KR0134486B1 - 단백질 고분비능을 지닌 효모 돌연변이주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효모를 돌연변이시켜 얻은 단백질 고분비능을 지닌 효모 돌연변이주 사카로마이세스 세레비지애 LBS 72 및 이를 이용하여 단백질, 특히 인간 과립구 거식 세포 콜로니 인자를 대량생산하는 방법을 제공한다.

Description

단백질 고분비능을 지닌 효모 돌연변이주

제1도는 돌연변이 시킨 변이주들로부터 고분비능을 지닌 변이주를 선별하기 위해 플라스크 배양한 다음 전기 영동한 결과이며,

제2도는 변이주와 비변이주의 분비능을 비교하기 위하여 5L발효조에서 회분식 발효후 시간별로 취한 상층액을 전기 영동한 결과이고,

제3도는 돌연변이후 선별한 변이주들을 발효조에서 분비능을 비교하기 위하여 발효시킨후 전기 영동한 결과이고,

제4도는 비변이주와 변이주의 분비능을 비교하기위하여 유가식 배양후 시간별로 취한 상층액을 전기 영동한 결과이다.

본 발명은 외래 단백질 고분비능을 갖는 효모 돌연변이주 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)LBS 72에 관한것으로, 보다 구체적으로 유전자 재조합 방법에 의해 외래 단백질을 발현, 분비하는 숙주세포인 효모를 인공 돌연변이를 통하여 외래 단백질을 고분비하도록 만든 돌연변이 효모에 관한 것이다.

식품 공업에서 많이 사용되고 있는 효모는 GRAS(generally recognized as safe)의 범주에 들어가는 안전한 미생물일 뿐 만아니라 유전적인 정보와 발효 기술이 많이 연구되었기 때문에 고등생물의 단백질을 발현하는 숙주로서 많이 이용되고 있다. 특히 외래 단백질을 효모에서 발현시킬때 분비 유도체를 이용하여 외래 단백질을 분비하도록 하는데, 이는 효모세포내에서 외래 단백질이 합성된 후 분비 경로를 거쳐 밖으로 나오는 동안에 적절한 글리코실화(glycosyiation)가 이루어지고 정확한 디설파이드 결합(disulfide bond)과 재중첩(refolding)이 이루어져 천연의 활성을 갖도록 하기 위해서이며, 또한 발효후 정제 과정을 용이하게 할 수 있게 하기 위함이다.

그러나, 이러한 여러 잇점에도 불구하고 외래 단백질을 분비하는 경우 효모의 분비능이 낮아 세포내 발현량보다 세포외 분비량이 작은 것이 문제가 되어 왔다. 그 이유는 아직 명확하게 밝혀지지는 않았으나 단백질이 소포체(endoplasmic reticulum), 골지체(golgi body)등의 여러 분비 경로를 거치면서 글리코실화등의 단백질수정이 일어난 후 세포외로 분비되는데 그 분비 경로중의 어는 한단계가 율속단계(rate limiting step)가 되어 분비율이 낮을 수 있고, 분비 경로외의 세포내 다른 장소로 이동되어 분해될수 도 있으며, 글리코실화 정도에 따라 또는 세포내 여러 단백질 분해효소의 활성유무에 따라 분비효율이 좌우될 수 있기 때문이다.

따라서, 이러한 효모의 분비능이 낮은 문제점을 해결하기 위해서 여러 연구 그룹에서 인공 돌연변이를 이용하여 단백질 고분비능을 지닌 효모를 개발하기 위한 연구가 진해되어 왔다(R.A.Smith등, Science 229, 1219(1985); Sakai, A 등. Genetics 119, 499(1988): Suzuki, K 등,Mol.Gen. Genet. 219,58(1989); Sleep,D. 등, BIO/TECHNOLOGY 9, 183(1991); Moir. D.T. 등, Method in Enzymology Vol. 194, 491(1991)).

이에, 본 발명자들도 단백질 고분비능을 지닌 효모를 얻기위하여 연구한 결과 화학적 변이원인 에틸 메탄설포네이트(ethylmethanesulfonate, 이하 EMS)또는 엔티지(NTG, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)로 효모를 처리한 후 본 출원인에 의해 개발된 이중막을 이용한 단백질 고분비능을 지닌 균주 선별방법(대한민국 특허 출원 제93-4000호)에 의해 외래 단백질을 고분비하는 변이 효모를 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 단백질 고분비능을 지닌 효모 돌연변이주 및 이를 이용하여 외래 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

