KR0154398B1 - 신균주 페니실리움속 am301 및 이로부터 생산되는 신규 파이타아제 - Google Patents

신균주 페니실리움속 am301 및 이로부터 생산되는 신규 파이타아제

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Abstract

본 발명은 신균주 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301(KCTC 8688P) 및 이로부터 생산되는 신규 파이타아제(Phytase)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신균주 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301(KCTC 8688P)과 단위가축에 급여하는 곡류내 인(P)의 체내이용성을 높여주는 신규한 파이타아제 효소에 관한 것이다.

Description

신균주 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301(KCTC 8688P) 및 이로부터 생산되는 신규 파이타아제(Phytase)
제1도는 본 발명 실험예 1에 따른 신규 파이타아제와 표준단백질의 전기영동사진을 나타낸 것이다.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
A : 표준단백질 B : 신규 파이타아제
본 발명은 신균주 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301(KCTC 8688P) 및 이로부터 생산되는 신규 파이타아제(Phytase)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신균주 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301(KCTC 8688P)과 단위가축에 급여하는 곡류내 인(P)의 체내이용성을 높여주는 신규한 파이타아제 효소에 관한 것이다.
파이타아제(Phytase)는 파이틱애시드(Phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 효소이다. 여기서, 파이택애시드는 가축의 사료로 사용하고 있는 곡물인 인(P)함량의 50∼70%를 차지하고 있지만, 닭이나 돼지와 같은 단위가축은 생체내에 파이틱애시드를 분해하는 파이타아제가 존재하지 않기 때문에 식물성 인의 이용률이 극히 낮을 뿐만 아니라 소화되지 못한 파이틱애시드(피틱태인)는 상수원등에 방류되어서 심각한 환경오염원으로 작용하여 소호수의 청조, 바닷물의 적조현상을 유발하는 중요요인으로 작용하고 있다. 또한 파이틱애시드는 단위동물에 중요한 미량광물질, 아미노산 또는 비타민등과 킬레이팅(chilating)하여서 이들을 불용화함으로써 동물로 하여금 이용할 수 없게 할 뿐만 아니라 분으로 배출되는 중요 생체활성화 물질이 폐수원으로 작용하여 악영향을 미친다. 따라서, 파이타아제를 단위가축에게 급여할 경우 인의 이용성을 증가시켜 무기태 인의 급여량을 줄일 수 있어 경제적인 이익을 가져옴과 동시에 미생물의 에너지원인 인과 중요한 미량 생체활성물질의 이용성을 향상시키고 동물분으로 배출되는 인의 양을 줄여 이로인한 환경오염을 감소시킬 수 있다. 특히, 1996년도부터 방류되는 폐수내 인의 함량을 규제하도록 입법예고되어 있을 뿐만 아니라 유럽에서는 단위동물의 사료에 파이타아제를 의무적으로 첨가하도록 되어 있어서 파이타아제의 동물의 이용성은 무한히 크다고 할 수 있다. 또한, 파이타아제를 첨가함으로써 음이온을 띠는 피틴태인과 결합하여 이용성이 저하되는 칼슘, 아연등의 미량 광물질과 비타민, 아미노산등의 생리활성물질의 이용성을 증가시켜서 가축의 생상성을 크게 향상시킬 수 있다. 이와같이 파이타아제를 사료에 첨가하여 단위가축에게 급여할 경우 사료의 이용성이 증가되고 생산성 제고를 통한 경제적 이익 뿐만 아니라 환경오염을 방지할 수 있게 된다.
상기와 같은 잇점으로 인하여 지금까지 유럽을 중심으로 파이타아제에 대한 연구(A.H.J. Ullah등 1994 ; K. C. Ehrich, 1994 ; C. S. Piddington, 1993) 가 진행되어 왔으며, 파이타아제의 동물에 대한 효과연구(L. G. Young등, 1993 ; X. G. Lei등, 1994 ; Z. Mroz등, 1994)등이 진행되어 왔지만, 여기서의 파이타아제는 파이타아제 자체가 6개의 인(P)중 1개만을 자르며, 아울러 단위동물의 생리에 잘 맞지 않아서 단위동물의 첨가제로는 한계가 있다.
