KR0135723B1

KR0135723B1 - 신규한 에스큘레틴 유도체 및 약학 조성물

Info

Publication number: KR0135723B1
Application number: KR1019940003709A
Authority: KR
Inventors: 고주 와따나베; 고이찌 니이무라; 기요노리 우메까와
Original assignee: 고다마 쥰이찌로; 구레하 가가꾸 고교 가부시끼가이야
Priority date: 1993-03-02
Filing date: 1994-02-28
Publication date: 1998-04-23
Also published as: KR940021058A; EP0614896A1; CN1101259A; EP0614896B1; CA2116617A1; NO940710D0; DE69415570T2; DE69415570D1; CA2116617C; NO940710L; JPH06312925A; US5455268A; CN1147297C; AU5643894A; AU660870B2

Abstract

하기 일반식(Ⅰ)의 화합물을 포함하는 약학 조성물.

상기식에서,

R¹및 R²는 각각 독립적으로 수소원자, 탄소수 2 내지 25의 포화 또는 불포화 지방족아실 그룹 또는 벤조일 그룹이고, R³이 수소원자 또는 탈킬 그룹

Description

신규한 에스큘레틴 유도체 및 약학 조성물

본 발명은 신규한 에스큘레틴(aesculetin)유도체 및 약학 조성물, 특히 연골 보호제에 관한 것이다.

관절증에는 만성관절 류마티스, 류마티스열 또는 변형성 관절증 등이 있다. 그 중에서도 만성관절 류마티스 및 변형성 관절증은 환자 수가 많아 중요한 관절증으로 여겨지고 있다. 변형성 관절증에는 선천성 또는 이차적인 증상과 노화에 의한 관절연골의 퇴행 변성에 의한 일차적인 증상이 있다. 일차적인 변형성 관절증은 근래에 노령자 인구의 증대에 따라서 증가하고 있다.

만성관절 류마티스 및 변형성 관절중에서는 병의 원인이나 병의 상태에 큰 차이가 있다. 그러나 어떤 것이라도 최종적으로는 연골 파괴에 의해 관절의 기능이 장애가 오는 공통점이 있다.

류마티스성 질환, 예를들면 만성관절 류마티스, 류마티스열, 전신성 홍반성 낭창(systemicerythematodes) 또는 변형성 관절증 등에 대해 1차적으로 선택되는 약제는 진통소염제, 예를 들면 아스피린 또는 인도메타신 등이 있다. 만성관절증 치료제로서는 그외 금제제(예를 들면, 시오졸 등), 면역조절제, 스테로이드제 또는 D-페니실라민등이 사용된다.

그러나 종래의 상기 진통소염제는 관절연골의 파괴에는 효과가 없고, 연골 세포를 이용한 실험에 있어서는 반대로 더 해로운 경우도 있다. 또한, 상기 만성관절증 치료제에도 관절 연골의 파괴억제작용이 발견되지는 않는다.

한편, 에스큘레틴이나 4-메틸 에스큘레틴이 콜레스테롤 저하, 혈관 보강 및 산화방지작용을 갖는다는 것은 알려져 있었다.(일본특허공개 제67-16626호의 공보). 또한, 4-메틸에스큘레틴의 탄소수 6 내지 25의 카복실산의 디에스트르, 특히 카프릴산 디에스테르, 라우린산 디에스테르 및 팔미틴산 디에스테르가 피부 질환 치료에 유용한 소염작용을 갖는다는 것도 알려져 있다(프랑스 특허 제2276819호). 그러나, 이들 에스큘레틴이나 에스큘레틴 유도체가 연골파괴를 억제하는 작용을 갖는다는것은 알려져 있지 않았다.

본 발명자들은 에스큘레틴 화합물, 즉 에스큘레틴 및 에스큘레틴 유도체가 연골 매트릭스를 구성하는 글리코스아미노글리칸(이하 GAG라 명칭한다)의 감소를 강하게 억제하여 관절연골의 파괴를 억제하는 연골 보호제로서 유용하다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다. 또 상기 활성을 갖는 에스큘레틴 유도체의 일부도 신규 화합물이다.

