 H. pylori 보균율을 조사한 결과, 미국 등의 선진국에서는 20대중 10내지 20%가 H. pylori 보균자였으며, 연령이 증가함에 따라 보균율이 증가하여 50 내지 50대에서는 50% 정도의 감염율을 보였다(Berkowicz J and Lee A, Lancet 2, 680-681(1987); Goodwin C. S., et al., J, Infect. Dis. 155, 488-494(1987); von Wulffen H., et al., J. Clin. Microbiol., 24, 716-720(1986); Jones D. M., et al., J. Clin. Pathol., 37, 1002-1006(1984)). 반면 후진국이나 개발 동상국에서는 어린 연령층에서도 보균율이 높은 것으로 보고되었는데(Graham D. Y., al., Scand. J. Gastroenterol., 23, 9-13(1988), Meraud F., et al., J. Clin. Microbiol., 27, 1870-1873(1989)), 우리나라의 경우도 후진국의 H. pylori 보균율과 유사하여 20 내지 30대중 약 80 내지 90%가 감염되어 있는 것으로 나타났다(정현채 등, 대한 소화기 병학회지, 20, 47-56(1988)); 백승철 등, 대한 미생물 학회지, 25(6), 455-462(1990)).
H. pylori의 항원중 하나인 우레아제(urease)는 분자량이 각각 다른 두개의 서브유니트(우레아제 A:29.5kDa와 우레아제 b:66kDa)로 이루어지며, 이들은 각각 동일 몰비 형태로 육중체를 형성한다. 우레아제는 우레아(urea)를 암모니아로 가수분해하여 주위 환경의 pH를 상승시킴으로써 H. pylori의 생존을 돕는 작용을 한다. 또한 우레아제는 여러가지의 검사방법, 예를 들어 혈청내에 형성된 우레아제 항체를 측정하거나 우레아 호흡검사를 통해 방사성 동위원소로 표지된 이산화탄소를 검출하는 방법에 의해 쉽게 검출될 수 있다(Graham D. Y., et al., Lancet, 1, 1174-1177(1987)). 따라서 H. pylori로부터 우레아제를 정제하여 그의 특성을 밝힌 보고가 많이 나오고 있다(Hu L. T. and Mobley HLT., Infection and Immunity 58, 992-998(1990); Nagata K. et al., Infection and Immunity, 60, 4826-4831(1992); Evans D. J., et al., Micobiol, Pathogenesis, 10, 15-26(1991); Dunn B. E. et al., JBC, 265, 9464-9469(1990); urbett G. R., et al., Infection and Immunity, 60, 5259-5266(1992)).
우레아제의 정제는 H. pylori를 배양한 후 세포를 파쇄하거나 적정 완충용액으로 용출한 후 겔 여과 칼럼 크로마토그래피, 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피 및 폐닐 소수어 칼럼 크로마토그래피를 실시하는 등 일련의 과정을 포함하고 있다. 그러나 이러한 방법에서는 여러가지 문제점이 야기되는데, 첫째 H. pylori는 미호기성 박테리아이므로 배양이 까다로워 많은 양의 배양이 어렵다는 문제점이 있고, 또한 전염될 우려가 있기 때문에 취급시 주위를 요한다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 재조합 유전자 조작기술을 이용하여 대장균으로부터 H. pylori 우레아제를 발현시킨 바 있으며(Cussac V., et al., J. of Bacteriology, 174, 2466-2473(1992); Hu L. T. and Mobley HLT Infection and Immunity, 61, 2563-2569(1993)), 또한 재조합 대장균에서 발현된 H. pylori 우레아제를 음이온 교환, 페닐 소수성, Mono Q 그리고 겔 여과 칼럼 크로마토그래피하여 비활성인 두개의 우레아제 서브유니트 단백질을 확인하였다(Hu L. T. et al., Infection and Immunity, 60, 2657-2666(1992)). 