KR0171893B1 - 세포장해성 약물에 대항하는 암세포의 다약제 내성의 역전을 위한 화합물 및 그를 포함하는 제약학적 조성물 - Google Patents

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Description

세포장해성 약물(cytotoxic drugs)에 대항하는 암세포의 다약제 내성의 역전을 위한 화합물 및 그를 포함하는 제약학적 조성물

제1도는 24 시간 노출후 CHO-kl (●―●, ○―○) 및 CHO-Adr(▲―▲, △―△) 세포계 내에서 토레미펜 농도 증가의 효과를 나타낸 그래프이다 (여기서, 닫힌 기호(●와 ▲)는 AAG(2 mg/ml)의 부재를 나타내고 열린 기호(○ 및 △)는 AAG의 존재를 나타낸다).

제2도는 토레미펜이 없을 때(●―●) 및 1μM(○―○), 5.0μM(○―○) 및 10 μM(○―○)로 존재할 때의 CHO-kl 세포의 아드리아마이신에 대한 민감성을 나타낸 그래프이다.

제3도는 토레미펜이 없을 때(▲―▲) 및 1.0 μM(△―△), 5μM(□―□) 및 10 μM(■―■)로 존재할 때의 CHO-Adr 세포의 아르리아마이신에 대한 민감성을 나타낸 그래프이다.

제4도는 각각 0.05 μM 및 0.1 μM의 아드리아마이신(□―□, ■―■)에 대한 CHO-kl 및 CHO-Adr 의 민감성 및 CHO-kl (●―●) 및 CHO-Adr (▲―▲) 세포계 내 10 μM 토레미펜의 존재 하에 아드리아마이신 세포 독성에 미치는 AAG(0-2 mg/ml)의 농도 증가의 효과를 나타낸 그래프이다.

제5도는 토레미펜이 없을 때(●―●) 및 10μM으로 존재할 때 (○―○) CHO-kl 세포 내 1 μM 아드리아마이신의 소비 시간 경과를 나타낸 그래프이다.

제6도는 토레미펜이 없을 때(▲―▲) 및 10 μM으로 존재할 때(■―■) CHO-Adr 세포 내 1 μM 아드리아마이신의 소비 시간 경과를 나타낸 그래프이다.

제7도는 화학적 증감제에 대한 MDR 비의 관계를 나타낸 그래프이다.

제8도는 DOX 상승 작용에 대한 플라스마 토레미펜 및 플라스마 데스메틸토레미펜의 관계를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 세포장해성 약물에 대항하는 암세포의 다약제 내성을 역전시키기 위한 토레미펜 및 그의 대사 산물인 N-데메틸토레미펜 (4-클로로-1,2-디페닐-1-(4-(2-메틸아미노)에톡시)페닐)-1-부텐) 및 4-히드록시토레미펜 사용에 관한 것이다.

세포장해성 약물로 인간의 암을 치료하는 것은 현대 임상 암 치료의 중요한 부분이다. 세포장해성 화학 요법은, 초기에는 종종 효과적일지라도, 저항성 종양 세포군의 성장으로 인하여 결국 종종 실패한다. 저항력은 전형적으로 동시에 몇 가지 세포 독소 약제에 대항하여 발달하며, 따라서 이를 다약제 내성(multidrug resistance, MDR)이라 부른다 (Deuchards KL, Ling V: 암 화학 요법에 있어서 p-당단백질 및 다약제 내성, Seminars in Oncology, 1989, 16, 156-165); Pastan I, Gottesman M : 인간의 암에 있어서 다약제 내성, NM. Engl. J. Med. 1987, 316,1388-1393). MDR의 메카니즘은 잘 알려지지 않았으나, 적어도 두가지 세포적 사실이 MDR과 일치하는 것으로 제시되어 왔다 ; 첫째, 170 kD(gp 170)의 분자량을 갖는 특이 세포막 당단백질 및 그의 mRNA(mdr-1)의 증가된 발현(Fuqua SAW, Moretti-Rojas IM, Schneider SL, Mcguiro WL : 인간의 유방암 세포 내에서 p-당단백질 발현, Cancer res. 1987, 47, 2103-2106), 및 둘째, 세포 내로 세포장해성 약물의 감소된 축적(Deuchards KL, Ling V : 암 화학 요법에 있어서 p-당단백질 및 다약제 내성, Seminars in Oncology, 1989, 16, 156, 165; Bell DR, Gerlich JH, Hartner N, Buick RN, Ling V : 난소 암 내 p-당단백질의 검출 ; 다약제 내성과 연관된 분자 표시제. J. Clin, Oncol. 1985, 3, 311-315). 이 두가지 사실이 연관되는 것은 당연하며 아마도 gp 170은 세포로부터 세포장해성 약제의 증가된 유출의 원인이 되는 것으로 생각되는 단백질이다.