따라서, 본 발명자들은 미생물이 생산하는 파이타아제, 특히 종래의 파이타아제와 비교하여 활성이 뛰어나거나 특성이 다른 파이타아제를 얻기 위하여 전국 각지의 토양, 나무들로부터 얻은 곰팡이, 방선균, 세균 등 수백종의 균주 중에서 신규 파이타아제를 생산하는 신규 미생물을 동정하였는 바, 이 신규 미생물은 효소의 역가가 뛰어날 뿐만 아니라 생산된 효소의 제반 특성이 종래의 효소에 비해서 단위동물에 사용하기 적합하다고 판단되고 효소가 신규성이 있다고 판단하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 신균주 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301(KCTC 8688P)과 이로부터 생산되는 단위동물에 사용하기 적합하고 그 특성이 우수한 신규 파이타아제를 제공하는 데 그 목적이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 신균주 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301(KCTC 8688P)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 미생물이 생산하는 최적온도가 60℃이고, 최적 pH가 5.5이며, 분자량이 25kDa이고 등전점이 5.2인 신규한 효소인 파이타아제에 관한 것도 포함한다.
그리고, 본 발명은 상기 미생물을 사료첨가제로 사용하는 방법에 관한 것도 포함한다.
이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 신균주 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301(KCTC 8688P)과 이로부터 생산되는 신규 파이타아제에 관한 것으로서, 본 발명의 미생물의 분리 및 동정과정은 다음과 같다.
[신규 미생물의 분리]
계룡산 부근의 목재 부후한 토양 및 나무가 썩은 곳에서 시료를 채취하여 1차 곰팡이 분리용 배지인 쟈펙배지(Czapek media)에서 곰팡이를 분리하고, 분리된 곰팡이를 1리터(liter)당 갈락토오즈(galactose) 15g 칼슘 파이테이트(Calcium phytate) 5g, 한천(agar) 25g을 포함하고 pH가 5.4로 조정된 배지위에서 27℃로 배양하였을 때 파이테이트를 분해하여 투명환(clear zone)을 형성하는 것을 파이타아제 생산균으로 하였다.
이중, 투명환의 크기가 가장 큰 녹색계통의 곰팡이를 분리하여 신규 파이타아제 생산균으로 하였다.
[신규 미생물의 동정]
상기에서 분리된 균주의 미생물학적 특징은 다음과 같다.
(1) 분류학적 특징
상기에서 분리 선발된 미생물을 형태적으로 확인 결과 곰팡이로 확인되어서, 우선적인 균주명을 AM301로 명명하고 중요 균학적 특성을 조사하였으며, 그 결과는 다음 표1에 나타낸 바와 같다.
상기 표1의 결과로부터 본 발명의 균주는 분생자기(Conidia)를 형성하기 때문에 듀토로마이세스구(Deutoromyces section)에 속하고 분생자기(Conidia)의 형태로 보아 피알로스포라 아속(Phialosporae subgenus)이고, 모양이 둥글게 생겨서 페니실리움속(Penicillum species)으로 판단하였다.
(2) 형태학적 특성
곰팡이의 분류동정에 많이 사용되는 CYA(Czapek Yeast Extract Agar)배지, MEA(Malt Eytract Agar)배지 및 G25N(25% Glycerol Nitrate Agar) 배지를 이용해서 콜로니의 모양, 균사체 및 분생자 생성(conidiogenesis)등을 조사하였으며, 그 결과는 다음 표2에 나타낸 바와 같다.
또한, 현미경을 이용하여 페니실리움이 갖는 자방병(Stipes), 기저경자(Metulae), 경자(Phialid) 및 분생자기(Conidia)의 형태적 특성 및 크기를 관찰하였으며, 그 결과는 다음 표3에 나타낸 바와 같다.
