KR100414532B1 - 슈도모나스 시린게 및 그로부토 생산되는 신규한 파이타아제 - Google Patents

슈도모나스 시린게 및 그로부토 생산되는 신규한 파이타아제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 슈도모나스 시린게 및 그로부터 생산되는 신규한 파이타아제에 관한 것이다. 본 발명은 토양 시료로부터 분리한 파이타아제 생산 균주 슈도모나스 시린게 MOK1 및 그로부터 생산되었으며, 종래 보고된 파이타아제와 구별되는 특징을 지니고 있는 신규한 파이타아제를 제공한다. 본 발명의 균주로부터 생산되었으며 활성이 우수한 파이타아제를 이용하여 재조합 기술 및 발효 최적화를 통하여 대량 발현시킴으로써 사료 첨가제로 이용 가능성을 높일 수 있을 것이다.

Description

슈도모나스 시린게{Pseudomonas syringae}
본 발명은 슈도모나스 시린게 및 그로부터 생산되는 신규한 파이타아제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 토양 시료로부터 분리되었으며 파이타아제를 생산하는 균주 슈도모나스 시린게 MOK1 및 전기 균주로부터 생산되었으며, 종래 보고된 파이타아제와 구별되는 특징을 지니고 있는 신규한 파이타아제에 관한 것이다.
대부분의 동물용 배합사료는 주로 식물성인 곡류나 그 부산물 및 박류로 구성되어 있으며, 식물성 사료에 함유된 인은 총 인의 약 75%가 파이테이트(phytate)의 형태로 존재한다(참조: Cromwell et al., J. Anim. Sci., 71:1831-1840, 1993). 식물 유기태 인산의 저장 화합물인 파이테이트(myo-inositol 1,2,3,4,5,6,-hexakis dihydrogen phosphate)는 식물성 사료의 주요성분으로 이노시톨(inositol)과 인산염(phosphate)이 결합되어 있는 형태로 존재하며, 이에 대한 가축의 활용은 매우 중요하다(참조: Maga, J. A., J. Agric. Food Chem., 30:1-9, 1982).
그러나, 곡류 및 박류에는 천연상태로 존재하는 인을 분해시키는 효소인 파이타아제(phytase)의 함량이 적을 뿐만 아니라, 활성도가 낮아 단위 가축이 인을 효율적으로 이용하는 데는 한계가 있다(참조: Sutardi and K. A. Buckle, J. Food Biochem.,10:197-216, 1986). 또한, 사료에 함유되어 있는 파이테이트는 화학적으로 미오-이노시톨 헥사포스페이트(myo-inositol hexaphosphate)에 칼슘, 마그네슘, 철, 아연 등이 결합된 상태로 존재하는데, 이것은 가축이 필요로 하는 중요한 무기이온을 흡착하는 항영양인자(anti-nutritional factor)로서 작용할 뿐만 아니라(참조: Qian et al., J. Anim. Sci.,74:1288-1297, 1996), 단백질과 결합하여 소화율을 감소시키고 사료 이용율을 낮추므로, 사료 중에 존재하는 파이테이트의 분해는 사료의 효율을 극대화하기 위하여 필수적이다(참조: Lei et al., J. Anim.Sci., 71:3368-3375, 1993). 그러나, 가금류나 돼지와 같은 단위 동물들은 소화기관 내에 파이테이트를 분해하여 인산을 유리시키는 효소인 파이타아제가 결여되어 있어 사료중의 유기인을 가용 유기인의 형태로 전환하지 못하므로, 파이테이트를 거의 이용하지 못하고 대부분 분뇨로 배출하고 있다(참조: Yi et al., Poultry Sci., 75:240-249, 1996).
파이타아제(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase, EC 3.1.3.8)는 식물, 미생물, 진균 등에 존재하며, 식물의 중요한 유기인산 저장 화합물인 파이테이트(myo-inositol hexaphosphoric acid)를 가수분해하여 미오-이노시톨과 포스페이트(free ortho-phosphate)를 생산하는 효소이다(참조: Reddy et al., Adv. Food Res., 28:1-92, 1982). 이와 같은 파이타아제는 사료첨가제로 사용시 사료내 유기태인의 이용성을 60% 이상 증가시키고, 무기질의 체내흡수를 증가시킬 뿐만 아니라, 단백질 이용율 및 소화흡수율 증진효과를 나타내어 사료의 영양가치를 증진시키는 것으로 알려져 있다(참조: Denbow et al., Poultry Sci., 74:1831-1842, 1995). 또한, 사육 가축의 골 성장(bone mineralization)을 건실화 할 수 있을 뿐만 아니라, 기타 칼슘, 아연 등 필수 무기염류의 흡수율을 향상시키는 부가적 기능도 확인되었다. 이에 따라 최근에는 미생물에서 분리하여 상업적으로 대량생산한 파이타아제(예; NatuphosR, BASF, Germany)를 첨가함으로써 사료에 첨가하는 무기인의 함량을 줄이고, 또한 이를 섭취한 가축의 배설물에서의 분비되는 유기인의 양을 감소시키고 있다(참조: Yi et al., Poultry Sci., 75:240-249, 1996).