MDR의 역전은 인간의 암에서 세포장해성 치료의 결과를 증진시키는 매우 유리한 방도일 것이다. 이 역전은 세포막 내 및 세포 내부에 있는 주요 칼슘 결합 단백질인 칼모둘린에 영향을 주는 화합물에 의하여 가능한 것으로 나타났다 (Miller RL, Bukowski RW, Budd CT, et al, 칼모둘인 저해제인 트리플루페라진에 의한 독소루비신 내성의 임상 조절 : 단계 I/II 시험. J. Clin. Oncol. 1988, 6, 880-888). 유사하게 글루타치온-s-전이제의 변화된 활성 및 낮아진 막전위는 MDR과 연관되는 것으로 보여졌다 (Cowan KH : 약제 내성에 있는 글루타치온-s-전이제의 역할, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 1989, 30, 674 ; Kramer RA, Zakher J. Kim G : 후천적 및 새로운 다약제 내성에 있어서 글루타치온의 산화 환원 순환의 역할. Science 1988, 241, 694-697). 단백질 키나제 C 또한 MDR의 발달에 중요할 것이다. 그것은 세포 내로 다양한 조절 신호의 변환에 결정적인 역할을 하며, 세포장해성 약물은 이 단백질을 억제하는 것으로 보고되었다 (Palayoor ST. Stein JM Hait WN : 항 종양제에 의한 단백질 키나제 C의 억제 : 약제 내성을 위한 의미. Biochem. Biophy. Res. Commun. 1987, 148, 718-725). MDR을 역전시키는 것으로 알려진 메카니즘에 영향을 주는 화합물들은 MDR의 역전을 얻는데 필요한 투여량 범위에서 독성을 나타내기 때문에, 보통 임상적으로 사용되지 않는다(Gottesman MW : 다약제-내성을 역전시키는 약품의 임상 시험. J. Clin. Oncol. 1989, 7, 409-410).

약제 타목시펜(tamoxifen)은 최근 MDR을 역전시키는 활성을 갖는 것으로 나타났다 (Foster BJ, Grotzinger KR, Mckoy WM, Rubinstein LV, Hamilton TC : 타목시펜 또는 퍼헥실린 말레이트를 사용한 두가지 인간의 유방암 세포계 내에서 아드리마이신에 대한 유도된 내성의 조절, 암 화학요법 약리학 22 : 147-152, 1988). 다른 화학적 증감제와 유사하게, 약물 내성을 역전시키기 위해 필요한 생체 및 타목시펜의 농도는 상당한 독성 없이는 얻어지지 않을 것이다.

토레미펜(Toremifene)(Fc-1157a)은 트리페닐에틸렌 구조를 갖는 항 에스테로겐 화합물이다. 그것의 약리학적 성질인 항에스트로겐 및 종양적 효과는 예컨대 미합중국 특허 제 4,696,949 호 및 공개 : 칼리오(Kallio) 일행 : 새로운 트리페닐에틸렌 화합물, Fc-1157a. I 호르몬 효과 암 화학 요법 약리학 1986, 17, 103-108 ; 캔거스(Kangas) 일행 : 새로운 트리페닐에틸렌 화합물, Fc-1157a. II 항종양 효과 암 화학 요법 약리학 1986, 17, 109-113 ; Ebbs SR, Roborts JV, Baum M : 유방암 내 항오에스트로겐 작용의 대안적 메카니즘, Lancet 1987, ii, 621 등에 기술되어 있다.

본 발명은 토레미펜 및 그 대사 산물인 N-데메틸토레미펜 및 4-히드록시토레미펜의 새로운 사용에 관한 것이다. 이러한 화합물, 특히 토레미펜은 높은 투여량에서도 이 화합물의 비교적 낮은 독성으로 인하여 임상적으로 효과적인 투여량이 얻어질 수 있기 때문에, 세포장해성 약물에 대한 내성을 역전시키는데 성공적으로 사용될 수 있다. 후천적 내성 및 선천적 내성 모두 이 화합물의 영향을 받는다. 이 성질은 중요하며 세포장해성 치료의 임상적 효능을 크게 증진시킬 수 있다. 하기에 사용된 바와같이, 용어 토레미펜 화합물은 토레미펜, N-데메틸토레미펜 또는 4-히드록시토레미펜 또는 이것의 제약학적으로 허용 가능함 염을 말한다. 본 발명의 주요 특징은 하기와 같다:

1. 토레미펜 화합물, 특히 토레미펜은 다약제 내성 암세포를 세포장해성 약물, 특히 독소루미신, 및 에토포시드, 시스플래티늄 및 시클로포스파미드에 민감하도록 변화시킨다.

2. 토레미펜 화합물 및 세포장해성 약물의 조합은 각각 단독으로 치료하는 경우의 독성에 현저한 정도로 영향을 주지 않는다.

3. 토레미펜 화합물이 단일 치료로서 사용될 때, 특히 유방암에서 항종양 활성을 가진다고 하더라도, MDR의 역전은 유방암에 제한되지 않는다. 사실상, 모든 유형의 종양이 통합적으로 치료될 수 있다.