상기의 결과들로부터 균주 AM301은 페니실리움 왁스마니(Penicillum waksmanii)와는 거의 동일한 특성을 보이지만, 다음 표 4에 나타낸 바와 같은 점에서 현격한 차이를 보인다.
상기 표4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 미생물은 37℃에서도 생육하나 종래의 페니실리움 왁스마니(Penicillum waksmanii)는 37℃에서는 전혀 생육할 수가 없다.
따라서, 본 AM301은 페니실리움 왁스마니(Penicillum waksmanii)의 변종임을 알수 있는 바, 본 미생물을 페니실리움속(Penicillum sp.)으로 동정하고, 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301로 명명하였다. 그리고 나서, 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자원센타에 1995년 9월 11자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC8688P를 부여받았다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
[신규 파이타아제의 생산]
파이타아제를 생산하기 위해 효모추출물 9g, 맥아추출물 9g, 트립톤 15g, 포도당 30g을 3ℓ의 물에 녹여 pH를 6.5로 조정한 후 5ℓ 용량의 발효조에 넣어 121℃에서 15분간 가압멸균한 후, 여기에 상기와 동일한 배지조성으로 미리 40시간 배양한 종배양액을 1% 접종하여 27℃에서 150rpm으로 48시간 배양한 후 원심분리하였다. 그 다음, 상등액을 황산암모늄설페이트로 80%까지 포화하고 탈염하여 그 액을 동결건조하여 효소의 분말을 얻었으며, 이를 생산된 효소로 하였다.
생산된 효소의 역가의 측정은 pH 4.5의 0.5몰 아세트산 완충액에 2밀리몰의 피틱산나트륨염이 함유된 용액을 기질로하여 37℃에서 20분간 반응한 후 생성된 인산의 양을 측정하는 방법으로 하였다. 여기서, 효소의 역가는 1분당 1마이크로몰의 무기인을 분해하는 효소량을 1단위로 하였다. 측정결과 신규 효소는 단백질 mg당 0.098단위의 효소역가를 가져서 동일한 조건으로 효소활성을 측정한 종래의 바실러스섭틸리스 나토(Bacillus subtilis natto) N-77 파이타아제의 0.027 단위와 비교하여 4배가량 활성이 큼을 알 수 있다.
[실험예 1]
[신규 파이타아제의 분자량 및 등전점측정]
상기 실시예에 따라 얻어진 효소분말을 pH 7로 조정된 완충용액에 녹인 다음, CM-세파로오즈와 DEAE-세파로오즈를 이용하여 순수 분리하였다. 그리고나서 순수분리된 효소를 분자량을 알고 있는 표준단백질과 함께 에스디에스 페이지 전기영동(SDS-PAGE Electrophoresis)를 실시하였으며, 그 결과는 첨부도면 제1도에 나타낸 바와 같다.
첨부도면 제1도에서 보는 바와 같이 분리된 효소의 분자량은 25kDa정도이며, 이는 종래의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 화이쿰(Aspergillus ficum), 아스퍼질러스 테루스(Aspergillu terrus) 및 바실러스 섭틸리스 나토(Bacillus subtilis natto) 효소의 분자량이 각각 200, 85∼100, 214 및 38인 것과 비교하여 5∼10배 가량 작은 분자량을 가지는 신규 파이타아제임을 알 수 있다.
또한, 효소단백질의 등전점을 파악하기 위해 일렉트로포커싱(Electrofocusing)으로 표준단백질과 비교한 결과 등전점이 5.2정도로 나타났으며, 이는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) N-77의 6.25보다 낮으며, 아스퍼질러스 화이쿰(Aspergillu ficum) NRRL 3135의 4.5보다는 높은 것으로 나타나서 신규 효소일 확률이 높음을 알 수 있다.