이 방법에서는 세포를 파쇄하여 상등액을 이용하는데, 세포 파쇄시 상등액에는 일반적으로 대장균에 존재하는 단백질 가수분해 효소가 많이 발생하여 우레아제를 분해시킬 우려가 있으며, 또한 초원심분리하여 세포막 성분을 제거하는 방법은 대량생산에 적합하지 않다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선하고 우레아제 단백질을 효율적으로 대량생산할 수 있는 방법에 관해 연구하던 중, 히스티딘과 유비퀴틴 유전자를 우레아제 B 유전자에 연결시켜 His-Ub-Ure B 융합단백질을 유전공학적인 방법으로 대장균에서 대량생산하는데 성공함으로써 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 대장균으로부터 발현될 수 있는 H. pylori 우레아제 B의 융합단백질을 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 H. pylori의 우레아제를 융합단백질의 형태로 제조하는 방ㅂㅂ을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori : H. pylori) 우레아제 B 유전자에 히스티딘과 유비퀴틴 유전자가 연결된 융합유전자, 상기 융합유전자를 포함하는 히스티딘-유비퀴틴-우레아제 B(His-Ub-Ure B) 융합단백질 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 융합단백질의 발현에 적합한 조건에서 배양하고, 융합단백질이 발현된 재조합 대장균 세포를 구아니딘 염이 포함된 완충용액에서 분쇄하고, 원심분리한 상등액을 히스티딘 결합수지 친화성 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 His-Ub-Ure B 융합단백질의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 좀 더 상세히 설명한다.
본 발명의 융합단백질에 사용되는 유비퀴틴은 76개의 아미노산으로 구성된 분자량 8,500 달톤의 단백질로서 모든 진핵세포에 존재하나 대장균과 같은 원핵세포에는 존재하지 않는다. 이러한 유비퀴틴에 단백질을 연결시켜 융합단백질 형태로 발현시키면 유비퀴틴은 연결된 단백질의 발현율을 증가시키거나 단백질 분해효소로부터 단백질을 보호해 주는 역할을 한다(Sabin E. A. et al., Biotechnology, 7, 705-709(1989)). 또한 유비퀴틴은 항 유비퀴틴 항체를 이용함으로써 그 발현을 확인할 수 있꼬, 정제에도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 우레아제 B를 히스티딘 및 유비퀴틴과의 융합단백질로 제조하기 위해서, 먼저 H. pylori(ATCC 43504)로부터 핵산(DNA)을 추출하고 우레아제 B(Ure B)의 염기서열 정보(Labigne A., et al., J. Bacteriol., 173, 1920(1991))로부터 Ure B 단백질을 코드하는 Ure B 유전자의 5'-말단과 3'-말단에 대응하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)용 시발체를 고안 합성한다. 이들 시발체는 5'-말단에 본 발명에서 합성한 유비퀴틴 유전자의 3'-말단과 중복되는 염기서열이 존재하도록 하고 이에 대응되는 시발체에는 종료코돈과 제한효소 인식부위를 삽입하여, 5'-말단에 8개의 히스티딘이 첨가된 유비퀴틴의 시작코돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료코돈에서 단백질 합성이 완료되도록 하고, 동시에 대장균 발현벡터로 클로닝이 용이하도록 한다.
상기 시발체는 이용하고 H. pylori의 DNA를 주형으로 해서 PCR 반응으로 원하는 부위의 유전자를 증폭하고, 증폭된 유전자를 인공합성된 히스티딘과 유비퀴틴 유전자와 결합시킨다(His-Ub-Ure B). 이어서 결합된 His-Ub-Ure B 유전자를 PCR 반응으로 대량 증폭하고, 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 적절한 대장균 발현벡터에 삽입하여 His-Ub-Ure B 융합단백질 발현벡터를 제조한다. 상기의 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 본 유전자의 발현에 적당한 조건에서 배양한다. 단백질의 생성여부는 통상적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 후 유비퀴틴 단일 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅 분석으로 His-Ub-Ure B의 발현을 확인할 수 있다.