따라서, 본 발명의 목적은 에스큘레틴 화합물을 유효성분으로서 포함하는 약학 조성물, 특히 연골 보호제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규의 에스큘레틴 유도체를 제공하는 데 있다.

본 발명은 하기 일반식(Ⅰ)의 화합물(이하에서는 화합물(Ⅰ)이라 약칭한다)을 포함하는 약학 조성물, 특히 연골 보호제에 관한 것이다.

상기식에서,

R¹및 R²는 각각 독립적으로 수소원자, 탄소수 2 내지 25의 포화 또는 불포화 지방족아실 그룹 또는 벤조일 그룹이고, R³은 수소원자 또는 알킬 그룹이다.

또한, 본 발명은 하기 일반식(Ⅱ)의 화합물(이하에서는 화합물(Ⅱ)라 약칭한다)에 관한 것이다 :

상기식에서,

R¹¹및 R¹²는 각각 독립적으로 수소원자, 피발로일 그룹, 카프릴로일 그룹, 라우로일 그룹, 팔미토일 그룹, 스테아로일 그룹, 리놀레오일 그룹, 도코사헥사에노일 그룹 또는 벤조일 그룹이고, R¹³은 수소원자 또는 메틸 그룹니다.

즉, 신규 화합물인 화합물(Ⅱ)은 연골 보호작용을 갖는 화합물(Ⅰ)에 관한 이하의 설명은 해당하는 경우에는 화합물(Ⅱ)에도 해당된다.

화합물(Ⅰ)에 있어서, R¹및 R²의 바람직한 예는 수소원자, 아세틸 그룹, 피발로일 그룹, 카프릴로일 그룹, 라우로일 그룹, 팔미토일그룹, 스테아로일 그룹, 리놀레오일 그룹, 도코사헥사에노일 그룹 및 베노조일 그룹이고, 보다 바람직한 예는 화합물(Ⅱ)에서의 R¹¹및 R¹², 즉 수소원자, 피발로일 그룹, 카프릴로일 그룹, 라우로일 그룹, 팔미토일 그룹, 스테아로일 그룹, 리놀레오일 그룹, 도코사헥사에노일 그룹 및 벤조일 그룹이며, 화합물(Ⅰ) 및 (Ⅱ)에 있어서, 보다 바람직한 예는 수소원자, 피발로일 그룹, 스테아로일 그룹 및 벤조일 그룹이다. R³의 바람직한 예는 화합물(Ⅱ)의 R¹³, 즉 수소원자 및 1 내지 4의 저급 알킬 그룹이고, 보다 바람직한 예는 화합물(Ⅱ)에서의 R¹³, 즉 수소원자 또는 메틸그룹이다.

본 발명의 화합물(Ⅰ) 및 (Ⅱ)로서는 예를 들면 하기 화합물들을 들수 있다.

에스큘레틴,

4-메틸에스큘레틴,

에스큘레틴 6,7-비스(아세테이트),

4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(아세테이트),

에스큘레틴 6,7-비스(피발레이트),

4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(피발레이트),

에스큘레틴 6-모노피발레이트,

4-메틸에스큘레틴 7-모노피발레이트,

에스큘레틴 7-모노피발레이트,

4-메틸에스큘레틴 7-모노피발레이트,

에스큘레틴 6,7-비스(카프릴레이트),

4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(카프릴레이트),

에스큘레틴 6,7-비스(라우레이트),

4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(라우레이트),

에스큘레틴 6,7-비스(팔미테이트),

4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(팔미테이트),

에스큘레틴 6,7-비스(스테아레이트),

4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(스테아레이트),

에스큘레틴 6,7-비스(리놀레이트),

4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(리놀레이트),

에스큘레틴 6,7-비스(도코사헥사에노에이트),

4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(도코사헥사에노에이트),

에스큘레틴 6,7-비스(벤조에이트),

4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(벤조에이트),

상기에 예시한 화합물 중에서 에스큘레틴 6-모노피발레이트, 에스큘레틴 6,7-비스(피발레이트), 에스큘레틴 6,7-비스(스테아레이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(스테아레이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(리놀레이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(도코사헥사노에이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(벤조에이트)는 화합물(Ⅱ)에 속하는 신규 화합물이다.