돌연변이시키고자 하는 효모, 예를 들면 인간 과립구 거식세포 콜로니 자극인자(hGM-CSF)유전자를 분비 유도체인 알파인자와 프로모터 A/G(글리세르알데히드-3-인산 탈수소 효소 유전자와 제2알코올 탈수소 효소 유전자의 혼성 프로모터)에 재조합시킨 발현벡터를 사용하여 형질전환시킨 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae LUCK-GM-CSF-1Y)(대한민국 특허출원 제 91-25880호, 한국 종균 협회 기탁 번호 KFCC-10716, 기탁일: 1991년 4월 17일)를 효모 돌연변이에 널리 사용되고 있는 화학적 변이원인 EMS를 두차례, 그리고 NTG를 두차례 처리하여 이미 알려진 방법(Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y., 1978)에 따라 실시하여 변이주를 얻었다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

선택 배지에서 적정한 세포 농도로 자란 효모를 원심분리하여 침전시킨 후 완충 용액으로 세척한다. 이때 효모는 대수기 초기의 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 세척후 완충액에 현탁시킨다음 적당량의 EMS를 처리한후 단백질을 강하게 흡착하는 여과막과 단백질을 거의 흡착하지 않는 여과막으로 된 이중막이 깔린 YEPD 한천배지에서 배양한다. EMS의 농도및 처리온도, 처리시간에 따라 효모의 사멸율이 달라질수 있으며, 사멸율에 따라 또한 변이주를 얻는 확율이 달라지므로 이들 조건들을 적절히 조절하는데, 사멸율이 50-90%가 되도록 조절하는 것이 적절하다. 효모 콜로니가 자란 후 이를 본 출원인의 대한민국 특허출원 제 93-4000호에 기술된 방법에 따라, 즉 배지상에 단백질을 잘 흡착하는 여과막을 깐 다음 그 위에 단백질을 잘 흡착하지 않는 여과막을 깔고, 상기 이중막위에 균주를 배양한후 단백질을 잘 흡착하는 여과막을 염색하여서 염색된 점의 크기와 진하기를 비교하여 고분비 변이주를 얻는다.

이렇게해서 얻은 변이주들을 삼각 플라스크에서 배양하여 단백질 분비정도를 전기 영동 방법에 의해 다시 검사하여 2차적으로 선별한후 발효기에서 배양하여 최종적으로 분비능을 확인하여 고분비 변이주를 얻는다.

이렇게 하여 선별된 고분비 변이주는 회분식 및 유가식 배양조건하에서 비변이주와 동일한 세포 특성을 나타내며 분비능도 회분식및 유가식 배양에서 동일하게 유지하면서 비변이주보다 증가된 생산성을 나타내므로 효모에서의 단백질의 대량생산을 가능케 한다.

본 발명을 통해 얻은 단백질 고분비 효모는 본 실시예에서 사용한 외래 단백질인 인간 과립구 거식 세포 콜로니 인자외에 효모 에서 발현, 분비 될수 있는 모든 외래 단백질에 숙주 세포로 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 그러나 하기 실시예는 본발명을 예시하기 위한 것이지 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

사카로마이세스 세레비지애 LUCK-GM-CSF-1Y(KFCC 10716)를 50ml의 루이신 결핍선택 배지(YNB(yeast nitrogen base without amino acids) 0.67%, 아데닌 0.004%, 우리딘 0.003%, 트립토판 0.002%, 티로신 0.003%, 라이신 0.003%, 페닐알라닌 0.04%, 트레오닌 0.04%, 포도당 8%)에 접종하여 600nm에서의 흡광도(O.D. 600)가 0.5내지 1이 될때까지 자라게 한후, 배양액 1ml을 소형 원심 분리기로 12,000rpm에서 2분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 침전된 세포를 인산나트륨 완충용액(pH 8.0)으로 세척한 후 인산나트륨 완충용액(pH 8.0)에 재현탁시키고 EMS를 2%(v/v)농도로 넣고 30℃의 진탕 배양기에서 30분 동안 방치한 후 50배의 6%농도의 티오황산나트륨으로 중화하였다.

상기액을 0.9% 생리 식염수로 100배 희석하여 그중 0.1ml를 YEPD한천 배지(효모추출물 1%, 펩톤 2%, 포도당 2%, 한천 1.5%)상의 셀룰로오스 아세테이트와 나이트로셀룰로오스의 이중 여과막위에 도말하였다. 30℃에서 4일간 배양한 후 나이트로셀룰로오스 여과막만을 들어내어 0.2% 트윈 20을 함유한 인산염 완충용액으로 10분씩 2회 세척하고 아미도 블랙으로 5분간 염색한 후, 탈색용액(에탄올 45%, 초산 10%, 증류수 45%)으로 콜로니 이외의 부분이 탈색될때까지 염색하였다. 탈 염색한 후 염색된 점의 크기와 진하기를 셀룰로오스 아세테이트 여과막에 남아있는 콜로니와 비교하여 염색 정도가 매우 크고 진한 점들에 상응하는 콜로니를 단백질 고분비 변이주로서 선별하였다.