재조합 His-Ub-Ure B 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균을 앰피실린이 함유된루리아(Luria) 배지에서 진탕배양한 후 이를 M9 배양액에 옮겨 진탕배양하여, 박테리아의 성장속도가 650nm에서 흡광도 0.3 정도로 될 때 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 His-Ub-Ure B의 발현을 유도한다. 상기 배양액을 원심분리하여 대장균 세포를 침전시킨 후, 단백질의 가수분해 활성을 막기 위해 카오트로픽(chaotrophic) 시약인 구아니딘 염을 침전된 세포에 첨가하여 초음파 분쇄기로 세포를 파쇄한 다음 흔들어 주고 원심분리한다. 상등액을 취하여 구아니딘 염, 50mM 트리스 완충용액으로 미리 평형된 히스티딘 결합수지 친화성 칼럼에 흘려보내 결합시킨 후 유리된 상태로 남아 있는 불순물을 상기 완충용액으로 씻어낸다. 이어서 카오트로픽 활성이 낮은 완충용액으로 바꾸기 위해 완충용액(8M의 우레아, 50mM Tris, 0.2M NaCl(pH 8.0))으로 칼럼을 세척한 다음, 동일한 완충용액에 15mM의 이미다졸이 함유된 완충용액으로 세척하여 결합된 오염 단백질을 제거한다. 칼럼에 결합된 His-Ub-Ure B 융합단백질은 동일 완충용액에 0.4M의 이미다졸이 함유된 완충용액으로 충분히 용출시키고 각 부분을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 His-Ub-Ure B 융합단백질 부분만을 모음으로써 고순도의 His-Ub-Ure B 융합단백질을 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[H. pylori DNA로부터 우레아제 B 유전자의 증폭]
[단계 1]
슬레이프의 방법(Schleif R. F., et al., Practical Methods in Molecular Biology, p98 Springer, New York(1981))에 따라 H. pylori(ATCC 43504)로부터 전체 DNA를 추출하였다. 즉, H. pylori 균주를 5%의 소 태아 혈청이 첨가된 브루셀라 액체배지(Brucella Broth, Difco Cat No. 0495-01-1)에 접종한 뒤 혐기성 배양용기(Anaerobic jar : Difco Cat No. 1951-30-1)에서 5% O2와 10% CO2존재하 37℃에서 4내지 5일간 배양하였다. 세포 침전물을 GES 용액(60% 구아니디움 티오시아네이트, 0.1M EDTA, 0.5% 사르코실)에 용존시켜 동일부피의 페놀/클로로포름 용액으로 추출한 다음 이소프로판올로 전체 DNA를 침전시켰다. 이 침전물을 100㎕의 TE 완충용액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5)에 용존시켰다.
[단계 2]
기존에 알려진 Ure B 유전자의 염기서열 정보(Labigne A., et al., J. Bacteriol., 173, 1920(1991))로부터 다음과 같은 시발체를 합성하였다 :
시발체 PUREBT2 : 5'-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTATGAAAAAGATTAGCAGAAA-3'(5'-말단의 25번째 핵산까지는 유비퀴틴 유전자 3'-말단의 25번째 핵산까지와 동일한 염기서열을 갖고, 26번째 핵산부터는 우레아제 B와 동일한 염기서열을 갖도록 고안되었다)
시발체 PUREBBAML : 5'-AAAAAGGATCCGTCGACTATCACTTTATTGGCTGGTTTAG-3'(우레아제 B의 해독이 종료되도록 두개의 종료코돈을 가지고 있고, 동시에 제한효소 SalI 및 BamHI 인지부위를 갖고 있다).