그러나, 현재 아스퍼질러스 피컴(Aspergillus ficcum), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 속(Enterobactersp. 4) 등의 미생물에서 파이타아제가 발견되었으나, 곰팡이의 경우 대량 배양시 배양기간이 길고 통기, 교반 등의 발효조건이 까다로워 대량설비가 증가되어야 하는 단점이 있으며 또한, 현재까지 발견된 효소의 비활성(specific activity)이 아스퍼질러스 피컴은 196단위/mg, 바실러스 서브틸리스는 20 내지 28단위/mg 정도로 낮기 때문에, 실제 상업적인 응용에 있어서는 상대적으로 많은 효소량을 필요로 하게 되며 이에 따라 생산비용의 상승을 초래하는 등의 단점을 내포하고 있다. 따라서, 상기한 단점을 해결한 파이타아제 개발의 필요성이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 종래 보고된 파이타아제와 비교하여 활성이 우수한 파이타아제를 생산하는 균주를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 파이타아제 생산균주를 분리동정하고, 전기 균주로부터 생산된 파이타아제가 종래 보고된 파이타아제와 구별되는 특징을 지니고 있는 신규한 파이타아제임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 신규한 파이타아제를 생산하는 슈도모나스 시린게 MOK1(Pseudomonas syringaeMOK1)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 균주로부터 생산되는 신규한 파이타아제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 균주로부터 파이타아제를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 슈도모나스 시린게 MOK1의 전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 슈도모나스 시린게 MOK1으로부터 생산된 파이타아제의 전기영동 사진이다.
도 3은 본 발명의 슈도모나스 시린게 MOK1으로부터 생산된 파이타아제의 온도에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 슈도모나스 시린게 MOK1으로부터 생산된 파이타아제의 pH에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 활성이 우수한 파이타아제를 생산하는 슈도모나스 시린게 MOK1(Pseudomonas syringaeMOK1) 및 전기 미생물에 의해 생산되는 신규한 파이타아제에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
파이타아제를 생산하는 미생물을 개발하고자, 토양 유래의 곰팡이를 대상으로 파이타아제 활성을 탐색하여, 파이타아제 활성이 우수한 곰팡이를 선별하였다.
① 파이타아제 생산 균주의 분리 및 동정
파이타아제 활성 균주의 탐색을 위하여, 각지의 토양으로부터 채취한 시료를 멸균 식염수 용액에 희석하여 변형된 NPSM 배지에 접종한 다음, 25 내지 35℃에서 36 내지 60시간 동안 배양하였다. 전기 배양액을 2차 NPSM 배지에 접종하여 계대배양하고, 전기 2차 배양액을 희석하여 고체배지에 도말한 다음, 30℃에서 48 내지 72시간 동안 배양하여 세균 콜로니를 순수 분리하였다. 전기 순수 분리된 세균들을 각각 NPSM 배지에서 배양하여 조효소액의 파이타아제 활성을 정량적으로 측정하고, 그 중 활성이 가장 우수한 MOK1 균주를 선별하였다.
이어, 전기 선별된 균주의 동정을 위하여 현미경 관찰, 그람염색, 세포 지방산 분석 및 생리화학적 특성을 조사한 결과, 선별된 MOK1 균주는 짧은 막대기 모양의 형태를 가지며, 그람음성 세균이고, 형광색소를 가지고 있음을 확인하였다. 아울러, 세포 지방산 분석 및 생리화학적 특성을 조사한 결과, MOK1 균주는 탄소수 16개 지방산이 가장 높은 비율로 함유되어 있으며 API 시험 결과, 글루코스, 아라비노스, 만노스, 만니톨, N-아세틸-글루코사민, 글루코네이트, 카프레이트, 말레이트, 구연산 등을 탄소원으로 이용할 수 있음을 확인함으로써, 전기 균주는 슈도모나스 시린게(Pseudomonas syringae)로 동정되었으며, 전기 균주를 슈도모나스 시린게 MOK1으로 명명하고, 미생물 기탁기관인 한국종균협회(KFCC)에 2000년 8월 10일자로 기탁하여 기탁번호 KFCC-11192를 부여받았다.