에스큘레틴 또는 4-메틸에스큘레틴은 시약으로서 입수 가능하다. 예를 들면, 에스큘레틴은 도꾜가세이 고교 가부시끼가이샤로부터, 4-메틸에스큘레틴은 시그마 케미칼 캄파니로부터 입수할 수 있다.

에스큘레틴 또는 4-알킬에스큘레틴의 각종 카복실산 모노 또는 디에스테르는 에스큘레틴 또는 4-알킬에스큘레틴과 각종 카복실산을 하기 방법으로 반응시켜 수득할 수 있다.

1) 적당한 용매를 사용하여 산촉매, 예를 들면 염산, 황산 또는 인산등의 무기산, 또는 예를 들면 초산 또는 p-톨루엔설폰산등의 유기산의 존재하에 에스큘레틴 또는 4-알킬에스큘레틴과 카복실산을 반응 시킨다.

2) 축합제, 예를 들면 디사이클로헥실카보디이미드, N,N'-카보닐디(2-메틸이미다졸), 디페닐케텐-N-사이크로헥실이민, 알콕시아세틸레, 폴리인산에틸에스테르, 염화티오닐 또는 염화옥살릴 등의 존재하에, 유기용매, 예를 들면 디메틸포룸아미드, 아세톤, 디옥산, 아세토니트릴, 클로로포름, 염화메틸렌, 테트라하이드로루란 또는 피리딘 중에서 에스큘레틴 또는 4-알킬에스큘레틴과 카복실산을 반응시킨다. 통상 냉각하 내지 실온에서 실시한다.

3) 산무수물과 에스큘레틴 또는 4-알킬에스큘레틴을 염기성 화합물, 예를 들면 트리에틸아민, 피리딘, 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘 또는 디에틸메틸아민의 존재하에 반응시킨다.

4) 산할로켄화물(할로겐화아실 : 염화물, 브롬화물 등)과 에스큘레틴 또는 4-알킬에스큘레틴을 염기성 화합물, 예를 들면 트리에틸아민, 피리딘, 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘 또는 디에틸메틸아민을 첨가한 용매중에서나 염기성 용매, 예를 들면 피리딘 중에서 반응시킨다.

상기 원료의 사용비율에 따라 모노에스테르 또는 디에스테르를 수득할 수 있다. 에스큘레틴 또는 4-알킬에스큘레틴과 등몰량 내지 적은 과잉량의 카복실산, 산무수물 또는 산할로겐 화물을 사용할 때는 모노에스테르를 수득할 수 있고, 또 이들을 많은 과잉량, 통상 몰비 2 이상을 사용할 때는 디에스테르를 수득할 수 있다.

후자의 경우, 디에스테르와 모노에스테르의 혼합물이 수득되는 경우도 있다. 이 경우는 크로아토그래피등의 통상의 분리법을 이용함으로써 디에스테르 및 모노에스테르를 용이하게 수득할 수 있다.

반응생성물의 정제법으로서는 추출, 크로마토그래피, 재결정화 또는 재침전 등을 이용할 수 있다. 정 제품의 구조는 적외선 흡수스펙트럼, 자외선 흡수스펙트럼, 핵 자기 공명 흡수스펙트럼, 원소분석 또는 질량스펙트럼 등에 의해 확인할 수 있다.

화합물(Ⅰ)에 대해 독성을 조사하였다. 화합물(Ⅰ)이 대표예를 750mg/kg(체중)의 양으로 수컷 마우스에게 연속 4일간 복강내투여 하였지만, 사망예는 없고, 별다른 독성은 나타나지 않았다. 화합물(Ⅰ)은 극히 안전한 화합물이다(하기 실시예 2 참조)

화합물(Ⅰ)은 약리 효과로서 배양연골세포(집토끼의 어깨, 담관절연골세포)의 연골 파괴 억제작용을 갖는다(하기 실시예 3 참조).

따라서 화합물(Ⅰ)은관절의 연골 파괴를 수반하는 각종 관절증의 치료를 위한 연골 보호제로서 유용하다. 이러한 관절증의 예는 만성관절 류마티스, 변형성 관절증, 어깨관절주위염, 어깨·팔·목 증후군, 요통증 등이다.

