KR0141261B1

KR0141261B1 - 뉴캣슬병(New Castle Disease)진단 방법

Info

Publication number: KR0141261B1
Application number: KR1019950002100A
Authority: KR
Inventors: 김원용; 박용하; 김선중; 김철중; 권혁준
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-02-07
Filing date: 1995-02-07
Publication date: 1998-06-15
Also published as: KR960031623A

Abstract

본 발명은 뉴캣슬병 바이러스의 F 단백질 유전자를 이용하여 뉴캣슬병을 진단하는 방법에 관한 것으로 뉴캣슬병 바이러스의 F 단백질 유전자 절편에 대응하는 프라이머를 가지고 역전사효소-중합효소 연쇄반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 뉴캣슬병을 진단하는 방법에 의하면 뉴캣슬병 바이러스를 신속하고 효과적으로 진단할 수 있다.

Description

뉴캣슬병(New Castle Disease) 진단 방법

제1도는 뉴캣슬병 바이러스의 F 단백질 유전자 및 Fm1, Fm2 및 Fm3 의 배치도이다.

본 발명은 뉴캣슬병(New Castle Disease)을 진단하는 방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 조류의 뉴캣슬병을 일으키는 파라믹소바이러스-I 의 F 단백질 유전자를 이용하여 뉴캣슬병을 진단하는 방법에 관한 것이다.

뉴캣슬병은 RNA 바이러스인 파라믹소바이러스과(Paramyxo viridae) 에 속하는 파라믹소바이러스-I 인 뉴캣슬병 바이러스에 의해 발병되는 조류의 질병으로, 이 바이러스에 감염된 조류는 기침 등의 호흡기 증상, 녹색변 등의 소화기 증상, 졸거나 목이 돌아가는 신경학적 증상 등의 복합적인 반응을 나타낸다. 또한 이 질병은 기침에 의해 공기로 전파되어 2 내지 3일 내에 계사 전체로 확산되며, 거의 100% 에 육박하는 폐사율을 보이기 때문에 경제적으로 피해가 심한 급성 전염병으로 다른 질병에 비해 더욱 신속한 진단 방법이 요망되어 왔다.

뉴캣슬병에 대한 기존의 진단 방법으로는 다음과 같은 것이 있다.

1) 혈구 응집반응을 이용하는 방법(오등, 가축위생연구소보, 1963년, 9월 9일; Takehara et al., Jp. Avian. Dis., 31,125, (1986));

2) 조류태아 섬유아세포를 합포체(syncytia)로 변성시키는 방법(Nagai et al., Virol., 72, 494, (1976));

3) 조류혈청내 항체가를 측정하는 방법(Allan et al., Vet. Rec., 95, 120, (1974); 및

4) DNA 프로브를 이용하는 방법(Chamber et al., J. Gen. Virol., 67, 2685, (1986)).

상기 진단 방법중 1) 및 2) 의 진단 방법은 호흡기 증상을 보이는 계사에서 분리된 변종에 대해서는 양성 반응을 나타내지 않는다(서승희, 뉴캐슬병 바이러스 국내 분리주의 생물학적 특성 및 올리고 뉴클레오티드 프로브를 이용한 검출, 서울대학교 수의학과 석사학위 논문, 1994년 6월).

3) 의 진단 방법에 있어서는 개체마다 항체가가가 다양하기 때문에 단순히 항체가를 측정하는 것은 절대적 기준이 될 수 없으며, 또한 바이러스를 감염시키거나 백신을 접종하고 적어도 일주일이 경과되어야 항체가의 증가가 관찰되며 창체가의 증가가 감염에 의한 것인지 백신 투여에 의한 효과인지를 구분하기 어려운 단점이 있다.

4)의 진단 방법은 상기 1) 내지 3) 의 진단 방법과는 달리 DNA 프로브를 이용하기 때문에 신속한 초기 진단이 가능하지만, 92-105D 주에 대해서는 양성 반응을 나타내지 않았다(서승희 등, 상기 문헌).

이에 본 발명자들은 보다 신속하고 정확한 진단 방법을 개발하기 위하여 노력하던 중, 뉴캣슬병 바이러스의 F 단백질 유전자의 염기서열이 백신주와 변이주에 있어 일치하지 않는다는 사실을 발견하고, 95% 이상의 상등성을 가지는 부분에 대응하는 2 개의 프라이머를 가지고 역전사효소-중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction: 이하 RT-PCR 로 언급함)을 실시하거나 이들 프라이머로 중폭하여 얻은 648bp DNA 프로브를 이용하여 더욱 신속하고 정확하게 뉴캣슬병을 진단하는 방법을 개발하였다.