[단계 3]
반응 튜브에 단계 1에서 얻은 H. pylori DNA 1ng을 주형으로 시발체 PUREBT2 2㎍, 사벌체 PUREBBAML 2㎍을 넣은 다음, 10㎕의 10배 중합 완충용액(500mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 9.0, 1.0% 트리톤 X-100), 10㎕의 2mM dNTP(각각 2mM dGTP, 2mM dCTP, 2mM dATP 및 2mM dTTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피가 100㎕가 되도록 하여, 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(담금단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 PCR을 40회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에서 분리하여 약 1690 염기쌍의 DNA가 증폭되었음을 확인하였고, 동일 조건의 아가로즈 겔로부터 분리정제하였다(이하, 이 DNA 단편을 '단편 UREB'라 함).
[실시예 2]
[유비퀴틴 유전자의 합성]
[단계 1]
기존에 알려진 유비퀴틴 유전자의 염기서열 정보(Ozkaynak, et al., EMBO, J., 6, 1429-1439(1987))로부터 다음과 같은 시발체를 합성하였다 :
시발체 UBI1 : 5'-CCCCATATGCATCATCACCATCATCACCATCATCAAATTTTCGTCAAAACTCTAACAGGGAAGACTATAACCCTAGAGGTTGAATCTTCCGACACTATTGACAACGTCAA-3'(이는 5'-말단에 제한효소 NdeI 인지부위(밑줄)를 갖고, 시작코돈인 메티오닌 코돈 다음에 8개의 히스티딘 코돈을 갖도록 고안되었고)
시발체 UBI2 : 5'-TAGTTGCTTACCAGCAAAAATCAATCTCTGCTGATCCGGAGGGATACCTTCTTTATCTTTGAATTTTACTTTTGACGTTGTCAATAGTCTC-3'(이는 5'-말단의 20개 핵산이 시발체 UBI3의 3'-말단의 핵산과 동일한 염기서열을 갖도록 고안되었고)
시발체 UBI3 : 5'-ACCACCGCGGAGTCTCAACACCAAGTGAAGAGTAGATTCCTTTTGGATGTTGTAGTCAGACAAGGTTCTACCATCTTCTAGTTGCTTACCAGCAAAAA-3'(이는 5'-말단에 SacII 인지부위(밑줄)를 갖고, 3'-말단의 20개 핵산은 시발체 UBI2의 5'-말단의 핵산과 동일한 염기서열을 갖도록 고안되었다).
[단계 2]
반응 튜브에 단계 1에서 합성한 3개의 올리고뉴클레오티드, 즉, 시발체 UBI1 2㎍, 시발체 UBI2 0.02㎍ 및 시발체 UBI3 2㎍을 넣은 다음, 10㎕의 10배 중합 완충용액(500mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 9.0, 1.0% 트리톤 X-100, 2.5mM MgCl2), 10㎕의 2mM dNTP, 2.5 단위체의 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피가 100㎕가 되도록 하여 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 PCR 반응을 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하여 약 270염기쌍의 DNA를 추출정제한 후(이하, 이 DNA 단편을 '단편 His-Ub'라 칭한다), 20㎕의 TE 용액에 용존시켰다.
[실시예 3]
[UREB 유전자 발현벡터의 제조]
Novagen 사에서 구입한 플라스미드 pET11C(Novagen Inc., Madison WI 53711, U.S.A.) 2㎍을 제한효소 NdeI과 BamHI으로 NEB 완충용액 3(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM dTT, pH 7.0)의 조건하에서 완전절단한 뒤 이를 0.7% 아가로즈 겔로 분리하여 약 5.6kb 단편을 분리정제하였다(이하, 이 단면을 '단편 PNB'라 칭함).
한편, 실시예 1에서 얻은 UREB 유전자의 5'-말단과 실시예 2에서 얻은 단편 His-Ub의 3'-말단은 25개 염기가 서로 중복됨으로 이들을 다음과 같이 PCR 반응으로 결합시켰다. 반응 튜브에 단편 UREB 10ng, 단편 His-Ub 10ng, 시발체 UBI1 2㎍ 및 시발체 PUREBBAML 2㎍을 넣은 다음 10㎕의 10배 중합 완충용액, 10㎕의 2mM dNTP, 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피가 100㎕가 되도록 하여 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 PCR 반응을 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전절단한 후 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액에 용존시켰다. 이를 '단편 His-UB-UREB-N/B'라 한다.