[실험예 2]
[신규 파이타아제의 열과 pH에 대한 활성 및 안정성]
상기 실험예 1과 같은 방법으로 분리된 효소를 이용해서 최적온도를 조사한 결과 60℃까지 파이타아제의 활성이 계속 증가하였으나, 60℃이상에서 효소활성이 급격히 감소되어서 최적온도는 60℃임을 알 수 있다. 그리고, 파이타아제의 열에 대한 안정성을 측정하기 위해 각 온도에서 10분간 방치한 후 55℃에서 효소활성을 측정한 결과 40℃부터 활성이 감소하기 시작하였다. 이와같은 결과로 볼 때 본 발명의 효소는 가축의 체내 온도에서 매우 높은 활성을 보일 것으로 판단되며 사료제조 공정에서 75℃이상으로 펠렛팅하거나 익스트루젼(extrusion)시키는 등의 가공사료 보다는 가루사료에 이용하는 것이 바람직하다고 판단된다.
그리고, 파이타아제의 활성을 pH를 달리하면서 측정한 결과 최적 pH가 5.5로 나타났으며, pH에 대한 안정성을 측정하기 위하여 여러 가지 pH에서 1시간 동안 방치한후 파이타아제의 잔존활성을 측정한 결과 pH 4이하의 산성 조건하에서도 상당량의 효소활성을 가지는 것으로 판명되었다. 이로써 본 발명의 신규 파이타아제는 종래의 pH5이하에서 안정성이 급격히 감소하는 식물성 파이타아제나 세균에서 생산되는 파이타아제에 비해 안정성이 높은 것으로 판단되며, 특히 0.1% 이하 수준으로 사료에 첨가하기 때문에 다른 사료성분들에 의해 보호되는 것을 고려하여 볼 때 본 발명의 신규 파이타아제는 가축의 위내 산성 조건하에서도 상당한 활성을 유지할 수 있으리라 판단된다.
[실험예 3]
[육계 사료에서 신규 파이타아제 사용이 환경오염에 미치는 영향]
육계에 급여하여 인의 이용성과 배출량에 대한 영향을 비교, 파악하기 위하여 신규 파이타아제 급여군, 대두에서 추출한 식물성 파이타아제 급여군, 바실러스섭틸리스(Bacillus subtilis) N-77 파이타아제 급여군의 3군으로 나누어 갓 부화한 아바에이커 브로일러(Aboracres Broiler) 병아리 수컷을 각각 200수씩 공시하여 시험하였다. 시료는 신규 파이타아제 급여군의 경우는 실시예에 따라 생산한 건조효소를 사료 kg당 500단위에 해당하는 양을 첨가하였으며, 대두 파이타아제 및 바실러스 섭틸리스 N-77 파이타아제도 동일한 단위만큼 첨가하여 시험하였으며, 그 결과는 다음 표 5에 나타낸 바와 같다.
상기 표 5의 결과로부터 본 발명의 신규한 파이타아제를 단위가축에게 급여할 경우 대두 파이타아제 및 바실러스 파이타아제를 급여한 군에 비해 인의 이용율이 높아 배출되는 인의 함량이 더 낮다는 것을 알수 있는 바, 이는 내산성 및 산성조건하에서 활성이 좋으며 가축의 장내에서 곡류 구조와 관련지어 좀더 유효하게 곡류내 피틴태인을 분해하기 때문으로 판단된다.
이상의 결과로부터 본 발명의 신규 미생물 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301이 생산하는 파이타아제는 그 활성이 우수하의 체내에서의 이용율을 향상시키는 바, 단위동물 사료첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (4)

  1. 파이타아제를 생산하는 페니실리움속(Penicillum sp.) AM301(KCTC 8688P).
  2. 제1항의 미생물이 생산한 것으로 최적온도가 60℃이고, 최적 pH가 5.5이며, 분자량이 25kDa이고, 등전점이 5.2인 것을 특징으로 하는 파이타아제(Phytase).
  3. 제1항의 미생물을 사료첨가제로 사용하는 방법.
  4. 제2항의 파이타아제를 사료첨가제로 사용하는 방법.
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