② 파이타아제의 정제
파이타아제를 정제하기 위하여, 전기 균주를 NPSM 배지에서 배양한 다음, 전기 배양액을 원심분리하여 회수한 균체를 파쇄하여 무균체 추출물(cell-free extract)을 얻었다. 전기 수득된 추출물을 양이온 및 음이온 교환수지 컬럼을 수행하여 파이타아제를 정제한 결과, 효소 정제도가 101배가 되는 것을 44% 수율로 얻을 수 있었으며, 최종 정제 효소의 비활성(specific activity)은 648.9 단위(Unit)이었다.
③ 파이타아제의 특성
SDS-PAGE를 수행하여 몇 가지 표준 단백질의 분자량과 비교한 결과, 본 발명의 정제된 파이타아제의 분자량은 약 45kDa으로 확인되었다. 정제된 파이타아제의 N-말단 아미노산 서열을 분석한 결과, 종래 보고된 파이타아제와 다른 아미노산 서열을 갖는 것으로 판명되었다. 정제된 파이타아제의 활성은 37 내지 40℃, pH 5.5 내지 6.0 범위에서 가장 높게 나타났으며, 정제된 파이타아제의 여러 가지 인산염 기질에 대한 특이성을 조사한 결과, 소디움-파이테이트에 대해서 특이적으로 반응하는 것으로 나타났다. 정제된 효소의 활성에 금속이온 및 저해제가 미치는 영향을 조사한 결과, 카드뮴, 아연, 구리 등의 금속이온에 대한 저해효과가 강하게 나타났다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 파이타아제를 생산하는 균주의 분리
파이타아제 생산 세균을 분리하기 위하여, 문헌조사를 통해 우리나라 전국각지의 경작지 토양(논토양, 밭토양)과 목장주변의 알팔파, 오처드글라스와 같은 두과 식물의 뿌리 주변 토양, 가축의 분뇨가 함유된 토양 그리고 섬지역 토양을 각각 채취하여 총 55종의 토양 시료를 확보하였다. 파이타아제를 생산하는 세균의 분리를 위한 선별배지로 리차드슨(Richardson)과 하도바스(Hadobas) 등(참조:Richardson, A. E. and P. A. Hadobas, Can. J. Microbiol., 43:509-516, 1997)이 이용한 배지를 변형한 새로운 파이타아제 탐색 배지(new phytase screening media, NPSM)를 제조(소디움-파이테이트 2g/L, NH4NO35g/L, MgSO40.5g/L, KCl 0.5g/L, FeSO40.01g/L, 글루코스 15g/L 및 박토-아가 15g/L, pH 6.5)하여 사용하였다. 한편 고체배지 제조시 곰팡이의 오염을 최소화하기 위하여, 사이클로헥사마이드 (cycloheximide, 50㎍/㎖)를 배지에 첨가하였다.
우선, 다양한 분리원으로부터 확보한 토양시료 50g을 0.9% 멸균 식염수 용액 200㎖이 담겨 있는 삼각 플라스크에 가하고, 충분히 혼합되도록 200rpm에서 2시간 동안 진탕배양기에서 교반시키고, 30분간 정치시킨 다음, 바로 전기 토양 추출물 1㎖을 취하여 NPSM 액체배지 100㎖에 접종하여 30℃에서 48시간까지 배양하면서 성장여부를 1차로 확인하였다. 또한, NPSM 액체배지에서 1차로 자란 배양액을 다시 1㎖을 취하여 2차로 NPSM 액체배지에 접종하여 계대 배양하였고, 전기 배양액을 최종적으로 10-6내지 10-9의 희석배율로 희석하여 고체배지에 도말하여 30℃에서 온도로 48 내지 72시간 동안 배양하면서 세균 콜로니들을 순수 분리하였고, 그들로부터 파이타아제 활성여부를 조사하였다. 그 결과, 파이타아제 활성이 우수한 균주를 분리하고 MOK1으로 명명하였다. 또한, 분리 균주 MOK1은 NPSM 한천배지에서 클리어존을 형성하고, PSS 용액에서도 짙은 갈색을 나타내었다.