선별한 변이주들을 각각 루이신 결핍 선택배지에서 24시간 동안 30℃로 종배양한 후 YEPD액체 배지가 든 플라스크에서 48시간 동안 30℃로 배양하였다. 12,000rpm 에서 2분 동안 원심분리하여 변이주 각각의 상층액을 얻어 15% 소듐도데실 설페이트 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)한 후, 은-염색(silver-staining)하여 고분비 변이주 LBS-18을 선별하였다. 이 변이주는 냉동하여 보관하며 다음 실험에 사용하였다.

이 변이주 LBS-18을 위와 같은 방법으로 다시 돌연변이시켜 고분비능을 지닌 새 변이주 LBS-43을 얻었고 이를 다시 NTG로 돌연변이시켜 LBS-56을 얻고 이를 NTG로 다시 돌연변이시켜 변이주 LBS-72를 얻었다. 이는 1994년 2월 21일자로 유전자 은행에 기탁번호 KCTC 0101BP로 기탁하였다. 이때, NTG로 돌연변이시키는 방법은 EMS의 방법과 같으며 단지 NTG처리 최종 농도가 20μg/ml로, NTG 2mg을 에탄올 1ml에 녹인 용액을 배양액 1ml에 10μl를 넣어 45분간 처리하였고, 사멸율은 70-85%였다.

제1도는 LBS 56을 돌연변이시켜 얻은 9개의 콜로니를 플라스크로 액체 배양하여 겔-전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

제1도에서 4레인부터 12레인까지는 변이주이고 1레인에서 3레인은 각각 4:2:1농도비의 GM-SCF표준 물질이다.

상기 9개의 콜로니중 GM-CSF분비량이 가장 많은 8번째 레인의 변이주를 선택하여 이를 LBS-72로 명명하였다. 참고로 비변이주를 상기와 동일하게 배양한 결과 4번 레인의 농도와 비슷한 정도로 단백질을 분비하였다.

[실시예2]

외래 단백질 고분비 변이주의 성장 특성과 고 분비능을 확인하기 위하여 5 리터 발효조에서 비변이주와 동일한 배양 조건으로 회분식 배양하여 비교한 결과 고분비 변이주가 비변이주에 비하여 외래 단백질, 특히 GM-CSF의 생산성이 두배 정도 향상되었음을 확인하였다.

-80℃ 냉동고에서 보관한 GM-CSF 고분비 변이주 LBS-72 한바이얼(1ml)를 루이신 결핍 선택 배지 50ml이 든 플라스크에 접종하여 30℃,180rpm으로 24시간 진탕 배양기에서 배양한후 YEPD접종 배지(효모 추출물 1%, 효모 펩톤 2%, 포도당 8%)100ml에 5%(v/v)비율로 접종하여 12-15시간동안 30℃,180rpm으로 진탕 배양기에서 배양하여 5리터 회분식 배양의 접종액으로 사용하였다.

상기 배양 접종액을 YEPD 복합 배지(효모 추출물 1%, 효모펩톤 2%, 포도당 2%)에 5%(v/v)비율로 접종하여 pH 4.5-5.5, 30℃,500rpm, 1vvm 통기 속도로 48시간 동안 회분식 배양하여 비변이주와 고분비 변이주의 성장 특성 및 GM-CSF분비율을 비교하였다. 이결과 두 균주 모두 동일한 세포 성장 특성을 보였다. 반면 제2도의 SDS-겔 전기영동(SDS-PAGE) 은-염색 사진에서 보는 바와 같이 고분비 변이주에 의해 발현된 GM-CSF의 양이 비변이주에 의해 발현된 경우 보다 두배 정도 많아 변이주가 플라스크에서만이 아니라 발효조에서 배양할때도 고분비능을 유지함을 알 수 있었다.

제2도에서 레인 1 내지 4는 각각 1:2:3:4 농도비의 GM-CSF표준물질이고, 레인 5 내지 8은 각각 비변이주의 35,24,12 및 8시간의 발효시간에 따른 분비량을 나타낸 것이고 레인 9 내지 12는 각각 변이주의 35,24,12및8시간의 발효시간에 따른 분비량을 나타낸 것이다.