따라서, 본 발명은 뉴캣슬병 바이러스의 F 단백질 유전자 절편에 대응하는 프라이머를 가지고 역전사효소-중합효소 연쇄반응을 실시하는 것을 특징으로 하는, 뉴캣슬병의 진단 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서 사용한 뉴캣슬병 바이러스주는 울스터(Ulster), 라소타(La Sota), B1/47, 미야데라(Miyadera) 등의 표준주 4 주 및 1984년부터 1993년까지 한국에서 분리된 24주로, 모두 서울대학교 수의과대학 조류질병학실로부터 입수하였다.

국내에서 분리된 주의 특성은 다음과 같다:

1) 56℃ 에서 30 분간 열처리한 88-139, 89-51, 89-70, 90-37, 90-111,91-33 주는 혈구응집 반응활성을 계속 유지하였다;

2) 56℃에서 10 분간 3 회 열처리한 92-76D, 92-76S, 92-83D, 92-83S, 92-105D, 92-105S 주는 계태아 섬유아세포에 감염시 활성을 유지하였다;

3) 92-76D, 92-82D, 92-83D, 92-84D, 92-105D, 93-58D 는 계태아 섬유아세포에 감염시 합포체를 형성하지 않았으며, 감염세포는 둥글게 변형되어 섬유아세포의 특성을 상실하였다;그리고

4) 분리주에 대하여 얻은 항혈청과 라소타주와 혼합하거나, 라소타주에 대한 항혈청을 분리주와 혼합하여 계태아 섬유아세포에 감염시킬 경우 혈청에 의한 바이러스의 중화능을 비교하는 항원 관련성에 있어서, 92-105S 와 93-58S 는 라소타주에 대해 매우 낮은 항원 관련성을 나타냈다;

뉴캣슬병 방이러스는 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질로 구성되는데 그중 F 단백질은 숙주 세포의 세포막과 융합하여 바이러스가 숙주세포에 감염되도록 도와주는 필수 단백질이다. F 단백질 유전자는 1796 bp 크기를 가지며 GenBank에 등록되어 있는 21 개 변이주에 대한 RNA 염기서열 비교에서 90% 이상의 상동성을 나타낸다.

본 발명에서는 F 단백질 유전자중 특히 95% 이상의 상동성을 가지는 531 ∼ 1178 의 절편 648 bp을 분리하고 이를 Fm2 라 명명하였다. 이어, Fm2 의 말단부위에 대응하는 프라이머 1 (5′-ATGAG GCTGT GCATG AGGTC-3′) 및 프라이머 2 (5′-CGCCT TCGGT CTTTG AGTAC-3′)을 합성하고, 또한 Fm2 의 앞에 위치하는 719 bp 의 절편(Fm1 이라 명명함) 및 뒤에 위치하는 693 bp 의 절편(Fm3 로 명명함)을 확인하기 위하여 이들 절편의 말단부위에 대응하는 프라이머3 (5′-AGATT CTGGA TCCCG GTTGG-3′) 및 4 (5′-GTGAA GTGAT TTGTG GTCCG-3′), 그리고 프라이머 5 (5′-GAACT TGACA CCTCA TACTG-3′) 및 6 (5′-GATAC CTCCG CCTCT CATCT-3′)을 각각 합성하였다. 계란의 요막강에서 배양하여 얻은 28주 바이러스의 RNA 와 이들 프라이머를 RT-PCR 반응시켰을 때, Fm2 부위는 강하게 반응하였으나 프라이머 3 내지 6 의 경우에는 이중 13주는 반응하지 않았다.

결과는 하기 표 1에 도시한 바와 같다.

상기 표에서, -는 육안으로 관찰되지 않는 경우이고, +부터 ++++까지의 양성 반응은 발명자의 주관에 따라 판정하였다.