실시예 2: 파이타아제 생산 균주의 동정
분리된 파이타아제 생산 세균 MOK1의 동정은 세포벽의 지방산 조성분석 및 생리화학적 특징을 기준으로 실시하였고, 그람염색 및 현미경 조사를 통하여 형태를 관찰하였다. 그 결과, MOK1 균주는 짧은 막대기 모양(도 1)의 그람음성 세균이고, 형광색소를 가지고 있음을 확인하였다. 아울러, 세포 지방산 분석 및 생리화학적 특성을 조사한 결과, MOK1 균주는 탄소수 16개 지방산이 가장 높은 비율로 함유되어 있으며(표 1), API 시험 결과, 글루코스, 아라비노스, 만노스, 만니톨, N-아세틸-글루코사민, 글루코네이트, 카프레이트, 말레이트, 구연산 등을 탄소원 으로 이용할 수 있음을 확인함으로써(표 2), 전기 균주는 슈도모나스 시린게(Pseudomonas syringae)인 것으로 동정되었다. 전기 균주를 슈도모나스 시린게 MOK1으로 명명하고, 미생물 기탁기관인 한국종균협회(KFCC)에 2000년 8월 10일자로 기탁하여 기탁번호 KFCC-11192를 부여받았다.
실시예 3: 파이타아제 활성 측정
전기 분리ㆍ동정된 세균의 파이타아제 활성을 조사하기 위하여, 1차적으로플레이트 수준에서 우선 NPSM 배지조성 중 파이테이트 기질로서 소디움-파이테이트를 칼슘-파이테이트로 대체한 불투명한 배지를 제조하고, 분리ㆍ동정된 세균을 전기 배지 위에 도말한 다음, 배양하면서 배지 내 클리어존 형성 여부를 확인하였으며 또한, 그 위에 PSS(phosphatase screening solution; 0.2% α-naphthyl phosphate, 0.1% Fast Garnet GBC salts, 0.5M Na-acetate, pH 5.5) 용액을 부어 짙은 갈색 형성여부를 확인하여 간접적인 파이타아제 활성여부를 또한 조사하였고, 최종적으로 NPSM 액체 배지에서 성장한 세균을 정량적인 방법으로 파이타아제 분석을 실시하여 수치화 하였다. 정량적인 파이타아제 활성을 측정하기 위하여, 다음과 같이 조효소액을 제조하였다. NPSM 배지에서 36시간 동안 생장한 배양액 50㎖을 4℃, 6,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액과 균체를 각각 회수하였다. 회수된 균체는 다시 10㎖의 0.1M 소디움-초산 완충용액(pH 5.5)으로 현탁시키고, 음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄한 다음, 10,000×g에서 20분간 원심 분리하여 얻은 상층액을 세포내 분획(intracellular fraction)으로 이용하였다.
한편, 파이타아제 활성분석은 Yoon 등(참조: Yoon, S. J. et al., Enz. Microbial Technol., 18:449-454, 1996)이 이용한 소디움-파이테이트(1mM)로부터 유리된 무기태인의 양을 405nm에서 OD 값을 측정하는 방법으로 수행하였다. 우선 효소가 들어있는 배양 상층액 1㎖ 와 기질인 1mM 소디움-파이테이트를 0.1M 소디움-초산 완충용액(pH 5.5)에 40℃에서 30분간 반응시킨 후 2㎖ AMM 용액을 첨가하고 1M 구연산를 200㎕ 첨가한 다음 405nm에서 OD 값을 측정함으로써 유리된 인산염의 양을 산출하였고, 1 단위(unit)는 주어진 조건에서 1분당 1μM의 인산염을유리하는 효소의 양으로 정의하였다. 아울러, p-니트로페닐인산염 (nitrophenylphosphate, 1mM)을 기질로 측정하는 산 탈인산화 효소의 활성분석도 410nm에서의 OD 값을 측정함으로써 수행하였다(참조: Greiner, R., Arch. Biochem. Biophys., 303:107-113, 1993). MOK1 균주를 NPSM 배지에서 배양하여 조효소액 수준에서 파이타아제 활성을 조사한 결과, 0.322단위/㎖의 활성을 나타내었고, 세포내의 효소량은 9.47단위/mg으로 나타났으며, 산 탈인산화 효소의 경우는 44.9단위/㎖으로 관찰되었다. 전기 결과로부터 본 발명의 MOK1 균주는 기질 파이테이트에 대한 분해능이 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 파이타아제의 정제 및 특성