접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 단편 His-UB-UREB-N/B와 100ng의 단편 PNB, 2㎕의 10배 접합 반응용액, 10단위체의 T4 리가제와 증류수를 가하여 총부피가 20㎕가 되도록 하여 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 대장균 HB101(ATCC33694) 컴피턴트 세포에 형질전환시켜 단편 His-UB-UREB를 포함하는 발현벡터 pETHUB-UREB를 얻었다.
제1도는 우레아제 B(Urease B) 유전자를 대장균 발현벡터 pETHUB-UREB로 클로닝하는 과정을 도시한 것이다.
상기 형질전환된 대장균(E. coli) BL21(DE3) pLYS.S(pETHUB-UREB)를 1996년 1월 9일자로 한구과학기술연구원 부설 생명공학 연구소 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0225BP 호로서 기탁하였다.
[실시예 4]
[대장균으로부터 UREB 유전자의 발현유도]
상기 실시예 3에서 얻은 발현벡터 pETHUB-UREB를 발현숙주인 대장균 BL21/(DE3)/pLys(Novagen Inc., Madison W I53711, U.S.A.)에 형질전환시켰다.
형질전환된 대장균 균주를 50㎍/㎖의 앰피실린과 34㎍/㎖의 클로람페니콜이 함유된 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 1㎖을 100㎖의 앰피실린과 클로람페니콜을 함유하는 루리아 배지로 옮겨 37℃에서 약 4시간동안 진탕배양하여 박테리아의 흡광도가 650nm에서 약 0.3 정도가 될 때 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)를 최종농도가 0.5mM이 되게 첨가하였다. IPTG를 첨가하기 직전, 그리고 첨가한지 1, 5 및 7시간 후에 각각 10㎖씩을 취하고 이를 10,000×G에서 15분간 원심분리하여 각각 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물을 램리 등의 방법(Laemmli et al., Nature 227, 680(1970))에 따라 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨 후, 쿠마시블루(Coomassie Brilliant blue R250)로 단백질을 염색하였다.
이어서, 겔상에서 분리된 단백질을 가지고 유비퀴틴 단일항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시한다. 먼저, 겔상에서 분리된 단백질을 토빈의 방법(Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4750(1979))에 따라 니트로 셀룰로즈 막(Rio-Rad Lab., Pore size 0.22㎛, CA, U.S.A.)으로 전달시키고 이 막을 0.5% 트윈 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH 7.0, 0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간 동안 약하게 흔들면서 파쇄시켰다. 이어서 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 유비퀴틴 단일항체를 1000배 희석하여 첨가하고 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들면서 반응시켰다. 계속해서 서양 고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)로 표시된 항 사람면역 글로블린 G(Bio-Rad Lab, anti-human IgG-HRP, 0.01㎎, CA U.S.A.)를 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS 1:500으로 희석시켜서 첨가하여 상온에서 1시간동안 흔들면서 반응시키고, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM 트리스 완충용액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 이막을 400㎍/㎖의 4-클로로-1-나프톨고 0.03% 과산화수소수가 함유된 500mM 트리스 완충용액을 가하여 발색시켰다.
제2도는 발현벡터 pETHUB-UREB로 형질전환된 대장균을 배양하여 얻은 세포 침전물을 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 제 m열은 표준단백질 분자량을 표시하는 것이고, 제1열은 IPTG를 가하기 직전의 세포 추출물을 나타낸 것이고, 제2열은 IPTG를 가한 후 배양하여 수득한 세포 추출물을 나타낸 것이고, 제3열은 정제된 His-Ub-Ure B 이다.