감염된 조류의 내부 장기에서 분리되는 뉴캣슬병 바이러스는 모두 병원성이므로(Nagi et al., J. Gen. Virol., 45, 263, (1979); Pritzer et al., Virus Res., 15, 237, (1990)), 감염장기에서 RNA를 분리하고 본 발명의 프라이머 1 및 2를 이용하여 RT-PCR 반응을 수행하였을 때에도 바이러스의 존재를 확인할 수 있다. 또한 프라이머 1 과 2를 증폭하여 얻은 648 bp 의 DNA 절편을 DNA 프로브로 사용하여 상기 실험을 반복하였을 때에도, 모든 조건에서 양성으로 나타났다.

이상에서와 같이 뉴캣슬병 바이러스의 F 단백질 유전자중 95% 이상의 상동성을 갖는 648 bp 절편인 Fm2 부위에 대응하는 프라이머 1 과 2 및 이들 프라이머로 증폭하여 얻은 648bp의 DNA 프로브를 뉴캣슬병 바이러스의 검출에 사용할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀더 구체적으로 예시하고자 하나 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

단계 1: 백신주 배양

페이먼트 등의 바이러스 배양법(Payment et al., Chap. 3, Isolation Identification of Viruses, ed. by Payment Trudel, Methods and Techniques in Virology, Marcel Dekker Inc., 1993) 에 따라, 백신으로 사용하는 라소타주를 9 내지 11 일령의 발육 계란 10개의 요강막에서 6 일간 배양하였다. 수확한 요막액 0.2㎖ 에 RNA 졸 B(Biotech Lab.) 0.5㎖ 및 클로로포름 0.07 ㎖을 첨가하고 강력하게 교반한 후 4℃에서 5 분동안 정치시켰다. 이를 12,000g 로 원심분리하여 상등액을 얻고 여기에 동량의 이소프로판올을 첨가하고 동일한 조건하에서 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. RAN 침전물을 수거하고 75% 에탄올 1 ㎖ 로 세척 및 건조시켰다.

단계 2: DNA 프로브 제작 및 바이러스의 검출

증류수 10 ㎕ 에 녹인 실시예 1 의 RNA 1 ㎕을 5 배 농축된 역전사 효소 완충액(Reverse transcriptase buffer, BRL Co.) 2 ㎕, 디티오트레이톨 1 ㎕, 2.5 mM dNTP(deoxy-nucleotide triphosphate) 혼합물(Perkin-Elmer Citus) 2㎕, 프라이머 1 (10 μM) 1 ㎕ 및 물 3㎕ 와 혼합한 후 광물유 2 방울을 적가하고 70℃에서 30 분간 가열하였다. 서서히 37℃ 로 온도를 낮춘후 역전사효소(SuperscriptII, BRL) 1 ㎕ (50U/㎕)를 첨가하여 1시간동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

합성한 cDNA 10㎕ 에 반응액(10× Taq 완충액 5 ㎕, 2.5 ㎖ dTNP 혼합물 4 ㎕, 프라이머 1 및 2 각 5 ㎕ 및 물 2 ㎕) 39 ㎕을 첨가하여 열 순환기(Perkin-Elmer Thermal Cycler 480; Perkin-Elmer Citus)에서 중합효소 연쇄반응을 실시하였다.

중합효소 연쇄 반응의 순환 사이클은 다음과 같다:

98℃에서 10 분, 4 ℃ 로 급냉후 AmpiTaq 중합효소(3U/㎕, Perkin-Elmer Citus) 1 ㎕을 첨가, 94℃에서 1 분, 55℃에서 45 초, 72 ℃에서 2 분; 이 사이클을 30 사이클 반복한 다음 55℃에서 100 초, 72 ℃에서 8 분간 반응시킨 다음 4 ℃ 로 냉각.

RT-PCR 로 얻은 Fm2 부위 5 ㎕을 6×겔 로딩 완충액 1 ㎕ 와 혼합하고 TAE(트리스-아세트산-EDTA) 완충액에 녹인 1% 아가로스 겔(Seakem GTG, FMC)상에서 4V/㎝ 의 전압으로 1 시간동안 전기영동하였다.

라소타주 RNA 는 Fm2 부위에서 강한 반응을 나타냈다.

[실시예 2 - 3]

백신으로 사용한 변이주 울스타주 및 B1 주 각각을 실시예 1의 방법에 따라 배양하여 RNA를 얻고 이어서 RT-PCR 반응시킨후 같은 방법으로 처리하였다.

울스타주 및 B1 주도 Fm2 부위에 강한 반응을 나타냈다.

[실시예 4]

백신주가 아닌, 병원성의 미야데라주를 실시예 1 의 단계 1 및 2 와 동일하게 배양 및 처리하였다.