실시예 4-1: 파이타아제의 정제
본 발명의 균주로부터 생산되는 파이타아제의 정제를 위하여, 선발 균주를 1L NPSM 배지에서 2일간 배양한 다음, 전기 배양액을 5000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 침전된 균체를 회수하였다. 5g의 유리 구슬(glass bead)을 사용하여 전기 침전된 균체를 파쇄시켜 무균체 추출물(cell-free extract)을 수득하고, UNO S6 양이온 교환수지 컬럼(cation exchange column)과 UNO Q6 음이온 교환수지 컬럼(anion exchange column)을 차례로 수행하여 파이타아제를 정제하였다. 그 결과, 먼저 조추출물에 대한 효소역가를 측정해 본 결과, 비활성(specific activity)이 6.43단위/mg으로 나타났다(표 3). UNO S6 컬럼을 사용하여 양이온 교환수지 크로마토그래피를 수행한 결과, 약 85배의 정제도를 나타내는 효소 분획을 수득하였다. 마지막으로, UNO Q2 컬럼을 사용하여 음이온 교환수지 크로마토그래피를 수행한 파이타아제의 최종 정제 결과, 전기 효소의 정제도가 101배가 되는 것을 44%의 수율로 수득할 수 있었으며, 최종 정제 효소의 비활성은 648.9단위 이었다. 전기 결과는 종래 보고된 파이타아제의 비활성 즉, 아스퍼질러스 피컴은 196단위/mg, 바실러스 서브틸리스는 20 내지 28단위/mg와 비교하여 우수하기 때문에, 실제 상업적인 응용에 있어서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
실시예 4-2: 파이타아제의 특성
전기 실시예 4-1에서 정제된 파이타아제를 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행한 다음, 코마시블루 염색(coomassie blue staining)을 통하여 표준 단백질 밴드와 비교 분석한 결과, 본 발명의 파이타아제는 약 45kDa의 분자량을 갖는 것으로 나타났으며(도 2, M: 표준 단백질 마커; 1: 조효소; 및, 2: 본 발명의 파이타아제), 이는 종래 보고된 세균 유래 파이타아제의 분자량과 다른 결과임을 확인하였다. 또한, 정제된 파이타아제의 동력학(kinetics)을 조사하기 위하여, 소디움-파이테이트를 기질로 Km 및 Vmax 값을 측정한 결과, Km 값은 0.38mM, Vmax값은 769.2단위/mg으로 확인되었다. 아울러, 파이타아제 시료 100pM을 PVDF (polyvinylidene fluoride) 막(Mini Trans-Blot Cell, Bio-Rad, U.S.A)에 옮긴 후, 역가를 보이는 밴드를 옮겨 N-말단의 아미노산 서열을 분석한 결과, 알라닌-아스파라긴산-글라이신-타이로신-발린-루이신-아스파라긴산-라이신-발린으로 나타났으며, 전기 결과는 종래 보고된 균주 유래의 파이타아제와는 다른 아미노산 서열을 갖는 새로운 파이타아제로 판명되었다(표 4).
실시예 4-3: 본 발명의 균주로부터 수득한 파이타아제의 효소학적 특성
① 온도에 따른 파이타아제 활성
온도 변화에 따른 파이타아제 활성의 양상을 조사하기 위하여, 20 내지 80℃의 온도 범위에서 기질과 조효소액을 pH 5.5인 0.1M 소디움-초산 완충용액에서 각각 30분간 방치하면서 파이타아제 활성의 변화 여부를 관찰하여 파이타아제 활성의 최적온도를 규명하였다(도 3). 도 3에서 보듯이, MOK1 균주의 온도별 파이타아제 활성 변화를 조사한 결과, 37 내지 40℃ 범위에서 파이타아제 활성이 가장 높게 나타났다.
② pH에 따른 파이타아제 활성
pH 변화에 따른 파이타아제 활성의 양상을 조사하기 위하여, 40℃에서 각각 pH 2 내지 3의 글라이신-염산 완충용액, pH 4 내지 5의 초산 완충용액, pH 6의 비스-트리스(bis-tris) 완충용액, pH 7 내지 8.5의 트리스 완충용액에서 파이타아제 활성의 변화를 관찰하여 파이타아제 활성의 최적 pH를 규명하였다(도 4). 도 4에서 보듯이, pH 5.5 내지 6.0 범위에서 가장 높은 파이타아제 활성을 나타내었다.