4. MDR의 역전에 있어서, 토레미펜 화합물은 세포장해성 화학 요법에 부가적인 것으로서, 그렇지 않다면 달리 지시될 것이다. 그러므로 토레미펜 화합물은 기정의 암 화학 요법의 원칙을 바꾸지 않는다.

5. MDR 역전에 있어서, 토레미펜 화합물의 농도가 높은 것이 낮은 농도 보다 더 효과적이다. 그러므로, MDR 역전을 위한 토레미펜 화합물의 투여량은 높아야 한다. 토레미펜이 MDR의 역전을 얻는데 요구되는 그러한 투여 수준에서 매우 안전한 약제임이 임상 단계 I, II 및 III 연구에서 나타났다. 이것은 임의의 다른 MDR 역전제로 부터는 얻을 수 없는 독특한 성질이다.

본 발명은 적어도 하나의 상기 세포장해성 화합물로 암을 치료함에 있어서, 세포장해성 화합물에 대한 암세포의 다약제 내성을 역전시키기 위해 토레미펜 또는 그 대사 산물인 N-데메틸토레미펜 또는 4-히드록시토레미펜 또는 이들의 비독성 제약학성으로 허용 가능한 염의 사용을 포함하여 구성되는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 암 치료에 있어서, 세포장해성 화합물에 대한 암세포의 다약제 내성의 역전에 사용하기 위한 의약품의 제조에 있어서, 토레미펜, N-레메틸토레미펜 또는 4-히드록시토레미펜, 또는 이들의 제약학적으로 허용가능함 비독성 염의 사용을 제공한다. 바람직하게는 MDR의 역전을 위한 화합물은 토레미펜이다. 다약제 내성에 기여할 수 있는 세포장해성 화합물은 질소 머스타드, 에틸렌이민 화합물 및 알킬설포네이트와 같은 알킬화제, 항 핵분열제, 메르캅토푸린, 아자티오프린, 플루오로우라실 및 메토트렉세이트와 같은 항대사물, 시스플래틴 및 카르보플래틴과 같은 플래티늄 화합물 및 항생제를 포함한다. 항생제는 독소루비신 및 다우노루비신과 같은 블레오미신 및 안트라시클린 항생 물질을 포함한다.

임상적 치료 계획은 하기와 같이 기술할 수 있다 : 토레미펜은 높은 투여량, 바람직하게는 최대 내성 투여량으로 사용해야 한다. 투여량 범위는 성인 1 인당 약 60-600 mg/day 로 요구된다. 바람직한 투여량은 성인 1 인당 약 400 mg/day 로 평가된다. 약제는 바람직하게 정제로서 경구적으로 투여된다.

토레미펜으로의 MDR 역전의 계획 :

1. 토레미펜의 투여는 가능한 한 높은 혈중 농도 및 조직 농도를 얻기 위해 세포장해성 치료 전 5-10 일 전에 시작한다.

2. 세포장해성 치료는 정상적으로 제공된다.

3. 토레미펜 투여는 세포장해성 치료 기간 마지막까지 계속된다.

세포장해성 약물은 보통 주기적으로 (약 1 일 내지 2 주의 치료 기간후 2 주 내지 3 달의 간격을 두고) 제공되기 때문에, 토레미펜 치료도 또한 약물에 대한 간격이 동시에 시작되도록 주기적으로 주어진다. 토레미펜 투여가 세포장해성 치료 전 5-10 일 전에 시작되기 때문에, 토레미펜의 치료 기간은 세포장해성 치료 기간 보다 5-10 일 더 길어질 것이다.

상기 제안된 토레미펜의 치료 계획은 N-데메틸토레미펜 및 4-히드록시토레미펜, 및 또한 모든 세 화합물의 제약학적으로 허용 가능함 염에 적용될 것이다. N-데메틸토레미펜 및 4-히드록시토레미펜은 토레미펜의 대사 산물이며 MDR 역전을 위한 효과적인 농도는 토레미펜으로 치료하는 기간 동안 얻어진다.

치료는 상승 조성물의 투여로 수행될 수 있다. 그러므로 본 발명은, (a) 토레미펜, N-데메틸토레미펜, 4-히드록시토레미펜 또는 이들의 제약학적으로 허용 가능한 비독성 염; (b) (a) 이외의 세포장해성 화합물; 및 (c) 제약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하여 구성되는 제약학적 상승 조성물을 제공한다. 조성물은 (a), (b) 및 (c)를 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 치료 계획에서 논의된 바와같이, 토레미펜 화합물은 세포장해성 화합물과 별도로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 따라서 본 발명은 암치료에 있어서 동시적, 별도의, 또는 연속적 사용을 위해 조합된 제제로서, (a) 토레미펜, N-데메틸토레미펜 또는 4-히드록시토레미펜 또는 이들의 제약학적으로 허용 가능한 비독성 염; 및 (b) (a) 이외의 세포장해성 화합물을 함유하는 생성물을 제공한다. 생성물은 단위 생성물 형태로 (a) 및 (b)를 조합하여 제조될 수 있다.