미야데라주도 Fm2 부위에 강한 반응을 나타냈다.

[실시예 5 - 30]

1984년부터 1993년까지 서울대학교 수의과대학 조류질병학실에서 분리한 국내 뉴캣슬병 바이러스 24 주 각각에 대하여 실시예 1 과 동일한 방법으로 배양 및 처리하였다.

이들 바이러스주도 Fm2 부위에 강한 반응을 나타냈다.

[실시예 31]

분리주 93-58S를 20 주령의 산란계 6 마리에 구강접종하고 관찰하였다. 모든 개체는 활기가 떨어지고 재채기 및 기관지 잡음 등의 호흡기 증상을 보였으며 모두 4 일내에 폐사하였다. 사체를 부검한 결과 모두 장점막면에 심한 충혈을 보였다.

사체로부터 기관지 100 ㎎을 채취하고 RNA 졸 B ㎖을 첨가하여 상피 세포를 파쇄하고 클로로포름 0.1 ㎖를 첨가하고 4 ℃에서 5 분동안 정치시켰다. 이를 12,000 g 로 원심분리하여 상등액을 얻고 여기에 동량의 이소프로판올을 첨가하고 동일한 조건하에서 원심분리하였다. 침전물을 수거하고 75% 에탄올 1 ㎖ 로 세척 및 건조시킨 다음 실시예 1 의 단계 2 와 동일한 방법으로 처리하였다.

분리주 93-58S 도 Fm2 부위에 강한 반응을 나타냈다.

[실시예 32]

실시예 31에서 얻은 사체의 비장 100 ㎎을 RNA 졸 B 1 ㎖을 첨가하여 파쇄하고 클로로포름 0.1 ㎖을 첨가한 다음 실시예 1 의 단계 2 와 동일하게 처리하였다.

이 분리주 역시 Fm2 부위에 강한 반응을 나타냈다.

[실시예 33]

실시예 31에서 얻은 분변 100 ㎎을 물 200 ㎕ 에 부유시키고 3,000 g에서 원심분리하였다. 상등액을 분리하고 여기에 인산염 완충액을 첨가하여 10 배로 희석시킨 후 희석액 200 ㎕ 에 RNA 졸 B 1 ㎖을 첨가하여 세포를 파쇄하고 플로로포름 0.1 ㎖을 첨가한 다음 실시예 1 의 단계 2 와 동일하게 처리하였다.

분변에서 분리된 균주도 Fm2 부위에 강한 반응을 나타냈다.

[실시예 34]

실시예1 의 단계 2에서 전기영동 밴드로부터 648 bp 크기의 DNA 밴드를 절단하고 PCR Prep 킷트(Promega Co.)를 이용하여 회수하고 동위원소 a -P (Amersham Co.) 로 방사 표지하여 F 단백질 유전자의 Fm2 부위에 대한 DNA 프로브를 제조하였다.

이 DNA 프로브를 사용하고 슬롯-블롯 장치(PR600, Hoefer Co.)에서 실시예 1 의 단계 1에서 얻은 라소타주 RNA 100 ng 과 반응시켰다.

반응 결과, X -선 필름상에 강한 반점이 나타났다.

[실시예 35]

실시예 31에서 얻은 기관지 유래 RNA 와 실시예 34 의 DNA 프로브를 반응시켰다. 반응 결과, X-선 필름상에서 강한 반점이 나타났다.

이상의 실시예에서 본 바와 같이, 뉴캣슬병 바이러스의 F 단백질 유전자의 Fm2 부위에 관련된 프라이머 1 과 2 및 이들로부터 제작된 DNA 프로브를 이용하여 뉴캣슬병 바이러스를 신속하고 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있다.

Claims

조류의 장기로부터 추출된 RNA에 대해 뉴캣슬병 바이러스의 F 단백질 유전자의 531 내지 1178 위치의 648 bp 절편에 대응하는 프라이머를 가지고 역전사효소-중합효소 연쇄반응을 실시하는 것을 특징으로 하는, 조류의 뉴캣슬병을 진단하는 방법.
제 1항에 있어서,

상기 프라이머가 하기 뉴클레오티드 염기서열을 가짐을 특징으로 하는

방법:

5′-ATGAG GCTGT GCATG AGGTC-3′

및

5′-CGCCT TCGGT CTTTG AGTAC-3′