화합물(Ⅰ)을 유효성분으로 하는 연골 보호제는 통상의 제제형태일 수 있다. 화합물(Ⅰ)을 단독으로 나 화합물(Ⅰ)과 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와의 혼합물로서 제형화할 수 있다. 제제중의 유효성분의 양은 0.01 내지 100중량%, 바람직하게는 0.1 내지 70중량%이다.

본 발명의 연골 보호제는 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.

본 발명의 연골 보호제의 투여량은 대상(동물 또는 인간), 연령, 개인차 또는 증상 등에 따라 달라지기 때문에, 하기 범위와의 양을 투여하는 경우도 있다. 그러나, 일반적으로 인간을 대상으로 하는 경위 화합물(Ⅰ)의 경구 투여량은 0.1 내지 500mg/kg(체중)/일, 바람직하게는 0.5 내지 200mg/kg(체중)/일이다. 통상 1일 투여량을 1회 또는 2 내지 4회로 나누어 투여한다.

실시예

이한, 실시예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 또한, 이하의 실시예에 있어서 TLC는 박충크로마토그래피이다.

실시예 1 : 화합물(Ⅰ)또는 (Ⅱ)의 합성

(1) 에스큘레틴 6,7-비스(아세테이트)의 합성

가지달린 플라스크(50ml)에 에스큘레틴(도꾜가세이사 제품 ; 890mg, 5밀리몰)과 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘(1,528g, 12.5밀리몰)을 넣은 후, 염화메틸렌(10ml)을 첨가하여 현탁액으로 하였다. 이 현탁액에 10℃에서 서서히 염화아세틸(와꼬우쥰야구사 제품 ; 918mg, 12.5밀리몰)을 적하하였다. 반응은 발열적이었다. 반응액을 10℃에서 2시간 교반하자, 백색 침전물이 생성되었다. 염화메틸렌(25ml)을 첨가하자, 침전물은 완전히 용해되었다.

반응 종료를 확인한 후, 반응액에 증류수(40ml)를 첨가하고, 여 염화메틸렌(25ml×2)으로 추출하였다. 유기층을 모아증류수 (20ml×1)로 세정하고 황산나트륨으로 건조시킨 후, 회전식 증발기로 용매를 증류 제거하여 결정성의 조 생성물(1.265g)을 수득하였다. 조 생성물을 에틸알콜로부터 재결정하여 무색 침상 결정으로서 표기 화합물(1.03g, 수율 78.6%)을 수득하였다.

융점 : 133-133.5℃

TLC : Rf 0.33(n-헥산/에틸아세테이트 1 : 1)

¹H-NMR(CDCI₃, δppm) :

2. 3 2 (s, 3H, Ac) , 2.33(s, 3H, Ac), 6.43(d, 1H, J=9.62Hz, C3-H),7.22(s, 1H), 7.35(s, 1H), 7.64(d, 1H, J=9.62Hz, C4-H)

1R(KBr, υmax) :

1778s, 1738s, 1636m, 1570m, 1510m, 1463m, 1378m, 1218s, 1128s

(2) 4-메틸에사큘레틴 6,7-비스(아세테이트)의 합성

4-메틸에스큘레틴(시그마사 제품)을 원료로 하여 상기 실시예 1 (1)과 동일한 방법으로 표기 화합물을 합성하였다. 황색 결정으로서 표기 화합물을 수득하였다.

¹H-NMR(CDCl₃, δppm) :

7.33(s, 3H), 7.40(s, 3H), 6.32(s, 1H), 7.24(s, 1H), 7.44(s, 1H)

(3) 에스큘레틴 6,7-비스(스테아레이트)의 합성

가지달린 플라스크(50ml)에 에스큘레틴(890mg, 5밀리몰)과 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘(1,528g, 12.5밀리몰)을 넣은 후, 염화메틸렌(20ml)을 첨가하여 현탁액으로 하였다. 이 현탁액에 10℃에서 서서히 염화스테아로일(도꾜가세이사 제품 ; 3.787g, 12.5밀리몰)을 적하하였다. 반응액은 뿌옇게 고화되었다. 이 반응액에서 염화메틸렌(20ml)을 더 넣었더니, 반응액은 다시 현탁액으로 되었다. 이 현탁액을 실온에서 5시간 교반하였다.