상승 조성물 또는 조합된 제제에 있어서 활성 성분 (a) 및 (b)는 단위 투여량 형태로 존재할 수 있다.

하기 실험은 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위한 것이다.

[실험]

[I. 시험관 내 실험]

초기의 세포 성장 연구는 독소루비신(doxorubicin) 민감성 및 저항성 세포 내에 토레미펜 + 독소루비신 결합의 효과를 조사하기 위해 수행되었다. CHO-Adr 세포 뿐만 아니라 야생형 CHO-kl 세포를 사용하여 세포 배양을 수행하였으며, CHO-Adr 세포는 0.4 μg/ml 의 독소루비신의 존재 하에 독소루비신 저항 클론들의 일련의 단계별 선택에 의해 선택되었다. 세포주는 독소루비신에 대한 저항성이 있으나, 동시에 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids), 다우노루비신(daunorubicin), 악티노마이신 D(actinomycin D) 및 콜히친(colchicine)에 대하여 교차 저항성이 있었다. 저항성 세포는 독소루비신이 없을 때 세포 배양액 내에서 안정했다. 세포주 둘 다는 5% 의 새로 태어난 송아지의 혈청, 5% 태내의 송아지 혈청, 항생 물질 및 3 mM 클루타민으로 보충된 Hams F10 배지 내에서 배양되었다. 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 당층 배양주로서 유지시켰다. CHO-Kl 및 CHO-Adr 세포 내 약물 민감성은 반자동 측색 MTT 검사에 의하여 측정되었다. 이 검사는 존재할 수 있는 세포의 미토콘드리아의 탈수소화 효소에 의해 분광도법으로 측정된 청색 포르마잔 생성물로의 MTT(3-U, 4,5-디메틸티아졸-2-일 A-2, 5-디페닐 테트라졸룸 브로마이드, 티아졸릴 블루우)의 세포적 환원에 의존한다. 세포들을 96-웰 플래이트 상에 시딩(seeding)하고 5% CO₂내 37℃ 에서 12 시간 동안 정착시켰다. 성장 배지 내 희석된 적절한 약물 농축액을 24 시간 동안 첨가했다. 토레미펜을 95% 에탄올 원액에 용해시켰고, 독소루비신 원액을 물에서 제조했다. 최종 배양 배지 내 에탄올 농도는 결코 0.1%를 초과하지 않았으며 세포 성장에 영향을 주지 않았다. 세포를 포스페이트 완충 염수로 두 번 세척하고 48 시간 동안 200 ㎕ 의 신선한 배지 안에 더 놓아둔 후, 24 시간 동안 약물과 함께 배양했다. 이 배양이 끝날 무렵 0.1 mg MTT를 각 웰에 첨가하고 4 시간 동안 배양했다. 배양액을 조심스럽게 흡인하고 결정을 100 ㎕ DMSO(디메틸 설폭사이드) 내에 용해시켰다. 엘리사(ELISA) 멀리스칸 판독기 상에서 540 nm에서의 흡광도를 즉시 읽었다. 대조군과 비교하여, 결과를 약물 처리된 세포의 흡광도의 백분율로서 나타냈다.

토레미펜은 α₁-산 당단백질(AAG)과 어느 정도 결합하기 때문에, 이 단백질을 몇몇 시험 시리즈의 성장 배지에 첨가하여 그것의 MDR의 역전에 영향을 줄 수 있는지를 측정하였다.

[결과]

이 검사의 결과를 표 1 및 제1 내지 6도에 나타내었다.

[토레미펜의 독성]

CHO-Kl 세포주 및 CHO-Adr 세포주는 토레미펜의 24 시간 노출에 대하여 똑같이 민감했다. 10 μM 이상의 토레미펜에 대하여 독성을 감지할 수 있었다. 암 환자에게서 발견된 것과 똑같은 농도(2 mg/ml)로 첨가된 AAG는 토레미펜 독성(제1도)으로부터 세포주 둘다를 보호했다.

[토레미펜에 의한 독소루비산(아드리아마이신) 세포장해성의 상승 작용]

1 내지 10 μM 토레미펜의 증가된 투여량을 가지는 CHO-Kl 세포 내에 독소루비신 독성의 증가된 상승 작용이 있었다. 이 효과는 보다 낮은 독소루비신 농도(제2도)에서 가장 뚜렷했다. 상승 작용의 정도가 더 크다 하더라도, CHO-Adr 세포에 있어서도 토레미펜에 의한 유사한 상승 작용이 있었다(제3도).

[토레미펜에 의한 독소루비신 독성의 상승 작용에 미치는 AAG의 효과]

CHO-Kl 및 CHO-Adr 세포주를, 토레미펜 부재 하에 동일한 독성을 나타내며 10 μM 토레미펜이 존재할 때 생존에 있어 유사한 감소를 나타내는 독소루비신 농축물과 함께 배양했다(제4도). 0.1 내지 2 mg/ml 농도의 AAG의 효과가 토레미펜에 의해 생성된 상승 효과 상에서 평가되었다. 0.5 mg/ml 이상의 AAG 의 농도에서, 토레미펜의 상승 효과는 점차로 역전되었으며, 가장 높은 수준인 2 mg/ml 에서는 독소루비신의 독성에 대해 토레미펜은 더 이상 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 이것은 저항성 및 야생형 세포주 모두에서 동일하게 일어났다.