③ 기질특이성
소디움-파이테이트를 포함하는 다양한 인산염 기질을 이용하여 40℃, pH 5.5 초산 완충용액에서 효소반응을 시킨 다음, 전기 반응액으로부터 유리된 무기태인의 양을 측정하였다. 이때, 소디움-파이테이트에 대한 효소반응을 100%로 하고, 다른 기질에 대한 효소반응을 상대적으로 표시하였다. 사용한 기질로는 1mM의 소디움-파이로포스페이트(Na-pyrophosphate), 프럭토스-1-포스페이트(fructose- 1-phosphate), 프럭토스-6-포스페이트, AMP(adenosine mono-phosphate), ADP(adenosine di-phosphate), ATP(adenosine tri-phosphate), 글루코스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate), α-글리세롤포스페이트(α-glycerolphosphate), β-글리세롤포스페이트, α-나프틸포스페이트(α-naphthylphosphate), p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)를 사용하였다(표 5). 표 5에서 보듯이, 본 발명의 파이타아제는 소디움-파이테이트를 가장 효과적인 기질로 이용함을 확인함으로써 파이테이트에 대한 특이성이 우수한 것으로 판명되었다.
④ 금속이온 및 저해제가 파이타아제 활성에 미치는 영향
파이타아제 활성에 영향을 미치는 금속이온 및 저해제의 효과를 규명하기 위해 마그네슘(Mg), 카드뮴(Cd), 바륨(Ba), 알루미늄(Al), 리튬(Li), 아연(Zn), 칼슘(Ca), 구리(Cu), 코발트(Co) 또는 망간(Mn) 금속이온과 EDTA 또는 PMSF 저해제를 각각 5mM 농도로 첨가하여 효소반응시켰다. 이때, 대조구로서 금속이온 또는 저해제가 처리되지 않은 반응액의 효소 활성을 100%로 하고 상대적인 파이타아제 활성을 측정하여 저해율을 표시하였다. 그 결과, 본 발명의 파이타아제는 카드뮴, 아연 및 구리 이온에 대해서 활성이 강하게 저해됨을 확인할 수 있었다(표 6). 지금까지 보고된 파이타아제 생산 세균으로서 바실러스(참조: Y. O. Kim et al., Enzyme and Microbial Technology, 22:2-7, 1998) 및 슈도모나스(참조: Richardson, A. E.and P. A. Hadobas, Can. J. Microbiol. 43:509-516, 1997)가 알려져 있으나, 전기 슈도모나스 균주의 경우, 파이타아제 활성 존재 여부만을 언급했을 뿐, 그외의 효소학적 특성에 대하여는 개시하지 않았으며, 본 발명의 균주와 동일한 균주로부터 파이타아제 생산을 보고한 문헌이 없으므로, 본 발명의 파이타아제 생산 균주 슈도모나스 시린게 및 전기 균주로부터 생산된 파이타아제는 신규한 것임을 확인 할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 토양 시료로부터 분리한파이타아제 생산 균주 슈도모나스 시린게 MOK1 및 그로부터 생산되었으며, 종래 보고된 파이타아제와 구별되는 특징을 지니고 있는 신규한 파이타아제를 제공한다. 따라서, 본 발명의 균주인 슈도모나스 시린게 MOK1으로부터 생산된 파이타아제는 종래 보고된 파이타아제와 그 특성이 다른 신규한 것으로 고유 활성도가 우수하기 때문에, 재조합 기술 및 발효 최적화를 통해 전기 효소의 발현을 증대시킴으로써 유용 효소로 이용될 것이다.

Claims (3)

  1. 신규한 파이타아제를 생산하는 슈도모나스 시린게 MOK1(Pseudomonas syringaeMOK1)(KFCC-11192).
  2. 삭제
  3. 제 1 항의 균주에 의하여 생산되는 파이타아제 정제방법에 있어서,
    (ⅰ) 제 1 항에 의한 균주를 배양하여 여과한 다음, 원심분리하여 균체를 수득하는 공정; (ⅱ) 전기 균체를 파쇄하여 무균체 추출물을 회수하는 공정; (ⅲ) 전기에서 회수한 무균체 추출물을 양이온 교환수지 크로마토그래피 하는 공정; 및 (ⅳ) 전기에서 수득한 활성분획을 음이온 교환수지 크로마토그래피하는 공정을 포함하는 파이타아제의 정제방법.
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