반응 종료를 확인한후, 반응액을 얼음물(20ml)에 붓고, 염화메틸렌(100ml×1)으로 추출하였다. 분리한 유기층을 증류수(20ml×1)로 세정하여 황산나트륨으로 건조시킨 후, 회전식 증발기로 용매를 증류 제거하여, 백색의 조 생성물(3.91g)을 수득하였다. 조 생성물을 염화메틸렌/n-헥산으로부터 재결정시켜 백색 분말 결정으로서 표기 화합물(2.773g, 수율 78.0%)을 수득하였다.

융점 : 85-85℃

¹H-NMR(CDCl₃, δppm) :

0.88(t, 6H, Ch₃), 1.26(m, 56H, CH₂), 1.72(m, 4H, CH₂), 2.55(q, 4H, CH₂CO), 6.42(d, 1H, C3-H), 7.21(s, 1H, 방향족), 7.33(s, 1H, 방향족), 7.63(d, 1H, C4-H)

(4) 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(스테아레이트)의 합성

4-메틸에스큘레틴을 원료로 하여 상기 실시예 1 (3)과 동일한 방법으로 표기 화합물을 합성하였다. 백색 결정으로서 표기 화합물을 수득하였다.

융점 : 121-122℃

¹H-NMR(DMSO, δppm) :

0.85(t, 6H, Ch₃), 1.24(m, 56H, CH₂), 1.48(m, 2H, CH₂), 1.64(m, 2H, CH₂), 2.18(m, 2H, CH₂), 2.34(s, 3H, C4-CH₃), 2.57(m, 2H, CH₂), 6.18(s, 1H, C3-H), 6.84(s, 1H, 방향족), 7.42(s, 1H, 방향족)

(5)4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(리놀레이트)의 합성

염화스테아로일 대신에 염화리놀레오일(도꾜가세이사 제품)을 사용하여 상기 실시예 1 (4)와 동일한 방법으로 표기 화합물을 합성하였다. 황색의 유상 생성물로서 표기 화합물을 수득하였다.

¹H-NMR(CDCl₃, δppm) :

0.90(t, 6H, 1.2~1.4(m, 32H), 1.4~2.0(m,4H), 2.0~2.2(m, 8H), 2.4(s, 1H), 2.8(t, 4H), 5.3~5.5(m, 8H), 6.3(s, 1H), 7.2(s, 1H), 7.4(s, 1H)

(6) 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(도코사헥사에노에이트)의 합성

염화스테아로일 대신에 염화도코사헥사에노일(도꾜가세이사제품; 염화도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노일)을 사용하여 상기 실시예 1 (4)와 동일한 방법으로 표기 화합물을 합성하였다. 황색의 유상 생성물로서 표기 화합물을 수득하였다.

¹H-NMR(CDCl₃, δppm) :

0.95(t, 6H), 2.10(m, 4H), 2.2(s, 3H), 2.4~2.7(m, 8H), 2.7~3.0(m, 12H), 5.3~5.7(m, 24H), 6.3(s, 1H), 7.2(s, 1H), 7.4(s, 1H)

(7) 에스큘레틴 6,7-비스(벤조에이트)의 합성

가지달린 플라스크(50ml)에 에스큘레틴(890mg, 5밀리몰)과 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘 (1.528g, 12.5밀리몰)을 넣은 후, 염화메틸렌(10ml)을 첨가형 현탁액으로 하였다. 이 현탁액에 10℃에서 서서히 염화벤조일(도꾜가세이사 제품; 1,757g, 12.5밀리몰)을 적하하였다. 즉시 백색 침전몰이 생성되었지만, 반응액을 실온에서 4시간 교반하였다.

반응 종료 후, 반응액을 얼음물(20ml)에 붓고, 염화메틸렌(20ml×3)으로 추출하였다. 유기층을 합하여 증류수(20ml×1)로 세정하고, 황산나트륨으로 건조시킨 후, 회전식 증발기로 용매를 증류 제거하여, 결정성의 조 생성물(2.136g)을 수득하였다. 조 생성물 염화메틸렌/n-헥산으로부터 재결정시켜 백색 분말상 결정으로서 표기 화합물(1.899g, 수율 98.4%)을 수득하였다.