[독소루비신 운반 상의 토레미펜의 효과]

2 μM 토레미펜은 저항성 세포(제6도)에서가 아닌 야생형 CHO-Kl 세포주(제5도)에서 1 μM 독소루비신의 약물 축적을 증가시켰다.

[CHO-Kl 및 CHO-Adr 세포 내 토레미펜에 의한 독소루비신 독성의 상대적인 상승 작용]

토레미펜의 증가된 농도에 따라, 상승 작용에 대한 가파른 투여량 반응 곡선을 나타내었으며, 이러한 기울기는 야생형 세포에서 보다 저항성 세포에서 더욱 컸다 (표 1).

a : 세포들은 본문에서 기술된 바와같이 24 시간 동안 약물에 노출되었고, 세포의 생존성은 MTT 검사에 의해 측정되었다. 각 수지는 적어도 3 번의 실험의 평균이다.

b : 토레미펜으로 처리된 세포의 IC으로 대조군의 IC을 나누어 계산됨.

2 개의 인간 난소 암세포주 내의 토레미펜 및 독소루비신의 조합을 파모(Farmos)의 암 연구 실험실에서 발생시켰으며, 1 개의 인간의 흑색종 세포내의 상기 토레미펜 및 독소루비신의 조합은 투르크 대학 부인과의 그렌만(Grenman) 박사에 의해 발생되었다.

[방법]

두 개의 인간의 난소 세포주를 신선한 혈청의 난소암 조직으로부터 시험관 내로 이식했다. 이 세포주들에 HOV-007 및 HOV-008 의 부호를 붙였다. 세포들을 1% 의 벗겨내지 않은 태내 송아지 혈청을 함유하는 이글스(Eagle's) MEM 내에서 배양했다. 96 웰 플래이트 상 5% CO내의 37℃ 에서 검사를 수행했다. 독소루비신을 성장 배지 및 95% 에탄올 내 토레미펜에 용해시키고, 이로부터 성장 배지로서 이를 희석시켰다. 에탄올의 농도는 결코 0.07% 를 초과하지 않았고 이는 또한 세포 성장에 영향을 주지 않았다. 살아있는 세포의 수를 생발광법(bioluminescenece method)으로 정량화했으며, 이 방법은 앞에서 이미 기술하였다 (Kangas L, Nieminen) A-L, Gr

onroos M : 세포 ATP 의 생발광 : 시험관 내 세포장해성 시약에 대한 새로운 측정 방법, Med. Biol. 1984, 62, 338-343).

[결과]

결과를 다음 3 개 표에 제시했다.

세포주 HOV-007 내의 토레미펜 및 독소루비신, 살아있는 세포의 수(대조군에 대한 %)를 제시했다. 세포 수는 3 일간 배양 후 정량했다.

세포주 HOV-018 내의 토레미펜 및 독소루비신. 0.1 및 0.3 μg/ml 의 독소루비신 농축물을 시험했다. 설명에 대해서는 이전 표를 참조하라.

세포들은 두 화합물 모두에 대하여 별도로 거의 저항성이 있었으나, 그 조합물을 사용하면 현저하게 민감해졌다.

인간의 흑색종 UV-me-1

세포들을 2 일 동안 배양했다. 토레미펜 및 독소루비신의 농도를 다음표에 나타냈다.

이 세포주는 독소루비신만에 대해서는 비교적 민감하나, 그 조합물은, 특히 낮은 독소루비신 농도 및 높은 토레미펜 농도에서 분명히 효과적이다.

토레미펜 및 독소루비신 조합물의 효능은 다른 세포주에서는 변화할 것이다. 그러나, 가장 좋은 효능은 높은 농도에서 얻어진다. 이것이 임상적으로도 유효하다면, 가장 효과적인 항 종양 효과를 얻기 위하여 토레미펜 및 정균(Cytostatics)의 높은 투여량을 사용하여야 할 것이다.