제3도는 발현벡터 pETHUB-UREB로 형질전환된 대장균을 배양하여 얻은 세포 침전물을 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 후 유비퀴틴 단일 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅(western blotting)한 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 제 m열은 표준단백질 분자량을 표시하는 것이고, 제1열은 대조군으로 tPA가 발현된 대장군 배양액의 경우를 나타낸 것이고, 제2열은 His-Ub-Ure B 단백질이 발현된 대장균 배양액의 경우를 나타낸 것이다.
[실시예 5]
[His-Ub-Ure B의 정제]
[단계 1] 대장균 세포의 배양과정
재조합 His-Ub-Ure B 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pETHUB-UREB로 형질전환된 재조합 균주(E. coli BL21(DE3) pLYS.S)를 앰피실린이 함유된 루리아(Luria) 배지에서 12시간 동안 진탕배양한 후, 이중 5㎖를 1ℓ의 M9 배양액으로 옮겨 37℃에서 약 3 내지 4시간 동안 진탕배양하였다. 박테리아의 성장속도가 650nm에서 흡광도 0.3정도로 될 때 IPTG를 최종농도 0.5mm이 되게 첨가하여 재조합 His-Ub-Ure B의 발현을 유도하였다. IPTG를 첨가한지 약 5시간 후에 세포 배양을 끝내고 원심분리기(Beckman, JB6, Rotor : JS4. 2, 미국)를 이용하여 3,500rpm에서 30분간 원심분리하여 대장균 세포 침전물을 수집하였다.
[단계 2] 세포 용해 및 His-Ub-Ure B 융합단백질의 정제과정
His-Ub-Ure B 융합단백질이 발현된 대장균 세포 1.5g에 6M 구아니딘 염, 50mM 트리스 완충용액(pH 8.0) 10㎖를 넣은 다음, 초음파 분쇄기(HEAT SYSTEMAS-ULTRASONICS, INC., W225, 미국)를 이용하여 50%의 출력으로 약 1분 동안 초음파를 처리하여 세포를 풀어준 후 30분 동안 흔들어 주고, 다시 원심분리기로 12,000rpm에서 20분간 원심분리하였다. 침전물은 버리고 상등액을 취하여 상기 완충용액으로 미리 평형시킨 히스티딘 결합수지(Novagen사, 미국) 친화성 칼럼(1.8㎖ bed)에 통과시켜 His-Ub-Ure B를 칼럼에 결합시킨 후, 유리된 상태로 남아있는 불순물을 상기 평형 완충용액으로 제거하였다. 우레아 완충용액(8M 우레아, 50mM 트리스, 0.2M NaCl(pH 8.0))으로 칼럼을 세척하여 카오트로픽 활성이 낮은 상태로 바꾸고, 우레아 완충용액에 15㎖ 이미다졸이 포함된 완충용액으로 오염 단백질을 완전히 제거하였다. 이미다졸의 농도가 0.4M 함유된 우레아 완충용액으로 칼럼에 결합된 His-Ub-Ure B 융합단백질을 용출하여 소디움 도데실 설페이드(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인한 후, His-Ub-Ure B 융합단백질 부분만을 모음으로써 고순도의 His-Ub-Ure B 융합단백질을 얻을 수 있었다.

Claims (6)

  1. 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori : H. pylori)의 우레아제 B 유전자에 히스티딘과 유비퀴틴 유전자가 연결된 융합유전자.
  2. 제1항의 융합유전자를 포함하는 히스티딘-유비퀴틴-우레아제 B(His-Ub-Ure B) 융합단백질 발현벡터.
  3. 제2항에 있어서, 발현벡터 pETHUB-UREB.
  4. 제2항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
  5. 제4항에 있어서, 대장균 BL21(DE3) pLYS.S(pET HUB UREB).
  6. 제4항의 대장균을 융합단백질의 발현에 적합한 조건에서 배양하고, 융합단백질이 발현된 재조합 대장균 세포를 구아니딘 염이 포함된 완충용액에서 분쇄하고, 원심분리한 상등액을 히스티딘 결합수비 친화성 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 His-Ub-Ure B 융합단백질의 제조방법.
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