융점 : 183-184.5℃

TLC : Rf 0.69(n-헥산/에틸아세테이트 1 : 1)

¹H-NMR(CDCl₃, δppm) :

6.47(d, 1H, J=9.62Hz), 7.38(m, 6H, 방향족), 7.44(s, 1H), 7.56(s, 1H), 7.71(d, 1H, J=9.62Hz), 8.04(m, 4H, 방향족)

IR(KBr, υmax) :

1765s, 1745s, 1625w, 1605w, 1570w, 1510m, 1475m, 1430m, 1390m, 1325w, 1255s

(8) 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(벤조에이트)의 합성

가지달린 플라스크(50ml)에 4-메틸에스큘레틴(960mg, 5밀리몰)과 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘(2.445g, 20밀리몰)을 넣은 후, 염화메틸렌(10ml)을 첨가하여 현탁액으로 하였다. 이 현탁액에 10℃에서 서서히 염화벤조일(2.811g, 0밀리몰)을 적하하였다. 즉시 백색 침전물이 생성되었지만, 반응액을 실온에서 4시간 교반하였다.

반응 종료 후, 반응액을 얼음물(20ml)에 붓고, 염화메틸렌(20ml×3)으로 추출하였다. 유기층을 합하여 증류수(20ml×1)로 세정하고, 황산나트륨으로 건조시킨 후, 회전식 증발기로 용매를 증류 제거하여, 결정성의 조 생성물(2.250g)을 수득하였다. 조 생성물을 염화메틸렌/n-헥산으로부터 재결정시켜 백색 분말상 결정으로서 표기화합물(1.960g, 수율 98.0%)을 수득하였다.

융점 : 146-152℃

¹H-NMR(CDCl₃, δppm)0 :

2.41(d, 3H, J=2.0Hz), 6.34(d, 1H, J=2.0Hz), 7.33~7.64(m, 8H), 8.00(d, 2H, J=2.6Hz), 8.09(d, 2H, J=2.3Hz)

(9) 에스큘레틴 6,7-비스(피발레이트(Ⅰ)과 에스큘레틴 6-모노피발레이트(Ⅱ)의 합성

가지달린 플라스크(50ml)에 에스큘레틴 (200mg, 1.12밀리몰)과 피리딘(3ml)을 넣었다. 이 혼합물에 0℃에서 염화피발로일(283.6mg, 2.35밀리몰)을 첨가한 후, 실온에서 26시간 교반하였다.

박층크로마토그래피로 원료의 소실과 2개의 생성물 (Rf=0.8 및 0.23, 염화틸렌/메탄올=9 : 1)을 확인한 수, 반응액을 얼음물(20ml)에 붓고, 에테르로 추출하였다. 유기층을 모아서 황산나트륨으로 건조시킨 후, 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다.

조 생성물을 실리카겔크로마토그래피로 분리 정제하였다.

염화메틸렌을 사용하여 제 1 유출분획으로서 표기 화합물(Ⅰ)(무색결정, 수율 72%)과 제 2 유출분획으로서(Ⅱ)(무색결정, 수율 25%)를 수득하였다.

표기 화합물(Ⅰ)

융점 : 148-149℃

¹H-NMR(90MHz, CDCl₃, δppm) :

1.35(s, 18H), 6.40(d, 1H, J=10.3Hz), 7.15(s, 1H), 7.64(d, 1H, J=10.3Hz)

표기 화합물(Ⅱ)

융점 : 159-162℃

¹H-NMR(90MHz, CDCl₃, δppm) :

1.39(s, 9H), 6.26(d, 1H, J=9.5Hz), 6.98(s, 1H), 7.18(s, 1H), 7.60(d, 1H, J=9.5Hz)

실시예 2 : 마우스를 이용한 연속 4일간 복강내 투여에 의한 독성실험

생후 6주의 Crj : CD-1(ICR)종 수컷 마우스(1군 5마리)에 에스큘레틴 또는 에스큘레틴 6,7-비스(벤조에이트)를 0.5%메틸셀룰로즈 수용액에 현탁시킨 용액을 1일 1회 연속 4일간 복강내 투여하였다. 투여량은 750mg/kg으로 하였다. 어떤 화합물에 대해서도 사망예는 없었고, 특기하 만한 독성은 발견되지 않았다.