MCF-7 은 기존의 인간 유방암 세포주이다. 이것은 에스트로겐 양성 수용기이고 유방암 연구에 있어 시험관 모델로서 널리 사용된다. 근원 세포주는 Ken Cowen 박사(국립암 기구(National Cancor Institute), 베테스다, 매릴랜드, USA)로부터 얻어졌다. 세포를 증가되는 농도의 독소루비신에 단게적으로 노출시키므로써, 독소루비신 저항성 돌연변이체 세포중 MCF-2/DOX 를 발현시켰다. 세포들을 코닝(Corning) 75-cm 조직 플라스크 내에서 성장시키고 5% CO및 95% 공기 내 5% 태내 소의 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지를 사용하여 지수적인 성장을 하도록 유지시켰다. 상기한 방법을 사용하여 세포 증식의 억제를 측정했다(Ford JM, Prozialeck WC, Hait WN : 다약제 내성의 역전 및 세포 성장의 억제를 위한 페노티아진 및 관련된 약제의 활성을 측정하는 구조적 특징. Mol. Pharmacol. 1989, 35, 105-115). 세포를 96-웰 미세 역가(microtiter) 플레이트 내 100 ㎕ 부피에서 배양시켰다. 방법의 원리는 48 시간 동안 약제들/약제 조합의 존재 하에 세포를 배양하는 것이었다. 이 시간 후 살아있는 세포를 메틸렌블루로 염색시키고, 애플 IIe 컴퓨터와 접속시킨 미세 역가 플래이트 판독기(Titertek Model MCC/340)를 사용하여 분광 광도법으로 정량했다. 세포 성장의 억제를 담체 처리된 대조 배양물 흡광도의 백분율로 나타냈다. 8 주 동안 날마다 10, 20, 40, 60, 200 또는 40 mg의 토레미펜을 투여받으면서 임상 단계 I 연구에 참여한 환자로 부터 인간 플라스마 샘플을 얻었다. 플라스마 표본을 아미콘 CF-10 필터(MW cutoff 10,000)에 놓고 이어서 20 분 동안 5000 x g 에서 원심분리하여 플라스마로 부터의 초여과물을 제조했다. 초여과물은 임상적으로 얻어진 농도가 MCF-7/DOX 를 민감화시킬 수 있는지를 알아보기 위해 사용되었다. 성장 배지의 일부를 플라스마 초여과물로 대치하고 세포를 4 시간 동안 성장하도록 두었으며, 이 때 이들을 상기한 바와 같이 염색하고 정량화했다.

토레미펜에 더하여, 토레미펜의 대사 산물인 N-데메틸토레미펜 및 4-히드록시토레미펜 뿐만 아니라 타목시펜도 사용했다. 이와 같이 항 에스테르로겐성 및 MDR 역전 능력의 관계를 연구하는 것이 가능했다.

타목시펜, 토레미펜 및 N-데메틸토레미펜은 표 5 및 제7도에 보여진 바와 같이 MCF-7/DOX 세포 내에서 MDR 을 역전시키는데 거의 똑같이 효과적이었다. 보다 낮은 내재성 에스트로겐성을 갖고 보다 강한 항에스트로겐성을 갖는 4-히드록시토레미펜은 약간 덜 효과적이었다. 이것은 MDR 역전이 화합물의 항 에스트로겐 성질에 기인하지 않음을 보여준다. 임상 샘플 내의 토레미펜 + N-데메틸토레미펜의 농도(20 μM 이상)는 MDR 역전에 필요한 농도(10 μM) 이상이었다. 환자의 혈청에서 MDR 역전 효과에 대한 명백한 농도 의존성을 발견했다 (제8도, 숫자가 적힌 점들은 환자 샘플을 말한다). 이것은 토레미펜의 보다 높은 투여량이 MDR 역전 효과에 더 좋음을 보여 준다. 그러므로, 임상 실험에 있어서 가능한 한 높은 투여량으로 토레미펜을 투여하는 것이 바람직하다. 최대 내성 투여량은 일일 약 400-600 mg 으로 임상 단계 I 실험에 따른다. 이 투여량은 효과적인 MDR 역전을 위한 충분한 혈청 및 조직 농도를 일으킨다. 중요하게, 타목시펜의 보다 높은 독성으로 인하여, 그와 같이 농도는 타목시펜 치료에 있어서는 달성할 수 없는 것이다.

표 5 에서 예측된 억제는 화합물 조합의 효과가 단순히 부가적일 경우 샘플 내에 살아있는 세포의 비율을 예측하므로써 계산되었다. 1 μmol/l 독소루비신은 세포 성장의 10% 억제를 야기시켰고, 이는 즉 남아있는 살아있는 세포의 비율이 0.9 임을 의미한다.

예컨대, 표 5 의 첫 번째 줄에 있는 데이터를 참조하면, 3 μg/ml의 토레미펜 투여량은 15% 의 억제를 야기했으며, 이는 즉 남아있는 살이있는 세포의 비율이 0.85 임을 의미하는 것이다. 그러므로, 토레미펜 및 독소루비신의 조합에 노출된 후 예측된 살아있는 비율은 0.85 × 0.9 = 0.76 이었다. 따라서, 예측된 억제는 24% 였다. 실제 (관찰된) 억제는 38% 로서, 예측된 것보다 더 큰 58% 의 상승 작용이 있었다.