제3도는 변이주 LBS 43,56 및 72를 5L발효조에서 회분식 배양하여 GM-CSF분비량을 비교한 것이다. 레인 1 과 5 는 각각 비변이주의 34.5시간 및 44시간 배양후의 GM-CSF분비량을 나타낸 것이고, 레인 2 내지 4 및 6 내지 8 은 각각 변이주 LBS 43,56 및 72의 34.5 시간 및 44 시간 배양후의 GM-CSF 분비량을 나타낸 것이고, 레인 9내지 12는 각각 1:2:4:6농도비의 GM-CSF표준물질을 나타낸다.

제3도로부터 알 수 있는 바와같이 변이주가 비변이주에 비해 모두 2배 이상의 분비량을 나타내며, 변이주중에는 LBS-72가 분비량이 가장 많았다.

실시예 3. 고분비 변이주의 유가식 배양

변이주가 비변이주와 마찬가지로 고농도 세포 배양이 가능하며 회분식 배양에서와 동일한 분비능을 유지하는지 알아보기 위하여 고분비 변이주를 비변이주와 동일한 조건으로 유가식 배양을 하여 비교하였다.

상기 실시예2의 종배양 방법에 의해 배양한 접종액을 초기배지(iYEPD: 효모 추출물 0.5%, 효모펩톤 1.0%,포도당 1.0%)에 5%(v/v)비율로 접종하여 pH 4.5 내지 5.5, 30℃,500rpm, 1vvm통기속도로 배양을 시작하였다. 약 5 내지 6 시간 후 배양액 내의 포도당이 고갈된 시점부터 최종 배지 조성이 효모 추출물 3.5%, 효모 펩톤 3.5%, 포도당 7.0%가 되도록 준비한 첨가 배지를 콤퓨터와 연결된 펌프를 이용하여 첨가해 주기 시작하였다. 이때 첨가 속도는 첨가 구간동안 여분의 포도당이 남지 않으며 에탄올이 생성되지 않도록 하면서 증가하는 세포 농도와 배양액 부피에 비례하여 공급하도록 미리 설정된 하기 계산식에 의하여 결정하였다.

F: 배지공급속도(/시간),μ: 0.05-0.2,

Y: 세포성장수율(g세포/g포도당), V:배양부피(l),

X: 세포농도(g/),SF: 공급배지내의 포도당 농도(g/).

이 결과 변이주는 비변이주와 동일한 세포 성장 특성을 보여 최종 세포 농도가 OD 85내지 90으로 비변이주의 최종 세포 농도와 유사하였으며,회분식 배양의 세포 농도 OD 20에 비해서는 4 내지 4.5배 증가하여 변이주도 고농도 세포 배양이 가능함을 알 수 있었다(제4도 참조). 제4도에서 레인 1 내지 4 는 각각 변이주의 10,24,35및 48시간의 발효시간에 따른 분비량을 나타낸 것이고, 레인 5내지 8은 각각 비변이주의 10,24,35및 48시간의 발효시간에 따른 분비량을 나타낸 것이며, 레인 9 내지 12는 각각 4:3:2:1 농도비의 GM-CSF표준물질을 나타낸 것이다. 또한, 고 분비 변이주의 유가식 배양에 의한 최종GM-CSF발현량은 제4도에서 보는 바와 같이 비변이주의 발현량에 비하여 두배 정도 많았다. 그런데 이것은 변이주의 회분식 배양의 발현량보다는 4 내지 5배 정도 많은 것으로 유가식 배양에 의해 얻은 세포 농도가 회분식 뱅양에 의해얻은 세포 농도보다 4내지 4.5배 증가한 것을 볼때 유가식 배양에서의 GM-CSF 비 발현량(specific production yield)이 회분식 배양의 GM-CSF 비 발현량에 비해 떨어지지 않고 비슷하게 유지함을 알 수 있었다.

따라서, 외래 단백질, 특히 GM-CSF를 고도로 분비하도록 선별된 변이주는 회분식 및 유가식 배양조건하에서 비변이주와 동일한 세포 성장 특성을 보일 뿐만 아니라 GM-CSF를 고도로 분비함으로써 비변이주의 GM-CSF 생산성보다 100% 증가된 생산성을 갖고 있음을 알 수 있었다.

Claims (2)

1. 세포내에서 발현된 외래 단백질인 인간 과립구 거식 세포 콜로니 자극 인자를 세포밖으로 고분비하는 효모 돌연변이주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) LBS 72(기탁번호: KCTC 0101BP).
2. 제1항의 효모 돌연변이주를 배양함을 포함하는, 인간 과립구 거식 세포 콜로니 작극 인자를 생산하는 방법.