4-메틸에스큘레틴, 에스큘레틴 6,7-비스(아세테이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(아세테이트), 에스큘레틴 6,7-비스(스테아레이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(스테아레이트), 4-메틸에스큘레틴, 6,7-비스(리놀레이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(도코사헥사에노에이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(ㄴ조에이트), 에스큘레틴 6,7-비스(피발레이트) 및 에스큘레틴 6-모노피발레이트에 대해서도 동일한 독성시험을 실시하였지만, 사망예는 발견되지 않았다.

실시예 3 : 배양연골세포에서의 연골 파괴 억제 작용

(a) 배양연골세포의 조제

집토끼(뉴질랜드산 흰토끼)(체중 1내지 1.5kg, 기따야마라베스에서 구입)의 어깨, 담관절에서 무균적으로 연골을 빼내었다. 이것을 PBS(-)(Ca²⁺, Mg²⁺이 제거된), 행크스 액(hank's solution) 및 0.1% EDTA-PBS(-)로 잘세정한 후, 약 1mm 각을 새겼다. 이것에 0.1%EDTA 함유 PBS(-)를 첨가하여 37℃의 항온조에서 30분간 처리하였다. 다시, 트립신용액(0.25%)으로 37℃에서 1시간 처리하여 연골에 부착된 결합조직을 빼내었다. 다음에 상등액을 제거한 후, 연골을 소태아 혈청(FBS) 10% 및 콜라게나 제 0.2%를 함유한 Ham F-12 배지 안에서 2 내지 2.5시간 처리하였다. 이 콜라게나제 용액을 원심분리 (1500rpm)시킨 후, 10%FBS 함유 Ham 배지(연골 배지)로 2회 세정하여, 최종적으로 연골세포를 연골배지에 세포수 3×10⁵개/ml의 세포농도가 되도록 조정하였다. 이 분산액을 1ml씩 24구멍판에 파종하여 4일후 융합하게 한 후 2주간 이내에 실험에 사용하였다.

(b) 시험물질 및 연골파괴인자의 첨가

이제까지 연골세포의 배양에 사용한 연골 배지를 빼내고, 혈청을 제거하는 S-클론(Clone) 배지 800㎕(0.1% 사람 혈청 알부민 함유)를 첨가하여 여기에 농도를 달리한 시험물질 100㎕(최종농도의 10배 S-Clone 배지액, DMSO농도 2.5%)를 첨가하고, 이산화탄소(5%)와 공기(95%)의 존재하에서 2시간 배양 후, 연골파괴인자 PMA(phorbol myristate acetate)(최종농도 0.1㎍/㎖) 또는 인터류킨(interleukin)la(1L-1a)(최종농도 20u/ml)를 연골세포배양액중에 첨가하였다.

여기서 사용한 시험물질은 다음과 같다.

본 발명의 화합물 : 에스큘레티(도꾜가세이사 제품), 4-메틸에스큘레틴(시그마사 제품), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(아세테이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(스테아레이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(리놀레이트), 4-메틸에스귤레틴 6,7-비스(도코사헥사에노에이트), 에스큘레틴 6,7-비스(벤조에노이트), 4-메틸에스큘레틴 6,7-비스(벤조에이트),에스큘레틴 6,7-비스아세테이트, 에스큘레틴 6,7 -비스(피발레이트) 및 에스큘레틴 6,7-모노피발레이트(이상 실시예 1에서 합성한 화합물)

비교물질 : 인도메타신(시그마사 제품)

(c) GAG의 정량

2일 후, 연골배양세포 상등액을 빼낸 후에 남은 연골 매트릭스층에 0.03%파파인 용액 1ml를 첨가하여 65℃에서 1시간 반응시켜 매트릭스층으로부터 GAG를 유리시켰다. 처리한 파파인 용액중의 GAG함유량을 1,9-디메틸메틸렌블루법을 이용하여 정량하였다(정량법 : R. W. Farndale, Biochim, Biophys. Acta., Vol. 883, pp. 173-177, 1986 참조). 연골파괴인자 무철가군(대조군)의 연골 매트릭스중의 GAG함유량을 100으로 했을 때의 각 샘플의 GAG 상대량을 하기의 식으로 구하였다. 대조군의 GAG함유량은 연골세포가 융합상태에 이른 후, 실험에 사용하기까지의 경과일수의 차이에 의해 일정 폭(10.9 내지 99.9㎍/㎖)을 나타냈다.