[II. 생체 내 실험]

[신장 하 섬유막 검사]

신선한 인간의 종양 조직을 쥐의 신장의 바깥 섬유막 밑에 이식시켰다. 토레미펜(150 mg/kg p.o.)과 함께 또는 토레미펜 없이, 세포장해성 약물의 서로 다른 조합(각 조합의 독성에 따라 미리 선택된 투여량)으로 쥐를 처리했다. 대조용 동물은 염수 주사를 맞았다. 종양 접종 후 5 일 연속으로 약물을 투여했다. 접종 후(초기 크기) 및 동물을 죽인 6 번째 날(최종 크기)에 즉시 접안 마이크로미터가 장치된 입체 현미경으로 종양 조작의 크기를 측정했다. 최종 크기와 초기 크기의 차이는 종양의 성장 또는 퇴화를 설명한다. 측정 단위는 접안 카이크로미터(omu)였다. 10 omu 는 1.0 mm 와 같다. 종양 크기 외에 동물의 체중의 증가도 측정했다. 체중 증가는 치료의 독성을 설명한다. 일반적으로, 최종 체중/시험 전 체중의 비는 0.80 이상이어야 한다. 그렇지 않으면 독성은 받아들일 수 없는 것으로 간주된다.

신선한 인간의 종양 샘플에서 신장 하 섬유막 검사(subrenal capsule assay, SRCA)에 있어서 세포장해성 약물과 조합된 토레미펜의 효과.

CPA = 시클로포스파미드 + 독소루비신 + 시스플래티늄

PE = 시스플래티늄 + 에토포시드

같은 동물에 있어서 검사하는 동안 동물의 체중 증가는 하기와 같았다.

이 결과는 인간의 종양, 특히 종양이 세포장해성 약물의 조합에 부분적으로 또는 완전히 저항적인 경우에, 토레미펜이 세포장해성 약물에 대한 민간성을 증가시킬 수 있음을 보여준다. 검사하는 동안 동물의 체중 증가는 토레미펜의 첨가에 의해 영향 받지 않았다.

토레미펜 및 독소루비신의 항종양 효과의 계획 의존성을 고형질의 쥐종양으로 연구했다. 루이스 렁(Lewis Lung, LL) 또는 멜라노마 B-16 종양 세포 2×10⁶세포/동물을 암컷 C-57 쥐에 근육 내로 접종했다. 토레미펜/독소루비신 치료를 다음 표에서 지시한 대로 시작한 후, 종양을 평균 지름 1.5 cm 크기로 성장하도록 했다. 치료 전 및 치료 10 일 후 종양의 크기를 2 차원적으로 측정하고, 이 평균을 종양 지름으로 간주했다. 동물의 체중 또한 기록했다.

이 결과는 토레미펜 및 독소루비신이 이 종양 모델이 동시에 주어졌을 때 가장 좋은 항 종양 효과를 가짐을 보여 준다. 유사한 결과를 G57 쥐 내 B-16 멜라노마에서 얻었다.

이 연구는 야생형 CHO 세포(CHO-Kl) 및 그의 MDR 돌연변이체(CHO-Adr) 내의 독소루비신에 대한 민간성이, 그것만으로는 세포 성장을 억제 하지는 못하는 토레미펜 농도에 의해 증가될 수 있음을 보여 준다. 상승 작용의 정도는 어버이 세포주 보다 CHO-Adr 세포주에서 훨씬 더 크다. 그러나, 토레미펜에 의한 독소루비신 세포장해성 조절의 정확한 메카니즘은 불분명하다. 두 개의 세포주 내에서 오에스트로겐 수용기가 측정 가능한 수준으로는 존재하지 않았기 때문에(결과가 보여지지 않음), MDR 역전은 두 세포주의 오에스트로겐 수용기 상태와는 무관한 것으로 결론지어진다. 서더랜드(sutherland) 일행(nature 288 : 273-275)은 배양된 세포 내에 높은 투여량의 타목시펜으로 조정된 성장 억제 효과가 오에스트라디올에 의해 역전될 수 없음을 관찰했고, 따라서 이들은 오에스트로겐 수용기 시스템과 무관한 메카니즘과 관련됨을 제시하였다. 라무(Ramu) 일행(Cancer Res. 44 : 4392-4395)은 타목시펜, 클로미펜, 나폭시딘 및 그 밖의 것과 같은 트리패라놀 유사체에 의한 MDR 의 역전을 예증했다. 이들은 MDR 세포막 내 보고된 증가된 막의 경직성이 트리패라놀 유사체에 의해 감소되며, 이는 독소루비신이 보다 쉽게 확산되고 그의 세포장해성을 증가시키는 것을 설명할 수 있다고 제안한다. 포스터(Foster) 일행(Chemother. Pharmacol. 22 : 147-152)은 10 μM 타목시펜 또는 퍼헥실렌 말레이트로 MCF-7 오에스트로겐 수용기 양성 유방암 세포주 내에서의 다약제 내성의 조절을 보고했다. 50 nM 에스트라디올의 첨가로 타목시펜의 효과가 약화되지 않았기 때문에, 이들은 타목시펜에 의한 MDR 의 역전은 오에스트로겐 의존성이 아니라고 제안했다. 그러나, C-독소루비신의 축적이 증가되지 않았기 때문에, 세포가 저항성인 항암 약물의 세포 내 축적을 증가시키는 것 이외의 다른 메카니즘에 의해 타목시펜( 및 그 밖의 유사체들)이 MDR 을 조절할 가능성을 증가시켰다.