GAG상대량(%)=(B/A)×100

상기식에서, A는 연골파괴인자 무첨가군(대조군)의 GAG함유량이고, B는 연골파괴인자 첨가군 또는(연골파괴인자+시험물질)첨가군의 GAG함유량이다.

결과를 표 1에 나타낸다. 표중의 GAG함유량은 평균치±표준오차(n=3)의 값이다. 각 실험에 있어서, 대조군 및 연골파괴인자 첨가군을 넣었다. 유의차 검정(significant difference analysis)은 각 실험의 연골파괴인자 첨가군에 대해 스튜던트의 t-시험(Student's t-test)으로 실시하였다. 검정결과의 표시는 다음과 같다. * : P0.05, * * : P0.01, * * * : P0.001.

연골 파괴이자 무첨가군(대조군)의 GAG함유량에 대해서 연골파괴인자인 PMA 및 1L-1a를 첨가함으로써 GAG의 감소가 유도되었다. 이 조건하에서 본 발명의 화합물은 GAG의 감소를 억제하여 연골파괴 억제작용을 갖는다는 것을 확인하였다. 이것에 대하여, 종래의 진통소염제인 인도메타신에서는 연골파괴 억제작용은 보이지 않고 반대로 연골파괴의 촉진작용이 보였다.

[표 1]

실시예 4 : 제제예(과립제)

에스큘레틴20중량부

유당68중량부

저치환 하이드록시프로필셀루로즈10중량부

하이드록시프로필셀루로즈 2중량부

상기 성분들을 혼합한 후, 습윤제 에탄올 32중량부를 사용하여 훈련하였다. 계속해서 습시과립화를 실시하고 건조시켜 과립제를 수득하였다.

이상과 같이, 화합물(Ⅰ)는 연골 매트릭스를 구성하는 GAG의 감소를 상당히 억제하여 연골보호작용을 나타낸다. 또한, 저독성이다. 따라서, 화합물(Ⅰ)은 연골보호제로서 만성관절류마티스, 변형성 관절증, 어깨관절주위염, 어깨, 팔, 목, 증후군, 요통증 등과 같은 관절증의 치료에 극히 유용한 용도를 갖고 있다.

이상, 본 발명을 특정의 태양에 관해서 설명하였지만, 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 달리 변형할 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.

Claims

하기 일반식(Ⅰ)의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 관절증 치료제

상기식에서, R¹, R²는 각각 독립적으로 수소원자, 탄소수 2 내지 25의 포화 또는 불포화 지방족아실 그룹 또는 벤조일 그룹이고, R³은 수소원자 또는 알킬 그룹이다.
제 1 항에 있어서, R¹, R²는 각각 독립적으로 수소원자, 아세틸 그룹, 피발로일 그룹, 카프릴로일 그룹, 라우로일 그룹, 팔미토일 그룹, 스테아로일 그룹, 리놀레오일 그룹, 도코사헥사에노일 그룹 또는 벤조일 그룹이고, R³가 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬 그룹인 관절증 치료제.
제 1 항에 있어서, 하기 일반식(Ⅱ)의 화합물을 포함하는 관절증 치료제 :

상기식에서 R¹¹및 R¹²는 각각 독립적으로 수소원자, 피발로일 그룹, 카프릴로일 그룹, 라우로릴 그룹, 팔미토일 그룹, 스테아로일 그룹, 리놀레오일 그룹, 도코사헥사에노일 그룹 또는 벤조일 그룹이고, R¹³은 수소원자 또는 메틸 그룹이다.
제 3 항에 있어서, R¹¹및 R¹²가 각각 독립적으로 수소원자, 피발로일 그룹, 스테아로일 그룹, 스테아로일 그룹 또는 벤조일 그룹인 관절층 치료제.
제 1 항에 있어서, 연골보호제인 관절층 치료제.