단백질 키나제 C(PKC)는 높은 친화성의 포볼(phorbol) 에스테르 수용기이다. 포볼 에스테르 및 다른 종양 촉진제는 시험관 내 및 생체 내 활성 PKC 및 디글리세리드 치환체로서 작용하는 기능을 한다. PKC 는 다양한 성장 촉진 신호를 변환시키는 것으로 믿어지며, 종양 촉진에 있어서도 중요한 역할을 하는 것 같다. 세포 성장의 조절에 있어서 PKC 의 중요성은 PKC 억제 물질이 효과적인 항 증식제로 밝혀질 수 있음을 제시한다. 오브라이언(O' Brian) 일행(J. Nat. Cancer Inst. 80 : 1628-1633)은 (a) 타목시펜 및 그의 주요 대사 산물인 4-히드록시타목시펜(이것은 효소의 촉매적 영역에 결합하는 화합물에 의해 조정된)에 의한 시험관 내 쥐의 PKC 활성의 억제, 및 (b) PKC 활성에 대항하는 억제 능력이 MCF-7 세포주 내에서 보여진 오에스트로겐 비가역성 세포장해성 효과와 관련이 있음을 보고했다. 호르간(Horgan) 일행(Biochem. Pharm. 35 : 4463-4465)은 타목시펜에 의한 생체 내 PKC 활성의 억제를 보여주었다. 그러므로, 이 결과들은 PKC 의 억제가 토레미펜에 의한 MDR 의 조절 및 항 종양 효과에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 강하게 제시한다. 매우 높은 AAG 농도에서 세포의생존 가능성은 독소루비신만이 존재하는 경우와 전혀 다를 바가 없다. 그러므로 높은 농도의 AAG 는 독소루비신의 세포장해성에 대한 토레미펜의 조절 효과를 방해할 수 있다.

이 연구의 임상적 의미는 토레미펜 및 그의 대사 산물이 다약제 내성의 조절자일 뿐만 아니라 효과적인 세포장해성 물질일 수 있고, 그 효과에 대한 제한 인자는 높은 수준의 AAG 일 수 있다는 것이다. 화학요법적 식이 요법에서 토레미펜 또는 그의 대사 산물을 첨가하는 임상 시험은, 오에스트로겐 수용기 상태와는 관계 없이, 항암제의 치료적 지수를 증가시킬 수 있었다.

이 연구는 인간에 있어서 임상학적으로 관련된 화학적 증감제의 농도가 얻어지며 이를 유지시킨 것에 대한 첫 번째 보고를 나타낸다. 이들 결과들은 토레미펜 및 그의 대사 산물이 인간에 있어서 다른 세포장해성 물질들과 함께 조합하여 종양 약제 내성의 임상적 조절제로 사용되기 위해 독보적으로 적합할 수 있음을 강력히 제시한다.

Claims (11)

1. 하나 이상의 세포장해성 화합물을 사용하는 암 치료에 있어서, 상기 세포장해성 화합물에 대한 암세포의 다약제 내성을 역전시키기 위한, 토레미펜, N-데메틸토레미펜, 4-히드록시토레미펜 및 이들의 제약학적으로 허용가능함 비독성 염으로 부터 선택되는 화합물.
2. 제1항에 있어서, 토레미펜인 화합물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포장해성 화합물이 알킬화제, 항핵분열제, 항대사물, 플래티늄 화합물 또는 항생제인 화합물.
4. 제3항에 있어서, 항생제가 안트라시클린 항생 물질인 화합물.
5. 제4항에 있어서, 안트라시클린 항생 물질이 독소루비신인 화합물.
6. (a) 토레미펜, N-데메틸토레미펜, 4-히드록시토레미펜 또는 이들의 제약학적으로 허용가능한 비독성 염; (b) (a) 외의 세포장해성 화합물; 및 (c) 제약학적으로 허용가능함 담체 또는 희석제를 포함하여 구성되며, 암 치료에 있어 암세포의 다약제 내성을 역전시키기 위하여 사용되는 제약학적 상승 조성물.
7. 제6항에 있어서, (b) 가 제3항 또는 제4항 중 어느 한항에서 정의된 바와 같은 세포장해성 화합물인 조성물.
8. 제6항에 있어서, (b)가 독소루비신인 조성물.
9. 암 치료에 있어서 동시적, 별도의 또는 연속적 사용을 위해 조합되는 제제로서, (a) 토레미펜, N-데메틸토레미펜 또는 4-히드록시토레미펜 또는 이들의 제약학적으로 허용가능한 비독성 염; 및 (b) (a) 외의 세포장해성 화합물을 함유하는, 암 치료에 있어 세포장해성 화합물에 대한 암 세포의 다약제 내성을 역전시키기 위하여 사용되는 생성물.
10. 제9항에 있어서, (b) 가 제3항 또는 제4항 중 어느 한항에서 정의된 바와 같은 세포장해성 화합물인 생성물.
11. 제10항에 있어서, (b) 가 독소루비신인 생성물.

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